Yöntem makalesi

Heksametildisiloksan Kolaylaştırmalı Difüzyon ve İyon Seçici Elektrot Ölçümleri Kullanarak Bir Murin Modelinde Serum, Kemik ve Dişlerdeki Florürün Kantifikasyonu

20 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/71488

⸱

28 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

Bu makalede

Özet

Bu protokol, heksametildisiloksan (HMDS) destekli difüzyon kaplarının hazırlanmasını ve ardından farelerin serum, kemik ve dişlerindeki florür iyon kütlesini belirlemek için iyon seçici elektrot ölçümlerini tanımlamaktadır. Bu yöntem, biyolojik örneklerdeki florür birikimini değerlendirmek için kalibrasyon tabanlı ve hassas bir yaklaşım sunar.

Özet

Biyolojik dokulardaki florür seviyelerinin belirlenmesi, florür maruziyetini, metabolizmasını ve toksisitesini anlamak için temel önem taşır. Bu protokol, heksametildisiloksan (HMDS) destekli difüzyon ve ardından iyon seçici elektrot (ISE) analizi kullanarak serum, kemik ve dişlerdeki florür iyon kütlesini ölçmek için hassas ve tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlamaktadır. Kontrollü florür tedavilerine maruz kalan farelerden serum, femoral kemik ve mandibular kesici dişler dahil olmak üzere biyolojik örnekler toplanır. Kemik ve diş örnekleri küllendirilir, öğütülür ve hidrate edilirken, serum doğrudan işlenir. Her örnek, ultra saf su içeren bir difüzyon kabına aktarılır ve florür tuzakları olarak hizmet eden sodyum hidroksit damlacıklarının bulunduğu, petrolatuminle kaplanmış bir kapakla mühürlenir. HMDS ile doyurulmuş sülfürik asit enjeksiyonu, florür salınımını ve difüzyonunu başlatarak serbest kalan florür iyonlarının tuzaklarda nicel olarak yakalanmasını sağlar. Gece boyunca süren difüzyonun ardından, florür tuzağı damlacıkları tek bir örnekte birleştirilir, gerekli pH aralığına asitlenir ve ISE ölçümü için belirlenen bir hacme ayarlanır. Bilinen florür kütleleri ile hazırlanan kalibrasyon difüzyon kapları, nicelleştirme için bir standart eğri oluşturur ve kalite kontrol örnekleri elektrot stabilitesini doğrular. 0 veya 125 ppm florüre maruz kalan ergen ve yetişkin farelerden elde edilen temsili sonuçlar, yöntemin serum, kemik ve dişlerdeki florür seviyelerindeki yaşa ve doza bağlı farkları tespit etme yeteneğini göstermektedir. Bu protokol, çeşitli biyolojik matrislerde florürü nicelleştirmek için sağlam, kalibrasyon tabanlı bir yaklaşım sunar ve fare modellerinde florür maruziyeti, doku birikimi ve toksikolojik sonuçları inceleyen çalışmalar için oldukça uygundur. Bu yöntemin temel avantajı, difüzyon işleminin salınan tüm florürü 100 µL'den daha küçük ölçülebilir bir örnek hacmine konsantre etmesi sayesinde, tekil fare kesici dişlerinden elde edilen 3–5 mg kül dahil olmak üzere son derece küçük örneklerde florürü doğru bir şekilde nicelleştirebilmesidir.

Giriş

Florür doğal olarak oluşan bir anyondur ve optimal florür seviyesi dental karyosların önlenmesinde etkilidir1,2,3,4,5. Amerika Birleşik Devletleri'nde (ABD), karyos insidansını azaltmak ve ağız sağlığını geliştirmek amacıyla bir halk sağlığı stratejisi olarak 0.7 ppm düzeyinde toplu su florürlemesi uygulanmaktadır6. Ancak, aşırı miktarda florürün uzun süreli alımı birçok dokiyi olumsuz etkileyebilir. Yüksek florür maruziyeti mine oluşumunu bozar7,8,9, kemik oluşumunu değiştirir10 ve iskelet bütünlüğünü tehlikeye atar11.

Hücresel düzeyde florür maruziyeti; oksidatif stres12, endoplazmik retikulum stresi13, gen ekspresyonunu değiştiren epigenetik modifikasyonlar14 ve ameloblastlarda apoptoz15,16,17,18 dahil olmak üzere çeşitli metabolik bozukluklara yol açar. Küresel olarak, yer altı sularındaki yüksek florür konsantrasyonları (>1.5 ppm) ciddi bir sağlık sorunu teşkil etmektedir. Yakın tarihli bir öngörücü modelleme çalışması, dünya genelinde yaklaşık 180 milyon kişinin aşırı florür maruziyetinden potansiyel olarak etkilendiğini ve en yüksek yükün Asya ve Afrika'da olduğunu tahmin etmiştir1. Florür maruziyeti, içme suyunun yanı sıra gıdalar (örneğin, deniz ürünleri; ~1.9 ppm), içecekler (örneğin, çay; 0.5–6 ppm19) ve diş macunu gibi diş ürünleri20 (1,000–1,500 ppm) aracılığıyla da gerçekleşir.

Bu nedenle, florür maruziyetini, metabolizmasını ve dokulardaki birikimini anlamak, hem terapötik faydalarının hem de potansiyel toksikolojik sonuçlarının değerlendirilmesi için esastır. İdrar, serum, kemik ve dişler dahil olmak üzere biyolojik örneklerde florürün doğru şekilde miktar tayini, bu çalışmanın kritik bir bileşenidir. Ancak, florürün kimyasal davranışı ve kalsiyum açısından zengin matrislere olan güçlü ilgisi nedeniyle ölçüm analitik olarak zorludur. Vücuttaki florürün yaklaşık %99'u kemik ve dişler gibi mineralize dokularda bulunur21. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, iyon seçici elektrot (ISE) potansiyometrisi, iyon kromatografisi, kolorimetrik analizler, titrimetrik prosedürler ve nükleer veya aktivasyon tabanlı yöntemler dahil olmak üzere çeşitli analitik teknikler geliştirilmiştir22. Bunlar arasında, heksametildisiloksan (HMDS) kolaylaştırmalı difüzyon tekniğinin florür seçici elektrot ölçümü ile birleştirilmesi; hassasiyeti, tekrarlanabilirliği ve çeşitli örnek türleriyle uyumluluğu nedeniyle biyolojik matrisler için en güvenilir ve yaygın olarak kullanılan yaklaşımlardan biri olarak ortaya çıkmıştır23,24,25,26,27,28,29.

Çok sayıda analitik yöntemin mevcut olmasına rağmen, her yaklaşımın deneysel veya klinik araştırmalardaki kullanımını kısıtlayabilecek sınırlamaları vardır. İyon kromatografisi yüksek hassasiyet ve seçicilik sağlar, ancak özel cihazlar ve kapsamlı numune hazırlama gerektirir30,31. SPADNS (sodyum 2‑(parasülfofenilazo)‑1,8-dihidroksinaftalin-3,6‑disülfonat) yöntemi gibi kolorimetrik analizler basit ve ucuzdur, ancak bulanıklıktan ve endojen kromoforların girişimlerinden etkilenebilirler, bu da karmaşık biyolojik örneklerdeki güvenilirliklerini kısıtlar22,32,33. Titrimetrik yöntemler maliyet açısından etkili ve kolaydır, ancak çoğu biyolojik örnekte eser düzeyde florür tespiti için gereken hassasiyetten yoksundurlar34. Nükleer veya aktivasyon temelli teknikler olağanüstü hassasiyet sunar ancak reaktörlere veya hızlandırıcı tabanlı nötron kaynaklarına erişim gerektirir, bu da onları rutin laboratuvar kullanımı için pratik olmaktan çıkarır35. Buna karşılık, HMDS destekli difüzyonun ardından yapılan ISE ölçümü, hem yumuşak hem de mineralize dokulardan florürün tamamen serbest bırakılmasını sağlarken hassasiyet, maliyet ve erişilebilirlik açısından pratik bir denge sunar. Bu durum, doku miktarının sınırlı olduğu ve fare kesici dişleri gibi mineralize yapıların diş başına yalnızca 3–5 mg kül verdiği küçük hayvanlarla yapılan çalışmalar için özellikle avantajlıdır.

