Yöntem makalesi

FFPE fare örneklerinde gelişen kraniofasiyal dokuların yerinde hibridizasyonu

DOI:

10.3791/71475

⸱

8 Mayıs 2026

 ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School, 3Shriners Hospital for Children, 4Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel in situ hibridizasyon, karmaşık mimari, yüksek arka plan, sınırlı prob özgüllüğü ve hassasiyet nedeniyle kraniofasiyal dokularda mRNA'yı görselleştirmekte zorlanır. Bu protokol, FFPE fare embriyonik kraniofasiyal dokularında birden fazla mRNA hedefinin hassas ve spesifik tespiti için çoklu floresan RNA in situ hibridizasyon yöntemini tanımlar; önceki sınırlamaları aşmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kraniofasiyal gelişim, karmaşık doku mimarilerinde etkileşime giren çeşitli ve uzmanlaşmış hücre popülasyonlarının koordineli aktivitesine dayanır; bu hücreler karmaşık doku yapısını ve işlevini oluşturur ve sürdürür. Bu hücrelerin birbirleriyle ve yerel mikroçevreleriyle nasıl iletişim kurduğunu anlamak, oluşumlarını ve homeostazlarını düzenleyen moleküler mekanizmaları tanımlamak için gereklidir. Bu süreçlerin bozulması, diş agenezi, yarık damak ve dudak yarığı gibi doğuştan gelen kraniofasiyal hastalıklara yol açabilir; bu durum tek başına veya sendromik bozuklukların bir parçası olarak gerçekleşebilir. RT-PCR gibi nicel teknikler yüksek hassasiyet ve dinamik aralık sunarken, homojenleşmiş dokudan RNA çıkarımı gerektirir; bu da mekansal ve hücresel bağlamın kaybına yol açar; bu durum özellikle heterojen kraniofasiyal dokular için kritik bir sınırlamadır; çünkü transkripsiyonların hücresel kökeni çözülemez. Çoklu floresan RNA in situ hibridizasyon, doku mimarisini korurken birden fazla mRNA transkriptinin hassas ve özgün tespitini sağlayarak bu sınırlamayı aşmaktadır. Bu gelişmiş yaklaşım, hücresel düzeyde gen ifadesinin hassas lokalizasyonuna olanak tanır ve kraniofasiyal biyolojide gelişim süreçlerinin ve hastalık mekanizmalarının mekansal düzenlemesi hakkında değerli bilgiler sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), yüksek hassasiyeti ve geniş dinamik aralığı nedeniyle gen ifade analizinde altın standarttır; ancak homojenleşmiş dokulardan RNA çıkarılmasını gerektirir ve bu da mekânsal ve hücresel bağlamınkaybına yol açar 1. Bu sınırlama, embriyonik gelişim sırasında kraniofasiyal dokular gibi heterojen dokular için özellikle sorunludur; çünkü tespit edilen transkriptlerin hücresel kaynağı çözülemez. 1968'de Joseph Gall ve Mary Lou Pardue tarafından öncülük edilen RNA in situ hibritizasyonu (ISH), bu sınırlamayı aşar; mRNA ekspresyonunun sağlam dokumimarisi içinde lokalizasyonunu mümkün kılar 2. Buna rağmen, geleneksel RNA ISH teknik olarak zorludur ve RNA bütünlüğünü korumak için optimal doku fiksasyonu ve örnek hazırlanmasına büyük ölçüde bağlıdır3. Bu zorluklar, yüksek kalsifikasyona sahip dokularda daha da kötüleşiyor; bu dokular, genellikle sert kimyasallar veya uzun süreli işlem gerektiren dekalsifikasyon prosedürleri gerektiriyor ve bu da RNA bozulmasına yol açıyor. Sonuç olarak, karmaşık hücre tipleri karışımlarından oluşan kraniofasiyal dokularda RNA ISH, dikkatli optimizasyon ve teknik uzmanlık gerektirir, zaman alıcıdır ve optimal olmayan boyalanma riski taşır. mRNA ifadesini görselleştirmenin zorluğu, son derece karmaşık yapı ve bileşime sahip diş dokularında daha da belirgindir. Dişler, mine, dentin, çimento ve çevresindeki kemik gibi mineralize bileşenlerin yanı sıra pulp ve periodontal bağ gibi yumuşak dokulardan oluşur. Bu dokular, diş gelişiminde kritik roller oynayan çeşitli hücre tipleriyle doludur4. Bu özellikler, güvenilir sinyal algılanması için dikkatli bir standartlaştırma gerektirir. Sonuç olarak, tarif edilen protokol, diş oluşumunun gelişimsel ve doğum sonrası evrelerinde gen ifadesinin araştırılması için özellikle uygundur.

