Kendi Kendine Kurulan Rekombinant Tip I Kolajen Fibrillerinde Kolajen Mineralizasyonu için Çok Renkli 3D-STORM Yüksek Çözünürlüklü Görselleştirme Protokolü

Summary

Burada, çok renkli 3D-STORM kullanarak rekombinant kollajen fibrillerde intrafibriller ile ekstrafibriller mineralizasyonu ayırt etmek için optimize edilmiş etiketleme, görüntüleme ve nicel kololokalizasyon analizini entegre eden bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Bu protokol, rekombinant tip I kolajen mineralizasyonunun nano ölçekli görselleştirilmesi için çok renkli üç boyutlu stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (3D-STORM) yöntemini tanımlar. Bu yöntem, kollajen, kollajen olmayan proteinlerin (örneğin, kondroitin sülfat) ve kalsiyum fosfat mineral fazlarının eşzamanlı görüntülenmesini sağlar. Örnek hazırlama, amino-silanizasyon ve kolajenin kendi kendine montajını içerir; ardından erken aşamada (30 dakika) amorf kalsiyum fosfat (ACP) oluşturan ve 6 saat içinde hidroksiapatite (HAP) olgunlaşan kalsiyum fosfat ortamı kullanılarak mineralizasyon yapılır. Daha sonra multipleks immünoflüoresans etiketleme yapılır ve örnekler önce konfokal mikroskopiyle değerlendirilir, ardından oksijen toplama görüntüleme tamponu kullanılarak 3D-STORM görüntü alınır. Veri işleme ve analiz, halka açık yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilir. Geleneksel elektron veya konfokal mikroskopiyle karşılaştırıldığında, bu protokol moleküler özgüllüğü nano ölçekli çözünürlükle birleştirir (tipik lateral hassasiyet 20–30 nm, eksenel 50–60 nm), böylece intrafibrillar ve ekstrafibrillar mineralizasyon desenlerinin üç boyutlu görselleştirilmesini sağlar. Temsil eden sonuçlar, üç boyutlu bir uzayda kolajen ağlarının, ilişkili kollajen olmayan proteinlerin ve mineral fazlarının net görselleştirilmesini göstermektedir. Pearson korelasyon katsayısı (0,89 ± 0,04) ve Manders'ın örtüşme katsayısı (0,91 ± 0,03) dahil olmak üzere nicel metrikler Sonuçlar bölümünde sunulmaktadır. Bu protokol, mineralizasyon dinamiklerine nano ölçekli içgınlık ihtiyacı olan biyomalzeme bilimi, biyomineralizasyon ve kemik dokusu mühendisliği alanlarındaki araştırmacılar için güçlü bir araç sunmaktadır.

Introduction

Kolajen mineralizasyonu, kemik ve dişler gibi sert dokuların oluşumunda hayati öneme sahip temel bir biyolojik^süreçtir. Kolajen liflerinin karmaşık yapısı ve mineral birikiminin ince ayarlanmış düzenlemesi bu dokulara olağanüstü mekanik güç ve yapısal bütünlük^{kazandırır.} Kolajen sadece pasif bir iskele olarak değil, aynı zamanda karmaşık moleküler ve fiziksel etkileşimler yoluyla hassas mineral birikimini organize eden aktif bir katılımcı^{olarak hizmet eder 3}. Bu mekanizmaların aydınlaştırılması, osteoporoz ve diş çürüğü gibi patolojik durumları anlamak ve rejeneratif tedaviler için biyomimetik materyaller geliştirmek için çok önemlidir⁴.

Sert dokularda kolajen liflerinin çapı yaklaşık 50 ila 100 nm arasında değişir; hidroksiapatit (HAP) parçacıkları ise daha da küçüktür (genellikle 2–5 nm kalınlığında ve 20–30 nm uzunluğunda) ve fibriller^{boşluklar içinde kesişir.} Boşluk bölgeleri çekirdeklenme noktaları olarak işlev görebilirken, doğal dokularda mineraller başlangıçta interfibrillar boşluklarda oluşur ve ardından intrafibrillar bölmelere genişler. Geleneksel karakterizasyon yöntemleri arasında histolojik boyama, konfokal lazer taramalı^{mikroskopi 6,7} ve elektron^{mikroskopi 8,9} bulunur. Histolojik boyama makroskobik bir değerlendirme sağlar ancak nano ölçekli mineralizasyon durumlarını değerlendiremez. Konfokal mikroskopi, belirli bileşenlerin gözlemlenmesini sağlar ancak difraksiyon sınırlıdır (~200 nm yanal), intrafibrillar ile ekstrafibrillar mineralizasyonu^{çözümleyemez 10}. Elektron mikroskopisi yüksek çözünürlük sunar ancak moleküler özbaşdaklıktan yoksundur. İmmünoaltın etiketleme elektron mikroskopi için moleküler özbaşlılık sağlayabilse de, özel işlem gerektirir ve STORM'a kıyasla çoklu bileşenin çoklanmış, üç boyutlu görselleştirilmesine daha az uygundur; uzun deneysel döngüler ve yüksek maliyetler gerektirir¹¹.

Stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (STORM), bireysel floroforları yüksek hassasiyetle lokalize ederek kırınım sınırını aşar ve ~20 nm yan çözünürlük¹² elde eder. Uyarılı emisyon azalması (STED)¹³mikroskopisi ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)¹⁴ gibi diğer süper çözünürlüklü tekniklerle karşılaştırıldığında, STORM daha yüksek lokalizasyon hassasiyeti sunar (~20 nm yanal ve ~50 nm eksenli) ve daha geniş organik floroforlarla uyumludur. Özellikle, STED biyolojik örneklere zarar verebilecek özel boyalar ve yüksek lazer güçleri gerektirirken, SIM yalnızca ~100 nm çözünürlük sunar ve fibril ölçekli (50–100 nm) özellikleri çözmek için yeterli değildir. STORM, çözünürlük, çoklama yeteneği ve örnek uyumluluğu arasında pratik bir denge sağlar. Yayınlanan kılavuzlar, STORM görüntüleme parametrelerinin optimize edilmesini ve çözünürlük değerlendirmesini kolaylaştırmak için standartlaştırılmış test^{örneklerini tanımlamıştır 15}. Üç boyutlu görüntüleme yetenekleriyle birleştiğinde, 3D-STORM aynı anda birden fazla bileşenin nano ölçekli^{görselleştirilmesini sağlar 16}. Son gelişmeler, STORM'u çok renkli ve çoklu görüntülemeye genişleterek aynı örneklem içinde birden fazla hedefin^{görselleştirilmesini sağlamıştır 17,18}.

Bu protokol, kendi kendine oluşturulmuş rekombinant tip I kolajen fibrillerine dayalı biyomimetik in vitro model kullanır ve nano ölçekte intrafibrillar ile extrafibrillar mineralizasyonu ayırt etmek için in vitro rekombinant tip I kolajen kendi kendine montajlı fibril modelleri için özel olarak tasarlanmıştır. STORM sabit örnekler ve oksijen toplama tamponları gerektirdiği için canlı hücre görüntülemesi için uygun değildir. Ayrıca, önceden dekalsifikasyon veya antijen geri alınması olmadan doğal yüksek mineralize dokular (örneğin, olgun kemik) için uygun değildir. Sadece genel mineral yoğunluğu veya geniş alan morfolojisi değerlendirme gerektiriyorsa, geleneksel konfokal veya elektron mikroskopisi daha verimlidir.

