Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Lipid Nanoparçacık Aracılı mRNA İletimi Yoluyla Claudin18.2'ye Özgü CAR-T Hücrelerinin In Situ Üretimi

357 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71482

⸱

14 Ağustos 2026

 ,  ,  , 
1School of Medicine, Shanghai University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Katı tümörlere CAR T-hücresi uygulaması, karmaşık yapılar nedeniyle sınırlıdır ex vivo üretim ve güvenlik kaygıları. Bu protokol, ... için bir yöntemi tanımlamaktadır in situ geçici CAR-T hücrelerinin üretimi aracılığıyla CAR kodlayan mRNA'nın LNP aracılı iletimi, diğer mRNA tabanlı immün hücre mühendisliği uygulamalarına uyarlanabilir ve tekrarlanabilir bir platform sağlamaktadır.

Özet

Kimerik antijen reseptörü (CAR) T-hücre tedavisi, hematolojik malignitelerde dikkat çekici klinik başarılar elde etmiştir; ancak, daha geniş kapsamlı uygulamaları yüksek üretim maliyetleri ve solid tümörlere karşı yetersiz etkinlik nedeniyle sınırlıdır. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, Claudin18.2'yi hedefleyen CAR mRNA'sının lipid nanopartikül (LNP) aracılı iletimine dayalı, CAR-T hücrelerinin doğrudan tümör dokusu içinde geçici olarak üretilmesini sağlayan bir in situ CAR-T hücresi oluşturma stratejisi geliştirilmiştir. LNP transfeksiyonunu takiben, aktive edilmiş T hücreleri CAR'ların etkin yüzey ekspresyonu göstermiştir. Bu geçici CAR-T hücreleri, NUGC4 ve NCI-N87 dahil olmak üzere Claudin18.2-pozitif gastrik karsinoma hücre hatlarına karşı güçlü sitotoksik aktivite sergilemiş ve tümör taşıyan fare modellerinde anlamlı antitümör etkinlik sağlamıştır. Bu protokol; CAR mRNA'sının in vitro transkripsiyonu, LNP formülasyonu, T-hücre aktivasyonu ve transfeksiyonu, CAR ekspresyon analizi ile CAR-T aracılı sitotoksisitenin in vitro ve in vivo fonksiyonel değerlendirmesine yönelik ayrıntılı prosedürleri açıklamaktadır. Topluca değerlendirildiğinde, bu strateji geçici CAR-T hücreleri oluşturmak için maliyet etkin ve çok yönlü bir platform sunmakta ve solid tümörlerin tedavisi için gelecek vaat eden bir yaklaşım sağlamaktadır.

Giriş

Kanser insidansı ve mortalitesi dünya genelinde hızla artmaktadır. Bu durum, insan hayatta kalma şansı ve toplumsal gelişim için bir tehdit oluşturmaktadır. Mide kanseri, küresel ölçekte kansere bağlı ölümlerin üçüncü öncü nedenidir ve yaygın görülmektedir1. Erken teşhis oranlarının düşük olması nedeniyle, hastaların önemli bir kısmı ileri evrelerde teşhis edilmektedir. Geleneksel tedaviler arasında cerrahi, radyoterapi ve kemoterapi yer almaktadır. Orta-geç evre veya kompleks mide kanserli hastalarda cerrahi rezeksiyon eksik kalabilmektedir. Dahası, meydana gelen ciddi cerrahi travma ve uzun süreli postoperatif iyileşme süreci, hastaların yaşam kalitesini olumsuz etkileyebilir ve potansiyel olarak komplikasyonlara yol açabilir. Radyoterapi ve kemoterapi normal dokulara ciddi şekilde zarar vererek tedavi sırasında çok sayıda yan etki oluşturur. Buna karşılık, hedefe yönelik tedaviler ve hücre tedavileri hassasiyet ve etkinlik sunmaktadır. Bu tedaviler, güncel bakım yöntemleri olarak ortaya çıkmış ve gelecekteki terapötik stratejilerin seçimindeki hakim eğilimi temsil eder hale gelmiştir.

Kimerik antijen reseptör T-hücresi (CAR-T) terapisinin gelişi, hücre terapisini dönüm noktası niteliğinde bir atılıma taşımıştır. Bu yöntem, hematolojik malignitelerin tedavisinde güçlü bir etkinlik göstermiştir2,3. CAR-T terapisi, belirli bir kimerik antijen reseptörünün (CAR) yerleştirilmesiyle in vitro olarak genetiği değiştirilmiş hastanın kendi T hücrelerini kullanır. Bu reseptör, tümör hücrelerinin yüzeyindeki spesifik antijenleri tanır ve T hücrelerini kanser hücrelerine saldırmak üzere aktive eder. Son yıllarda, mide kanserine yönelik CAR-T terapisi araştırmaları da ilerleme kaydetmiştir. Terapötik hedeflerin seçimi, CAR-T hücrelerinin hedefleme hassasiyetini ve etkinliğini belirlediği için özellikle kritiktir. HER2'nin ardından, Claudin18.2, hastalar arasında %40 ile %87 oranında ekspresyon göstererek mide kanserinde öne çıkan bir diğer terapötik hedef olarak ortaya çıkmıştır. Claudin18.2 normalde mide mukozasının içinde gömülüdür. Malign tümörler, hücreler arası moleküler değişimden sorumlu olan sıkı bağlantıları bozduğunda, Claudin18.2 tümör hücrelerinin yüzeyinde açığa çıkar. Bu durum, onu bu tümörler için spesifik bir terapötik hedef haline getirir4.