Mekânsal RNA tespiti için çoklu floresans in situ hibridizasyon (FISH) tabanlı teknikler mevcuttur; bunlar arasında prob tabanlı amplifikasyonlu RNAFISH 5,6,7,8,9, hibritleşme zincir reaksiyonu FISH6, tek moleküllü RNA FISH10, değişim reaksiyonu FISH 5 ile sinyal güçlendirme ve MERFISH11 ile seqFISH12 gibi yüksek çoklanmış FISH platformları yer alır.13. Bunlar arasında, çift Z-prob tasarımından elde edilen tek bir RNA molekülünü tespit etmede yüksek hassasiyeti nedeniyle çoklu floresan RNA ISH 7,8,9, yaygın olarak kullanılır; burada iki bitişik prob sinyal yükseltmesini başlatmak için hedef diziye hibritleşmek zorundadır. Bu çift tanıma tasarımı, özgüllüğü büyük ölçüde artırır ve hedef dışı sinyali azaltır. Yöntem, 2–4 hedefin çoklu algılanmasını destekler (benzer tekniklerle 12 veya daha fazla hedefe kadar genişletilebilir), doku morfolojisini korur ve formalin sabitli parafin-gömülü (FFPE)7,8,9, taze dondurulmuş ve seçilmiş kalsifikasyon dokularla uyumludur; bu da kraniofasiyal ve diş gelişiminde karşılaşılan karmaşık örnekler için uygundur. Yöntem standartlaştırılmış, tekrarlanabilir, iyi kurulmuş prob kütüphaneleri tarafından desteklenmiş ve geniş çapta doğrulanmıştır; böylece çeşitli laboratuvarlarda erişilebilir ve güvenilir sonuçlar sağlanmıştır.

Çoklu floresan RNA ISH, aynı transkriptin farklı bölgelerini hedefleyen birden fazla probu ve gelişmiş sinyal güçlendirmeyi kullanarak düşük bolluklu veya kısmen bozunmuş mRNA'lar için bile yüksek hassasiyetli ve spesifik tespit sağlar14,15. Çoklu floresan RNA ISH, dekalsifiye kemik örneklerine başarıylauygulanmış olsa da 16 ve karmaşık kraniofasiyal dokularda kullanımı daha öncebildirilmiştir 7,8,9; Ancak, bu bağlamda uygulanmasını tanımlayan ayrıntılı adım adım protokol henüz bildirilmemiştir.

Kraniofasiyal yapılar, osteoblastlar, osteoklastlar, osteositler, ameloblastlar, odontoblastlar, fibroblastlar, kök hücreler, bağışıklık hücreleri, damar yapısı ve duyusal nöronlar gibi çeşitli hücre tiplerine sahip karmaşık doku mimarilerinden oluşur; bu hücrelerin mekansal olarak koordine edilen etkileşimleri doku oluşumu, işlevi, yenilenme ve bağışıklık koruması için gereklidir4. Bu nedenle, bu dokularda lokal gen ifadelerini incelemek kritik öneme sahiptir ve çoklu floresan RNA ISH, bu tür analizler için önde gelen bir yaklaşımdır.

Bu çalışmada, RNAscope probları ve teknolojisine dayalı çoklu floresan RNA ISH'nin karmaşık kraniofasiyal dokuların incelenmesinde nasıl uygulanabileceğini açıkladık (Şekil 1). Ayrıca, RNA bütünlüğünü koruyan ve yüksek kaliteli, mekansal olarak çözülmüş gen ekspresyonu analizini mümkün kılan optimize edilmiş bir FFPE kesitleme iş akışı oluşturduk.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından Hayvan Çalışması Protokolü #24-031 kapsamında onaylanmıştır.

1. Zamanlanmış çiftleşme ve embriyo dokusu toplama

  1. Zamanlı çiftleşmeler kurun.
    1. Sağlıklı, verimli bir erkek ve dişi Mus musculus öğleden sonra eşleştirin. Ertesi sabah, vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edin. Bir tıkaç gözlemlendiği günü embriyonik gün (E) 0.5 olarak belirtin.
  2. Hamile dişiyi ötenazi yapın.
    1. İstenen gelişim aşamasında, hamile dişi fareyi CO₂ inhalasyonu ve ardından servikal dislokasyon ile ötanazi, kurumsal hayvan bakım yönergelerine uygun olarak gerçekleştirin.
    2. Fareyi sırtüstü, steril emici bir yüzeye yerleştirin. Karın bölgesini, planlanan kesi bölgesi boyunca %70 etanol ile dezenfekte edin.
  3. Rahim boynuzlarını açığa çıkarıp izole edin.
    1. Steril cerrahi makasla orta karın kesisi yapın, ardından mikrocerrahi makasla periton duvarını açarak rahim boynuzlarını açığa çıkarın.
    2. Rahim zincirini nazikçe dışa çıkarmak için küt forseps kullanın. Rahim dokusunu miyometrium boyunca serbest bırakın ve embriyoları izole etmek için yumurta teli ile orta rahim boynuzu tutumunu kesin.
  4. Bütün embriyoları transfer edin.
    1. Embriyoları içeren rahim zincirini, buz gibi soğuk, steril 1× PBS (pH 7.4) içeren 10 cm Petri kabına hemen aktarın.
  5. Bireysel embriyoları dissekse edin.
    1. Her embriyoyu çevresindeki uterinik, amniyotik ve koryonik zarlardan dikkatlice ayırın.
    2. Temizlenmiş embriyoları, buz gibi soğuk, steril PBS içeren taze 10 cm'lik bir kaba aktarın.
  6. Fare embriyonik başlarını disseksiye.
    1. Steril bir cerrahi bıçak kullanarak, başlıkları disekiye edin ve daha fazla işlemden önce buz gibi PBS'de bir kez durulayın.
      NOT: Hayvan protokolüne uygun olarak istenen gelişim aşamasında yeni doğan fareleri toplayıp disseksiye.

