Yöntem makalesi

Heksametildisiloksan Kolaylaştırmalı Difüzyon ve İyon Seçici Elektrot Ölçümleri Kullanarak Bir Murin Modelinde Serum, Kemik ve Dişlerdeki Florürün Kantifikasyonu

81 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71488

⸱

28 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

Bu makalede

Özet

Bu protokol, heksametildisiloksan (HMDS) destekli difüzyon kaplarının hazırlanmasını ve ardından farelerin serum, kemik ve dişlerindeki florür iyon kütlesini belirlemek için iyon seçici elektrot ölçümlerini tanımlamaktadır. Bu yöntem, biyolojik örneklerdeki florür birikimini değerlendirmek için kalibrasyon tabanlı ve hassas bir yaklaşım sunar.

Özet

Biyolojik dokulardaki florür seviyelerinin belirlenmesi, florür maruziyetini, metabolizmasını ve toksisitesini anlamak için temel önem taşır. Bu protokol, heksametildisiloksan (HMDS) destekli difüzyon ve ardından iyon seçici elektrot (ISE) analizi kullanarak serum, kemik ve dişlerdeki florür iyon kütlesini ölçmek için hassas ve tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlamaktadır. Kontrollü florür tedavilerine maruz kalan farelerden serum, femoral kemik ve mandibular kesici dişler dahil olmak üzere biyolojik örnekler toplanır. Kemik ve diş örnekleri küllendirilir, öğütülür ve hidrate edilirken, serum doğrudan işlenir. Her örnek, ultra saf su içeren bir difüzyon kabına aktarılır ve florür tuzakları olarak hizmet eden sodyum hidroksit damlacıklarının bulunduğu, petrolatuminle kaplanmış bir kapakla mühürlenir. HMDS ile doyurulmuş sülfürik asit enjeksiyonu, florür salınımını ve difüzyonunu başlatarak serbest kalan florür iyonlarının tuzaklarda nicel olarak yakalanmasını sağlar. Gece boyunca süren difüzyonun ardından, florür tuzağı damlacıkları tek bir örnekte birleştirilir, gerekli pH aralığına asitlenir ve ISE ölçümü için belirlenen bir hacme ayarlanır. Bilinen florür kütleleri ile hazırlanan kalibrasyon difüzyon kapları, nicelleştirme için bir standart eğri oluşturur ve kalite kontrol örnekleri elektrot stabilitesini doğrular. 0 veya 125 ppm florüre maruz kalan ergen ve yetişkin farelerden elde edilen temsili sonuçlar, yöntemin serum, kemik ve dişlerdeki florür seviyelerindeki yaşa ve doza bağlı farkları tespit etme yeteneğini göstermektedir. Bu protokol, çeşitli biyolojik matrislerde florürü nicelleştirmek için sağlam, kalibrasyon tabanlı bir yaklaşım sunar ve fare modellerinde florür maruziyeti, doku birikimi ve toksikolojik sonuçları inceleyen çalışmalar için oldukça uygundur. Bu yöntemin temel avantajı, difüzyon işleminin salınan tüm florürü 100 µL'den daha küçük ölçülebilir bir örnek hacmine konsantre etmesi sayesinde, tekil fare kesici dişlerinden elde edilen 3–5 mg kül dahil olmak üzere son derece küçük örneklerde florürü doğru bir şekilde nicelleştirebilmesidir.

Giriş

Florür doğal olarak oluşan bir anyondur ve optimal florür seviyesi dental karyosların önlenmesinde etkilidir1,2,3,4,5. Amerika Birleşik Devletleri'nde (ABD), karyos insidansını azaltmak ve ağız sağlığını geliştirmek amacıyla bir halk sağlığı stratejisi olarak 0.7 ppm düzeyinde toplu su florürlemesi uygulanmaktadır6. Ancak, aşırı miktarda florürün uzun süreli alımı birçok dokiyi olumsuz etkileyebilir. Yüksek florür maruziyeti mine oluşumunu bozar7,8,9, kemik oluşumunu değiştirir10 ve iskelet bütünlüğünü tehlikeye atar11.