Genellikle, CAR-T hücreleri için standart üretim süreci; hücre toplama, T hücresi seçimi ve zenginleştirme, T hücresi aktivasyonu, CAR gen yapılandırması, gen transduksiyonu, ekspansiyon, kalite kontrol, saklama ve taşıma ve ardından hastaya infüzyon aşamalarını içerir. Tüm CAR-T hücresi hazırlama süreci oldukça karmaşıktır; steril koşullar gerektirir ve katı çevresel ve ekipman spesifikasyonları talep eder. Bu durum, CAR-T terapisinin maliyetinin yüksek olmasına yol açarak klinik uygulamasını sınırlandırmaktadır. ex vivo CAR-T üretiminin karmaşıklıklarını gidermek için in vivo CAR-T hazırlama kavramı önerilmiştir. Bu yaklaşım, CAR-T hücrelerinin doğrudan hastanın vücudu içinde programlanmasını sağlayarak ex vivo hücre toplama, modifikasyon ve ekspansiyon ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu strateji, maliyetleri düşürmeyi, güvenliği ve erişilebilirliği artırmayı ve hastalık tedavisinin daha geniş uygulamalarını mümkün kılmayı amaçlamaktadır5.

in vivo CAR-T hazırlamanın anahtarı, optimal bir iletim vektörü seçmekte yatar. Günümüzde vektörler viral veya viral olmayanlar olarak kategorize edilmektedir. Viral seçenekler arasında, ağırlıklı olarak lentiviral (LV) ve adeno-ilişkili viral (AAV) vektörler kullanılmaktadır. Ancak, viral vektörlerle ilişkili önemli riskler ve sınırlı yükleme kapasitesi, klinik araştırmalar için büyük engeller oluşturmaktadır6. Viral vektörlerin in vivo iletim için temel bir dezavantajı, genetik toksisiteye ve insersiyonel mutasyonlara yol açabilen genomik entegrasyon potansiyelleridir. Önceki vakalar, tedavi sonrası hastaların küçük bir kısmında ölümcül immün yanıtlar veya kanser vakaları belgelemiştir. Ayrıca, virüslerin doğal toksisitesi ve immünojenitesi, tekrarlanan in vivo uygulamalar için kullanımlarını ciddi şekilde kısıtlamaktadır. Bir diğer zorluk ise, birden fazla genin eş zamanlı iletimini engelleyen viral vektörlerin sınırlı yükleme kapasitesidir.

Viral olmayan mRNA iletim sistemleri bu eksiklikleri etkili bir şekilde gidermektedir. Bu sistemler, konak genomuna entegre olmaktan kaçınır ve böylece birçok riski bertaraf eder. Geçici etkileri, hedef dışı toksisiteyi önleyerek kısa süreli ve kontrol edilebilir CAR-T hücresi ekspresyonuna olanak tanır; böylece yan etkileri ve güvenlik risklerini azaltır. Viral olmayan sistemler arasında lipid nanopartiküller (LNP'ler) daha güvenli bir yaklaşım sunar. Bunlar, viral vektörlerin boyut sınırlamalarını aşarlar. LNP'ler ayrıca insersiyonel mutasyonlar ve immünojenite sorunlarını da çözer. Bu durum onları, toksisiteyi azaltma, güvenliği artırma ve maliyetleri düşürme potansiyeli ile CAR-T hücresi terapisinde gelecek vadeden adaylar konumuna getirir7.

Solid tümörlere yönelik immünoterapi üzerine yürütülen güncel araştırmalar; melanoma da dahil olmak üzere çeşitli kanser modellerinde temel olarak LNP formülasyon optimizasyonuna, hedeflenmiş modifikasyona ve mRNA dizi mühendisliğine odaklanmaktadır.8, meme kanseri ve kolorektal kanser9Çabalar ayrıca kimerik antijen reseptörlü makrofajların (CAR-M) oluşturulmasına da yöneltilmiştir.10 ve dendritik hücreler (CAR-DC)11 aracılığıyla Katı tümörlerin karmaşık fiziksel bariyerlerini ve immünsupresif tümör mikroçevresini (TME) aşmak için LNP iletim sistemleri. Burada sunulan platform, yüksek modülarite ile karakterize, çok yönlü ve viral olmayan bir mRNA iletim sistemi sağlar. Sadece mRNA dizisinin değiştirilmesiyle bu platform; diğer antijenleri hedefleyen katı tümör modellerine hızla uyarlanabilir veya otoimmün, kardiyovasküler ve fibrotik hastalıklar gibi onkoloji dışı terapötik alanlara genişletilebilir.

Ancak, bu platformları kullanan mide kanseri tedavilerinde teknik bir boşluk devam etmektedir: önceki çalışmalar ağırlıklı olarak myeloid hücre düzenlemesine odaklanmışken, yüksek verimli in vivo T-hücresi yeniden programlama stratejileri büyük ölçüde keşif aşamasında kalmıştır. Bu boşluğu doldurmak için bu protokol, LNP aracılı mRNA iletimi via geçici CAR-T hücreleri üretme yöntemini detaylandırmaktadır. Bu yaklaşım; yüksek maliyetler, karmaşık üretim süreçleri ve sistemik toksisite gibi geleneksel CAR-T hücresi tedavilerinin doğasında bulunan sınırlamaların üstesinden gelmeyi amaçlamakta, böylece hastalar için daha etkili ve erişilebilir bir terapötik alternatif sunmaktadır. Claudin18.2'yi hedefleyen spesifik bir CAR kodlayan optimize edilmiş bir mRNA dizisinin T hücrelerine transfeksiyonunun, güçlü bir hücre yüzeyi CAR ekspresyonuna olanak tanıdığı ve modifiye edilmiş T hücrelerini spesifik tümör hücrelerine karşı hedeflenmiş sitotoksik aktivite göstermeye yönlendirdiği gösterilmiştir. Bu protokol beş ayrı bölüme ayrılmıştır: CAR mRNA'sının in vitro transkripsiyonu, LNP hazırlama ve karakterizasyonu, T-hücresi aktivasyonu ve transfeksiyonu, CAR ekspresyonunun tespiti ve CAR-T hücresi sitolitik etkinliğinin in vitro ve in vivo değerlendirilmesi.