Difüzyon-ISE yönteminin salınan tüm florürü küçük ve tanımlanmış bir hacimde yoğunlaştırabilme yeteneği, son derece küçük örneklerde bile doğru nicel tayine olanak tanır. Bu durum, yöntemi toksikokinetik çalışmalar, doz-yanıt deneyleri ve gelişimsel aşamalar boyunca florür metabolizması araştırmaları için oldukça uygun hale getirir. Küçük kemirgenler, özellikle C57BL/6J fareler, florürün etkilerini incelemek için hayvan modelleri olarak yaygın şekilde kullanılmıştır7,9,12,29,36.

Bu protokolde yazarlar, yüksek florür dozuna (125 ppm) maruz bırakılan farelerden toplanan serum, kemik ve dişlerdeki florür miktarını, tedavi edilmemiş kontrollerle karşılaştırarak belirlemek amacıyla HMDS destekli difüzyon tekniğini ve ardından florür seçici elektrot ölçümünü uygulamaktadırlar. Yazarlar ayrıca, florür metabolizması ve doku birikimindeki yaşa bağlı farklılıkları değerlendirmek için ergen (tedavi başlangıcında 6 haftalık) ve yetişkin (tedavi başlangıcında 18 haftalık) farelerdeki florür birikimini karşılaştırmaktadırlar. Kemirgen kesici dişleri sürekli olarak sürdüğü ve yaklaşık 7 haftalık yaşa kadar sürme ile oklüzal aşınma arasında kararlı bir dengeye ulaştığı için temsilci diş dokusu olarak alt çene kesici dişleri seçilmiştir. Bu sürekli büyüme paterni, mine gelişimi için tutarlı ve erişilebilir bir gradyan sağlayarak fare kesici dişlerini, mine oluşumu ve dental florozis araştırmaları için yaygın olarak kullanılan ve doğrulanmış bir model haline getirmektedir.

Protokol

Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler, Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) tarafından akredite edilmiş olan Nova Southeastern University'deki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış omurgalı hayvan kullanımı kılavuz ve düzenlemelerine (Protokol No. 2023.02.MSuz1) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan çalışmaları, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı kılavuzuna ve American Veterinary Medical Association (AVMA) hayvanların ötanazisine yönelik kılavuzlarına uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışmada kullanılan tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hayvanlar ve bir fare modelinde sodyum florürün hazırlanması ve uygulanması

  1. Hayvanlar: Erkek C57BL/6J farelerini iki yaş kategorisine ayırın: tedavi başlangıcında 6 haftalık olan ergenler ve tedavi başlangıcında 18 haftalık olan yetişkinler.
    1. Her gruba, 6 haftalık maruziyet süresi boyunca ya florürsüz deiyonize su (0 ppm F⁻) ya da sodyum florür takviyeli içme suyu (125 ppm F⁻) sağlayın.
    2. Her yaş ve tedavi durumu için beş hayvan dahil edin (N = 5/grup).
    3. Maruziyet süresinin sonunda serum, femur ve mandibular kesici dişleri toplayın ve toplanan tüm örnekleri sonraki analizler için hazırlayın.
      ​NOT: Örnek: Küllendirilmiş kemik, küllendirilmiş diş ve serum gibi işlenmiş materyaller.
  2. Hayvan barındırma ve diyeti: Fareleri, yiyecek ve suya ad libitum erişimlerinin olduğu standart laboratuvar koşullarında barındırın.
    1. Arka plan florür seviyelerini en aza indirmek için, diş, kemik ve serum toplamasından bir hafta önce başlayarak florürsüz bir diyet uygulayın.
  3. Sodyum florürlü içme suyu
    1. Florür takviyeli içme suyu hazırlamak için, istenen florür konsantrasyonuna (örneğin, 125 ppm F⁻) ulaşacak şekilde sodyum florürü (NaF) deiyonize su içinde çözün.
    2. Çözeltiyi 0,2 µm vakum filtresiyle süzerek otoklavlanmış bir şişeye aktarın. Her 2 günde bir taze çözelti hazırlayın.
      DİKKAT: NaF yutulması halinde toksiktir; cilt ve göz tahrişine neden olabilir. Laboratuvar önlüğü, nitril eldiven ve koruyucu gözlük takarak çeker ocak altında çalışın.
  4. Florürsüz kontrol suyu için, deiyonize suyu 0,2 µm vakum filtresiyle süzerek otoklavlanmış bir şişeye aktarın. Her 2 günde bir taze su hazırlayın.
  5. Florür tedavisi için istenen süre boyunca florür takviyeli veya florürsüz içme suyunu ad libitum olarak sağlayın. Su seviyelerini günlük olarak izleyin ve şişeleri her 2 günde bir değiştirin.
  6. Maruziyet süresinin sonunda, hayvanları karbon dioksit (CO₂) inhalasyonu ve ardından dekapitasyon yoluyla ötanize edin. Ötanazi prosedürleri, AVMA Hayvanların Ötanazisi Kılavuzları'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve kurumsal IACUC protokolünün bir parçası olarak onaylanmıştır.
    DİKKAT: CO2 bir asfiksiyandır. İşlemleri iyi havalandırılan bir alanda gerçekleştirin ve haznenin düzgün çalıştığından emin olun. Doğrudan inhalasyondan kaçının.