Bu protokolün genel amacı, bireysel kolajen fibriller içindeki minerallerin ve kollajen dışı proteinlerin nanoölçekli dağılımını görselleştirmek için çok renkli 3D-STORM kullanılarak standartlaştırılmış, adım adım bir iş akışı sağlamaktır; özellikle intrafibriller ile ekstrafibriller mineralizasyonun ayırımına vurgu yapılır. Bu protokol, optimize edilmiş immünoetiketlemeyi, özel görüntüleme tamponu ile entegre ederek birden fazla organik bileşenin (kollajen, kollajen olmayan proteinler) ve inorganik fazların (ACP, HAP) eşzamanlı izlenmesini mümkün kılarak üç^{boyutlu 19}. Önemli bir yenilik, intrafibrillar ve ekstrafibrillar mineralizasyon desenlerinin nicel olarak değerlendirilmesidir. Nicel belirleme iki bağımsız kriterle sağlanır: (1) görüntü analiz yazılımındaki Kolokalizasyon modülü kullanılarak mineral (kalsiyum gösterge boyası (örneğin, kalsein)) ve kollajen (uzak kırmızı floresan boya) kanalları arasındaki Pearson kolokalizasyon katsayısının hesaplanması (katsayı >0.8 güçlü ilişkiyi gösterir); (2) bireysel fibrilllerin Z-dilimleri boyunca mineral sinyalinin kalıcılığını analiz etmek: Eğer mineral sinyal merkezi dikey merkezden Z = 0 ile ±120 nm arasında) maksimumun ≥%50'si yoğunlukta bulunursa, intrafibriller olarak sınıflandırılır. Geleneksel elektron veya konfokal mikroskopiden farklı olarak, bu protokol moleküler özgüllüğü nano ölçekli çözünürlükle birleştirerek intrafibrillar mineralizasyonun üç boyutlu mekansal dağılımını sağlar.

Bu protokol, mineralizasyon dinamiklerine nano ölçekli bir bakış açısı gerektiren biyomalzeme bilimi, biyomineralizasyon ve kemik dokusu mühendisliği alanlarındaki araştırmacılar için tasarlanmıştır. Standartlaştırılmış prosedür, demineralize dentin dilimleri veya kolajen bazlı hidrojeller gibi diğer mineralize kolajen sistemlerini incelemek için de uyarlanabilir; ilk örnek hazırlama adımları buna göre ayarlanır.

Protocol

Biyolojik örnekleri içeren tüm deneyler, Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin Çekirdek Tesisleri'nin yönergeleri ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirildi ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından onaylandı (Onay Sertifikası No. BSL20235710079). Burada tanımlanan deneysel protokol, ticari kaynaklı reaktifler ve in vitro biyomimetik sistemler kullanır. İnsan katılımcıları, hayvan denekleri veya insan dokusu örneklerini içermez ve bu nedenle kurumsal inceleme kurulundan etik onay gerektirmez.

DIKKAT: Tehlikeli kimyasallarla ilgili tüm işlemler, uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla (laboratuvar önlüğü, eldiven, koruma gözlüğü) bir duman davlumbazında yapılmalıdır. Kimyasal atıkları kurumsal düzenlemelere göre bertaraf etmektedir. NaN₃ için, atıkları "azide atığı" olarak işaretlenmiş özel bir kapta topla ve asitlerle karıştırmayın (patlayıcı gaz riski). Glutaraldehit için, bertaraf edilmeden önce %10 fazla sodyum bisülfit ile inaktive edin. β-merkaptoetanol için, boşaltmadan önce 1 saat boyunca ağartıcı (1:10 v/v) ile oksitleyin.

NOT: İmmünoflüoresans etiketleme, mineralleşmeden önce yapılmalı, mineral birikintileri tarafından epitopun maskelenmesini önlemek için. Mineralizasyon sonrası etiketleme gerektiren uygulamalarda antijen geri alınması gerekebilir.

1. Mineralizasyon ortamının hazırlanması

1. Yeniden oluşturulmuş kolajen fibrilleri için mineralizasyon ortamının hazırlanması
   1. Kalsiyum stok çözeltisi, 5 mL poliaspartik asit (p-Asp, Mw 9-11 kDa) damla-damla ekleyerek 15 mL konik bir tüpte 5 mL CaCl₂ çözeltiye eklenerek hazırlanır.
   2. Vortex tüpte 30 saniye karıştırın ve homojen hale gelir.
   3. P-Asp'i yavaşça ekleyin ve amorf kalsiyum fosfatı (ACP) stabilize etmek için iyice karıştırın.
   4. Kalsiyum stok çözeltisine 5 mL fosfat çözeltisi (19 mM Na₂HPO₄ + 300 mM NaCl) ekleyin.
   5. Vortex karışımı 1 dakika.
      NOT: Karıştırmadan sonra nihai konsantrasyonlar: 1,67 mM CaCl₂, 9,5 mM Na₂HPO₄, 150 mM NaCl ve 50 μg/mL p-Asp.
   6. Mineralizasyon ortamını hemen kullanmadan önce hazırlayın. Saklama; tutarlı sonuçlar elde etmek için kararsız ACP öncülünü hemen kullanın.
      NOT: Depolama erken kristalleşmeye yol açar.
2. Kolajen jelleri/demineralize dentin için mineralizasyon ortamının hazırlanması
   1. 8,77 g NaCl, 0,01 g NaN₃, 6,06 g Tris ve 1,11 g CaCl₂ 800 mL deionize suda çözünerek kalsiyum içeren çözelti hazırlayın.
   2. Deionize su ile hacmi 1 L'ye çıkarın.
   3. Kalsiyum içeren çözeltiye 350 μg/mL poliakrilik asit (PAA, Mw ~1800) ekleyin.
   4. 1 dakika girdabında dur.
      NOT: Daha yüksek kalsiyum konsantrasyonlarında daha iyi stabilizasyon için p-Asp yerine PAA kullanın.
   5. Fosfat çözeltisi, 0,85 g Na₂HPO₄'u 1 L deiyonize suda çözerek 6 mM Na₂HPO₄ elde ederek hazırlayın.
   6. Fosfat çözeltisi 0,22 μm membran kullanılarak filtre-sterilize edilsin.
   7. Kalsiyum ve fosfat çözeltilerinin eşit hacimlerini (örneğin, her biri 500 mL) manyetik karıştırma ile 300 rpm'de birleştirin.
   8. 1 M HCl veya NaOH kullanarak pH ölçüm cihazıyla 7.4'e ayarlayın.
      NOT: pH 7.4 ± 0.1'de tutun. Erken kristalleşmeye neden olan pH sapmalarına >0.2 izin vermeyin.