Hücresel düzeyde florür maruziyeti; oksidatif stres12, endoplazmik retikulum stresi13, gen ekspresyonunu değiştiren epigenetik modifikasyonlar14 ve ameloblastlarda apoptoz15,16,17,18 dahil olmak üzere çeşitli metabolik bozukluklara yol açar. Küresel olarak, yer altı sularındaki yüksek florür konsantrasyonları (>1.5 ppm) ciddi bir sağlık sorunu teşkil etmektedir. Yakın tarihli bir öngörücü modelleme çalışması, dünya genelinde yaklaşık 180 milyon kişinin aşırı florür maruziyetinden potansiyel olarak etkilendiğini ve en yüksek yükün Asya ve Afrika'da olduğunu tahmin etmiştir1. Florür maruziyeti, içme suyunun yanı sıra gıdalar (örneğin, deniz ürünleri; ~1.9 ppm), içecekler (örneğin, çay; 0.5–6 ppm19) ve diş macunu gibi diş ürünleri20 (1,000–1,500 ppm) aracılığıyla da gerçekleşir.

Bu nedenle, florür maruziyetini, metabolizmasını ve dokulardaki birikimini anlamak, hem terapötik faydalarının hem de potansiyel toksikolojik sonuçlarının değerlendirilmesi için esastır. İdrar, serum, kemik ve dişler dahil olmak üzere biyolojik örneklerde florürün doğru şekilde miktar tayini, bu çalışmanın kritik bir bileşenidir. Ancak, florürün kimyasal davranışı ve kalsiyum açısından zengin matrislere olan güçlü ilgisi nedeniyle ölçüm analitik olarak zorludur. Vücuttaki florürün yaklaşık %99'u kemik ve dişler gibi mineralize dokularda bulunur21. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, iyon seçici elektrot (ISE) potansiyometrisi, iyon kromatografisi, kolorimetrik analizler, titrimetrik prosedürler ve nükleer veya aktivasyon tabanlı yöntemler dahil olmak üzere çeşitli analitik teknikler geliştirilmiştir22. Bunlar arasında, heksametildisiloksan (HMDS) kolaylaştırmalı difüzyon tekniğinin florür seçici elektrot ölçümü ile birleştirilmesi; hassasiyeti, tekrarlanabilirliği ve çeşitli örnek türleriyle uyumluluğu nedeniyle biyolojik matrisler için en güvenilir ve yaygın olarak kullanılan yaklaşımlardan biri olarak ortaya çıkmıştır23,24,25,26,27,28,29.

Çok sayıda analitik yöntemin mevcut olmasına rağmen, her yaklaşımın deneysel veya klinik araştırmalardaki kullanımını kısıtlayabilecek sınırlamaları vardır. İyon kromatografisi yüksek hassasiyet ve seçicilik sağlar, ancak özel cihazlar ve kapsamlı numune hazırlama gerektirir30,31. SPADNS (sodyum 2‑(parasülfofenilazo)‑1,8-dihidroksinaftalin-3,6‑disülfonat) yöntemi gibi kolorimetrik analizler basit ve ucuzdur, ancak bulanıklıktan ve endojen kromoforların girişimlerinden etkilenebilirler, bu da karmaşık biyolojik örneklerdeki güvenilirliklerini kısıtlar22,32,33. Titrimetrik yöntemler maliyet açısından etkili ve kolaydır, ancak çoğu biyolojik örnekte eser düzeyde florür tespiti için gereken hassasiyetten yoksundurlar34. Nükleer veya aktivasyon temelli teknikler olağanüstü hassasiyet sunar ancak reaktörlere veya hızlandırıcı tabanlı nötron kaynaklarına erişim gerektirir, bu da onları rutin laboratuvar kullanımı için pratik olmaktan çıkarır35. Buna karşılık, HMDS destekli difüzyonun ardından yapılan ISE ölçümü, hem yumuşak hem de mineralize dokulardan florürün tamamen serbest bırakılmasını sağlarken hassasiyet, maliyet ve erişilebilirlik açısından pratik bir denge sunar. Bu durum, doku miktarının sınırlı olduğu ve fare kesici dişleri gibi mineralize yapıların diş başına yalnızca 3–5 mg kül verdiği küçük hayvanlarla yapılan çalışmalar için özellikle avantajlıdır.