2. Doku fiksasyonu ve işlenmesi

  1. Mendiliyi düzeltin.
    1. Diseksiyon edilen dokuyu hemen %10 nötr tamponlu formaline batırın ve oda sıcaklığında bir shaker'da gece boyunca sabitleyin.
      NOT: RNA'nın doğru korunması, yerinde hibritleşme analizlerinin başarısı için kritik öneme sahiptir. Birçok çalışma, standart yaklaşımın—doku örneklerinin %10 nötr tamponlu formalinde sabitlenmesin, dokunun özel boyutu ve yaşına bağlı olarak 6 ila 48 saat arasında değişen sürelerde—RNAkoruma için güvenilir sonuçlar verdiğini göstermiştir. Daha erken embriyonik evrelerde (E12.5 ve altında), fiksasyonun nüfuzu hızlıdır ve aşırı fiksasyonu önlemek için fiksasyon süresi buna göre kısaltılmalıdır. Embriyonik gün 17.5'ten (E17.5) itibaren ve doğum sonrası örneklerde, fiksasyonun nüfuzu başta deri bulunması nedeniyle daha az verimli olabilir; bu deri fiziksel bir engel görevi görür. Bu nedenle, fiksasyon çözeltinin etkili bir şekilde nüfuz etmesini sağlamak için deri tüm baştan çıkarılmalıdır. Kireçsizleştirme, %0,5 metanolsüz formaldehit içeren 0,5 M EDTA (pH 8,0) ile 4 °C7'de yapılabilir. Kireçsizasyon süresi hızlı bir mikroBT taramasıyla izlenebilir ve mineralizasyon derecesine ve spesifik doku tipine bağlı olarak ayarlanabilir; E18.5 embriyoları için genellikle 24–48 saat yeterlidir.
  2. Dokuyu durulayın ve işleyin.
    1. Fiksantörü çıkarın ve örnekleri PBS'de durulayın. Doku %70 etanole aktarın ve daha fazla işlemeye (1–4 hafta) kadar 4 °C'de saklanın20. Üreticinin talimatlarına göre otomatik doku işlemcisi kullanarak doku dehidrasyonu, temizleme ve parafin infiltrasyonu gerçekleştirin.
      NOT: Tipik doku işleme protokolü şöyledir: 30 dakika %70 etanol, ardından 30 dakika (2 kez) %95 etanol ve 30 dakika (3 kez) %100 etanol; 1 saat (3 kez) ksilen içinde temizlendi ve ardından parafin mumu ile 60 °C'de 1 saat (3 kez) infiltrasyon yapıldıktan sonra parafin doku bloklarına gömüldü.
  3. Dokuyu göm.
    1. Başları parafine gömüp örnekleri deneysel gereksinimlere bağlı olarak koronal veya sagital düzlemde yönlendirin.
    2. Gömülü blokları parafin blok soğuk plakasına aktararak mumun yaklaşık 30 dakika sertleşmesini sağlar; blok boyutuna göre zamanlama gerekirse ayarlanır.
  4. FFPE bloklarını sakla.
    1. Parafinin tamamen katılaşmasına izin verin. Kalıplardan blokları çıkarın, etiketli hava geçirmez kaplara veya zip-lock torbalara koyun ve 4 °C'de kesimlenmeye hazır olana kadar saklayın.
      NOT: İyi korunmuş RNA ile FFPE blokları, kesitlenmeden önce doku bütünlüğünden zarar görmeden birkaç yıl boyunca depolanabilir.

3. Çoklu floresan RNA ISH için FFPE dokusunun işlenmesi

  1. RNase içermeyen bir çalışma alanı hazırla.
    1. Tüm çalışma yüzeylerini ve aletleri %70 etanol ile dezenfekte edin. Yüzeyleri, aletleri ve eldivenleri RNA bozulmasını en aza indirmek için RNase dekontamin edici bir çözeltiyle tedavi edin.
    2. Mikrotomu kur ve yeni bir bıçak tak. Açıklık açısını 10°'ye ayarlayın. Cımbız ve fırçaları kullanmadan önce RNase dekontamin edici çözeltiyle tedavi edin.
      NOT: Kesitleme için her zaman yeni bir bıçak kullanın, böylece hassas doku dilimleri elde edin. Kanat açısı, kesit kalitesini, doku bütünlüğünü, kalınlık düzenini ve morfolojik özelliklerin korunmasını önemli ölçüde etkiler.
  2. Su banyosunu hazırla.
    1. Bir yüzme su banyosunu ultra saf laboratuvar kalitesinde suyla doldurun.
    2. Embriyonik evre ve doku özelliklerine bağlı olarak 40–43 °C arasında sıcaklığı ayarlayın.
  3. FFPE bloğunu kesin ve monte edin.
    1. Gömülü dokunun etrafındaki fazla parafini kesin. FFPE bloğunu buzda soğutup mikrotom soğuk aşamasına monte edin.
  4. İlgilendiğiniz bölgeye göre kırpıştırın.
    1. Parafin blok yüzeyini mikrotom bıçağıyla hizalayın ve 12 μm adımlarla kesin, örneğin, azi dişi veya kesici dişin bitişiği olan bölge koronal kesitlerde ortaya çıkana kadar kesin.
    2. Blok ve bıçağı simetrik, doğru şekilde konumlanmış tüm baş koronal veya sagital kesitler için gerektiği gibi yeniden konumlandırın.
  5. Dokuyu kesitleyin.
    1. İlgi alanına ulaşıldığında, 5–7 μm kesitler kesilir. Bölümleri su banyosunda yüzdürerek nazikçe rahatlama ve düzleştirme sağlayıp kaydırmaya aktarmadan önce yapın.
  6. Bölümleri monte edin ve kurutun.
    1. Bölümleri pozitif yüklü cam slaytlara monte edin. Doğru yön ve doku bütünlüğünü doğrulamak için slaytları ışık mikroskobu altında inceleyin.
    2. Slaytları gece boyunca 40 °C'de slayt ısıtıcısında kurutarak çoklu floresan RNA ISH testi yapılmadan önce yapın.