2. Florür ölçümü için numune hazırlama

  1. Kan toplama
    1. Fareleri CO₂ inhalasyonu ile ötanize edin ve hemen 1 mL tüberkül şırıngası kullanarak terminal kardiyak ponksiyon yoluyla kan toplayın. Kanı 1,5 mL mikro santrifüj tüplerine aktarın. Kullanılan tüm iğne ve şırıngaları onaylı bir kurumsal kesici-delici atık konteynerine atın.
      UYARI: Şırınga iğneleri keskindir ve delinme yaralanmalarına neden olabilir; dikkatle taşıyın.
    2. Kanı oda sıcaklığında 30 dk bekletin, ardından 2.000 × g hızında 10 dk santrifüjleyin.
    3. Süpernatantı (serum) bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve −80 °C'de saklayın.
      UYARI: Ultra düşük sıcaklıklı dondurucular donma riski taşır. Tüpleri taşırken yalıtımlı eldivenler giyin ve soğuk yüzeylerle uzun süreli cilt temasından kaçının.
  2. Kemikler
    1. Femurların çıkarılması: Ötanazi sonrası, arka bacakları kalça eklemlerinden disseke edin.
    2. Femurlardaki tüm yumuşak dokuları dikkatlice temizleyin. Dokuları deiyonize suda üç kez yıkayın. Kemikleri ileri işleme kadar -80 °C'de saklayın. Çıkarılan yumuşak dokuları ve kontamine olmuş tüm malzemeleri kurumsal biyolojik atık akışına atın.
      NOT: Dokular, %70 etanol içinde uzun süreli saklama için %2 sakkaroz içeren %4 paraformaldehit ile 12–16 sa boyunca fikse edilebilir. Bu fiksasyon prosedürü, sonraki florür kantifikasyonunun doğruluğunu değiştirmez.
    3. Kemikleri deiyonize su ile iyice durulayın. Fazla nemi tüy bırakmayan bir kağıt havlu ile kurulayın.
    4. Kemikleri, buharlaşmaya izin vermek için kapakları açık 1,5 mL mikro santrifüj tüplerine aktarın ve 60 °C'deki kurutma fırınına 12–16 sa boyunca yerleştirin.
      UYARI: Kurutma fırını yanıklara neden olabilir. Numuneleri taşırken ısıya dayanıklı eldivenler kullanın.
    5. Kemiklerin küllendirilmesi: Kurutulmuş kemikleri alümina potalara aktarın. Potaları kül fırınına yerleştirin ve 150 °C/sa hızla 600 °C'ye ısıtın, ardından 6 sa boyunca bu sıcaklıkta tutun. Potaları çıkarmadan önce fırının 200 °C'nin altına soğumasını bekleyin. Kalan kemik parçalarını veya kontamine olmuş sarf malzemelerini kurumsal biyolojik atık akışına atın.
      UYARI: Kül fırını ve potalar aşırı sıcaklıklara ulaşır ve ciddi yanık riski oluşturur. Potaları taşımadan önce her zaman fırının soğumasını bekleyin. Potaları çıkarırken laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve ısıya dayanıklı eldivenler giyin; sıcak yüzeylerle doğrudan teması önlemek için uzun pensler kullanın.
      KRİTİK ADIM: Eksik küllendirme, sonraki analizleri tehlikeye atacaktır. İşleme devam etmeden önce kemik materyalinin tamamen okside bir duruma ulaştığını doğrulayın; herhangi bir kalıntı karbon, sonraki ölçümleri etkileyecektir.
      ​NOT: Doğru şekilde küllendirilmiş kemik, tekdüze açık gri ile beyaz arasında görünmelidir. Daha koyu parçacıklar —özellikle siyah veya kömür benzeri kalıntılar— eksik yanmayı gösterir. Renk değişimi mevcutsa, organik maddenin tamamen uzaklaştırılmasını sağlamak için küllendirme süresini uzatın.
    6. Küllendirilmiş kemiklerin saklanması: Küllendirme işleminin hemen ardından kemikleri 1,5 mL mikro santrifüj tüplerine aktarın. Tüpleri Parafilm ile mühürleyin ve kullanıma kadar vakumlu desikatörde saklayın.
  3. Dişler
    1. Mandibular insizörlerin çıkarılması: Mandibulayı maksilladan ayırmak için temporomandibular eklem seviyesinde yatay bir kesi yapın.
    2. Hem maksillayı hem de mandibulayı sol ve sağ yarılarına bölmek için mid-sagittal kesiler yapın.
    3. Dokuları deiyonize suda üç kez yıkayın ve mandibular insizörleri dikkatlice çıkarın. Çıkarılan insizörleri ileri kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. Çıkarılan yumuşak dokuları ve kontamine olmuş tüm sarf malzemelerini kurumsal biyolojik atık akışına atın.
      UYARI: Kişisel yaralanmaları önlemek için temporomandibular eklemde ve mid-sagittal planda kesiler yaparken keskin diseksiyon aletlerini dikkatli kullanın. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük dahil olmak üzere uygun KKD giyin.
      NOT: Dokular, %70 etanol içinde uzun süreli saklama için %2 sakkaroz içeren %4 paraformaldehit ile 12–16 sa boyunca fikse edilebilir. Bu fiksasyon prosedürü, sonraki florür kantifikasyonunun doğruluğunu değiştirmez.
    4. Dişlerin küllendirme hazırlığı: Dişleri deiyonize su ile iyice durulayın ve 12–16 sa boyunca %1 hidrojen peroksit (H₂O₂) içinde bekletin. Kullanılmış hidrojen peroksit çözeltilerini tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edin.
    5. Deiyonize su ile tekrar durulayın, tüy bırakmayan bir mendil ile kısa süreliğine kurulayın ve kapakları açık 1,5 mL mikro santrifüj tüplerine aktarın. Tüpleri 60 °C'deki kurutma fırınına 12–16 sa boyunca yerleştirin.
      UYARI: Hidrojen peroksit bir oksitleyicidir ve cilt ve göz tahrişine neden olabilir. Laboratuvar önlüğü, nitril eldiven ve koruyucu gözlük takarak çeker ocak altında çalışın. Yanıcı malzemelerle temasından kaçının.
    6. Dişlerin küllendirilmesi: Kurutulmuş dişleri alümina potalara aktarın ve kül fırınında 150 °C/sa hızla 600 °C bekleme sıcaklığında 20 sa boyunca küllendirin.
    7. Potaları ancak fırın 200 °C'nin altına soğuduktan sonra çıkarın.
      UYARI: Kül fırını ve potalar aşırı sıcaklıklara ulaşır ve ciddi yanık riski oluşturur. Potaları taşımadan önce fırının 200 °C'nin altına soğumasını bekleyin. Potaları çıkarırken laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve ısıya dayanıklı eldivenler giyin; sıcak yüzeylerle doğrudan teması önlemek için uzun pensler kullanın.
      KRİTİK ADIM: Tam oksidasyonu sağlayın; kalıntı karbon sonraki analizleri etkileyecektir.
      NOT: Küllendirilmiş diş materyali tekdüze açık gri ile beyaz arasında görünmelidir. Siyah kalıntılar kalırsa yeniden küllendirin.
    8. Küllendirilmiş diş numunelerinin saklanması: Küllendirmenin hemen ardından dişleri 2 mL yuvarlak tabanlı mikro santrifüj tüplerine aktarın.
    9. Tüpleri Parafilm ile mühürleyin ve kullanıma kadar vakumlu desikatörde saklayın.