Difüzyon-ISE yönteminin salınan tüm florürü küçük ve tanımlanmış bir hacimde yoğunlaştırabilme yeteneği, son derece küçük örneklerde bile doğru nicel tayine olanak tanır. Bu durum, yöntemi toksikokinetik çalışmalar, doz-yanıt deneyleri ve gelişimsel aşamalar boyunca florür metabolizması araştırmaları için oldukça uygun hale getirir. Küçük kemirgenler, özellikle C57BL/6J fareler, florürün etkilerini incelemek için hayvan modelleri olarak yaygın şekilde kullanılmıştır7,9,12,29,36.

Bu protokolde yazarlar, yüksek florür dozuna (125 ppm) maruz bırakılan farelerden toplanan serum, kemik ve dişlerdeki florür miktarını, tedavi edilmemiş kontrollerle karşılaştırarak belirlemek amacıyla HMDS destekli difüzyon tekniğini ve ardından florür seçici elektrot ölçümünü uygulamaktadırlar. Yazarlar ayrıca, florür metabolizması ve doku birikimindeki yaşa bağlı farklılıkları değerlendirmek için ergen (tedavi başlangıcında 6 haftalık) ve yetişkin (tedavi başlangıcında 18 haftalık) farelerdeki florür birikimini karşılaştırmaktadırlar. Kemirgen kesici dişleri sürekli olarak sürdüğü ve yaklaşık 7 haftalık yaşa kadar sürme ile oklüzal aşınma arasında kararlı bir dengeye ulaştığı için temsilci diş dokusu olarak alt çene kesici dişleri seçilmiştir. Bu sürekli büyüme paterni, mine gelişimi için tutarlı ve erişilebilir bir gradyan sağlayarak fare kesici dişlerini, mine oluşumu ve dental florozis araştırmaları için yaygın olarak kullanılan ve doğrulanmış bir model haline getirmektedir.

Protokol

Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler, Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) tarafından akredite edilmiş olan Nova Southeastern University bünyesindeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan omurgalı hayvan kullanımı kılavuz ve düzenlemelerine (Protokol No. 2023.02.MSuz1) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan çalışmaları, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı kılavuzu ile Amerikan Veteriner Tıp Birliği (AVMA) hayvanların ötanazisine yönelik kılavuzlarına uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışmada kullanılan tüm materyaller Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hayvanlar ve bir fare modelinde sodyum florürün hazırlanması ve uygulanması

  1. Hayvanlar: Erkek C57BL/6J farelerini iki yaş kategorisine ayırın: tedavi başlangıcında 6 haftalık olan ergen grup ve tedavi başlangıcında 18 haftalık olan yetişkin grup.
    1. Her gruba, 6 haftalık bir maruziyet süresi boyunca ya florür içermeyen deiyonize su (0 ppm F⁻) ya da sodyum florür takviyeli içme suyu (125 ppm F⁻) sağlayın.
    2. Her yaş ve tedavi koşulu için beş hayvan dahil edin (N = 5/grup).
    3. Maruziyet süresinin sonunda serum, femur ve mandibüler kesiciler toplanmalı ve toplanan tüm örnekler ileri analizler için hazırlanmalıdır.
      NOT: Numune: Kül haline getirilmiş kemik, kül haline getirilmiş diş ve serum gibi işlenmiş materyaller.
  2. Hayvan barındırma ve diyeti: Fareleri, şu standart laboratuvar koşulları altında barındırın: ad libitum gıda ve suya erişim.
    1. Arka plan florür seviyelerini minimize etmek için diş, kemik ve serum örneklemesinden bir hafta önce başlayacak şekilde florür içermeyen bir diyet uygulayın.
  3. Sodyum florürlü içme suyu
    1. Florür takviyeli içme suyu hazırlamak için, istenen florür konsantrasyonunu (örneğin, 125 ppm F⁻) elde edecek şekilde sodyum florürü (NaF) deiyonize su içerisinde çözün.
    2. Çözeltiyi bir ... aracılığıyla süzün 0.2 µm otoklavlanmış bir şişeye vakum filtreleyin. Her 2 günde bir taze çözelti hazırlayın.
      DİKKAT: NaF yutulması durumunda toksiktir; ciltte ve gözlerde tahrişe neden olabilir. Laboratuvar önlüğü, nitril eldiven ve koruyucu gözlük takarak çeker ocak altında çalışın.
  4. Florür içermeyen kontrol suyu için, deiyonize suyu bir ... üzerinden filtreleyin 0.2 µm otoklavlanmış bir şişeye vakum filtresi ile süzün. Her 2 günde bir taze su hazırlayın.
  5. Florür takviyeli veya florürsüz içme suyu sağlayın ad libitum florür işlemi için istenen süre boyunca bekletin. Su seviyelerini günlük olarak izleyin ve şişeleri her 2 günde bir değiştirin.
  6. Maruziyet süresinin sonunda, hayvanlar karbondioksit (CO₂) inhalasyonu ve ardından dekapitasyon yoluyla sakrifiye edilmelidir. Ötanazi prosedürleri, AVMA Hayvanların Ötanazisine İlişkin Kılavuzları ile uyumlu olarak gerçekleştirilmiş ve kurumsal IACUC protokolünün bir parçası olarak onaylanmıştır.
    DİKKAT: CO2 bir boğucu ajandır. Prosedürleri iyi havalandırılan bir alanda gerçekleştirin ve kabinin düzgün çalıştığından emin olun. Doğrudan soluma yoluyla maruziyetten kaçının.