Mevcut mRNA-LNP iletim teknolojileriyle karşılaştırıldığında, bu protokolün temel metodolojik yeniliği, geçici ekspresyonun kinetik optimizasyonunda yatmaktadır. 5' UTR, 3' UTR, 5' Cap ve 120-bp poly(A) kuyruğu üzerinde sinerjik bir optimizasyon gerçekleştirilmiştir. Bu özel tasarım, mRNA'nın tümör mikroçevresindeki yarı ömrünü modüle ederek, belirlenmiş bir terapötik pencere içinde oldukça verimli bir translasyonun ardından güvenli degradasyonun sağlanmasını gerçekleştirir. Hızlı ve geçici CAR oluşumu ile karakterize edilen bu platform, konvansiyonel tedaviler için gereken uzun üretim süreci boyunca hastalığın ilerlemesini önleyen, hemen kullanıma uygun "hazırda bekleyen" bir formülasyon görevi görür. Ayrıca, bu geçici ekspresyon profili, potansiyel "hedefe yönelik ancak tümör dışı" toksisitelere sahip antijenleri hedeflemede veya konvansiyonel CAR-T tedavileriyle ilişkili şiddetli sitokin salınım sendromunu (CRS) tolere edemeyen hastalar için kontrol edilebilir bir güvenlik avantajı sunar.

in vivo in situ CAR-T hücresi üretiminin, karmaşık ex vivo üretimin ortadan kaldırılması ve ekonomik yüklerin azaltılması gibi derin avantajlarına rağmen, bazı kısıtlamalar devam etmektedir. Sistemik dolaşımda LNP'ler, karaciğerde spesifik olmayan birikime ve makrofajlar ile dendritik hücreler tarafından hızlıca internalize edilmeye eğilimlidir. T hücrelerine yönelik spesifik hedefleme birimleri olmadan, hedef T hücresi popülasyonunun transfeksiyon verimliliği kaçınılmaz olarak azalır. Ayrıca, tümör dokusuna girdiklerinde, in situ üretilen CAR-T hücreleri zorlu TME ile karşı karşıya kalır; hipoksik, asidik ve immünsupresif koşullar altında bu T hücreleri immün tükenmeye karşı oldukça duyarlıdır ve bu durum sitotoksik potansiyellerini kısıtlar. Ek olarak, mRNA ekspresyonunun geçici doğası güvenliği artırsa da, terapötik pencerenin süresini kısıtlar. Sürekli bir antitümör etkinlik sağlamak için sıklıkla aralıklı ve tekrarlanan uygulamalar gerekir. Sonuç olarak, gelecekteki araştırmalar, hassas ve soy hattına özgü hedefleme sağlamak amacıyla LNP iletim verimliliğini geliştirerek bu kısıtlamaların giderilmesine odaklanacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Shanghai Tenth People’s Hospital Laboratuvar Hayvanları Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Onay No.: SHDSYY-2025-P085; Onay Tarihi: 1 Ocak 2025). Bu çalışma yerel yasalara, düzenlemelere ve kurumsal gerekliliklere uygundur. 6–8 haftalık NSG dişi fareler kullanılmıştır. Bu çalışmada kullanılan Periferik Kan Mononükleer Hücreleri (PBMCs) ticari bir kaynaktan temin edilmiştir. Çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Materyaller Tablosunda listelenmiştir.