3. HMDS destekli difüzyon kaplarının hazırlanması

  1. Reaktifler ve malzemeler
    1. 6 N sülfürik asit: Difüzyon plakalarını hazırlamadan en az iki gün önce, 6 N'lık bir stok çözelti hazırlayın N sülfürik asit.
      NOT: Difüzyon kabı: İşlenmiş biyolojik materyalden salınan bileşenlerin, kapağa sabitlenmiş bir kimyasal tuzağa yakalanabildiği, kontrollü ve kapalı bir ortam oluşturmak için tasarlanmış sızdırmaz kap. Sızdırmaz tasarım, dış hava ile değişimi önler ve salınan analitlerin sonraki ölçüm için tuzağa yönlendirilmesini sağlar.
    2. 1 adet yerleştirin manyetik karıştırıcı üzerindeki manyetik karıştırma çubuğu içeren L plastik bekere 416 ekleyin mL ultra saf su.
    3. 50'lik kullanarak mL serolojik pipetle, 84 yavaşça ekleyin 36 mL N H₂SO₄ sürekli karıştırarak suya ekleyin. Çözelti ısınacaktır; oda sıcaklığına gelene kadar soğumaya bırakın. Kullanılmamış veya tüketilmiş tüm sülfürik asit çözeltileri, kurumsal kimyasal atık akışı üzerinden tehlikeli kimyasal atık olarak imha edilmelidir.
      DİKKAT: Sülfürik asit yüksek derecede koroziftir. Aside dayanıklı eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takarak çeker ocak altında çalışın. Temas durumunda, bölgeyi derhal bol suyla durulayın.
    4. HMDS-doymuş 6 N sülfürik asit: 6 2'lik N sülfürik asit L ayırma hunisine aktarın ve 15 ekleyin mL heksametildisiloksan (HMDS).
    5. Tıpa ve musluğun sıkıca kapalı olduğundan emin olun, ayırma hunisini yan tutun ve küçük HMDS damlacıkları görünene kadar kuvvetlice çalkalayın.
    6. Gelişen gazın tahliye edilmesi için tıpaya açın ve işlemi iki kez daha tekrarlayın.
    7. Tıpayı birkaç saat boyunca aralık bırakın. 6 içeren ayırma hunisini saklayın Kimyasal çeker ocuk içindeki bir standa HMDS ile doyurulmuş sülfürik asit yerleştirin. HMDS içeren sülfürik asidi ve kontamine materyalleri tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edin.
      DİKKAT: HMDS yanıcıdır ve solunum yoluyla toksiktir. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük takarak çeker ocak altında çalışın. Ateş kaynaklarından uzak tutun.
    8. 0,05 N sodyum hidroksit: 1 miktarını çözün 25 ml'de g NaOH peletleri 1'lik hazırlamak için mL ultrapure su N stok çözeltisi.
    9. Karışım 2 1'in mL'si 38 ile N NaOH stok çözeltisi 0,05 elde etmek için mL ultra saf su N NaOH çözeltisi.
    10. 0,05'lik miktarları alikotlayın. 1,5'lik N NaOH tek kullanımlık mL mikrocentrifüj tüpleri kullanın, kapakları Parafilm ile sabitleyin ve CO2 girişini minimize etmek için tüpleri vakumlu bir desikatörde saklayın₂ absorpsiyon. Kullanılmamış veya kullanılmış sodyum hidroksit çözeltilerini tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edin.
      DİKKAT: Sodyum hidroksit yüksek derecede koroziftir ve ciddi yanıklara neden olabilir. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük takın. Sıçramaları önlemek için çözeltileri dikkatli bir şekilde taşıyın.
    11. 0,2 N asetik asit: 575 ekleyin µL ultrapure su ile glasiyal asetik asidi karıştırın ve nihai hacmi 50'ye tamamlayın 0,2 hazırlamak için mL N asetik asit. Asetik asit çözeltilerini tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edin.
      DİKKAT: Asetik asit koroziftir; cildi, gözleri ve solunum yollarını tahriş edebilir. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük takarak kimyasal çeker ocak altında çalışın.
    12. Petrolatum: Yaklaşık 100 g eritiniz 60°C'de g petrolatum °C bir fırında. Sıvı petrolatumu 10'a aspire edin mL'lik şırıngalara aktarın; soğumasına ve katılaşmasına izin verin. Petrolatum dolu şırıngalar oda sıcaklığında birkaç hafta boyunca saklanabilir.
    13. Petri kabı: 60 adet kullanın × 15 difüzyon plaklarının hazırlanması için mm işlem görmemiş Petri kapları.
    14. Isıtılmış 18-G şırınga iğnesi kullanarak bir Petri kabının kapağında küçük bir delik açın.
    15. Kapak iç kenarını, bir 10'luk yardımıyla kesintisiz bir petrolat sızdırmazlık katmanı ile kaplayın ucu küt 14G iğne takılmış mL şırınga G iğnesi. Kullanılan tüm iğneleri, kurum tarafından onaylanmış bir kesici-delici alet atık konteynerine atın.
      DİKKAT: Şırınga iğneleri keskindir ve delinme yaralanmalarına neden olabilir. Dikkatli taşıyınız ve onaylı tıbbi kesici-delici alet konteynerlerine atınız. İğneleri ısıtırken, yanıkları önlemek için ısıya dayanıklı eldivenler ve göz koruyucu kullanınız.
    16. Kalibrasyon difüzyon kapları için NaF stok çözeltileri. 4,19 miktarında çözün. 1 g NaF'de 100'lük hazırlamak için ultrapure su ekleyin mM stok çözelti. 10 hazırlayın mM, 100 µMve 10 µM 100'lük stok çözeltilerin ardışık 1:10 seyreltmeleri ile stok çözeltiler mM çözelti.
      NOT: Bir mol NaF, 19 g F⁻; bu nedenle, 1 µL 10 üzerinden µM NaF 0,19 içerir ng F⁻ ve 1 µL 10 üzerinden mM NaF 190 içerir ng F⁻.
      ​NOT: Kalibrasyon difüzyon kapları: Bilinen bir florür iyonu (F-) kütlesi ile özellikle kalibrasyon için kullanılan difüzyon kapları¯).
  2. Numuneye özgü difüzyon tabağı hazırlıkları
    1. Serum difüzyon kabı: Petri kabının tabanına 3 mL ultra saf su pipetleyin ve ekleyin 75 µL serum. Serumla kontamine olmuş tüm malzemeleri kurumun biyolojik atık akışına uygun şekilde imha edin. Adım 3.4 ile devam edin.
    2. Kemik difüzyon kabı
      1. Kemik külünün pulverizasyonu: Küllendirilmiş kemikleri 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerinin içinde ince bir toz haline getirmek için mikro spatula kullanın. Pulverize edilmiş kemik külünün işlemine derhal geçin. Kemik külü ile kontamine olmuş sarf malzemelerini kurumun kimyasal atık akışına uygun şekilde bertaraf edin.
      2. Kemik külünün tartılması ve hidratasyonu
        1. Okunabilirliği en az 0,1 olan bir analitik terazinin tartım kefesine boş Petri kabının alt kısmını yerleştirin. mg.
        2. Öğütülmüş kemik külünü 2'den aktarın statik yükü minimize etmek ve toz dağılımını önlemek için mL'lik mikro santrifüj tüpündeki içeriği küçük bir porselen kaba aktarın.
        3. Bir mikro spatula kullanarak yaklaşık 5 kabına mg kemik külü ekleyin ve tozun üzerini hemen 3 ile örtün kül dağılımını önlemek için kap analiz terazisinden kaldırılmadan önce mL ultrapure su ekleyin.
        4. Her bir kemik külü örneğinin tam ağırlığını kaydedin. [Şu] adımla devam edin 3.4.
    3. Diş difüzyon kabı
      1. Küllendirilmiş dişlerin öğütülmesi
        1. Külleştirilmiş kesici dişleri 2'ye aktarın mL yuvarlak tabanlı mikro santrifüj tüplerine ve 5 ekleyin Her tüpe mm çapında paslanmaz çelik boncuk ekleyin. Tüpleri kapatın ve kapakları Parafilm ile sabitleyin.
        2. Külleştirilmiş kesici dişleri, bir bead beater (boncuklu parçalayıcı) kullanarak 2.500 hızda toz haline getirin. 10 dakika boyunca rpm Öğütülmüş dişlerin işleme sürecine hemen geçiniz.
      2. Külleştirilmiş dişlerin tartılması ve hidratasyonu
        1. Paslanmaz çelik boncuk da dahil olmak üzere tüpün tüm içeriğini, analitik terazinin tartım kefesi üzerine yerleştirilmiş olan difüzyon kabının tabanına boşaltın. Diş külü içeren kontamine sarf malzemelerini kurumun kimyasal atık hattı üzerinden bertaraf edin.
        2. Paslanmaz çelik boncuğu kaptan çıkarın ve diş külünün kesin ağırlığını kaydedin (genellikle 3-4 (mandibuler kesici diş başına mg).
        3. Hemen 3 ekleyin statik boşalmanın neden olduğu kül dağılımını önlemek için, kabı teraziden kaldırmadan önce diş külünü kaplayacak şekilde mL ultrapure su ekleyin. Adıma devam edin 3.4.
  3. Difüzyon disklerinin kalibrasyonu ve kalite kontrolü
    1. Numune difüzyon kaplarına paralel olarak, 5-6 noktalı bir kalibrasyon için iki set kalibrasyon difüzyon kabı ve bir boş kontrol dahil olmak üzere bir adet özdeş kalite kontrol difüzyon kabı seti hazırlayın.
      NOT: Kalite kontrol difüzyon plakaları: Kalibrasyon difüzyon plakalarıyla aynı şekilde hazırlanır ancak elektrot stabilitesini doğrulamak ve tutarlı ölçüm performansı sağlamak için periyodik olarak kullanılır.
    2. Pipet 3 11 veya 13 Petri kabının her birine mL ultra saf su ekleyin ve beklenen F konsantrasyonlarını kapsayacak şekilde NaF stok çözeltisi ilave edin¯ numune örneklerindeki kütle aralığı. Adımla devam edin 3.4. difüzyon kabı düzeneğinin tamamlanması37.
  4. Difüzyon kabı düzeneğinin tamamlanması
    1. Bir florür tuzağı biriktirmesi oluşturmak için, 50 µl 0,05 N NaOH'den üç damla, Petri kabı kapağının iç yüzeyine, kapağın kenarından oldukça uzağa eklenir.
      NOT: Florür tuzağı (F¯ Tuzak): Difüzyon kaplarının, F'yi hapseden bir bileşeni¯, özellikle sodyum hidroksit (NaOH).
    2. NaOH damlacıklarını bozmadan kapağı ters çevirin ve petrolatum ile kabın tabanına sıkıca mühürleyin.
    3. 3 N HMDS-doymuş sülfürik asit çözeltisi hazırlamak için, eşit hacimlerde 6 N HMDS-doymuş sülfürik asit ve ultra saf suyu karıştırın. Saklanamadığı için kullanımdan hemen önce taze olarak hazırlayın.
    4. Hazırlanan 3 N HMDS-doymuş sülfürik asidin 3 mL'sini, 20 G iğne takılmış 10 ml'lik bir şırınga kullanarak, kapak üzerindeki delikten difüzyon kabının tabanındaki suyun içine enjekte edin. Şırınga iğnesini yerleştirirken veya çekerken asidin kapağın iç yüzeyine sıçramamasına dikkat edin.
    5. HMDS destekli florür difüzyonu: Enjeksiyon deliğini, açıklığı tamamen kapatacak şekilde bir miktar petrolatum ile derhal mühürleyin ve difüzyon kaplarını düşük hıza ayarlanmış bir değişken sallayıcıya yerleştirin. Oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin (Şekil 1).