2. Florür ölçümü için numune hazırlama

  1. Kan toplama
    1. Fareleri CO₂ inhalasyonu ile ötanize edin ve 1 mL tüberküloz şırıngası kullanarak terminal kardiyak ponksiyon yoluyla derhal kan toplayın. Kanı 1,5 mL mikrocentrifüj tüplerine aktarın. Kullanılan tüm iğneleri ve şırıngaları onaylı bir kurum kesici atık konteynerine atın.
      DİKKAT: Şırınga iğneleri keskindir ve delinme yaralanmalarına neden olabilir; dikkatle kullanın.
    2. Kanı 30 dk boyunca oda sıcaklığında bekletin, ardından 2.000 × g hızda 10 dk santrifüjleyin.
    3. Süpernatantı (serum) bir mikrocentrifüj tüpüne aktarın ve −80 °C'de saklayın.
      DİKKAT: Ultra düşük sıcaklıklı dondurucular donma riski taşır. Tüpleri taşırken yalıtımlı eldivenler giyin ve soğuk yüzeylerle uzun süreli cilt temasından kaçının.
  2. Kemikler
    1. Femurların çıkarılması: Ötanazi sonrası, arka bacakları kalça eklemlerinden diske edin.
    2. Tüm yumuşak dokuları femurlardan dikkatlice temizleyin. Dokuları deiyonize su ile üç kez yıkayın. Kemikleri ileri işlemlere kadar -80 °C'de saklayın. Temizlenen yumuşak dokuları ve kontamine olmuş tüm malzemeleri kurumun biyolojik atık hattına atın.
      NOT: Dokular, %70 etanol içinde uzun süreli saklama için %2 sükroz içeren %4 paraformaldehitte 12–16 saat sabitlenebilir. Bu fiksasyon prosedürü, sonraki florür miktar belirleme analizinin doğruluğunu etkilemez.
    3. Kemikleri deiyonize su ile iyice durulayın. Fazla nemi hav bırakmayan bir kağıt havlu ile kurulayın.
    4. Kemikleri, buharlaşmaya izin vermek için kapakları açık 1,5 mL mikrocentrifüj tüplerine aktarın ve 60 °C'deki bir kurutma fırınında 12–16 saat bekletin.
      DİKKAT: Kurutma fırını yanıklara neden olabilir. Numuneleri taşırken ısıya dayanıklı eldivenler kullanın.
    5. Kemiklerin küle dönüştürülmesi: Kurutulmuş kemikleri alümina potlara aktarın. Potları kül fırınına yerleştirin ve 150 °C/sa hızla 600 °C'ye ısıtıp 6 saat boyunca bu sıcaklıkta tutun. Potları çıkarmadan önce fırının 200 °C'nin altına soğumasını bekleyin. Kalan kemik parçalarını veya kontamine olmuş sarf malzemelerini kurumun biyolojik atık hattına atın.
      DİKKAT: Kül fırını ve potlar aşırı sıcaklıklara ulaşır ve ciddi yanık riski oluşturur. Potları taşımadan önce her zaman fırının soğumasını bekleyin. Potları çıkarırken laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve ısıya dayanıklı eldivenler giyin; sıcak yüzeylerle doğrudan teması önlemek için uzun pensler kullanın.
      KRİTİK ADIM: Eksik küle dönüştürme işlemi, sonraki analizleri tehlikeye atacaktır. Devam etmeden önce kemik materyalinin tamamen oksitlenmiş duruma ulaştığını doğrulayın; kalıntı karbon sonraki ölçümleri etkileyecektir.
      NOT: Doğru şekilde küle dönüştürülmüş kemik, tek tip açık gri veya beyaz görünmelidir. Daha koyu parçacıklar —özellikle siyah veya kömür benzeri kalıntılar— eksik yanmayı gösterir. Renk değişimi varsa, organik materyalin tamamen uzaklaştırılması için küle dönüştürme süresini uzatın.