2. Rekombinant kolajen liflerinin hazırlanması

1. Cam tabanlı çanakların amino-silanizasyonu
   NOT: Bu tedavi, (3-aminopropil) trietoksisilan (APTES) kullanarak pozitif yüklü amino gruplarını (-NH₂) cam yüzeyine yerleştirir; bu da elektrostatik adsorbsiyonu ve negatif yüklü kolajen monomerlerinin stabilizasyonunu destekler.
   1. Her cam tabanlı kültür kabına 200 μL APTES çözeltisi (%5 v/v mutlak etanol) ekleyin (35 mm, #1,5H kalınlığı, 0,17 mm ± 0,005 mm).
   2. APTES çözeltisi ile çanak yüzeyinin tam kapsamını garanti edin.
   3. Oda sıcaklığında (20–25 °C) 2 saat karanlıkta kuluçka yapın.
   4. Bulaşıkları mutlak etanol ile üç kez durulayın (yıkamada 2 mL).
   5. 40 kHz'de 10 dakika boyunca deiyonize suda ultrason yapın. Özgün olmayan bağlanmayı önlemek için kalan APTES'i tamamen çıkarın.
   6. Silanize edilmiş tabaklar 4 °C'de 1 haftaya kadar kuru saklanabilir.
   7. (İsteğe bağlı) Daha fazla stabilite için fırınlama: Yıkanmış ve kurutulmuş bulaşıkları 100–120 °C sıcaklıkta fırında 30–60 dakika boyunca koyun.
   8. Devam etmeden önce oda sıcaklığına soğumasına izin verin.
      NOT: Plastik kaplar kullanıyorsanız, deformasyonu önlemek için sıcaklığı 80 °C'nin altına düşürün. Bitter ve Muir^20'den silanizasyon prosedürünü uyarlayın.
2. Kolajen kendi kendine montaj ve çapraz bağlama
   1. Her silanize kabın üzerine 100 μL kollajen-I çözeltisi (0,1 M asetik asitte 50 μg/mL) pipetleyin.
   2. 37 °C'de 10 saat boyunca bir nem odasında kuluçka yapın (%90 göreceli nem >). Çözelti buharlaşmasını önlemek için sabit nem korun.
   3. Faz kontrastı veya konfokal mikroskopi ile fibril oluşumunu doğrulamak; Başarılı bir hazırlık, güzel, ağ benzeri bir fibril ağı gösterir.
   4. Ultrastruktural düzeyde doğru fibril oluşumunu doğrulamak için, aynı kendi kendine montaj koşullarını (kollajen-I 50 μg/mL, 37 °C, 10 saat, nem > %90) takip ederek polivinil formal/karbon kaplamalı TEM ızgarasında ayrı bir örnek hazırlayın.
   5. 10 dakika boyunca %1 fosfortungstik asit (pH 7.0) ile boyan.
   6. Deiyonize suyla yıkayın.
   7. Geçirim elektron mikroskobu altında inceleyin. Başarılı fibrillogenez, karakteristik 67 nm D-periyodik bantlama deseniyle gösterilir ( bkz. Şekil 3).
   8. Cam tabanlı tabaklardan kalan kolajen çözeltisi dikkatlice aspire edin.
   9. Her tabaka 2 mL kondroitin sülfat (CS) çözeltisi (PBS 50 mg/mL, pH 5.5) ekleyin.
   10. 4 °C'de 12 saat boyunca kuluçka yapın, böylece CS'nin kollajen fibrillerine elektrostatik adsorpsiyonu sağlanır.
   11. EDC/NHS çapraz bağlama^{çözeltisi 21} hazırlanın: MES tamponunda 0,2 M EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid) ve 0,05 M NHS (N-hidroksisuccinimide) çözün.
       NOT: MES tamponu, MES serbest asidi deiyonize suda çözünerek ve pH değerini NaOH ile 5.5'e ayarlayarak hazırlanabilir.
   12. CS çözümünü çıkarın ve 2 ml EDC/NHS çapraz bağlama çözeltisi ekleyin.
   13. Oda sıcaklığında 2 saat kuluçka yapın, KS'yi kovalent olarak immobilize etmek için kolajen üzerinde kullanın.
   14. Tepki vermeyen reaktifleri çıkarmak için PBS ile üç kez (her biri 5 mL, 5 dakika) bulaşıkları yıkarın.
   15. İşlenmiş kolajen liflerini mineralizasyondan önce PBS'de 4 °C'de 24 saate kadar saklayın.

3. İmmünoflüoresans etiketleme (mineralizasyondan ÖNCE yapılır)

1. Numune hazırlama
   1. Kolajen fibrillerini 500 mM NaCl çözeltisi ile üç kez durulayın (her yıkamada 10 mL, her biri 5 dakika).
   2. Deiyonize suyla üç kez yıkayın (her yıkamada 10 mL, her biri 5 dakika).
   3. 50 rpm'de dönen yatay bir shaker platformunda yıkamalar yapın; böylece kapsamlı yıkama sağlanır ve montaj edilmiş fibrilleri ayırabilecek kesme kuvvetlerini en aza indirin.
2. Bloklama ve primer antikor kuluçka
   1. Nemli bir odada 37 °C'de %5 sığır serum albümini (%5 sığır serum albümini) ile 1 saat boyunca kuluçka yapın.
   2. Antikor kokteyli bloklayıcı tamponda hazırlayın: tavşan anti-kollajen-I (1:100 seyreltme) ve fare anti-kondroitin sülfat (1:100 seyreltme).
   3. Her örnek başına 200 μL antikor kokteyli ekleyin.
   4. Örnekleri laboratuvar sızdırmazlık filmiyle kaplayın.
   5. Gece boyunca 4 °C'de kuluçka (12–16 saat) yapılır.
   6. Alüminyum folyo kullanarak ışığı korumayı unutmayın. Birincil antikor kuluçkasından sonra, örnekler PBS'de 4 °C'de 24 saate kadar saklanabilir.
3. İkincil antikor boyama
   1. Bağlanmamış birincil antikorları bulaşıkları yıkama tamponu (PBS'de %0,1 Tween-20) ile üç kez yıkayarak her yıkamada 10 dakika ile temizleyin.
   2. Flüoresan ikincil antikor karışımını bloklayıcı tampon içinde (35 mm tabak başına 200 μL) hazırlayın; bunlar arasında uzak kırmızı floresan boya ile konjuge edilmiş keçi anti-tavşan IgG (1:100) ve keçi anti-fare IgM kırmızı floresan boya ile konjuge edilmiş (1:100).
      NOT: Bu adımdan itibaren, floroforun fotobeyazlanmasını önlemek için örnekleri ışıktan koruyun.
   3. Örnekleri oda sıcaklığında (20–25 °C) karanlıkta 1 saat kuluçka edin.
   4. Bulaşıkları üç kez yıkama tamponu ile (her biri 10 dakika) yıkayarak bağlanmamış ikincil antikorları çıkarın.
      NOT: Etiketlenmiş örnekleri PBS'de 4 °C (ışık korumalı) sıcaklıkta görüntülemeden önce 48 saate kadar saklayın. Otofloresansı kontrol etmek için birincil antikor içermeyen kontroller ekleyin.

4. Kolajen liflerinin mineralizasyonu (etiketlemeden SONRA gerçekleştirilir)

1. Mineralizasyon süreci
   1. Her yemek başına 2 ml taze hazırlanmış mineralizasyon ortamı ekleyin.
   2. Erken aşama mineral (ACP) oluşumu için 37 °C'de 30 dakika (kısa süreli) kuluçka yapın.
   3. Alternatif olarak, olgun mineral (HAP) kristalleşmesi için uzun vadeli, 6 saat boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.
      NOT: Kalibre edilmiş bir kuluçka makinesi kullanarak tam sıcaklığı 37 °C ± 0,5 °C arasında tutun.
   4. Nazikçe emilen mineralizasyon ortamı.
   5. Deiyonize suyla üç kez durulayın (her yıkamada 5 mL, 1 dakika aralıklar).
2. Kalsiyum fosfat etiketleme
   1. PBS (her tabak başına 200 μL) içinde 4 μM kalsiyum gösterge boyası (örneğin, kalsein) ekleyin.
   2. Oda sıcaklığında (20–25 °C) karanlıkta 30 dakika kuluçka yapın.
      NOT: Kalsiyum gösterge boyası (örneğin, kalsein) kalsiyum iyonlara bağlanır ve amorf ile kristalin fazlar arasında ayrım yapmaz; faz ataması mineralizasyon süresine bağlıdır (30 dakika = ACP, 6 saat = HAP). Amber tüpler veya folyo sargılarla ışıktan korunmalıdır.
   3. Beş kez durulayın: üç kez deiyonize su ile ve iki yıkama %70 etanol ile (her biri 1 dakika), ikisi arasında dönüşümlü olarak.
3. Görüntüleme için örnek hazırlama
   1. Örnekleri görüntüleme tamponuna daldırın: PBS'de %10 (w/v) gliserol. İsteğe göre, üreticinin talimatlarına göre bir antiifade reaktifi ekleyin.
   2. Örneği kapsayacak kadar hacimli (20–50 μL) görüntüleme tamponu uygulanır.
   3. Numunenin üzerine bir kapak koyun.
   4. Örnekleri 4 °C'de karanlıkta 72 saate kadar saklayın.