1. CAR mRNA Hazırlanışı

  1. Lineerleştirilmiş DNA şablonlarının hazırlanması
    NOT: CAR dizisini içeren plazmid, BspQI kısıtlama enzimi kullanılarak lineerleştirilmiştir. Seçilen kısıtlama enzimi, DNA fragmanını promotör bölgesinin sağ tarafındaki aşağı akış (downstream) kısmına yerleştirmeli ve eklenen DNA fragmanı içerisinde herhangi bir tanıma bölgesi içermemelidir.
    1. Çifte distile su (ddH2O), 10× tampon, DNA şablonu ve BspQI enzimini Tablo 1'de belirtilen sırayla ekleyin. 50 °C'de 2 saat inkübe edin, ardından enzimi 80 °C'de 20 dakika boyunca inaktive edin. Lineerleştirilmiş plazmid 4 °C'de saklanabilir.
      1. Kısıtlama sindirimi reaksiyonunu steril bir mikrosantrifüj tüpünde kurun. Çifte distile suyu, kısıtlama enzimi tamponunu, plazmid DNA şablonunu ve BspQI kısıtlama enzimini Tablo 1'de belirtilen spesifik sıra ve hacimlerde ekleyin.
      2. Reaksiyon karışımını pipetle yukarı-aşağı çekerek nazikçe karıştırın, ardından bir mikrosantrifüjde kısa süre santrifüjleyin. Tam sindirimin gerçekleşmesi için karışımı bir termal döngüleyicide 50 °C'de 2 saat inkübe edin. Karışımı 80 °C'de 20 dakika inkübe ederek kısıtlama enzimini inaktive edin.
        NOT: Opsiyonel - Lineerleştirilmiş plazmidi kısa süreli kullanım için 4 °C'de saklayın veya doğrudan kalite kontrol aşamasına geçin.
    2. 0,25 g agarozu tartıp 25 mL 1× Tris–Asetat–EDTA (TAE) tamponu içinde çözerek %1'lik agaroz jel hazırlayın. 2,5 µL Gel Green ekleyin ve iyice karıştırın. Kaynama noktasına getirin, ardından şiddetli bir şekilde çalkalayın. Karışımı jel döküm tepsisine dökmeden önce bu işlemi üç kez tekrarlayın. 10 V'da 10 dakika, ardından 130 V'da 20 dakika boyunca çalıştırın.
      1. Tam sindirimi doğrulamak için ultraviyole (UV) görüntüleme gerçekleştirin. Bant konumları DNA markerları ve kesilmemiş plazmid ile karşılaştırıldığında, lineerleştirilmiş plazmid, öngörülen moleküler ağırlıklarına karşılık gelen yalnızca iki belirgin bant göstermiştir: hedef dizisi yaklaşık 1.791 bp ve kalan fragman yaklaşık 2.535 bp idi.
    3. Sindirilen ürünleri DNA izolasyon boncuklarını kullanarak saflaştırın.
      1. Tam karışım sağlamak için manyetik boncukları vorteksleyin. Belirtilen hacimdeki manyetik boncukları DNA örneğine pipetleyin ve nazikçe karıştırın. DNA'nın boncuklara bağlanması için Oda Sıcaklığında (RT) 10 dakika inkübe edin.
      2. Örneği 5 dakika boyunca bir manyetik standa yerleştirin. Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Yıkama için taze hazırlanmış 20 µL %80 etanol ekleyin. RT'de 30 saniye inkübe edin ve süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
      3. Kuruması için örneği manyetik stand üzerinde, kapağı açık şekilde oda sıcaklığında 5 dakika bekletin. Örneği manyetik standdan çıkarın. 1 µL nükleaz içermeyen ddH2O ekleyin. Pipetle yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin. Çözeltinin berraklaşana kadar manyetik stand üzerinde 5 dakika çökmesini bekleyin.
      4. Süpernatantı dikkatlice yeni bir nükleaz içermeyen santrifüj tüpüne aktarın. DNA konsantrasyonunu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın; elde edilen DNA hemen in vitro transkripsiyon için kullanılmalıdır. Geri kazanım oranını, saflaştırılan DNA miktarını eklenen başlangıç DNA miktarına bölerek hesaplayın.
  2. In Vitro Transkripsiyon (IVT)
    1. T7 RNA polimeraz tabanlı bir in vitro transkripsiyon ve RNA başlama (capping) kitinin tüm bileşenlerini buz üzerinde çözdürün (kullanıma kadar -20 °C'de saklanması gereken T7 RNA Polimeraz Karışımı hariç). Tamponları kısa süre vorteksleyin ve santrifüjleyin.
    2. IVT reaksiyon karışımını, Tablo 2'de belirtilen hacimlere göre oda sıcaklığında, steril ve nükleaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın. Bileşenleri, T7 enzim karışımıyla sona erecek şekilde listelenen sırayla ekleyin.
    3. Reaksiyon karışımını tüpü hafifçe vurarak veya pipetle yukarı-aşağı çekerek dikkatli ama iyice karıştırın. Sıvıyı dipte toplamak için kısa süre santrifüjleyin. Karışımı bir termal döngüleyicide 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
    4. Kalıntı DNA şablonunu degrade etmek için IVT reaksiyonuna doğrudan 2 µL DNase I enzimi ekleyin. Nazikçe karıştırın ve ek olarak 15 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin. Hemen saflaştırma adımına geçin.
  3. Elde edilen RNA ürününü, DNA sindirim ürünü saflaştırmasıyla aynı prosedürü izleyerek RNA izolasyon boncukları ile saflaştırın.
    1. 20 µL enzim içermeyen su içinde çözün. mRNA konsantrasyonunu ve absorbans (OD) oranını ölçmek için NanoDrop spektrofotometre kullanın. Boş kontrol olarak 1 µL nükleaz içermeyen su kullanın. OD260/280 oranı 1,8 ile 2,1 arasında, OD260/230 oranı ise 2,0 ile 2,4 arasında olmalıdır.
      NOT: Oranların bu aralıkların dışında olması kontaminasyona işaret eder ve örneğin yeniden saflaştırılması gerekir.
    2. Sentezlenen CAR mRNA'sının uzunluğunu ve bütünlüğünü analiz etmek için nükleik asit ve protein analizi yapan otomatik bir kapiler elektroforez sistemi kullanın. Elektroforez profili, kuyruklanma olmadan ve düz, temiz bir baz hattı ile beklenen tam uzunluktaki CAR mRNA boyutuna (yaklaşık 180 nt) karşılık gelen tek ve keskin bir pik göstermelidir. Belirgin düşük moleküler ağırlıklı yaygın bantlar veya çoklu pikler bulunmamalıdır; aksi takdirde bu durum RNA degradasyonuna işaret eder.
    3. Tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçınmak için onaylanmış CAR mRNA'sını alikotlayın ve uzun süreli saklama için -80 °C'de depolayın.