    6. Küllendirilmiş kemiklerin saklanması: Küllendirme işleminin hemen ardından kemikleri 1,5 mL mikrocentrifüj tüplerine aktarın. Tüpleri Parafilm ile kapatın ve kullanıma kadar vakumlu desikatörde saklayın.
  3. Dişler
    1. Mandibular kesici dişlerin çıkarılması: Mandibulayı maksilladan ayırmak için temporomandibular eklem seviyesinde yatay bir kesi yapın.
    2. Hem maksillayı hem de mandibulayı sol ve sağ yarıya bölmek için mid-sagittal kesiler yapın.
    3. Dokuları deiyonize su ile üç kez yıkayın ve mandibular kesici dişleri dikkatlice çıkarın. Çıkarılan kesici dişleri daha sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. Çıkarılan yumuşak dokuları ve kontamine olmuş tüm sarf malzemelerini kurumun biyolojik atık hattına atın.
      DİKKAT: Kişisel yaralanmaları önlemek için temporomandibular eklem ve mid-sagittal düzlemde kesiler yaparken keskin diseksiyon aletlerini dikkatli kullanın. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük dahil uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) kullanın.
      NOT: Dokular, %70 etanol içinde uzun süreli saklama için %2 sükroz içeren %4 paraformaldehitte 12–16 saat sabitlenebilir. Bu fiksasyon prosedürü, sonraki florür miktar belirleme analizinin doğruluğunu etkilemez.
    4. Dişlerin küllendirme için hazırlanması: Dişleri deiyonize su ile iyice durulayın ve 12–16 saat boyunca %1 hidrojen peroksit (H₂O₂) içinde bekletin. Kullanılmış hidrojen peroksit çözeltilerini tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edin.
    5. Tekrar deiyonize su ile durulayın, hav bırakmayan bir mendille kısa süreliğine kurulayın ve kapakları açık 1,5 mL mikrocentrifüj tüplerine aktarın. Tüpleri 60 °C'deki bir kurutma fırınında 12–16 saat bekletin.
      DİKKAT: Hidrojen peroksit bir oksitleyicidir ve cilt ile göz tahrişine neden olabilir. Laboratuvar önlüğü, nitril eldivenler ve koruyucu gözlük takarak çeker ocak altında çalışın. Yanıcı maddelerle temastan kaçının.
    6. Dişlerin küle dönüştürülmesi: Kurutulmuş dişleri alümina potlara aktarın ve 150 °C/sa hızla ısıtarak kül fırınında 600 °C bekleme sıcaklığında 20 saat boyunca küllendirin.
    7. Potları yalnızca fırın 200 °C'nin altına soğuduktan sonra çıkarın.
      DİKKAT: Kül fırını ve potlar aşırı sıcaklıklara ulaşır ve ciddi yanık riski oluşturur. Potları taşımadan önce fırının 200 °C'nin altına soğumasını bekleyin. Potları çıkarırken laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve ısıya dayanıklı eldivenler giyin; sıcak yüzeylerle doğrudan teması önlemek için uzun pensler kullanın.
      KRİTİK ADIM: Tam oksitlenme sağlandığından emin olun; kalıntı karbon sonraki analizleri etkileyecektir.
      NOT: Küllendirilmiş diş materyali tek tip açık gri veya beyaz görünmelidir. Siyah kalıntılar varsa yeniden küllendirme yapın.
    8. Küllendirilmiş diş numunelerinin saklanması: Küllendirmenin hemen ardından dişleri 2 mL yuvarlak tabanlı mikrocentrifüj tüplerine aktarın.
    9. Tüpleri Parafilm ile kapatın ve kullanıma kadar vakumlu desikatörde saklayın.