figure-protocol-1
Şekil 1: Florür ekstraksiyonu ve yakalama için kemik difüzyon kabının şeması. Şekil 1, 60 × 15 mm boyutunda işlem görmemiş bir Petri kabında oluşturulan kemik difüzyon kabının tasarımını göstermektedir. Kapak, petrolatum boncukla sızdırmazlığı sağlanmış küçük bir enjeksiyon deliği içerir. Kapağın iç yüzeyinde, difüzyon sırasında kapaktan sarkan florür iyonu (F⁻) tuzakları olarak üç damla NaOH konumlandırılmıştır. Kapak, petrolatum kullanılarak kabın tabanına hava sızdırmaz şekilde mühürlenmiştir. Petri kabının tabanı, florür salınımı ve ardından yakalanması için reaksiyon ortamını birlikte oluşturan ultrapure su, heksametildisiloksan (HMDS)–doymuş sülfürik asit ve kemik külü içerir. Bu şekil, yazarlar tarafından Biorender kullanılarak oluşturulmuştur ve şekil CC BY lisansı altında lisanslanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. İyon seçici elektrot (ISE) ile florür ölçümü

  1. ISE'nin kurulumu
    1. Çift kanallı florür-selektif elektrodu uygun doldurma çözeltisi ile doldurun, potansiyometreye bağlayın ve elektrodu bir elektrot tutucuya sabitleyin.
    2. İşlem görmemiş bir Petri kabını, elektrodun algılama yüzeyinin altına, bir makaslı kriket üzerine yerleştirin; algılama yüzeyinin Petri kabının tabanına paralel olduğundan emin olun ve makaslı kriketin tablasını, Petri kabı elektroda neredeyse değecek şekilde kaldırın (Şekil 2).
  2. Ölçüm için numunelerin hazırlanması
    NOT: Numuneler: Protokolde numune olarak, difüzyondan sonraki F¯ tuzağından oluşan ve ardından asetik asit ve su ile birleştirilen, yalnızca iyon-selektif elektrot (ISE) ile ölçülen nihai ürünler kastedilmektedir. 
    1. Numunenin pH'ını 5'e ayarlamak için, inkübasyon süresinin ardından difüzyon kabını sallayıcıdan çıkarın ve petrolatum sızdırmazlığını bozarak kapağı dikkatlice kaldırın. Üç F¯ tuzak damlasının bozulmadan kaldığından emin olarak kapağı düz bir yüzeye ters çevirin.
    2. Bir P20 pipet ile bir damlaya 15–20 µL 0,2 N asetik asit ekleyin, ardından pipet ucunu değiştirmeden üç damlanın tamamını tek bir damla halinde birleştirin.
      NOT: Yüksek F¯ konsantrasyonuna sahip numuneler, başlangıçta daha düşük bir pH'a sahip olma eğilimindedir ve bu nedenle pH'ı 5'e ayarlamak için, daha az F¯ içeren numunelere kıyasla daha az 0,2 N asetik asit gerektirirler. Elektrot potansiyeli kaydedildikten sonra (adım 5.3) kalan numune hacmi minimum olduğundan, pH'ı indikatör kağıdı ile doğrulamak için mevcut olan tüm kalıntı numuneyi kullanın.
    3. Numune hacmini ayarlamak için, bir P100 pipeti 75 µL'ye ayarlayın, hava girmesine izin vermeden F¯ tuzağının tüm hacmini aspire edin ve ultra saf su kullanarak numuneyi tam olarak 75 µL'ye ayarlayın.
    4. Florür konsantrasyon hesaplamaları için doğru hacmi sağlamak amacıyla bu adımı dikkatle gerçekleştirin. Numuneyi pipet ucunda tutun ve hemen adım 4.3'e geçin.
  3. Örneklerin, kalibrasyon ve kalite kontrol numunelerinin ölçümü
    1. Numunenin elektrot potansiyelini ölçmek için, numuneyi florür-selektif elektrodun algılama yüzeyi ile Petri kabı arasına boşaltın. Elektrodun tüm algılama yüzeyinin, Petri kabına doğrudan temas etmeden tamamen sıvıya gömüldüğünden emin olun. Potansiyometrenin stabilize olmasını bekleyin ve ISE tarafından görüntülenen potansiyeli (mV) kaydedin.
    2. En düşük F¯ konsantrasyonundan başlayarak en yükseğe doğru, ilk kalibrasyon standart setini sırayla ölçerek kalibrasyon standart eğrisini belirleyin.
      1. Kalibrasyon eğrisini oluşturmak için elektrot potansiyelini (mV), F¯ (ng) logaritmasına karşı grafikleyin (Şekil 3). Standart eğri denklemini ve belirleme katsayısını (R2) elde etmek için eksponansiyel regresyon uygulayın. Kalibrasyon eğrilerini yalnızca R2 ≥ 0,99 olduğunda kabul edin.
    3. Her bir örnek numunesini ölçün ve elektrot potansiyelini (mV) kaydedin.
    4. Elektrot stabilitesini izlemek ve olası analiz sapmalarını tespit etmek için, her analiz çalışması boyunca aralıklarla kalite kontrol numunelerini ölçün.
      1. Zaman içinde stabil elektrot performansını doğrulamak için kalite kontrol numune değerlerini doğrudan ilgili kalibrasyon numuneleriyle karşılaştırın ve yaklaşık %5 dahilinde uyumu onaylayın.
      2. Numune hazırlama ve difüzyon sırasında florür kontaminasyonu olmadığını doğrulamak için periyodik olarak boş bir difüzyon kabı ölçün.
  4. Her bir örnek numunesindeki F¯(ng) kütlesini hesaplamak için standart eğri denklemini kullanın. Ardından bu kütleyi, difüzyon kabına eklenen serum hacmine (µL) veya kemik ya da diş külü kütlesine (mg) bölün.
    1. Kemik külündeki F¯ konsantrasyonunun örnek hesaplaması (ng/mg)
      1. Difüzyon kabına eklenen kemik külü kütlesi: 5,1 mg; 75 µL örnek numunesinin elektrot potansiyeli: –31,6 mV
      2. Adım 1: Kalibrasyon denklemini kullanarak florür kütlesini hesaplayın
        1. F⁻ kütlesi (ng) = 3505,4 x e(-0,043x-31,6)
        2. F⁻ kütlesi (ng) = 13.641 ng
      3. Adım 2: Kemik külündeki florür konsantrasyonunu hesaplayın
        1. F⁻ konsantrasyonu =  13.641 ng  /  5,1  mg
        2. F⁻ konsantrasyonu =  2.675 ng / mg (ppm)