4. 1. Gün: Deparafinizasyon ve rehidrasyon

  1. Slaytları pişir.
    1. FFPE kesitleriyle slaytları 60 °C'de 1 saat pişirin.
      NOT: Sürgü hemen kullanılmazsa, fırınlanmamış oda sıcaklığında (RT) kuruducu ile 1–4 hafta boyunca saklayın. Uzun depolama RNA bozulmasına yol açabilir.
  2. Kaymaları dengeleyin.
    1. FFPE doku slaydının oda sıcaklığında (RT) 10 dakika dengelenmesine izin verin.
  3. Bölümleri deparaffize edin ve yeniden nemlendirin.
    1. Slaytları ksilen veya ksilen ikamesi ile nazikçe çaltarak RT rejiminde 5–10 dakika boyunca daldırın. Parafinin tamamen alınmasını sağlamak için bu adımı bir kez tekrarlayın.
      NOT: Ksilen ile çalışmalar kimyasal bir buhar davlumbazında yapılmalıdır. Düşük toksisiteli bir ksilen ikamesi kullanılırsa, kimyasal buhar kapasonun dışında kullanılabilir.
    2. Slaytları %100 etanole aktarın ve RT'de 2 dakika kuluçka yapın. Kalan ksileni çıkarmak için bir kez tekrarlayın. Bölümleri %70 etanolle 2 dakika boyunca yeniden nemlendirin.
    3. Bölümleri PBS ile 3 kez durulayın. Sonra bölümleri tamamen kaplayacak kadar bir damla PBS ekleyin ve hemen bir sonraki adıma geçin.

5. FFPE doku kesitlerinde multipleks floresan RNA ISH.

NOT: Bu çalışma, üreticinin RNAscope teknolojisi21 kullanarak FFPE doku kesitlerinde çoklu floresan RNA ISH yapılması talimatlarını takip etti.