2. LNP hazırlama ve karakterizasyonu

  1. 10 mg/mL'lik bir stok çözelti hazırlamak için SM102, kolesterol, 1,2-Distearoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DSPC) ve DMG-PEG20'i susuz etanol içinde çözün. Organik fazı 1:50:38,5:10:1,5 oranını kullanarak hazırlayın.
    1. Pozitif yüklü amino N gruplarının negatif yüklü fosfat P gruplarına olan 8:1 oranına dayanarak gerekli mRNA miktarını hesaplayın. Sulu fazı hazırlamak için mRNA'yı sodyum sitrat çözeltisinde çözün. Her biri 1,5 mL/dak akış hızlarında, 1:3 oranında organik:sulu faz oranını koruyun. LNP'leri bir herringbone karıştırıcılı mikroakışkan cihaz kullanarak hazırlayın.
  2. Öncelikle, boruları ve mikroakışkan çipi (balıksırtı karıştırıcı) bir kez susuz etanol ve sodyum sitrat çözeltisi ile durulayın. Hazırlanan organik ve sulu fazları süpürme yoluyla karıştırdıktan sonra, bunları 1 mL'lik bir şırınga kullanarak çekin; organik fazın sulu faza oranı 1:3'tür. Bunları sırasıyla şırınga pompasının iki kanalına yükleyin.
    1. Organik ve sulu fazlar için akış hızlarını ayarlayın. Çıkışa bağlı santrifüj tüpüne 5 mL sodyum sitrat tamponu (50 mM) ekleyin. Borulardaki kalıntı yıkama çözeltisini temizledikten sonra cihazı çalıştırın ve elüatı toplayın.
    2. Sodyum sitrat çözeltisi içinde dağıtılmış LNP'leri 10 kDa'lık bir ultrafiltrasyon tüpüne aktarın ve 400 × g'de santrifüjleyin g 5–10 dakika boyunca santrifüjleyin, ardından onları yeniden dağıtmak için 2,5 mL sodyum sitrat çözeltisi ve 2,5 mL 1× TBS çözeltisi ekleyin ve santrifüj işlemini bir kez daha tekrarlayın.
    3. Parçacıkları yeniden dağıtmak için 1 mL sodyum sitrat çözeltisi ve 4 mL 1× TBS çözeltisi ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Konsantre edilmiş LNP'leri 1 mL TBS çözeltisi içinde şu sıcaklıkta saklayın: 4 °C kısa bir süre için.
  3. Demülsifikasyon öncesi ve sonrası LNP'deki mRNA içeriğini ölçmek için floresan tabanlı bir RNA kantifikasyon kiti kullanın; iki değer arasındaki fark, LNP'nin enkapsülasyon verimliliğini temsil eder.
    1. 1× TE tamponu, prob çalışma çözeltisi ve %2'lik Triton X-10 hazırlayın. mRNA standardını seyreltin (100 µg/mL) e/a 2 µg/mL 1× TE tamponu kullanarak; boş kontrol, 10, 20, 10, 50 ve 100 ng/mL konsantrasyonları ile bir standart eğri hazırlayın. Vortekslayın. 4 µL şunlar içeren LNP solüsyonunun 16 µL %2'lik Triton X-10 çözeltisi ile, ardından 10 dakika bekletin.
    2. Ekle 5 µL demülsifiye edilmiş LNP çözeltisinin ...'ye 95 µL 1× TE tamponundan ekleyin. 100 µL prob çalışma çözeltisini hem standart eğri hem de örnek kuyucuklarına ekleyin, iyice karıştırın, ışıktan koruyun ve siyah tabanlı bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın.
    3. İnkübasyon sonrası, bir mikroplaka okuyucu kullanarak floresan yoğunluğunu (Ex480/Em520) ölçün. Standart eğriyi çizmek için, boş kuyucukların absorbans değerlerini sırasıyla standart eğri kuyucuklarının ve örnek kuyucuklarının değerlerinden çıkarın.
    4. Demülsifikasyon öncesi ve sonrası LNP çözeltisindeki mRNA konsantrasyonlarını hesaplamak için standart eğriyi kullanın, seyreltme öncesi konsantrasyonları elde etmek için bu değerleri 20 ile çarpın ve hesaplama formülünde yerine koyun:
      Kapsülleme oranı formülü; kimyasal süreç, verimlilik hesaplaması, demülsifikasyon yöntemi.
  4. Alın 10 µL LNP'den [miktar] alıp 1 mL TBS çözeltisi ile seyreltin. Malvern partikül boyut analizörü kullanarak partikül boyutunu, zeta potansiyelini ve Polidispersite İndeksi (PDI) değerini belirleyin.

3. T hücresi aktivasyonu ve transfeksiyonu

  1. T hücre ayıklama
    1. 1 × 107/mL konsantrasyonda PBMC alın, 37 °C'de yeniden süspanse edin, 10 mL immunomanyetik hücre ayırma tamponu ekleyin, iyice karıştırın, 50 × g hızda 8 dakika santrifüjleyin ve sayım yapın.
    2. Hücreleri yeniden süspanse edin ve yoğunluğu 5 × 107 hücre/mL'ye ayarlayın, her 1 mL hücre süspansiyonu için 50 µL İzolasyon Kokteyli ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin; her 1 mL hücre süspansiyonu için 40 µL immunomanyetik hücre izolasyonu için manyetik partikül ekleyin ve karıştırın; tüpü manyetik bir standa yerleştirin ve RT'de 10 dakika inkübe edin.
      1. Zenginleştirilmiş hücre süspansiyonunu bir pipet kullanarak dikkatlice yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü mıknatıstan çıkarın, 4 mL taze immunomanyetik hücre ayırma tamponu ekleyin ve ikinci bir ayırma döngüsü için ek 5 dakika daha inkübe edin.
    3. Hücreleri T-hücresi kültür ortamı (RPMI 1640 GlutaMAX + %10 Fetal Bovine Serum + %1 Penisilin/Streptomisin + 10 IU/mL rhIL-2 + 5 ng/mL rhIL-7 + 5 ng/mL rhIL-15) ile yıkayın, ardından santrifüjleyin ve sayım yapın. Hücre yoğunluğunu 1 × 106/mL'ye ayarlamak için T-hücresi kültür ortamı ekleyin ve 12,5 µL insan T hücresi aktivatörü CD3/CD28 manyetik boncukları ekleyin. Hücreleri aktive etmek için %5 CO₂ inkübatöründe 37 °C'de 48 saat inkübe edin.
  2. T-hücresi aktivasyon parametrelerinin tespiti
    1. 48 saat boyunca aktive edilmiş 20 µL T hücresini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. CD3/CD28 aktivasyon manyetik boncuklarını uzaklaştırın, yıkama için 1 mL FACS tamponu ekleyin, pipetleme ile nazikçe karıştırın, ardından 50 × g hızda, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve işlemi 2-3 kez tekrarlayın.
    2. Hücreleri 10 µL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Anti-insan CD3, anti-insan CD25 ve anti-insan CD69 antikorlarından her birinden 1 µL ekleyin. Örnekleri nazikçe karıştırın ve buz üzerinde, karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
      1. Hücreleri yıkamak için 1 mL FACS tamponu ekleyin, santrifüjleyin, ardından süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın, 10 µL FACS tamponu ve 0,1 µL LIVE/DEAD fikslenebilir ölü hücre boyası ekleyin ve buz üzerinde, karanlıkta 10 dakika inkübe edin.
    3. Hücreleri 1 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve 50 x g hızda, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. İşlemi 2-3 kez tekrarlayın. Süpernatantı atın ve hücreleri 200 µL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri akış sitometrisi kullanarak analiz edin.
    4. FSC-A ve SSC-A kullanarak hedef hücreleri seçin, FSC-A ve FSC-H kullanarak tekil hücreleri izole edin ve LIVE/DEAD Hücre Ayırt Etme Boyası (LIVE/DEAD) kullanarak canlı hücreleri tanımlayın. İnaktif ve aktive T hücreleri arasındaki CD25 ve CD69 oranlarını karşılaştırın.
  3. T hücrelerinin LNP Transfeksiyonu
    1. Kapsülleme verimliliği hesaplamasına dayanarak, mRNA miktarına göre gerekli LNP hacmini alın. Önce, ayırmak için TBS içinde dağılmış LNP'yi santrifüjleyin, ardından RPMI 1640 ortamına aktarın.
    2. 48 saat sonra, CD3/CD28 aktivasyon manyetik boncuklarını uzaklaştırmak için bir manyetik raf kullanın. 50 × g hızda 8 dakika santrifüjleyin, sayım yapın ve yoğunluğu 2 × 106 hücre/mL'ye ayarlamak için T-hücresi kültür ortamı ekleyin. 1 × 105 hücre başına 1 µg LNP-mRNA ekleyin. Pipetleme ile nazikçe karıştırın ve %5 CO₂ inkübatöründe 37 °C'de 4-6 saat inkübe edin.