5. Lazer konfokal mikroskop altında gözlem

1. Numunelerin 4 °C depolamadan oda sıcaklığına (20–25 °C) aktarılması.
2. Yoğuşmayı önlemek için 10 dakika dengeye izin verin.
3. Amber kaplar veya folyo sarğı kullanarak ışık korumasını koruyun.
4. Görüntüleme tamponunun tüm örneği kapladığını doğrulayın.
5. Konfokal mikroskobu aşağıdaki ayarlarla yapılandırın:
   1. Kolajen görüntüleme için (uzak kırmızı floresan boya): 647 nm lazer, emisyon filtresi 650-710 nm.
   2. Kalsiyum fosfat görüntüleme için (kalsiyum gösterge boyası (örneğin, kalsein)): 488 nm lazer, emisyon filtresi 500-550 nm.
   3. Hedef: 100× yağ batırılması (NA 1.4).
   4. Iğne deliği çapı: 1 Airy Unit (AU).
   5. Piksel kalma süresi: 1-2 μs.
      NOT: Görüntülemeden önce lazer hizalama ve iğne deliği kalibrasyonu yapın.
6. Ardışık tarama yapın: ilk tarama 647 nm uyarıma (kollajen) ile yapıldı.
7. 488 nm uyarımla ikinci tarama (mineral) yapıldı.
   NOT: Kanalları sıralı olarak toplayın, böylece kanamayı önleyin.
8. 3D yeniden yapılandırma için, yeterli örnekleme sağlamak için Z-yığını adım boyutunu 0,5 μm veya daha küçük olarak ayarlayın.
9. Meta veri korunmuş şekilde kayıt dosyaları.
10. Ortak lokalizasyon analizi için, Pearson korelasyon katsayısını hesaplayabilen görüntü analiz yazılımı kullanın (örneğin, uygun eklentilerle halka açık yazılım).

6. Üç boyutlu stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (3D-STORM) ile görüntüleme

1. STORM görüntüleme^{tamponu 22'nin} hazırlanması
   NOT: Glikoz oksidaz ve katalaz görüntüleme tamponuna eklenir; böylece foto ağartma azalır ve floroforların yanıp sönmesini uzatır; bu da STORM'da tek moleküllü lokalizasyon için gereklidir.
   1. 50 mM sodyum asetat tamponunda (pH 5.1) 8 mg/mL seviyesinde bir glukoz oksidaz (GOx) stok çözeltisi hazırlayın.
   2. 160 μg/mL ile 1× PBS'de katalaz stok çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Enzim stoklarını Aliquot yapın, sıvı azot veya kuru buz/etanol banyosu ile dondurun ve -20 °C veya -80 °C'de saklayın. Tekrarlayan donma-çözülme döngülerinden kaçının.
   3. Buz üzerinde, ışıktan korunan taze STORM görüntüleme tamponunu hazırlayın.
   4. Aşağıdaki bileşenleri sırayla birleştirerek 1 mL nihai hacmi elde edin: steril nükleazsız H₂O (1 mL'ye), 1 M NaCl (10 μL, 10 mM final), 1 M Tris-HCl pH 8.0 (50 μL, 50 mM final), taze hazırlanmış 1 M sisteamin (MEA) pH ~7.0 (50 μL, 50 mM final), %50 (w/v) glikoz (200 μL, %10 son kılıç), GOx stoku (200 μL, 1.6 mg/mL final), katalaz stoku (200 μL, 32 μg/mL final).
   5. Nazikçe pipetleme veya ters çevirerek karıştırın. Vortex yapma.
      NOT: Tampon taze hazırlanmalı ve ışıktan korunan buz üzerinde tutulmalıdır. Hazırlıktan sonra 30 dakika içinde kullanın. STORM görüntüleme koşullarının ayrıntılı optimizasyonu için, test örnekleri kullanılarak oluşturulmuş^{protokollere bakınız 15}.
   6. Numuneyi tamamen kaplamak için 200 μL yeni hazırlanmış STORM görüntüleme tamponu ekleyin.
2. 3D-STORM sistem yapılandırması
   1. Görüntüleme yolunun elektron çoğaltıcı CCD (EMCCD) kameraya yönlendirildiğinden emin olun.
   2. 3D görüntüleme için silindirik lens modülünü devreye alın.
   3. Yazılımı 3D STORM alma moduna ayarlayın.
   4. Kullanılan boyalar için optik yol filtrelerini yapılandırın.
   5. 647 nm lazeri açın ve gücü düşük seviyeye (1-5 mW) ayarlayın.
   6. 100× yağ daldırma hedefi (NA ≥1.4) kullanarak, geniş alan veya TIRF canlı önizleme modunda ilgi alanını konumlandırın.
   7. Daha sonra karşılaştırmak için geleneksel bir geniş alan floresans görüntüsü edinin.
   8. TIRF aydınlatma moduna geçin.
   9. TIRF açısını kalibre ederek arka plan floresansını en aza indirmek için ince bir aydınlatma alanı (~100-200 nm) elde edin.
   10. Kamera pozlama süresini (10-30 ms) başlangıç sinyal yoğunluğuna göre ayarlayın.
   11. Görüntüleme lazer gücünü başlangıç sinyal yoğunluğuna göre ayarlayın.
   12. Kısa bir test kaydı gerçekleştirin.
   13. Parametrelerin doğru ayarlandığını ve hızlı fotobeyazlama yaratmadan emin olun.
       NOT: Silindirik lens ekseninin örnek düzlemle hassas hizalanmasını sağla. Çoğu modern sistem otomatik kalibrasyona sahiptir. Manuel kalibrasyon için, simetrik, yuvarlak nokta yayılım fonksiyonlarını (PSF) doğrulamak için 100 nm floresan boncuklar kullanın.
   14. 647 nm lazer gücünde 1–2 kW/^{cm 2} ile 10–30 ms pozlama ile başlayın.
   15. Yanıp sönme yoğunluğunun 0.1–1 molekül/^{μm 2} olduğunu doğrulayın.
   16. Yoğunluk çok düşük veya çok yüksekse, lazer gücünü veya pozlama süresini buna göre ayarlayın.
   17. Doğrulama ve ayarlamayı ideal yoğunluk sağlanana kadar tekrarlayın.
3. 3D-STORM veri toplama
   1. Edinim yazılımını "Sürekli Aktivasyon" moduna ayarlayın.
   2. Görüntüleme lazerini (647 nm) yüksek güce (100-500 mW fiber girişi) ayarlayarak çoğu floroforu karanlık duruma geçirin.
   3. Aktivasyon lazeri (405 nm) düşük güce (0.1–5 mW) ayarlayın.
   4. 405 nm gücünü ampirik olarak optimize ederek 256×256 piksellik bir bölgede her kare başına 100–200 lokalize molekül korunabilir.
   5. Toplam kare sayısını 10.000–20.000 olarak ayarlayın.
   6. Her döngüde 1 kare aktivasyon ışığı (405 nm) ve ardından 5 kare görüntüleme ışığı (647 nm) kullanın.
   7. Satın almaya başlayın.
   8. EMCCD'yi maksimum hassasiyetle çalıştırın (EM kazancı uygulanır)
   9. Kare başına 10–30 ms pozlama kullanın.
   10. Edinim sırasında aktif molekül yoğunluğunu izleyin.
   11. 405 nm lazer gücünü tek moleküllü olayların düzenli akışını sürdürmek için ayarlayın.
       NOT: Ham film verileri, yeniden yapılandırmadan önce uzun vadeli arşivleme için standart bir sabit diskte saklanabilir.
4. Kolajen mineralizasyonunun veri analizi (STORM modüllü görüntü analiz yazılımı kullanılarak)
   1. Analiz yazılımında uygun kamera sürücüsünü (STORM modülü) seçin.
   2. STORM panelinde [Analiz GUI] tuşuna tıklayın. Analiz penceresi açılıyor.
   3. [Dosya Aç] seçeneğine tıklayın. Analiz edilecek ham mikroskopik görüntü dosyasını seçin. Aç düğmesine tıklayın.
   4. Geçerli sinyaller için minimum floresans değerini (Minimum Yükseklik) belirleyin.
   5. Tek moleküllü bir sinyal olarak hala tanınabilecek en karanlık noktayı bul.
   6. Fareyi ortasına çekin.
   7. Peak Height değerini okuyun.
   8. Bu değeri kaydedin.
   9. [Kimlik Ayarları]'na tıklayın. Diyalogda aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Minimum Yükseklik (6.4.8. adımda kaydedilen değeri girin), Maksimum Yükseklik (20000), CCD Temeli (100) ve 3D-STORM veri kontrolü için "3D" (2D için işareti kaldırın).
   10. Daha fazla parametreyi genişletmek için >> tıklayın. Ayarlanır: Minimum Genişlik (nm) 200'e, Maksimum Genişlik (nm) 700'e (2D için 400), Başlangıç Uyum Genişliği (nm) 300'e, Maksimum Eksenel Oran 2,5 (2D için 1,3) ve Maksimum Yer Değiştirme (piksel) 1'e.
   11. Diyalogu kapatmak için Ok'a tıklayın.
   12. Parametreleri doğrulamak için bir test analizi yapın. Drift düzeltmesini işaretten kaldırın.
   13. Periyotları 1 olarak ayarlayın.
   14. [Test] tuşuna tıklayın.
   15. Analizden sonra, açılır açılır diyalogda Ok'a tıklayın.
   16. Sinyal noktalarının doğru tanımlandığından emin olun. Arka plan gürültüsü yanlış seçilmemelidir. Gerçek noktalar gözden kaçırılmamalıdır.
   17. Eğer tatmin edici değilse, parametreleri düzeltene kadar ayarlamak için 6.4.9–6.4.16 adımlarını tekrarlayın.
   18. Test analizi geçtikten sonra tam analiz yapılacaktır. Drift düzeltmesini kontrol et.
       NOT: Analiz yazılımı, moleküler lokalizasyonların zaman segmentleri arasındaki korelasyonu en üst düzeye çıkaran yedekli çapraz korelasyon (RCC) algoritması kullanarak sürüklenme düzeltmesini gerçekleştirir. Hiçbir güvenilir boncuk gerekmez²³.
   19. Keep Period = 1.
   20. [Başlat] tuşuna tıklayın (veya tekrar [Test]'e tıklayın, sonra [Başlat]'a tıklayın).
   21. Analizin tamamlanmasını bekleyin. Açılır açılır diyalogda Ok'a tıklayın.
   22. Analizden sonra, .nd2 dosyasıyla aynı klasörde iki sonuç dosyası (.bin ve .txt) oluşturulur.
   23. Ortak lokalizasyon analizi için (647 nm ve 488 nm kanallar), analiz penceresinin kanal listesinde her iki kanalı aynı anda gösterin.
   24. İlgi alanı için uygun bir bölge (ROI) seçin.
   25. Pearson korelasyon katsayısını hesaplamak için kololokalizasyon modülünü kullanın. Otomatik olarak sağlanmadıysa, halka açık görüntü analiz yazılımında bir kolokalizasyon eklentisine manuel olarak nokta bulutu verisi dışa aktarın. Değeri kaydedin.
   26. İntrafibriller mineralizasyonu doğrulamak için Z-dilim analizi yapın. Ana menüde View > Z-stepping > Slice'ı seçin.
   27. 60 nm aralıklarla bireysel düzlemleri çıkarın.
   28. Mineral sinyalini gözlemleyin (yeşil, 488 nm kanal). Sinyalin merkezi dilimlerde (Z = 0 nm ±120 nm) devam edip etmediğini kontrol edin. Kalıcılık intrafibrillar mineralizasyonu doğrular.
   29. İsteğe bağlı: yoğun yayıcılardan kaynaklanan aşırı sayımı azaltmak için yoğunluk filtreleme işlemi yapılabilir. STORM yeniden oluşturulmuş görüntüyü, tek molekül lokalizasyon analizi için bir eklenti kullanarak halka açık görüntü analiz^{yazılımında açın 24}.
   30. Yoğun paketlenmiş yayıcılardan kaynaklanan aşırı sayımı azaltmak için, sinyal yoğunluğuna göre yoğunluk filtreleme (örneğin, medyan filtre veya yerel yoğunluk eşiği) uygulanır.
   31. Eğer 6.4.18. adımda kayma düzeltmesi etkinleştirilmemişse veya ek düzeltme gerekiyorsa, sapma düzeltmesi gerçekleştirin. Güvenilir işaretlerin PSF'sine göre doğru. Alternatif olarak, çapraz korelasyon algoritmaları kullanın (örneğin, aynı eklentide uygulanan drift düzeltme).
   32. Kanal çapraz konuşmasını ortadan kaldırmak için spektral karıştırma gerçekleştirin. STORM analiz penceresinde, çapraz takılma aracına tıklayın (genellikle sağ alt köşede).
   33. Yarıçapı 25.0 nm olarak ayarlayın (önerilir). Kaynak kanalı seçin. Kaldırma yöntemini seçin: İstatistiksel önerilir.
   34. Uyarılma lazeri tarafından neden olan çapraz aktivasyonu ortadan kaldırmak için, NSA > Çapraz Aktivasyon ile birlikte Çıkar seçeneğini seçin. Tamam tuşuna tıklayın. Yeni bir kanal, Nonspecific Activation-Xt, otomatik olarak oluşturulur.
   35. Otofloresans seviyeleri ve arka plan sinyalleri lekelenmemiş kontrol örnekleri kullanılarak doğrulan. Tüm sinyallerin özel olarak etiketlendiğinden emin olun.
   36. 3D görselleştirme yapın. Analiz penceresinde bir ilgi alanı (ROI) seçin.
   37. [3D] butonuna tıklayın (veya [3D Göster]). 3D projeksiyon veya hacim renderasyonu oluşturun.
   38. Görüntüleme parametrelerini ayarlamak için sağ tıklayın. Videoları ortak formatlarda (örneğin, .avi veya .mp4) dışa aktarın.
   39. Bir mineral sinyalini intrafibriller olarak sınıflandırmak için, 6.4.26–6.4.28'deki gibi Z-dilimi analizi yapın. Şiddet profillerini ihracat edin.
   40. Fibril merkezi, kolajen sinyalinin maksimumda olduğu Z-düzlemi olarak tanımlayın.
   41. Bir mineral sinyal, Z = 0 (merkez) ve Z = ±60 nm olduğunda o fibrildeki maksimum mineral yoğunluğunun %≥50'si olduğunda intrafibriller olarak kabul edilir. Sinyal Z = 0 olduğunda %30'un altına düşerse, ekstrafibriller olarak sınıflandırılır.
   42. Her koşul başına en az 50 fibril için sınıflandırmayı kaydederek intrafibrillar mineralizasyonun yüzdesini hesaplayın.
       NOT: Yoğunluk filtreleme, kayma düzeltme ve spektral karışıklama için alternatif halka açık eklentiler de mevcuttur.