  1. 1. Gün: Ön tedavi ve prob hibridizasyonu
    1. Hidrofobik bir bariyer çiz.
      1. Bir bariyer kalemi kullanarak, her doku kesitinin etrafına hidrofobik bir bariyer çizin. Sürgüleri oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika hava kurumasına izin verin.
      2. Kurumayı önlemek için doku bölümlerinin her zaman PBS ile kaplı kaldığından emin olun.
        NOT: Dokuyu nemli tutmak için tüy içermeyen bir mendil (lens mendil) kullanın. Bariyer kalem mürekkebinin doku bölümüne temas etmediğinden emin olun.
    2. Ön tedavi yapın.
      1. Her bölümü tamamen kapsayacak özel ön işlem reaktifini uygulayın. Slaytları hibritizasyon fırınında nemlendirilmiş bir odada 40 °C'de 30 dakika kuluçka edin.
        NOT: Damlalı şişelerde verilen tüm reaktifler için, bariyer içindeki bölümü tamamen kaplaması için yeterli damla ekleyin. Tüm reaktiflerin kullanımdan önce RT'ye getirildiğinden emin olun.
    3. Bölümleri durulayın.
      1. Bölümleri PBS ile birkaç kez durulayın, ardından RT'de taze PBS'de 2 dakika kuluçka yapın.
        NOT: Her slaytı PBS ile tek tek yıkamak için 5 mL'lik transfer pipeti kullanın. 2 dakikalık yıkama sırasında, bölümlerin tamamen PBS ile kaplı kaldığından emin olun.
    4. Endojen peroksidaz aktivitesini söndürün.
      1. Her bölüme %3 hidrojen peroksit uygulayın ve endogen peroksidaz aktivitesini engellemek için RT'de 10 dakika kuluçka yapın.
    5. Yıkamayı tekrarlayın.
      1. Slaytları PBS'de RT'de 2 dakika yıkayın. İki kez tekrarlayın.
    6. Probları hazırla.
      1. Probları 40 °C'de 10 dakika önceden ısıtın. Kullanmadan önce probların RT olarak soğumasına izin verin.
    7. Prob karışımını hazırlayın.
      1. C1 probu 1× çalışan bir çözüm olarak sağlanır; Bunu doğrudan kullanın.
      2. Buna karşılık, C2, C3 ve C4 probları %50× konsantre olarak sağlanır; bu probları C1 prob çözeltisiyle seyreltirin. Eğer C1 probu kullanılmıyorsa, üretici tarafından sağlanan sonda sulandırıcı ile C2, C3 ve/veya C4 problarını seyreltin.
    8. Probları hibritleştirin.
      1. Her doku bölümüne 30–40 μL prob karışımı uygulayarak tam kapsama sağlanır. Slaytları hibridizasyon fırınında nemlendirilmiş bir odada 40 °C'de 2 saat kuluçka edin.
        NOT: RNAscope tekniğini öğrenirken, test çalışmaları sırasında hem negatif hem de pozitif kontrol problarının dahil edilmesi önerilir. Bu yaklaşım, testi doğrulamaya ve işlemin kalitesini doğrulamaya yardımcı olur. Farkında olunması gereken potansiyel bir sınırlama, üretici tarafından sağlanan bazı pozitif kontrol problarının ilgi çeken dokuda ifade edilmeyemesidir. Bunu çözmek için hücre tipine özgü problar kullanılabilir. Örneğin, Col1a1 bağ dokuları için güvenilir bir pozitif kontroldür. Col1a1 (veya yüksek ekspresyona sahip başka bir gen) için boyama, örneklerdeki RNA koruması ve doku morfolojisini değerlendirmek için ilk adım olarak gerçekleştirilebilir. Teknikte yeterlilik sağlandıktan sonra, negatif kontroller genellikle slaytlar probsuz işlenerek ancak diğer tüm çözeltilerle işlenerek gerçekleştirilir. Bu yöntem, tüm algılama kanallarındaki arka plan sinyali hakkında kritik bilgiler sağlar. Standart Multiplex V2 kiti, dört farklı probun eşzamanlı boyama ve görüntüleme yapılmasını sağlar. Gen ifade seviyeleri önceki transkriptomik çalışmalarıyla belirlendiğinde, düşük ekspresyona sahip genlerin Cy5 ve Cy7 kanallarına atanması tavsiye edilir. Yüksek şekilde ifade edilen genler, optimal tespit için GFP ve RFP kanallarına yerleştirilmelidir. Hiçbir prob yüksek ekspresyona sahip genleri hedef almadığı durumlarda, GFP kanalı kullanılmadan kalmalıdır. Bu, GFP kanalının RFP kanalından arka plan çıkarımı için bir referans olarak hizmet vermesini sağlar ve düşük ifade eden hedefler için sinyal algılama doğruluğunu artırır.
    9. Yıkama tamponuyla durulayın.
      NOT: Ticari olarak mevcut olan 20× Yıkama Tamponu, kullanımdan önce RNase içermeyen suyla 1× kadar seyreltilmiştir.
      1. Slaytları RT'de kitle birlikte verilen 1× Wash Buffer'da 2 dakika yıkayın. İki kez tekrarlayın.
    10. 5x tuzlu-sodyum sitrat (SSC) tamponu içinde kuluçka yapın.
      NOT: Ticari olarak mevcut 20× SSC Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodyum sitrat, pH 7.0) kullanımdan önce RNase içermeyen suyla 5× kadar seyreltilmiştir.
      1. Yıkamadan sonra, bölümleri RT'de 5× SSC tamponunda gece boyunca kuluçka yapın.
  2. 2. Gün: Sinyal güçlendirme, floresan etiketleme ve montaj
    1. Slaytları yıkayın.
      1. Slaytları oda sıcaklığında (RT) 2 dakika boyunca 1× Yıkama Tamponunda yıkayın. İki kez tekrarlayın.
    2. Yükseltme adımlarını gerçekleştirin.
      1. Her bölüme Amplification 1 reaktifini uygulayın ve nemlendirilmiş bir odada 40 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