figure-protocol-2
Şekil 2: ISE ölçüm düzeneğinin şeması. Şekil 2, çift kanallı bir iyon seçici elektrot (ISE) ile florür iyon ölçümleri için kullanılan konfigürasyonu göstermektedir. Bir Petri kabı, yüksekliğinin elektroda göre hassas bir şekilde ayarlanabilmesi için bir makaslı kriko üzerine yerleştirilmiştir. ISE bir potansiyometreye bağlanmıştır ve algılama yüzeyi Petri kabının düzlemine paralel olacak şekilde, yaklaşık 1–2 mm mesafe korunacak şekilde yönlendirilmiştir. Mesafe ayarlandıktan sonra, küçük bir hacimdeki numune (75 µL), algılama yüzeyi ile Petri kabı arasındaki boşluğa pipetlenerek numunenin ölçüm sırasında elektrodun algılama alanını tamamen kaplaması sağlanır. Bu şekil yazarlar tarafından Biorender kullanılarak oluşturulmuştur ve CC BY lisansı ile lisanslanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-3
Şekil 3: Diş numunelerindeki florür iyonu kütlesinin miktar tayini için kalibrasyon eğrisi ve ilgili kalibrasyon tablosu. Üst panel: Diş numunelerindeki florür iyonu kütlesini belirlemek için kullanılan örnek kalibrasyon eğrisi. x-ekseni elektrot potansiyelini (mV, doğrusal ölçek), y-ekseni ise karşılık gelen florür iyonu kütlesini (ng F⁻, logaritmik ölçek) göstermektedir. Ölçülen kalibrasyon noktaları düz bir çizgiyle, uydurulan eksponansiyel regresyon ise noktalı bir çizgiyle gösterilmiştir. İçteki kutucuk, standart eğri denklemini ve belirleme katsayısını (R2 = 0.99) göstermektedir. Alt panel: Kalibrasyon eğrisini oluşturmak için kullanılan sayısal değerleri içeren tablo. İlk satır, kalibrasyon numuneleri için kaydedilen beş elektrot potansiyelini (mV) listeler. İkinci satır, her bir kalibrasyon numunesi için karşılık gelen florür iyonu kütlelerini (ng F⁻) sağlar. Üçüncü satır, kalibrasyon difüzyon kaplarına eklenen 10 mM NaF stok çözeltisinin hacimlerini (µL) listeler; eklenen bu florür iyonu kütlesi, difüzyon sonrası her bir kalibrasyon numunesinde tutulan kütleye eşittir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Biyolojik materyallerdeki florür (F-) konsantrasyonlarının ölçümü için bu protokolün uygulamasını göstermek amacıyla, kontrollü florür tedavilerine maruz bırakılan farelerden toplanan serum, kemik ve mandibular kesici diş örneklerinden numuneler oluşturulmuştur. Erkek C57BL/6J fareleri; adolescent (6 haftalık) ve mature (18 haftalık) olmak üzere iki yaş kategorisine ayrılmış ve 6 haftalık maruziyet süresi boyunca ya florürsüz deiyonize su (0 ppm F⁻) ya da sodyum florür takviyeli içme suyu (125 ppm F⁻) ile beslenmiştir. Her yaş ve tedavi koşulu beş hayvan içermiştir. Maruziyet süresinin sonunda serum, femurlar ve mandibular kesici dişler toplanmış; numuneler protokole uygun olarak hazırlanmış ve analiz edilmiştir. Serum, kemik ve dişlerde ölçülen temsilci florür konsantrasyonları aşağıda özetlenmiştir.

figure-results-1
Şekil 4Serum, femur kemiği ve mandibular kesici dişlerde ölçülen florür konsantrasyonları. Erkek C57BL/6J fareleri, ergen (6 haftalık, boş çubuk) ve yetişkin (18 haftalık, dolu çubuk) olmak üzere iki yaş kategorisine ayrılmış ve kendilerine ya florürsüz deiyonize su (0 ppm F⁻) veya sodyum florür takviyeli içme suyu (125 ppm F⁻) 6 haftalık bir maruziyet süresi boyunca. Maruziyet süresinin sonunda, aynı tedavi gruplarından alınan (A) serum, (B) femoral kemik ve (C) mandibüler kesici dişlerdeki florür seviyeleri ölçülmüştür. Tespit sınırının altındaki serum değerleri (<0,02 ppm) görselleştirme amacıyla grafiğe aktarılmış ancak istatistiksel analizden hariç tutulmuştur. Veriler ortalamalar olarak ifade edilmiştir ± SD. Ergen ve yetişkin gruplar arasındaki karşılaştırmalar, çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni–Dunn düzeltmeli Mann–Whitney U testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *p < 0.05, **p < 0,01 (N = 5/grup). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Serumdeki florür konsantrasyonları
0 ppm florür ile tedavi edilen hem ergen hem de yetişkin gruplarda, serum florür konsantrasyonları iyon seçici elektrodun saptama limitinin altında kalmıştır (<0.02 ppm). 125 ppm tedavi gruplarında serum florür düzeyi, ergen grubunda 0.3 ± 0.2 ppm'e ve yetişkin grubunda 0.7 ± 0.2 ppm'e yükselmiştir (p = 0.06). 125 ppm tedavi gören ergen ve yetişkin gruplar arasındaki karşılaştırma, çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni-Dunn düzeltmeli Mann–Whitney U testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/grup). 0 ppm tedavi grupları istatistiksel analizden hariç tutulmuştur. (Şekil 4A, Tablo 1).

Femoral kemikte florür konsantrasyonları
0‑ppm uygulama gruplarında, ergenlerdeki femoral florür konsantrasyonları (292 ± 39 ppm), yetişkin hayvanlara (896 ± 55 ppm) kıyasla anlamlı derecede daha düşüktü (p < 0.01). Buna karşılık, 125‑ppm gruplarında ergenlerdeki florür konsantrasyonları (4.108 ± 482 ppm), yetişkin hayvanlara (2.966 ± 612 ppm) göre anlamlı derecede daha yüksekti (p = 0.04). Ergen ve yetişkin gruplar arasındaki karşılaştırmalar, çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni–Dunn düzeltmeli Mann–Whitney U testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/grup). (Şekil 4B, Tablo 1). Şekil 5A, her yaş grubu için 0‑ppm ve 125‑ppm uygulamaları arasındaki femoral florür kat değişimini göstermektedir. Ergenler 125 ppm'de florür seviyelerinde 14 kat artış sergilerken, yetişkin farelerde 3 kat artış görülmüştür.

Mandibuler kesici dişlerdeki florür konsantrasyonları
0 ppm gruplarında, mandibuler kesici diş florür konsantrasyonları ergenlerde (35 ± 4 ppm), yetişkin hayvanlara (123 ± 23 ppm) kıyasla anlamlı derecede daha düşüktü (p = 0.03). 125 ppm tedavi gruplarında, kesici diş florür konsantrasyonları ergenlerde 5641 ± 955 ppm'e ve yetişkin hayvanlarda 4392 ± 1694 ppm'e yükseldi. Ergen ve yetişkin gruplar arasındaki karşılaştırmalar, çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni–Dunn düzeltmeli Mann–Whitney U testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/grup). (Şekil 4C, Tablo 1). 125 ppm'deki mutlak florür konsantrasyonları yaş grupları arasında anlamlı bir farklılık göstermese de, 0 ppm'den 125 ppm'e olan kat değişim, ergen farelerde (161 kat artış), yetişkin farelere (36 kat artış) göre anlamlı derecede daha yüksekti (Şekil 5B).

figure-results-2
Şekil 5: Ergen fareler, kemik ve kesici diş florür birikiminde yetişkin farelere göre daha yüksek bir kat artış sergilemektedir. Ergen (boş çubuk) ve yetişkin (dolu çubuk) farelerde 0 ppm'den 125 ppm'e florür tedavisine bağlı florür konsantrasyonlarındaki kat değişimi. (A) Aynı tedavi gruplarından femoral kemik ve (B) mandibuler kesici diş. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir. Ergen ve yetişkin gruplar arasındaki karşılaştırmalar, eşleştirilmemiş t-testi kullanılarak yapılmıştır. * p < 0.05, (N = 5/grup). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ÖrnekSerumFemurMandibular Kesici Diş
Yaş GrubuErgenOlgunErgenOlgunErgenOlgun
Tedavi Grubu0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192Lütfen çevirmek istediğiniz kaynak metni sağlayın.72711114909
Ortalama< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
SDYOK0.2YOK0.239482556123955231694

Tablo 1: Serum, femoral kemik ve mandibular kesici dişlerdeki bireysel florür ölçümleri. Tablo 1, 0 ppm veya 125 ppm florüre maruz bırakılan ergen ve yetişkin farelerden alınan serum, femoral kemik ve mandibular kesici diş örneklerinde ölçülen bireysel florür konsantrasyonlarını (ppm F⁻) listelemektedir. Her doku tipi için veriler, dört tedavi grubuna karşılık gelen sütunlarda sunulmuştur: ergen 0 ppm, ergen 125 ppm, yetişkin 0 ppm ve yetişkin 125 ppm. Her sütun, beş bireysel kayıtlı değeri (N = 5) ve ardından hesaplanan ortalama ile standart sapmayı (SD) içermektedir. Ergen 0 ppm serum grubunda, tüm kayıtlı değerler iyon seçici elektrodun saptama sınırının altındaydı (<0,02 ppm). Tablo, Şekil 4'te gösterilen özet değerlerin ve istatistiksel karşılaştırmaların temelini oluşturan ham sayısal verileri sağlamaktadır.