Results

Bu protokolün başarılı uygulanması, çok renkli 3D-STORM kullanılarak mineralize kolajen fibrillerinin yüksek çözünürlüklü üç boyutlu görselleştirmesini sağlar. Aşağıdaki sonuçlar tipik sonuçları, kalite kontrollerini ve nicel değerlendirmeleri göstermektedir.

Şekil 1 , amorf kalsiyum fosfat (ACP) ile mineralize edilmiş bir kolajen ağının çok renkli 3D-STORM rekonstrüksiyonunu göstermektedir. Kolajen (uzak kırmızı floresan boya ile etiketlenmiş) iyi tanımlanmış bir fibriller ağ olarak görülür. Kondroitin sülfat (GAG, kırmızı boya ile etiketlenmiş) kollajen fibrilleriyle yakından ilişkilidir ve birleşen görüntüde kolokalizasyon bölgeleri siyanik görünür. Önemli olarak, ACP parçacıkları (yeşil, kalsiyum gösterge boyasıyla etiketlenmiş) kolajen fibrillerinin sınırları içinde gözlemlenir ve erken aşamada (30 dakika) intrafibriller mineralizasyon görülür. Bu şekil, protokolün nano ölçekte üç farklı bileşeni (kollajen, GAG, mineral) aynı anda çözebilme yeteneğini vurgulamaktadır; bu başarı geleneksel konfokal mikroskopiyle elde edilemezdir (görüntüleme çözünürlüğü karşılaştırması için Şekil 5'e bakınız). ACP'nin fibriller içindeki nano ölçekli kolokalizasyonu, amorf öncülün kristal dönüşümden önce fibriller iç mekana sızabileceğini doğrular.