      2. 1× Wash Buffer'da iki kez durulayın, RT'de 2 dakika sür.
      3. Amplifikasyon 2 reaktifini uygulayın ve 40 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
      4. 1× Wash Buffer'da iki kez durulayın, RT'de 2 dakika sür.
      5. Amplifikasyon 3 reaktifini uygulayın ve 40 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
        NOT: Hangi kanallar (problar) geliştirilirse geliştirilsin, üç amplifikasyon adımının tamamı gereklidir.
      6. 1× Wash Buffer'da iki kez durulayın, RT'de 2 dakika sür.
    3. At turpu peroksidazı (HRP) ve floroforu geliştirin.
      1. Gerekli florofor hacmini hesaplayın (genellikle slayt başına 100–200 μL) ve Opal florofor stoklarını seyreltin.
        NOT: Florofor için önerilen seyreltme aralığı 1:300–1:1500 arasındadır. Bu deneylerde, Opal Polaris 780 (Florofor reaktiv) antikor seyreltici ile 1:500 oranında, diğer tüm boyalar ise TSA tamponunda 1:1000 seyreltildi. Mümkün olduğunda slaytlara ışık maruziyetini en aza indirin.
      2. HRP-C1 reaktifi uygulayın ve 40 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
      3. 1× Wash Buffer'da iki kez durulayın, RT'de 2 dakika sür.
      4. Her bölüme 30–40 μL Opal boya (örneğin, Opal 570 veya Opal 690) uygulanır. 40 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
      5. 1× Wash Buffer'da iki kez durulayın, RT'de 2 dakika sür.
      6. HRP Blokeri uygulayın ve 40 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
      7. 1× Wash Buffer'da iki kez durulayın, RT'de 2 dakika sür.
      8. HRP-C2 veya HRP-C3 reaktifi uygulayın ve 40 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
      9. 1× Wash Buffer'da iki kez durulayın, RT'de 2 dakika sür.
      10. İkinci Opal boyasından 30–40 μL uygulanır ve 40 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
      11. 1× Wash Buffer'da iki kez durulayın, RT'de 2 dakika sür.
      12. HRP Blokeri uygulayın ve 40 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
      13. 1× Wash Buffer'da iki kez durulayın, RT'de 2 dakika sür.
      14. HRP-C3 veya HRP-C4 reaktifini uygulayın ve 40 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
      15. 1× Wash Buffer'da iki kez durulayın, RT'de 2 dakika sür.
    4. Tiramid sinyal amplifikasyonu-digoksigenin (TSA-DIG) ve florofor etiketlemesi (Varsa) uygulanır.
      1. Her bölüm için 30–40 μL seyreltilmiş TSA-DIG reaktifi uygulayın ve RT'de 30 dakika kuluçka yapın.
      2. 1× Wash Buffer'da iki kez durulayın, RT'de 2 dakika sür.
      3. Bloklayıcı reaktif uygulayın ve 40 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
      4. 1× Wash Buffer'da iki kez durulayın, RT'de 2 dakika sür.
      5. 30–40 μL seyreltilmiş florofor reaktifi uygulayın ve 40 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
      6. 1× Wash Buffer'da iki kez durulayın, RT'de 2 dakika sür.
    5. Karşı boyama ve montaj yapın.
      1. 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) uygulayın ve karanlıkta RT'de 5 dakika kuluçka yapın.
      2. DAPI'yi durulayın ve bölümleri hemen anti-fade montaj maddesi ile monte edin, kapak kabarını nazikçe uygulayın ve hava kabarcıklarının sıkışmasını önleyin. Doku örtüsüyle uygun şekilde örtülü bir örtü ölçüsü seçin.
      3. Slaytları karanlıkta RT rejiminde 2 saat kurut, sonra uzun süreli depolama için 4 °C'de tutun.
        NOT: Floresans, doğru anti-fade montajıyla karanlıkta 4 °C sıcaklıkta saklanırsa bir yıla kadar korunabilir.
    6. Görüntüleme yapın.
      1. Çok kanallı floresan mikroskobu ile görüntüleme yapılabilir; LED aydınlatma ve spektral ayrım için filtreler (Şekil 2A). Uyarılma ve emisyon dalga boylarını aşağıdaki şekilde kullanın: DAPI (353/465 nm), FITC (495/519 nm), Cy3 (548/561 nm), Cy5 (650/673 nm) ve Cy7 (747/773 nm). Belirli filtreler spektral örtüşmeleri minimize eder ve mavi, yeşil, turuncu, kırmızı ve yakın kızılötesi sinyalleri ayırt eder.
      2. Tüm görüntüleri örnekler arasında aynı pozlama ve aydınlatma ayarlarıyla elde edin, tutarlılık sağlanır ve güvenilir karşılaştırmalı analiz sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tarif edilen protokolü (Şekil 1) kullanarak, Zeiss mikroskop platformunda görüntülenen bir fare başının tamamında çoklu floresan mRNA ISH transkript algısını gösteriyoruz (Şekil 2B). Belirli görüntü görünümleri yan sekme (sarı kutu) kullanılarak seçilebilirken, kanal sekmesi (kırmızı kutu) ile birden fazla kanal aynı anda görselleştirilebilir. Canlı görüntünün parlaklığı, gaması ve kontrastı, ekran sekmesi (yeşil kutu) altındaki...