3. HMDS destekli difüzyon kaplarının hazırlanması

  1. Reaktifler ve malzemeler
    1. 6 N sülfürik asit: Difüzyon kaplarını hazırlamadan en az iki gün önce, 6 N sülfürik asit stok çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Difüzyon kabı: İşlenmiş bir biyolojik materyalden salınan bileşenlerin, kapağa sabitlenmiş bir kimyasal tuzak tarafından yakalanabildiği, kontrollü ve kapalı bir ortam oluşturmak için tasarlanmış sızdırmaz bir kaptır. Sızdırmaz tasarım, dış hava ile değişimi önler ve salınan analitlerin sonraki ölçüm için tuzağa yönlendirilmesini sağlar.
    2. Manyetik karıştırıcı üzerine manyetik balık içeren 1 L'lik plastik bir beher yerleştirin ve 416 mL ultrapure su ekleyin.
    3. 50 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, sürekli karıştırırken suya yavaşça 84 mL 36 N H₂SO₄ ekleyin. Çözelti ısınacaktır; oda sıcaklığına gelene kadar soğumasını bekleyin. Kullanılmayan veya tükenmiş tüm sülfürik asit çözeltilerini, kurumsal kimyasal atık akışı içinde tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edin.
      UYARI: Sülfürik asit oldukça korozifdir. Aside dayanıklı eldivenler, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takarak çeker ocak altında çalışın. Temas durumunda derhal bol su ile durulayın.
    4. HMDS-doymuş 6 N sülfürik asit: 6 N sülfürik asidi 2 L'lik bir ayırma hunisine aktarın ve 15 mL heksametildisiloksan (HMDS) ekleyin.
    5. Tıpanın ve musluğun sıkıca kapalı olduğundan emin olun, ayırma hunisini yan tutun ve küçük HMDS damlacıkları görünene kadar kuvvetlice çalkalayın.
    6. Oluşan gazı tahliye etmek için tıpayı açın ve işlemi iki kez daha tekrarlayın.
    7. Tıpayı birkaç saat boyunca aralık bırakın. 6 N HMDS-doymuş sülfürik asit içeren ayırma hunisini kimyasal çeker ocak içindeki bir standda saklayın. HMDS içeren sülfürik asidi ve kontamine malzemeleri tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edin.
      UYARI: HMDS yanıcıdır ve solunması durumunda toksiktir. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük takarak çeker ocak altında çalışın. Ateşleme kaynaklarından uzak tutun.
    8. 0.05 N sodyum hidroksit: 1 N stok çözelti hazırlamak için 1 g NaOH peletini 25 mL ultrapure su içerisinde çözün.
    9. 0.05 N NaOH çözeltisi elde etmek için 2 mL 1 N NaOH stok çözeltisini 38 mL ultrapure su ile karıştırın.
    10. 0.05 N NaOH'ı tek kullanımlık 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine paylaştırın, kapakları Parafilm ile sabitleyin ve CO₂ absorbsiyonunu en aza indirmek için tüpleri vakumlu desikatörde saklayın. Kullanılmayan veya tükenmiş sodyum hidroksit çözeltilerini tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edin.
      UYARI: Sodyum hidroksit oldukça kaustiktir ve ciddi yanıklara neden olabilir. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük takın. Sıçramaları önlemek için çözeltileri dikkatle taşıyın.
    11. 0.2 N asetik asit: Ultrapure suya 575 µL glasial asetik asit ekleyin ve 0.2 N asetik asit hazırlamak için son hacmi 50 mL'ye tamamlayın. Asetik asit çözeltilerini tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edin.