Şekil 2, 6 saatlik mineralizasyon sonrası olgun hidroksiapatitin (HAP) intrafibriller penetrasyonuna dair nicel kanıt sunmaktadır. Şekil 2A , kollajen (kırmızı) ve HAP (yeşil) arasında yoğun kolokalizasyonu gösteren 2D STORM görüntülerini sunar; birleşmiş kanallar sarı görünür. Şekil 2B , entegre mimariyi gösteren 3D hacim rekonstrüksiyonudur. Şekil 2C , Z eksenli kesim analizini üstten (Z = −120 nm) merkeze (Z = 0) ve daha derin kesitlere (Z = +120 nm) 60 nm aralıklarla göstermektedir. HAP sinyali, merkezi dilimlerde (Z = 0 ile ±120 nm) ≥%50 yoğunlukta devam eder ve bu yoğunluk, Protokol adımları 6.4.39–6.4.41'de tanımlanan intrafibrillar mineralizasyon için sınıflandırma kriterlerini karşılar. Üç bağımsız deneyden (n = 3 tekrar, her biri 5 ilgi alanı olan) nicel kolokalizasyon analizi, Pearson korelasyon katsayısı 0.89 ± 0.04 ve Manders örtüşme katsayısı 0.91 ± 0.03 (ortalama ± SD) vermiştir. Bu değerler, fibriller içindeki kolajen ile HAP arasında güçlü ve spesifik bir ilişki göstererek, olgun kristalin fazın da intrafibrillar olarak bulunduğunu doğrular.

Şekil 3 , kendiliğinden monte edilen kolajen iskelesinin yapısal bütünlüğünü geçirimli elektron mikroskopisi kullanılarak doğrulamaktadır. %1 fosfotungstik asit (pH 7.0) ile boyanmış kolajen fibriller, yerli benzeri fibrillogenezin tanısını gösteren karakteristik 67 nm D-periyodik çapraz bantlama desenini gösterir. Bu kalite kontrol adımı, mineralizasyon deneylerine geçmeden önce gereklidir; çünkü iskelenin yapısal olarak sağlam olduğunu ve intrafibrillar mineral birikimini destekleyebildiğini doğrular. Bu bantlama deseni olmadan, kolajen denatüre olabilir veya yanlış birleştirilebilir, bu da yapay mineralizasyon desenlerine yol açar.

Şekil 4, mineralizasyon koşulları doğru şekilde kontrol edilmediğinde (örneğin, poliaspartik asit veya pH 7.6 > yokluğu) elde edilen temsil edici bir negatif sonucu göstermektedir. Bu optimal olmayan koşullarda, HAP birikintileri (yeşil) yalnızca kolajen fibrillerinin (kırmızı) dışındaki cam substrat üzerinde gözlemlenir ve intrafibriller invazion yoktur. Bu sonuç önemli bir kontrol işlevi görür: Şekil 1 ve 2'de gözlemlenen intrafibriller mineralizasyonun özgül olmayan çökelmeden veya eksik yıkamadan kaynaklanmadığını, bunun yerine kimyasal ortamın hassas kontrolünü gerektirdiğini (pH 7.4 ± 0.1, poliaspartik asit varlığı ve hemen taze mineralizasyon ortamının kullanımı) gerektirdiğini gösterir. Araştırmacılar, kendi sistemlerini doğrulamak için bu olumsuz kontrolleri dahil etmelidir.

Şekil 5, STORM alınmadan önce alınan temsil konfokal mikroskopik görüntüleri ön örnek taraması için göstermektedir. Kolajen kanalı (Şekil 5A) net bir fibrillar ağ gösterirken, HAP kanalı (Şekil 5B) fibrillerle ilişkili minerali gösterir. Birleştirilmiş görüntü (Şekil 5C), kırılma sınırlı seviyede (~200 nm) kolokalizasyonu doğrular. Bu görüntüler iki amaca hizmet eder: (1) örnek kalitesini (yeterli etiketleme, minimum toplama ve spesifik mineral ilişkisi) doğrulamaktan önce zaman alan STORM görüntülemesine geçmeden; ve (2) 3D-STORM edinimi için ilgi alanlarının seçimini yönlendirirler. Önemli olarak, konfokal görüntüler intrafibrillar ile ekstrafibrillar mineralizasyonu ayırt edecek çözünürlüğe sahip değildir. Mineral sinyalinin fibriller boyunca sürekli göründüğünü, içinde mi yoksa dışarıda mı olduğunu göstermeden belirttiğini unutmayın. Bu sınırlama, burada tanımlanan süper çözünürlüklü yaklaşımın gerekliliğini vurgular.

Şekil 6 iki kontrol deneyi sunmaktadır. Şekil 6A (birincil antikor kontrolü yok) yalnızca ikincil antikor uygulandığında spesifik bir sinyal göstermemektedir; bu da etiketlenmiş örneklerdeki gözlem sinyallerinin özgün olmayan ikincil antikor bağlanmasından kaynaklanmadığını doğrular. Şekil 6B (lekelenmemiş kontrol) floresans sinyali göstermez (tamamen siyah), örnek veya substrattan önemli otofloresans dışlanmaktadır. Bu kontroller, immünoflüoresans etiketlemesinin özgüllüğünü doğrulamak için gereklidir. Bu kontrollerdeki herhangi bir tespit edilebilir sinyal, engelleme veya yıkama adımlarının ayarlanması gerektiğini gösterir.

Optimize edilmiş görüntüleme koşullarımızda, 3D-STORM sistemi tipik lokalizasyon hassasiyetini 20–30 nm yan taraf ve 50–60 nm eksenli olarak sağladı; bu, orijinal 3D-STORM^{literatürüyle uyumlu oldu 25}. Sürüklenme düzeltmesi, dahili yedekli çapraz korelasyon (RCC) algoritması kullanılarak yapılan sapma düzeltmesi sırasında gerçekleştirilmiştir; bu algoritma dışsal fiducial belirteçlere olan ihtiyacı^{ortadan kaldırır 23}. Faz ataması için, belirlenen olgunlaşma kinetiklerine dayanarak ACP 30 dakika mineralizasyonda, HAP ise 6 saat içinde atandı. Bu iki fazın zamansal olarak ayırt edilebilme yeteneği ve nanoölçekli lokalizasyon ile birleşmesi, araştırmacıların intrafibrillar mineral dönüşümünün dinamiklerini incelemesini sağlar.

Özetle, temsil eden sonuçlar bu protokolün rekombinant kolajen modelinde intrafibrillar ve ekstrafibrillar mineralizasyon arasında nano ölçekli ayrım sağladığını, nicel kolokalizasyon metrikleri ve uygun negatif kontrollerle mümkün kıldığını göstermektedir. Bu yöntem, biyomineralizasyon mekanizmaları, biyomimetik malzemeler ve kemik dokusu mühendisliği üzerine çalışan araştırmacılar için özellikle değerlidir.