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yerinde hibritizasyon, gen ifadesini incelemek için kırk yılı aşkın süredir temel bir araç olmuş ve sürekli olarak geliştirilmiştir. Ancak, geleneksel ISH yaklaşımları genellikle düşük hassasiyet, yüksek arka plan sinyali ve uzun, emek yoğun prosedürlerle sınırlıdır. Bu kısıtlamalar, özellikle hassas mekansal çözünürlük ve düşük bolluklu transkriptlerin tespitinin önemli olduğu karmaşık kraniofasiyal dokularda daha geniş uygulamalarını kısıtlamıştır. Çoklu floresan RNA ISH, hede...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NICHD hayvan tesisi personeline hayvan yetiştiriciliği ve yetiştirme konusunda yardımcı oldukları için teşekkür ediyoruz. Floresan görüntüleme konusunda yardımı için Mikroskopi ve Görüntüleme Merkezi'nden (NIH/NICHD) Dr. Vincent Schram'a teşekkür ederiz. Mevcut makale, NIH/NIDCR RO1DE033520'den M.B.'ye, Intramural Araştırma Programı, Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (NICHD) ve Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (NICHD) Araştırma Hibe Tanımlayıcısı ZIA HD009015 fonlarıyla desteklenmektedir. Fon sağlayıcının çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlama kararı veya makalenin hazırlanması gibi süreçlerde hiçbir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1&Times; PBSTermo Fischer10010023Use  iş akışı sırasında yıkama yapmak
20& kez; SSCTermo FischerJ60839. K21´ Yıkama tamponu
50 mL konik tüpler (Ambion) RNAse içermeyenTermo FischerAM12502Farklı çözeltilerde örnekleri saklamak için kullanım
İleri yörünge sallayıcısıVWR6683-470İnkubasyon sırasında fiksasyon çözeltisinde dokuları silkelemek için kullanılır
Alkol, %70, Fisherbrand, HistoPrepFisher ScientificHC-1000-1GLTüm çalışma alanını temizlemek ve dezenfekte etmek için kullanılır
Antikor Sulaştırıcı Akoya BiosciencesARD1001EATSA-DIG için Sildilentif
Otomatik vakum doku işlemciLeica BiosystemsASP300SNumunelerin temizlenmesi, dehidrasyonu, yeniden hidrasyonu ve mum infiltrasyonu için kullanılır
Kaplama Camı Kalınlığı 1.5, 25 mm x 25 mm ve nbsp;Corning2850-25Visium HD iş akışında sürgü montajı için kullanım
Özel Ön İşleme ReaktifiACD, Bio-Techne300040Doku geçirimliliğini ve hedef erişilebilirliğini optimize etmek
EDTAMillipore Sigma03690Mineralize dokuları kalsifikasyon için kullanmak
Etanol %100AeroBase Grubu6505001050000İşlem sırasında ksilin çıkarmak ve örnekleri yeniden hidretlemek için kullanın
HistoCore Su Banyosu Leica BiosystemsHIS2326Bölümleri 40-43 derece ve derecede yüzdürmek için kullanılır; C FFPE bölümlerinden kırışıklıkları gidermek için 
HybEZ Nemlendirici KağıtACD, Bio-Techne310015Hibritleşme sırasında nemi korumak ve doku kesimlerinin kurumasını önlemek için HybEZ fırınının içinde kullanın
HybEZ Fırın, Tepsi ve RafACD, Bio-Techne310011, 310012, 310014Hibritleşme ve kuluçka aşamalarında kontrollü sıcaklık, nem ve doğru kaydırma konumlandırması sağlamak için kullanılır;
ImmEdge Hidrofobik Bariyer KalemVektör LaboratuvarıH-4000Boyama işlemleri sırasında reaktifleri doku bölümünde sınırlamak için slaytlarda hidrofobik sınırlar çizmek için kullanılır.
Düşük Profilli Tek Kullanımlık Bıçaklar DB80LXLeica Biosystems14035843496FFPE bloklar  bölümlerine almak için kullanın;
Nötr Tamponlu Formalin %10Azer ScientificNBF-4-GDokuları düzeltmek için kullanın
OPAL 520 REAKTIF PAKETIAkoya Biosciences, Inc.FP1487001KTFloresan etiketleme ile hedef RNA sinyallerini güçlendirmek ve tespit etmek.
OPAL 570 REAKTIF PAKETIAkoya Biosciences, Inc.FP1488001KTFloresan etiketleme ile hedef RNA sinyallerini güçlendirmek ve tespit etmek.
OPAL 620 REAKTIF PAKETIAkoya Biosciences, Inc.FP1495001KTFloresan etiketleme ile hedef RNA sinyallerini güçlendirmek ve tespit etmek.
OPAL 690 REAKTIF PAKETIAkoya Biosciences, Inc.FP1497001KTFloresan etiketleme ile hedef RNA sinyallerini güçlendirmek ve tespit etmek.
Opal Polaris 780 Reaktif PaketiAkoya Biosciences, Inc.FP1501001KTFloresan etiketleme ile hedef RNA sinyallerini güçlendirmek ve tespit etmek.
Prolong DiamondTermo FischerP36970Floresan sinyalleri korumak ve görüntüleme sırasında RNA sinyalini korumak için antiifade montaj ortamı
RNAscope 4-Plex Yardımcı KitÖZGÜL UIACD, Bio-Techne323120RNAscope Multiplex Fluorescent v2 testinde kullanılan ek malzemeler
RNAscope DAPIACD, Bio-Techne320858RNA kapsamında hücre çekirdeklerini görselleştirmek için kullanılan floresan nükleer boya,
RNAscope Multiplex Fluoresan Reaktif Kiti v2ACD, Bio-Techne323100Çoklu floresan in situ hibritizasyon yapmak
RNAscope Multiplex TSA BufferACD, Bio-Techne322810RNAscope'da opal boyaları seyreltmek için kullanılan bir tampon
RNAscope Wash tampon reaktifleriACD, Bio-Techne310091Test sırasında slaytlarda doku bölümlerini yıkamak için kullanılır
RNaseZap RNase Dekontekromasyon ÇözeltisiTermo FischerAM9782RNase temizlemek ve çıkarmak için kullanılır
Yarı Otomatik Döner MikrotomLeica BiosystemsRM2245Kılavuzlarda bildirildiği gibi FFPE bloklarını kesimlendirmek için kullanın.