Tartışma

Florür ölçümleri, lantan florür (LaF₃) kristal membran içeren florürle seçici bir iyon seçici elektrot (ISE) kullanılarak elde edilmiştir38,39. Bu membran, diğer halidlere kıyasla florür iyonlarına karşı güçlü bir tercih sağlayan, oldukça stabil La–F bağları oluşturur. Yerleşik elektrokimya literatürüne ve üretici spesifikasyonlarına göre, LaF₃ membran klorür için çok düşük seçicilik katsayıları sergilemektedir; bu da klorür iyonlarının bu protokolde kullanılan koşullar altında ölçülebilir bir girişime neden olmadığını göstermektedir. Klorür doğal olarak dişlerde ve kemikte bulunsa da, aktivitesi elektrot potansiyelini etkilemez ve kaydedilen sinyalle özellikle florür aktivitesi yansıtılır. 0,02 ppm alt saptama sınırı, Orion florür seçici elektrot için üretici tarafından onaylanmış minimum ölçülebilir konsantrasyona karşılık gelmektedir. Bu sınır, elektrodun stabil bir Nernst yanıtı ve kalibrasyon eğrisiyle doğrusal bir ilişki sürdürdüğü en düşük florür konsantrasyonunu yansıtır. Saptama sınırı, elektrodun membran özellikleri tarafından tanımlandığı ve üretici tarafından doğrulandığı için bu protokol için ek bir deneysel belirlemeye gerek duyulmamıştır; ancak üst saptama aralığına ilişkin olarak yazarlar, 50 µL NaOH tuzağındaki yaklaşık 38.000 ng'i aşan florür kütlelerinin doğrusal olmayan bir elektrot yanıtına yol açtığını gözlemlemişlerdir; bu da kalibrasyon eğrisinin çok yüksek florür yüklerinde artık güvenilir olmadığını göstermektedir. Bu doğrusallık kaybı, muhtemelen ISE'nin kendi içsel üst sınırını yansıtmaktan ziyade, verilen deneysel koşullar altında elektrot için optimal iyonik şiddet ve aktivite aralığının aşılmasından kaynaklanmaktadır. Bu eşiğin üzerinde florür kütleleri içermesi beklenen numuneler için, ölçümleri elektrodun doğrusal dinamik aralığında tutmak amacıyla NaOH tuzak hacminin artırılması önerilir.

Protokol, olağandışı derecede yüksek florür içeriğine sahip örneklere uygulandığında bu husus göz önünde bulundurulmalıdır. Difüzyon basamağı tüm örnek hacmini tükettiği için, biyolojik örnekler üzerinde mükerrer ölçümler ve spike‑and‑recovery (ekleme ve geri kazanım) deneyleri gerçekleştirilememiştir. Analitik doğruluk ve kesinliği sağlamak amacıyla, bilinen florür konsantrasyonlarını içeren kalite kontrol (QC) standartları her ölçüm serisine dahil edilmiştir. Bu QC standartları, deneysel örneklerle aynı şekilde işlenmiş ve ölçülmüştür. Tüm çalıştırmalar boyunca, QC standartlarının ölçülen florür konsantrasyonları tutarlı bir şekilde beklenen değerlerin %5'i dahilinde kalmıştır. 10–20 örneklik her bir spesimen serisi için, spesimen örneklerle paralel olarak 5–6 kalibrasyon örneğinden oluşan iki bağımsız set hazırlanmış ve her ölçüm oturumu öncesinde bir kalibrasyon eğrisi kaydedilmiştir. Kalibrasyon aralığı; spesimen tipine, difüzyon kabına eklenen materyal kütlesine, hayvanın tedavi grubuna ve yaşına bağlı olarak değişen, spesimen örneklerin beklenen florür kütlelerine yakın olacak şekilde her çalıştırma için ayarlanmıştır. Serum ölçümleri için kalibrasyon standartları, spesimendeki yaklaşık 0.06–1.20 ppm florür konsantrasyonlarına karşılık gelmekteydi. Kemik ve diş ölçümleri için kalibrasyon standartları ise spesimendeki yaklaşık 19–7,600 ppm florür konsantrasyonlarına karşılık gelmekteydi.

Bu protokol, heksametildisiloksan destekli difüzyon ve ardından gelen ISE analizi kullanılarak serum, kemik ve dişlerdeki florür iyon kütlesinin miktarlarını belirlemek için hassas ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunmaktadır. Yöntem, çeşitli biyolojik matrislerden salınan florürü güvenilir bir şekilde yakalar ve kontrollü maruziyet sonrası florür birikiminin kantitatif değerlendirmesine olanak tanır. Ergen ve yetişkin farelerden elde edilen temsili sonuçlar, dokular genelindeki florür birikiminde belirgin yaş ve doz bağımlı farklılıklar olduğunu göstermekte; bu da yaklaşımın florür metabolizması ve in vivo toksikokinetiği çalışmadaki faydasını vurgulamaktadır.

Bu protokolün temel bir güçlü yönü, florür salım reaksiyonunu florür tutucu ortamdan fiziksel olarak ayıran difüzyon kaplarının kullanılmasıdır. Petrolatum ile mühürlenmiş tasarım, atmosferik değişimi minimize eder ve serbest kalan florür iyonlarının kapaktaki sodyum hidroksit damlacıkları tarafından verimli bir şekilde yakalanmasını sağlar. HMDS doyurulmuş sülfürik asit, kemik ve dişler gibi yüksek derecede kalsifiye olmuş yapılar da dahil olmak üzere mineralize dokulardan florür salınımı için güçlü ve tutarlı bir itici güç sağlar. Difüzyonla eşleştirilmiş standartlarla kalibre edilen ardından gelen ISE ölçümü, geniş bir dinamik aralıkta doğru miktar belirlemeye olanak tanır. Bu yaklaşımın bir başka avantajı ise son derece küçük biyolojik örneklerdeki florürü miktar belirleme yeteneğidir. Farelerden alınan mineralize dokular, özellikle mandibüler kesici dişler, diş başına yalnızca 3–5 mg kül verir. Geleneksel analitik yöntemler, güvenilir tespit elde etmek için genellikle daha büyük örnek kütleleri veya daha yüksek florür içeriği gerektirir. Buna karşılık, difüzyon tabanlı tasarım, tüm örnekten salınan tüm florürü küçük ve tanımlanmış bir hacimde yoğunlaştırarak, düşük mutlak florür kütlesine sahip küçük örneklerde bile doğru miktar belirlemeye imkan tanır. Bu özellik, özellikle küçük hayvanları içeren çalışmalar, sınırlı doku mevcudiyeti veya mikro-disekte edilmiş mineralize yapılar için oldukça değerlidir.

Bu yöntemin temel bir kısıtlaması, bu çalışmada kullanılan ISE'nin tespit limitidir (0.02 ppm). Florür içermeyen kontrol hayvanlarından alınan serum örnekleri sıklıkla bu eşiğin altında kalmış ve bu durum oldukça düşük florür konsantrasyonlarının miktar tayininin yapılmasını engellemiştir. Mevcutsa, difüzyon kabına eklenen numune kütlesinin veya hacminin artırılması ya da tespit limitine yakın veya altındaki eser konsantrasyonların ölçümünde alternatif analitik tekniklerin kullanılması gerekebilir. Ayrıca yöntem, gece boyunca süren bir difüzyon süreci ve korozif reaktiflerin dikkatli kullanımını gerektirir; bu durum yüksek hacimli çalışmalarda işlem kapasitesini sınırlayabilir. ISE, toplam florür miktarının hassas bir şekilde belirlenmesini sağlasa da dokular içindeki uzamsal dağılımı değerlendiremez. Mikro ve makro ölçekte florür dağılımını görselleştirmek ve haritalamak için enerji dağılımlı X-ışını spektroskopisi ile birleştirilmiş taramalı elektron mikroskopisi (SEM-EDX) veya parçacıkla uyarılmış gama ışını emisyonu (PIGE) gibi tamamlayıcı yaklaşımlar sisteme dahil edilebilir. Bu görüntüleme tabanlı modaliteler, mineralize veya yumuşak dokulardaki lokalize florür birikiminin değerlendirilmesine olanak tanıyarak ISE ölçümlerini tamamlar ve doku florür içeriğinin daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağlar.