Ek Tablo 1 , mineralizasyon ve STORM görüntüleme işlemlerinde karşılaşılan yaygın sorunları, olası nedenleri ve önerilen çözümleri özetlemektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 1: Mineralize kolajen fibrillerinin çok renkli 3D-STORM rekonstrüksiyonu. Kolajen (kırmızı, uzak kırmızı floresan boya) ve kondroitin sülfat (GAG, mavi, kırmızı floresan boya) aynı anda görüntülenir. Kolajen ve GAG'nin kolokalizasyonu, birleşen kanalda magenta olarak görünür ve üç örtüşme noktasının olduğu bölgeler beyaz görünür. Amorf kalsiyum fosfat (ACP, yeşil, kalsiyum gösterge boyası) da gösterilmiştir. ACP, kolajen fibrillerinin sınırları içinde gözlemlenir ve bu da intrafibriller lokalizasyonu gösterir. Ölçek çubuğu: 1 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İntrafibriller hidroksiapatit (HAP) mineralizasyonunun 3D-STORM görüntülemesi. (A) Kolajen (kırmızı, uzak kırmızı floresan boya), HAP (yeşil, kalsiyum göstergesi boyası) ve birleşmiş kanalın 2D STORM görüntüleri. (B) 3D hacim yeniden yapılandırması. (C) 60 nm aralıklarla Z eksenli dilim analizi (Z = −120, −60, 0, +60, +120 nm). Merkezi dilimlerdeki kalıcı HAP sinyali (Z = 0 ile ±120 nm) intrafibrillar mineralizasyon sınıflandırma kriterlerini (yoğunluk ≥maksimumun %50'si) karşılar. Bu şekilden hesaplanan nicel kololokalizasyon: Pearson'ın r = 0.89 ± 0.04, Mander'in örtüşmesi = 0.91 ± 0.03. Ölçek çubukları: 0.1 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kendi kendine oluşan kolajen fibrillerinin geçirimli elektron mikroskopisi (TEM) doğrulaması. Kolajen fibrilleri %1 fosfotungstik asit (pH 7.0) ile boyanmıştır. Tanısal 67 nm D-periyodik çapraz bant deseni başarılı fibrillogenezi ve yapısal bütünlüğü doğrular. Ölçek çubuğu: 200 nm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Temsil eden olumsuz sonuç: ekstrafibrillar mineralizasyon. Kolajen (kırmızı, uzak kırmızı floresan boya) ve HAP (yeşil, kalsiyum göstergesi boya). HAP, yalnızca kollajen fibrillerinin dışındaki cam substrata birikir ve intrafibrillar bir invazion yaşamaz. Bu optimal olmayan sonuç, olası sonuçların aralığını göstermek için negatif kontrol olarak dahil edilmiştir. Ölçek çubuğu: 0.1 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Ön tarama için kullanılan temsilci konfokal görüntüler. (A) Kolajen (kırmızı, uzak kırmızı floresan boya) kanalı net bir fibriller ağ gösterir. (B) HAP (yeşil, kalsiyum gösterge boyası) kanalı mineral ilişkisini gösterir. (C) Birleştirilen görüntü, kolajen ve HAP'ın kolokalizasyonunu gösterir. Ölçek çubuğu = 2 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Kontrol deneyleri. (A) Birincil antikor kontrolü: yalnızca ikincil antikor uygulanır; Özel bir sinyal yok. (B) Lekesiz kontrol: florofor veya antikor uygulanmaz; floresans sinyali yok (tamamen siyah). Ölçek çubuğu = 1 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Sorun giderme rehberi. Mineralizasyon ve 3D-STORM edinimi/analizi sırasında karşılaşılan yaygın sorunlar, olası nedenleri ve önerilen çözümler. Detaylı adım numaraları için metne bakınız. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu protokol, çok renkli 3D-STORM kullanılarak nano ölçekli kollajen mineralizasyonunun görselleştirilmesi için kapsamlı bir iş akışı sağlar. Başarılı sonuçlar için birkaç kritik adım özel dikkat gerektirir.

İlk olarak, örnek hazırlamak yüksek kaliteli STORM görüntülemesi için temeldir. Cam tabanlı kapların amino-silanizasyonu, sonraki yıkama ve etiketleme aşamalarında kolajen fibrillerinin stabil şekilde tutulmasını sağlamak için titiz olmalıdır. Kalıntı APTES, spesifik olmayan bağlanmaya ve yüksek arka plana neden olabilirken, eksik silanizasyon fibril ayrılmaya yol açabilir. Önerilen ultrasonikasyon adımı (40 kHz'de 10 dakika), yüzeyin işlevselleştirilmesini korurken bağlanmamış silan etkili bir şekilde ortadan kaldırılır. Kolajen liflerinin çapraz bağlanması için, yüksek spesifiklik için EDC/^{NHS 21} önerilir. Alternatif olarak, %0,1 glutaraldehit kullanılabilir (oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka, sonra iyice yıkayabilir), ancak bu daha az spesifiktir. En önemlisi, mineralizasyona geçmeden önce TEM ile doğru fibril oluşumunun doğrulanmasını öneririz. Şekil 3'te gösterildiği gibi, karakteristik 67 nm D-periyodik bantlama deseninin varlığı, kendi kendine montaj sürecinin yapısal olarak bozulmamış, yerli benzeri kolajen^{fibrilleri 26} ürettiğini doğrular. Bu kalite kontrol adımı, kötü oluşmuş veya denatüre olmuş kolajen iskelelerinden kaynaklanan sonuçların yanlış yorumlanmasını önler.

İkinci olarak, mineralizasyon ortamı hassas pH kontrolüyle (7.4 ± 0.1) hazırlanmalı ve hemen kullanılmalıdır. Amorf kalsiyum fosfat (ACP) öncüsü, pH ve iyon gücüne karşı son derece hassastır; küçük sapmalar erken kristalleşmeye neden olabilir. Bu nedenle, mineralizasyon ortamı hazırlandıktan hemen sonra kullanılmalıdır. Birden fazla zaman noktası arasında karşılaştırma gerektiren çalışmalar için, her deney için depolanmış çözelti yerine taze ortam hazırlayın. Mineralizasyon koşulları doğru şekilde kontrol edilmediğinde (örneğin, yetersiz poliaspartik asit veya yanlış pH), Şekil 4'te gösterildiği gibi ekstrafibriller mineralizasyon baskındır. Bu negatif kontrolde, HAP yalnızca kollajen fibrillerinin dışındaki cam substrata birikir ve intrafibrillar bir invazion olmaz. Bu olumsuz sonuçların dahil edilmesi, Şekil 1 ve Şekil 2'de gözlemlenen intrafibrillar sinyalin aslında kontrollü intrafibrillar mineralizasyondan kaynaklandığını doğrulamak için gereklidir; spesifik olmayan çökelme veya eksik yıkamadan değil. Ayrıca, önceki çalışmalar, intrafibrilları ekstrafibriller mineralizasyondan ayırmanın yerel kimyasal ortamın ve poliaspartik^{asit 27} gibi stabilizator katkı maddelerinin dikkatli kontrol edilmesini gerektirdiğini vurgulamıştır.

Üçüncü olarak, immünofluoresans etiketleme dikkatli bir optimizasyon gerektirir. Sağlanan antikor konsantrasyonu (1:100) tanımlanan kolajen ve kondroitin sülfat sistemi için iyi çalışır, ancak farklı antikorlar veya örnek tipleri için titrasyon gerektirebilir. Otofloresansı ve spesifik olmayan bağlanmayı değerlendirmek için her zaman birincil antikor içermeyen kontroller ekleyin. İkincil antikor aşamasından itibaren, florofor foto ağartmayı önlemek için sıkı ışık koruması gereklidir.

Dördüncüsü, STORM görüntüleme tamponu taze hazırlanıp 30 dakika içinde kullanılmalıdır. Oksijen toplama sistemi (glikoz oksidaz/katalaz) zamanla aktivite kaybeder ve sisteamin hem ışığa hem de oksijene duyarlıdır. Enzim stoklarının önceden alikot edilmesi ve -80 °C'de saklanması, deneyler arasında tutarlı performans sağlar. Yanıp sönme yoğunluğu gerçek zamanlı olarak izlenmeli ve 405 nm lazer gücü modüle edilerek ayarlanmalıdır; Çok az molekül alma süresini uzatırken, çok fazla molekül PSF'lerin örtüşmesine ve lokalizasyon hassasiyetinin azalmasına neden olur. STORM görüntüleme parametrelerinin ayrıntılı optimizasyonu için, okuyucuları yerleşik test örnekleme^{protokollerine yönlendiriyoruz 15}.