Slide BriteElektron Mikroskopi Bilimi23401-01RNAscope işlemeden önceki deparafinizasyon adımı için.
Kapaklı Kaydırma IsıtıcıPremiere XH2004Farklı sıcaklıklarda slaytların kuluçka aşamasında kullanımı
Superfrost Plus Slaytları Fisher Scientific12-550-15 Vsium HD için bölüm bağlamak için kullanılır
Cerrahi ParaplastLeica Biosystems39601006doku infiltrasyonu ve dokuların gömülmesi için kullanılır
Doku kültürü DISH 100 x 20 MM 500/CSFisher Scientific8772221&akut; PBS
KsilenFisher Scientific6.81001E+12Alkolü çıkarmak ve dokuları şeffaf hale getirmek için temizleyici olarak kullanılır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Artika, I. M., et al. Real-time polymerase chain reaction: current techniques, applications, and role in COVID-19 diagnosis. Genes. 13 (12), 2387(2022).
  2. Chu, Y. H., et al. In situ hybridization: introduction to techniques, applications and pitfalls in the performance and interpretation of assays. Semin Diagn Pathol. 36 (5), 336-341 (2019).
  3. Atout, S., et al. Evaluation of the suitability of RNAscope as a technique to measure gene expression in clinical diagnostics: a systematic review. Mol Diagn Ther. 26 (1), 19-37 (2022).
  4. Tseng, K. C., Crump, J. G. Craniofacial developmental biology in the single-cell era. Development. 150 (19), dev202077(2023).
  5. Kishi, J. Y., et al. SABER amplifies FISH: enhanced multiplexed imaging of RNA and DNA in cells and tissues. Nat Methods. 16 (6), 533-544 (2019).
  6. Lovely, A. M., et al. Hybridization chain reaction fluorescence in situ hybridization (HCR-FISH) in Ambystoma mexicanum tissue. Methods Mol Biol. 2562, 109-122 (2023).
  7. Raju, R., et al. Profiles of Wnt pathway gene expression during tooth morphogenesis. Front Physiol. 14, 1316635(2024).
  8. Piña, J. O., et al. Multimodal spatiotemporal transcriptomic resolution of embryonic palate osteogenesis. Nat Commun. 14, 5687(2023).
  9. Piña, J. O., et al. Spatial multi-omics reveals the role of the Wnt modulator Dkk2 in palatogenesis. J Dent Res. 103 (13), 1412-1420 (2024).
  10. Raj, A., et al. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  11. Xia, C., et al. Spatial transcriptome profiling by MERFISH reveals subcellular RNA compartmentalization and cell cycle-dependent gene expression. Proc Natl Acad Sci USA. 116, 19490-19499 (2019).
  12. Lubeck, E., et al. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nat Methods. 11, 360-361 (2014).
  13. Shah, S., et al. In situ transcription profiling of single cells reveals spatial organization of cells in the mouse hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  14. Gaspar, I., Ephrussi, A. Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).
  15. Erben, L., Buonanno, A. Detection and quantification of multiple RNA sequences using emerging ultrasensitive fluorescent in situ hybridization techniques. Curr Protoc Neurosci. 87, e63(2019).
  16. Makareeva, E., et al. RNA-based bone histomorphometry: method and its application. J Bone Miner Res. 39 (2), 177-189 (2024).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  18. Monné Rodríguez, J. M., et al. Review of in situ hybridization techniques for drug research and development. Toxicol Pathol. 51 (3), 92-111 (2023).
  19. Colburn, M. E., et al. Effect of formalin-fixation and paraffin-embedded tissue storage times on RNAscope signal amplification. J Vet Diagn Invest. 36 (4), 498-505 (2024).
  20. Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium. Am J Clin Pathol. 137 (3), 429-436 (2012).
  21. RNAscope multiplex fluorescent reagent kit v2 user manual. , ACDbio. Available from: https://manuals.plus/m/0f24eea864dcf70b83735b261589c2e98f9c707b01c1c9c0455f349c8ab2eb0c (2025).
  22. Bankhead, P., et al. QuPath: open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7, 16878(2017).
  23. Hernández, S. C., et al. Single-cell and spatial transcriptomic profiling of cardiac fibroblasts following myocardial infarction. Sci Data. 13, 216(2026).
  24. Dropmann, A., et al. The TGF-β1 target WISP1 is highly expressed in liver cirrhosis and cirrhotic HCC microenvironment. Biochem Biophys Res Commun. 732, 150409(2024).
  25. Stolley, D. L., et al. RNA in situ hybridization with sequential protein immunofluorescence in tandem assay. J Vis Exp. (224), e68615(2025).
  26. Anderson, C. M., et al. Visualizing genetic variants, short targets, and point mutations in the morphological tissue context. J Vis Exp. (138), e58097(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Multiplex Fluorescent HybridizationIn Situ HybridizationCraniofacial DevelopmentFFPE Mouse SamplesmRNA DetectionGene Expression LocalizationTissue ArchitectureCraniofacial TissuesCongenital Craniofacial DisordersSpatial Gene Expression

İlgili makaleler