      UYARI: Asetik asit korozifdir ve cilt, gözler ve solunum yollarını tahriş edebilir. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük takarak kimyasal çeker ocak altında çalışın.
    12. Petrolatum: Yaklaşık 100 g petrolatumu bir fırında 60 °C'de eritin. Sıvı petrolatumu 10 mL'lik şırıngalara çekin ve soğuyup katılaşmasını bekleyin. Petrolatum dolu şırıngalar oda sıcaklığında birkaç hafta boyunca saklanabilir.
    13. Petri kabı: Difüzyon kaplarını hazırlamak için 60 × 15 mm'lik işlem görmemiş Petri kapları kullanın.
    14. Isıtılmış 18-G şırınga iğnesi kullanarak bir Petri kabının kapağına küçük bir delik açın.
    15. Kapağın iç kenarını, küt uçlu 14 G iğne takılmış 10 mL'lik bir şırınga kullanarak sürekli bir petrolatum sızdırmazlık tabakasıyla kaplayın. Kullanılan tüm iğneleri onaylı kurumsal kesici-delici alet atık konteynerine atın.
      UYARI: Şırınga iğneleri keskindir ve delinme yaralanmalarına neden olabilir. Dikkatle taşıyın ve onaylı kesici alet konteynerlerine atın. İğneleri ısıtırken yanıkları önlemek için ısıya dayanıklı eldivenler ve göz koruması kullanın.
    16. Kalibrasyon difüzyon kapları için NaF stok çözeltileri. 100 mM stok çözelti hazırlamak için 4.19 g NaF'ı 1 L ultrapure su içerisinde çözün. 100 mM çözeltinin ardışık 1:10 seyreltmeleri ile 10 mM, 100 µM ve 10 µM stok çözeltiler hazırlayın.
      NOT: Bir mol NaF, 19 g F⁻ sağlar; dolayısıyla 1 µL 10 µM NaF, 0.19 ng F⁻ ve 1 µL 10 mM NaF, 190 ng F⁻ içerir.
      ​NOT: Kalibrasyon difüzyon kapları: Özellikle bilinen bir florür iyonu (F¯) kütlesi ile kalibrasyon yapmak için kullanılan difüzyon kaplarıdır.
  2. Örnek spesifik difüzyon kabı hazırlıkları
    1. Serum difüzyon kabı: Petri kabının tabanına 3 mL ultrapure su pipetleyin ve 75 µL serum ekleyin. Serumla kontamine olmuş tüm malzemeleri kurumsal biyolojik atık akışına atın. Adım 3.4 ile devam edin.
    2. Kemik difüzyon kabı
      1. Kemik külünün pulverizasyonu: Küllemiş kemikleri 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpleri içinde ince bir toz haline getirmek için mikro spatula kullanın. Pulverize edilmiş kemik külünün işlemine derhal geçin. Kemik külü ile kontamine olmuş sarf malzemelerini kurumsal kimyasal atık akışına atın.
      2. Kemik külünün tartılması ve hidratasyonu
        1. Petri kabının boş tabanını, okunabilirliği en az 0.1 mg olan bir analitik terazinin tartım kefesine yerleştirin.
        2. Statik yükü en aza indirmek ve toz dağılımını önlemek için öğütülmüş kemik külünü 2 mL'lik mikrosantrifüj tüpünden küçük bir porselen kaba aktarın.
        3. Mikro spatula kullanarak kaba yaklaşık 5 mg kemik külü ekleyin ve kül dağılımını önlemek için kabı analitik teraziden kaldırmadan önce tozu derhal 3 mL ultrapure su ile kaplayın.
        4. Her bir kemik külü örneğinin kesin ağırlığını kaydedin. Adım 3.4 ile devam edin.
    3. Diş difüzyon kabı
      1. Küllenmiş dişlerin öğütülmesi