Bu protokolde florür difüzyonunun ve ölçümünün doğruluğu ile güvenilirliği birkaç tekrarlayan teknik faktörden etkilenebilir; gözlemlerimiz kalibrasyon hazırlığının, difüzyon kabı sızdırmazlığının, pH kontrolünün, elektrot performansının ve numune işlemenin veri kalitesini kolektif olarak nasıl şekillendirdiğini vurgulamaktadır. Lineer olmayan bir kalibrasyon eğrisi (R2 < 0,99) veya beklenen aralığın dışındaki doku örneği okumalarının olası nedenleri arasında, difüzyon kabına eklenen NaF stok çözelti hacminin yanlış hesaplanması veya kalibrasyon standartlarının hazırlanması sırasındaki pipetleme hataları yer alır. Önerilen işlem: Her çalışma için en az iki bağımsız kalibrasyon numune seti hazırlayarak, bir kalibrasyon eğrisi beklenen aralığın dışına çıktığında yedek bir setin mevcut olmasını sağlayın. Difüzyon kabının sızdırmazlığının yetersiz olması, difüzyon sırasında florür kaybına neden olarak yapay olarak düşük okumalarla sonuçlanabilir. Bu durum genellikle difüzyon kabı kapağının kenarına yetersiz petrolatum uygulandığında meydana gelir. Önerilen işlem: Difüzyon kabı kapağının kenarına bol miktarda petrolatum jeli uygulayın ve tam sızdırmazlık sağlamak için sıkıca bastırın. NaOH tuzağına asetik asit çözeltisi eklerken yapılan pipetleme hataları, numune pH'ını pH 5,0 olan optimal aralığın dışına çıkarabilir ve bu da yanlış florür geri kazanımına yol açabilir. Önerilen işlem: Her numunenin pH'ını pH kağıdı ile kontrol edin ve pH 5 dışındaki tüm numuneleri atın. Kalibrasyon numuneleri ayrıca florür seçici elektrodun geçerli kayıt sınırlarının dışında kalabilir. 0,02 ppm altındaki konsantrasyonlar elektrodun saptama sınırının altındadır. Önerilen işlem: 0,02 ppm'den daha az florür içeren kalibrasyon numuneleri kullanmayın. Aksine, aşırı yüksek florür konsantrasyonlarına sahip kalibrasyon numuneleri çözeltinin iyonikleliğini değiştirebilir ve lineer olmayan elektrot yanıtları üretebilir. Önerilen işlem: Projenin başlangıcında, kullanılan özel elektrodun lineer çalışma aralığını belirlemek için geniş bir florür konsantrasyon aralığını kapsayan kalibrasyon çözeltileri hazırlayın. Eğer doku numuneleri bu lineer aralığı aşarsa, doku kütlesini azaltın veya NaOH tuzağı hacmini artırın ve pH 5'i korumak için asetik asit hacmini buna göre ayarlayın. 0,02–1 ppm aralığında lineer kalibrasyon eğrileri elde etmedeki zorluk: Yaygın bir neden elektrot yaşlanmasıdır. Eski florür seçici elektrotlar, çok düşük florür konsantrasyonlarında hassasiyetlerini kaybederler. Önerilen işlem: Florür seçici elektrodu değiştirin. Kararsız potansiyometre okumaları (sinyal kayması veya sıçramaları), genellikle elektrodun algılama yüzeyi numune çözeltisine tamamen daldırılmadığında meydana gelir. Önerilen işlem: Algılama yüzeyi sıvı numune tarafından tamamen örtülecek şekilde elektrodu indirin.

Genel olarak bu protokol, çeşitli biyolojik matrislerde florür miktarını belirlemek için kalibrasyon tabanlı, sağlam bir yaklaşım sunmakta olup; fare modellerinde florür maruziyetini, doku birikimini ve toksikolojik sonuçları araştıran çalışmalar için oldukça uygundur.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu yayında bildirilen araştırmalar; Japan Society for the Promotion of Science; JSPS Overseas Research Fellowships 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.) ve National Institutes of Health bünyesindeki National Institute of Dental and Craniofacial Research; R01DE027648 (M.S.) ve K02DE029531 (M.S.) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetik Asit, GlasiyalSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
Alümina Porselen PotlarAdvalue Technology12 mm dış çap × 25 mm Y, AL-6212AL-6212
Analitik TeraziVWRVWR 124B2, d = 0,1 mg—
Boncuklu HomojenizatörKıyaslamaBeadBug 6—
Küt Uçlu Şırınga İğnesiAmazonEndüstriyel Küt Uçlu İğne, 14 G × 0,5 inçX001TT8KX1
KarbondioksitAirGas——
Kimyasal Çeker OcakMott ManufacturingModel 7421040—
D(+)-SükrozThermo ScientificBiyokimya için %99,7177142500
Elektrot Dolgu ÇözeltisiThermo ScientificOrion IonPlus Dolgu Çözeltisi900061
Etil Alkol ÇözeltisiKoptec140 Proof2401
Dondurucu, −80 °CThermo ScientificRevco RDE Serisi—
Isıya Dayanıklı EldivenlerFisher ScientificBel-Art Clavies Biyotehlike Otoklav EldivenleriH13201
Heksametildisiloksan (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
Hidrojen PeroksitVWRJ.T. Baker, %302204-01
İyon Seçici ElektrotThermo ScientificOrion Florür ISE, Çift Kanallı9609BNWP
Manyetik KarıştırıcıVWR360 Karıştırıcı—
Mikro SpatulaAmazonMum Oyma Spatulası #7A, Paslanmaz Çelik—
MikrosantrifüjEppendorf5427R5404000131
Kül FırınıThermo ScientificThermolyne Küçük Tezgah Üstü Kül Fırını, 1,3 L, FB1315MFB1315M
FırınBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
PBS İçinde Paraformaldehit ÇözeltisiThermo ScientificPBS içinde %4 ParaformaldehitJ19943-K2
Petri KabıVWR60 × 15 mm, İşlem Görmemiş25384-092
PetrolatumThermo ScientificPetrolatum, Beyaz, Saf417090010
pH İndikatör KağıdıFisher ScientificpH-Fix 4.5–10.092120.3
Porselen KapFisher ScientificFisherbrand Pota, 5 mL, 20 mm Yükseklik, Yüksek FormFB-965-B
PotansiyometreThermo ScientificOrion Dual Star pH/ISE Metre2115102
Klempli Ring StandVWRHalka Kelepçe, 15 cm470104-526
Kemirgen DiyetiBio-ServF1515, AIN-76A, ½ PeletlerF1515
Makaslı KrikoAmazonLaboratuvar Makaslı Kriko—
Ayırma HunisiFisher ScientificEisco, Borosilikat Cam, 2 LS89285
Sodyum KlorürFisher ScientificSertifikalı ACS, KristalizeS271-1
Sodyum FlorürFisher ScientificSertifikalı ACS, TozS299-100
Sodyum HidroksitFisher ScientificBeyaz PeletlerBP359-500
Paslanmaz Çelik BoncuklarFisher ScientificScientific Industries, 5 mm, 100 adetSI-CS05
Sülfürik AsitFisher ScientificACS DerecesiA300-500
TISAB IIThermo ScientificOrion IonPlus Uygulama Solüsyonu940909
Vakum DesikatörüFisher ScientificBel-Art Space Saver Vakumlu Desikatör, 10 inçF42010-0000
Vakum FiltresiFisher ScientificAkış Şişe Üstü Filtre, PES, 90 mm, 0.2 µm597-4520
Değişken Hızlı SallayıcıMidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

Kaynaklar

  1. Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x
  2. Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O'Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2
  3. Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885
  4. Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273
  5. Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279
  6. Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038
  7. Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302
  8. Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629
  9. Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.
  10. Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948
  11. Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.
  12. Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.
  13. Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200
  14. Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600
  15. Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.
  16. Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436
  17. Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495
  18. Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2
  19. Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.
  20. Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486
  21. Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.
  22. Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.
  23. Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.
  24. Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2
  25. Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.
  26. Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339
  27. Martínez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657
  28. Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.
  29. Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.
  30. Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.
  31. Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.
  32. Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.
  33. Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.
  34. Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.
  35. Kučera J, Štefánik, M. & Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.
  36. Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583
  37. Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.
  38. Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.
  39. Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

BiologyFluorideHexamethyldisiloxane HMDS facilitated diffusionion selective electrodeserumboneteeth
Video yakında

İlgili makaleler