4. CAR ekspresyonunun saptanması

  1. Transfeksiyondan 4–6 saat sonra, CAR-T hücrelerini iyice karıştırmak için nazikçe pipetleyin. En az 2 × 105 hücreyi 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  2. 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne 1 mL FACS tamponu ekleyin. Karıştırmak için pipetleyin, ardından 4 °C'de 5 dakika boyunca 50 x g hızında santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Bu adımı 2–3 kez tekrarlayın.
  3. Hücre peletini 10 µL FACS tamponu içinde resüspande edin ve örneği, her biri 50 µL içeren bir kontrol grubu ve bir deney grubu şeklinde ikiye bölün. Deney grubundaki hücre süspansiyonuna 1 µL CAR saptama antikoru G4S-linker ekleyin, örneği nazikçe karıştırın ve karanlıkta buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Kontrol grubu için antikor eklemeyin; buz üzerinde inkübe edin.
  4. 0,2 µL LIVE/DEAD fikslenebilir ölü hücre boyasını (10×) pipetleyin ve 100 µL FACS tamponu ile seyreltin; ardından kontrol ve deney gruplarının her birine 50 µL pipetleyin, örneği nazikçe karıştırın ve karanlıkta buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
  5. Hücreleri 1 mL FACS tamponu ile yıkayın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 50 x g hızında santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. 2–3 kez tekrarlayın.
  6. Süpernatantı atın ve hücreleri 20 µL FACS tamponu içinde resüspande edin. Hücreleri akış sitometrisi kullanarak analiz edin.
  7. CAR ekspresyonunu şu kapılama (gating) stratejisini kullanarak değerlendirin: FSC-A ve SSC-A grafiği ile hedef hücreleri kapılayın, FSC-A ve FSC-H grafiği ile tek hücreleri kapılayın ve LIVE/DEAD fikslenebilir hücre boyası ile canlı hücreleri kapılayın.
    NOT: Kontrol grubunun canlı hücre popülasyonunun en sağ sütununda G4S-linker antikoru ile pozitif boyanan hücrelerin seçimine dayanarak, deney grubu için gösterilen yüzde CAR pozitiflik oranını temsil eder.

5. CAR-T hücrelerinin in vitro sitotoksisite analizi

  1. Lusiferaz eksprese eden NUGC4 ve NCl-N87 tümör hücrelerini tripsin ile sindirin. 5 dakika boyunca 30 x g hızda santrifüjleyin. 1 mL RPMI 1640 besiyeri ekleyin, hücreleri sayın ve hücre yoğunluğunu 5 × 104 hücre/mL olacak şekilde ayarlayın. 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 10 µL aliquot ekleyin. Buharlaşmayı önlemek için kalan kuyucuklara eşit hacimde Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) ekleyin. 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO₂ içeren bir inkübatörde 24 saat boyunca inkübe edin.
  2. Akış sitometrisi sonuçlarına göre CAR pozitiflik oranını hesaplayın. Tümör hücreleri içeren kuyucuklara (10 µL/kuyucuk), 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3 ve 1:5 efektör-hedef hücre oranlarında CAR-T veya T hücreleri ekleyin. 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO₂ ile 24 saat boyunca inkübe edin.
  3. Firefly lusiferaz raporlayıcı gen analiz kiti kullanarak, kalan tümör hücrelerinden gelen lusiferaz sinyalini ürün kılavuzuna göre tespit edin ve öldürme oranını şu şekilde hesaplayın: (1 - (efektör hücre RLU değeri/hedef hücre RLU değeri)) × 10%.