Beşincisi, veri işleme için örnekler arasında anlamlı karşılaştırmalar için standart parametreler gereklidir. Minimum foton sayısı eşiği (genellikle 500-1000 foton) düşük güvenli lokalizasyonları hariç tutar. Örnek sinyalleri zayıfsa, uygun şekilde 300 fotona indirgenebilir, ancak 200 fotonun altına düşmesi önerilmez. Sürüklenme düzeltmesi, fiducial belirteçler veya çapraz korelasyon algoritmaları kullanılarak çözünürlüğü korumak için gereklidir, özellikle 3B^{rekonstrüksiyonlar için 28}. Spektral karıştırma, kanallar arasındaki çapraz iletişimi ortadan kaldırmaya yardımcı olur ve bu, doğru kololokalizasyon analizi için kritik öneme sahiptir. Yaygın sorunların giderilmesi Ek Tablo 1'de özetlenmiştir.

Protokolün birkaç sınırlaması vardır. Biyomimetik in vitro modeller için optimize edilmiştir; Yerli, yüksek mineralize dokulara (örneğin, olgun kemik) uygulanmak, kalsifikasyon veya daha agresif antijen toplama gibi ek adımlar gerektirebilir; bu da ultrayapıyı etkileyebilir. Belirli antikorlara bağımlılık, özellikle yoğun yığılmış yapılarda etiketleme yoğunluğu sorunları veya sterik engel yaratabilir. Bu teknik, ekipman açısından yoğun olup, uygun lazer çizgilerine sahip üst düzey bir STORM mikroskobuna ve EMCCD kameraya erişim gerektirir. Ayrıca, örnek hazırlığından veri analizine kadar olan toplam zaman (~53 saat) bazı uygulamalarda veri verimliliğini sınırlayabilir.

Bu sınırlamalara rağmen, bu protokol alternatif yöntemlere göre önemli avantajlar sunar. Elektron mikroskopisiyle karşılaştırıldığında, immünoflüoresans etiketleme yoluyla moleküler özbaşdaklık sağlar ve birden fazla organik ve inorganik bileşenin eşzamanlı görselleştirilmesini sağlar. Konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, ~10 kat daha yüksek mekansal çözünürlük elde eder ve intrafibrillar ve ekstrafibrillar mineralizasyon desenleri arasında ayrım yapılmasını sağlar. 3B yeteneği, kollajen matrisi içindeki mineral dağılımını anlamak için gerekli hacimsel bilgileri sağlar.

Yöntem, biyomineralizasyon araştırmalarında geniş bir uygulama alanına sahiptir. Potansiyel uygulamalar arasında, mineral çekirdeklemede kollajen olmayan proteinlerin rolünün incelenmesi, kemik yenilenmesi için biyomimetik materyallerin değerlendirilmesi, osteoporoz ve diş çürüğü gibi hastalıklarda patolojik mineralizasyonun araştırılması ve terapötik müdahalelerin mineral dağılımı üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi yer almaktadır. Uygun değişikliklerle, protokol dokularda veya biyomalzemelerde diğer organik-inorganik arayüzleri incelemek için uyarlanabilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poliaspartik asit (p-Asp)	Sigma-Aldrich	P9903	Amorf kalsiyum fosfat için stabilizatör
Kalsiyum klorür (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Kalsiyum kaynağı
Sodyum fosfat dibazı (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S0876	Fosfat kaynağı
Sodyum klorür (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	İyonik dayanıklılık ayarlayıcı
Poliakrilik asit (PAA)	Sigma-Aldrich	323667	Yüksek konsantrasyonlu kalsiyum için stabilizatör
Tris tabanı	Sigma-Aldrich	T1503	Tampon bileşeni
Sodyum azidi (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002	Antimikrobiyal ajan
(3-Aminopropil)trietoksisilan (APTES)	Sigma-Aldrich	440140	Cam yüzeyi işlevselleştirme ajanı
Mutlak etanol	Sigma-Aldrich	459836	Çözücü
Tip I kolajen çözeltisi (50 μ g/mL 0.1 M asetik asit)	Corning	354249	Kendi kendine montaj iskelesi
Kondroitin sülfat (CS)	Sigma-Aldrich	C9819	Kollajen olmayan protein takliti
EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid)	Sigma-Aldrich	E7750	Çapraz bağlayıcı
NHS (N-hidroksisükinimid)	Sigma-Aldrich	130672	Çapraz bağlayıcı aktivatörü
MES serbest asit	Sigma-Aldrich	M5287	Çapraz bağlama için tampon
Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS)	Gibco	10010023	Yıkama ve seyreltme tamponu
Sığır serum albümini (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Engelleme maddesi
Tavşan anti-kollajen-I antijüsü	Abcam	AB34710	Kolajen için birincil antikor
Fare anti-kondroitin sülfat antikoru	Sigma-Aldrich	C8035	CS için birincil antikor
Keçi anti-tavşan IgG, uzak kırmızı floresan boyaya konjuge edilmiş (Alexa Fluor 647)	Thermo Fisher Scientific	A-21244	Kolajen için ikincil antikor
Keçi anti-fare IgM, kırmızı floresan boyaya konjuge edilmiş (Alexa Fluor 568)	Thermo Fisher Scientific	A-11031	CS için ikincil antikor
Kalsein (kalsiyum göstergesi boyası)	Sigma-Aldrich	C0875	Kalsiyum fosfat etiketi
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	Yıkama tamponu için deterjan
Gliserol	Sigma-Aldrich	G5516	Görüntüleme tamponu bileşeni
Glikoz oksidaz (GOx)	Sigma-Aldrich	G7141	Oksijen toplayıcısı
Katalaz	Sigma-Aldrich	C1345	Oksijen toplayıcısı
Sisteamin (MEA)	Sigma-Aldrich	M6500	Flüofor yanıp sönmesi için Thiol
D-Glukoz	Sigma-Aldrich	G6152	Glikoz oksidaz için substrat
Sodyum asetat	Sigma-Aldrich	S2889	GOx stok için tampon
Hidroklorik asit (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	pH ayarlaması
Sodyum hidroksit (NaOH)	Sigma-Aldrich	71690	pH ayarlaması
Fosfortungstik asit	Sigma-Aldrich	P4006	TEM için negatif leke
Cam tabanlı kültür tabakları (35 mm, #1.5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	Örnek alt; kalınlık 0,17 mm
Ultrasonik temizleyici (40 kHz)	Branson	B200	Temizleme cihazı
Nem odası	Thermo Fisher Scientific	11-432-10	Kollajen kendi kendine montaj için
Geçirim elektron mikroskobu	Hitachi	HT7800	TEM görüntüleme
Formvar/karbon kaplamalı TEM ızgaralar (200 ağ)	Sigma-Aldrich	FCF200-Cu	TEM örnek desteği
Yatay sallayıcı platformu	Labnet	S2030-RC	Nazik yıkama
Konfokal lazer tarama mikroskobu	Nikon	A1	Ön tarama
3D-STORM mikroskop sistemi (405/488/647 nm lazerler, silindirik lens, EMCCD ile)	Nikon	N-FIRTINA	Süper çözünürlüklü görüntüleme
100 kez; yağ daldırma hedefi (NA 1.49)	Nikon	MRD01991	Yüksek çözünürlüklü görüntüleme
pH ölçer	Mettler Toledo	FiveGo F2	pH kontrolü
STORM edinim ve analiz yazılımı	Nikon	NIS-Elements (STORM modülü)	STORM veri toplama ve işleme
.nd2 dosya formatı (ham mikroskopik görüntü dosyası)	Nikon	Yok	Nikon mikroskopları tarafından üretilen ham görüntü dosya formatı.
Kamuya açık görüntü analiz yazılımı	Açık kaynak	Yok	örneğin, tek molekül lokalizasyon analizi (kolokalizasyon, sürüklenme düzeltmesi) için ThunderSTORM eklentisiyle ImageJ.
Parafilm	Bemis	PM996	Kuluçka sırasında örnek örtü
Alüminyum folyo	Herhangi bir laboratuvar tedarikçisi	Yok	Işık koruması için (örneğin, ambalaj örnekleri)
Amber mikrosantrifüj tüpleri	Fisher Scientific	05-669-21	Fluoroforların ışık koruması için
Kapak Slipleri (No. 1.5)	Corning	2855-18	Örnek montaj