6. CAR-T hücrelerinin in vivo fonksiyonel doğrulaması

  1. İnokülasyon öncesinde 1 haftalık bir aklimatizasyon döneminin ardından, her bir farenin aksilla bölgesine deri altına 5 × 106 NUGC4 hücreleri. Tümör boyutunu günlük olarak ölçün ve tümör hacmini şu formülü kullanarak hesaplayın: V (mm3) = L × W2/2 (burada L tümörün en uzun çapı ve W en kısa çapıdır) tümör 10 mm'ye ulaşana kadar3.
  2. Fareleri rastgele dört gruba ayırın: farklı dozlar alan üç tedavi grubu ve PBS alan bir kontrol grubu; her grupta üç fare bulunmalıdır.
    NOT: Körlük Yasası uygulanmamıştır.
  3. İnkübasyon sonrası 10 µg 1 × 10 miktarıyla mRNA'nın6 aktive edilmiş T hücrelerini 4 saat boyunca inkübe edin, 5 × 10 dozlarını hazırlayın5 hücre/fare, 1 × 106 hücre/fare ve 2 × 106 hücre/fare. LNP ve T hücreleri karışımını farelere uygulayın aracılığıyla her bir fareye ... gelecek şekilde kuyruk veni enjeksiyonu 100 µL hücre veya PBS hacmi. Dozlar 1., 4., 7. ve 10. günlerde olmak üzere toplam dört doz şeklinde uygulanmıştır.
  4. Farelerin tümör boyutlarını 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 ve 14. günlerde ölçün, tümör hacmini hesaplayın ve bir büyüme eğrisi çizin. Verileri ortalama ± SD şeklinde ifade edin. Gruplar arasındaki farkları, bir istatistik ve grafik yazılımı kullanarak, Tukey çoklu karşılaştırma testi ile kombine edilmiş iki yönlü varyans analizi (ANOVA) ile analiz edin. ns: istatistiksel olarak anlamlı değil; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Claudin18.2'yi hedefleyen bir CAR dizisi kullanılmıştır; bu dizi, humanize edilmiş bir anti-Claudin18.2 monoklonal antikorundan türetilen tek zincirli değişken fragman (scFv), CD8 menteşe bölgesi, CD28 transmembran bölgesi, ko-stimülatör domain ve CD3ζ aktivasyon domaininden oluşmaktadır. in vitro CAR mRNA transkripsiyonu için bu diziye dayalı, T7 promotörü ve poli A kuyruğu içeren bir DNA şablonu oluşturulmuştur (Şekil 1A). CAR mRNA'sının uzunluğu, kapiler elektroforez ile doğrulan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, konak genomuna entegrasyonu önleyen ve böylece immün reddedilme dahil birçok riski bertaraf eden viral olmayan bir mRNA iletim sistemi sunar. Geçici fonksiyonelliği ayrıca hedef dışı toksisiteyi de önleyerek, yan etkileri ve güvenlik risklerini azaltmak için CAR-T hücrelerinde kısa süreli, kontrol edilebilir ekspresyona olanak tanır.

Çeviri verimliliğini ve ekspresyon süresini düzenlemek amacıyla CAR mRNA sekans tasarımının optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. mRNA molekülünün 5'UT...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir

Teşekkürler

Bu çalışma için bir araştırma platformu sağlayan Şanghay Üniversitesi'ne ve Şanghay Onuncu Halk Hastanesi Merkezi Laboratuvarı'na teşekkürlerimizi sunarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Mutlak EtanolSigma-Aldrich459836Organik faz
AgarozBeyotimeST004LJel elektroforezi
anti-G4S linker (B02H1) mAb PE HycellsGS-ARPE100CAR tespiti
BspQI Restriksiyon EnzimiNEBR0712Plazmit lineerizasyonu
BV421 Mouse Anti-Human CD25BD Biosciences564033Aktivasyon belirteci
CD3/CD28 Aktivasyon BoncuklarıThermo Fisher Scientific11161DT hücresi aktivasyonu
KolesterolSigma-AldrichC8667Yapısal lipid
CO2 Hücre Kültürü İnkübatörüThermo Fisher / eşdeğeri250iT hücresi ve tümör hücresi kültürü için
DMG-PEG2000Avanti Polar Lipids880151PEGillenmiş lipid
DNA İzolasyon Manyetik BoncuklarıSYNTHGENE10501-005DNA saflaştırma
DNaz I (RNaz-free)NEBM0303LDNA kalıbının uzaklaştırılması
DSPCAvanti Polar Lipids850365Fosfolipid
Dinamik Işık Saçılım AnalizörüMalvern Panalytical         Zetasizer    LNP boyutu, PDI, zeta potansiyeli için 
EasySep TamponuSTEMCELL Technologies20144Manyetik ayırma
Fetal Bovin Serum (FBS)Gibco10099-141Kültür takviyesi
FITC Mouse Anti-Human CD3BD Biosciences555332T hücresi tanımlama
Akış Sitometresi      BD Biosciences / eşdeğeriFACSCelesta / LSRFortessa CAR ve aktivasyon belirteci için
GelGreen Nükleik Asit BoyasıBiotium41005DNA görselleştirme
LIVE/DEAD Sabitlenebilir BoyaInvitrogenL34955Canlılık boyaması
Lusiferaz Analiz KitiPromegaE1500Sitotoksisite okuması
Manyetik Ayırma Standı   STEMCELL Technologies / eşdeğeri18000PBMC ve T hücresi izolasyonu için
Nanodrop Spektrofotometre  Thermo Fisher Scientific  NanoDrop 2000            DNA/RNA kantifikasyonu için     
NSG Dişi Fareler (6–8 haftalık)Jackson Laboratory5557In vivo model
PBMC'lerShanghai Saili Biotechnology Company
PCR termal döngüleyiciBio-Rad / eşdeğeri  T100DNA amplifikasyonu için
PE Mouse Anti-Human CD69BD Biosciences557050Erken aktivasyon
Penisilin-StreptomisinGibco15140-122Antibiyotikler
Qsep Nükleik Asit Analizörü    BiOptic Inc.  Qsep100      mRNA boyut/bütünlük analizi için
Quant-iT RiboGreen RNA KitiInvitrogenR11490Enkapsülasyon verimliliği
RapidSpheresSTEMCELL Technologies15061Manyetik etiketleme
Rekombinant İnsan IL-15PeproTech200-15Bellek fenotipi desteği
Rekombinant İnsan IL-2PeproTech200-02T hücresi ekspansiyonu
Rekombinant İnsan IL-7PeproTech200-07T hücresi sağkalımı
Soğutmalı SantrifüjEppendorf / eşdeğeri 5425RLNP konsantrasyonu ve hücre işleme için 
RNA 6000 LadderThermo Fisher ScientificAM7152RNA karakterizasyonu
RNA Kartuş Kiti(1 adet)BiopticC105110RNA kalite kontrolü
RNA İzolasyon Manyetik BoncuklarıSYNTHGENE10511-005mRNA saflaştırma
RNaz-free SuThermo Fisher ScientificAM9937IVT ve RNA işlemleri
RPMI 1640 GlutaMAXGibco61870-036T hücresi kültürü
SM-102MedChemExpress / eşdeğeriHY-112563İyonize edilebilir lipid
T Hücresi İzolasyon KokteyliSTEMCELL Technologies15061CD3+ T hücresi izolasyonu
T7 Ko-Transkripsiyon ve Kep-Ekleme KitiSYNTHGENE10111-3011IVT mRNA sentezi
TBS TamponuGibco3005LNP saklama
Tripsin-EDTAGibco25200-056Hücre ayırma
UV Jel Görüntüleme Sistemi  Syngene / eşdeğeri  NuGenius/NuGenius+DNA sindirim doğrulaması için

Kaynaklar

  1. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394-424.
  2. Saez-Ibañez AR, Upadhaya S, Partridge T, Shah M, Correa D, Campbell J. Landscape of cancer cell therapies: trends and real-world data. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(9):631-632.
  3. Dunbar CE, High KA, Joung JK, Kohn DB, Ozawa K, Sadelain M. Gene therapy comes of age. Science. 2018;359(6372):eaan4672.
  4. Jiang H, Shi Z, Wang P, Li X, Hou W, Zhang H, et al. Claudin18.2-specific chimeric antigen receptor engineered T cells for the treatment of gastric cancer. J Natl Cancer Inst. 2019;111(4):409-418.
  5. Baker DJ, Arany Z, Baur JA, Epstein JA, June CH. CAR T therapy beyond cancer: the evolution of a living drug. Nature. 2023;619(7971):707-715.
  6. Raguram A, Banskota S, Liu DR. Therapeutic in vivo delivery of gene editing agents. Cell. 2022;185(15):2806-2827.
  7. Khawar MB, Afzal A, Si Y, Sun H. Steering the course of CAR T cell therapy with lipid nanoparticles. J Nanobiotechnology. 2024;22(1):380.
  8. Hamilton AG, Thatte AS, Xu J, Mai D, Billingsley MM, Mitchell MJ, et al. High-throughput in vivo screening using barcoded mRNA identifies lipid nanoparticles with extrahepatic tropism for in situ immunoengineering. Adv Mater. 2026;38(13):e14370.
  9. Żak MM, Yoo J, Utrero-Rico A, Kim J, Smith R, Wang L, et al. A tumor-selective mRNA system enables precision cancer treatment. Mol Ther. 2026;34(2):1066-1083.
  10. Han JH, Fagan E, Yeom K, Park JH. In situ chimeric antigen receptor macrophage therapy via co-delivery of mRNA and immunostimulant. ACS Nano. 2025;19(48):40798-40816.
  11. Chen X, Li X, Yan Y, Wang J, Liu Y, Zhang Q, et al. Splenic dendritic cell-targeting mRNA transfection of H-type ionizable lipid-based LNPs for enhancing tumor immunotherapy. Bioact Mater. 2026;61:429-447.
  12. Roundtree IA, Evans ME, Pan T, He C. Dynamic RNA modifications in gene expression regulation. Cell. 2017;169(7):1187-1200.
  13. Ikeda RA, Richardson CC. Interactions of the RNA polymerase of bacteriophage T7 with its promoter during binding and initiation of transcription. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83(11):3614-3618.
  14. Holtkamp S, Kreiter S, Selmi A, Simon P, Koslowski M, Huber C, et al. Modification of antigen-encoding RNA increases stability, translational efficacy, and T-cell stimulatory capacity of dendritic cells. Blood. 2006;108(13):4009-4017.
  15. Tada M, Abe N, Inagaki M, Sato K, Yamaguchi T, Tanaka H, et al. The effect of cap structure and poly(A) positioning on mRNA translation efficiency. Angew Chem Int Ed Engl. 2025;64(50):e202514124.
  16. Ye Z, Chen J, Zhao X, Li Y, Wang X, Zhang Y, et al. In vitro engineering chimeric antigen receptor macrophages and T cells by lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery. ACS Biomater Sci Eng. 2022;8(2):722-733.
  17. Billingsley MM, Singh N, Ravikumar P, Zhang R, June CH, Mitchell MJ. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Lett. 2020;20(3):1578-1589.
  18. Billingsley MM, Hamilton AG, Mai D, Singh N, Zhang R, Lee Y, et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Lett. 2022;22(1):533-542.
  19. Zong Y, Lin Y, Wei T, Cheng Q. Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy. Adv Mater. 2023;35(51):e2303261.
  20. Sun D, Lu ZR. Structure and function of cationic and ionizable lipids for nucleic acid delivery. Pharm Res. 2023;40(1):27-46.
  21. Su FY, Zhao QH, Dahotre SN, Li X, Wang Y, Zhang Z, et al. In vivo mRNA delivery to virus-specific T cells by light-induced ligand exchange of MHC class I antigen-presenting nanoparticles. Sci Adv. 2022;8(8):eabm7950.
  22. Herrera-Barrera M, Ryals RC, Gautam M, Patel A, Kim S, Wilson J, et al. Peptide-guided lipid nanoparticles deliver mRNA to the neural retina of rodents and nonhuman primates. Sci Adv. 2023;9(2):eadd4623.
  23. Kheirolomoom A, Kare AJ, Ingham ES, Mahakian LM, Tam SM, Silvestrini MT, et al. In situ T-cell transfection by anti-CD3-conjugated lipid nanoparticles leads to T-cell activation, migration, and phenotypic shift. Biomaterials. 2022;281:121339.
  24. Tombácz I, Laczkó D, Shahnawaz H, Muramatsu H, Natesan A, Yadegari A, et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Mol Ther. 2021;29(11):3293-3304.
  25. Rurik JG, Tombácz I, Yadegari A, Méndez Fernández PO, Shewale SV, Li L, et al. CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury. Science. 2022;375(6576):91-96.
  26. Shi D, Toyonaga S, Anderson DG. In vivo RNA delivery to hematopoietic stem and progenitor cells via targeted lipid nanoparticles. Nano Lett. 2023;23(7):2938-2944.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

CAR-T Hücre TedavisiLipid Nanopartikül İletimiClaudin18.2 HedeflemeCAR mRNA TransfeksiyonuT Hücresi AktivasyonuIn Situ CAR-T ÜretimiSolid Tümör İmmünoterapisiCAR Ekspresyon AnaliziIn Vitro TranskripsiyonAntitümör Etkinlik

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.