        1. Küllenmiş kesici dişleri 2 mL'lik yuvarlak tabanlı mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve her tüpe 5 mm çapında paslanmaz çelik bir boncuk ekleyin. Tüpleri kapatın ve kapakları Parafilm ile sabitleyin.
        2. Küllenmiş kesici dişleri bir bead beater cihazında 2,500 rpm'de 10 s boyunca pulverize edin. Öğütülmüş dişlerin işlemine derhal geçin.
      2. Küllenmiş dişlerin tartılması ve hidratasyonu
        1. Tüpteki tüm içeriği, paslanmaz çelik boncuk dahil olmak üzere, bir analitik terazinin tartım kefesine yerleştirilmiş difüzyon kabının tabanına boşaltın. Diş külü içeren kontamine sarf malzemelerini kurumsal kimyasal atık akışına atın.
        2. Paslanmaz çelik boncuğu kaptan çıkarın ve diş külünün kesin ağırlığını kaydedin (tipik olarak alt kesici diş başına 3–4 mg).
        3. Statik boşalmanın neden olduğu kül dağılımını önlemek için kabı teraziden kaldırmadan önce diş külünü kaplayacak şekilde derhal 3 mL ultrapure su ekleyin. Adım 3.4 ile devam edin.
  3. Kalibrasyon ve kalite kontrol difüzyon kapları
    1. Örnek difüzyon kaplarıyla paralel olarak, 5–6 noktalı bir kalibrasyon için iki set kalibrasyon difüzyon kabı ve bir boş (blank) dahil olmak üzere bir adet özdeş kalite kontrol difüzyon kabı seti hazırlayın.
      NOT: Kalite kontrol difüzyon kapları: Kalibrasyon difüzyon kaplarıyla aynı şekilde hazırlanır ancak elektrot stabilitesini doğrulamak ve tutarlı ölçüm performansı sağlamak için periyodik olarak kullanılır.
    2. 11 veya 13 Petri kabının her birine 3 mL ultrapure su pipetleyin ve örnek numunelerdeki beklenen F¯ kütle aralığını kapsayacak şekilde NaF stok çözeltisi ekleyin. Difüzyon kabı montajını tamamlamak için adım 3.4 ile devam edin37.
  4. Difüzyon kabı montajının tamamlanması
    1. Bir florür tuzağı birikintisi oluşturmak için, 0.05 N NaOH'tan 50 µl, Petri kabı kapağının iç yüzeyine, kapağın kenarından oldukça uzağa üç damla halinde eklenir.
      NOT: Florür tuzağı (F¯ Tuzağı): Difüzyon kaplarının, özellikle sodyum hidroksit (NaOH) kullanılarak F¯'yi yakalayan bileşenidir.
    2. NaOH damlacıklarını bozmadan kapağı ters çevirin ve petrolatum ile kabın tabanına sıkıca mühürleyin.
    3. 3 N HMDS-doymuş sülfürik asit çözeltisi hazırlamak için eşit hacimlerde 6 N HMDS-doymuş sülfürik asit ve ultrapure suyu karıştırın. Saklanamadığı için kullanımdan hemen önce taze olarak hazırlayın.
    4. Hazırlanan 3 N HMDS-doymuş sülfürik asidin 3 mL'sini, 20 G iğne takılmış 10 ml'lik bir şırınga kullanarak kapaktaki delikten difüzyon kabının tabanındaki suya enjekte edin. Şırınga iğnesini yerleştirirken veya çekerken asidin kapağın iç yüzeyine sıçramamasına dikkat edin.
    5. HMDS ile kolaylaştırılmış florür difüzyonu: Enjeksiyon deliğini derhal açıklığı tamamen kapatan bir petrolatum damlasıyla mühürleyin ve difüzyon kaplarını düşük hıza ayarlanmış bir değişken sallayıcı (rocker) üzerine yerleştirin. Oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin (Şekil 1).

Petri kabı şeması; F-Tuzak, petrolatum mühür, kemik külü, HDMS-doygun sülfürik asit işlemi.
Şekil 1: Florür ekstraksiyonu ve tuzaklama için kemik difüzyon kabının şeması. Şekil 1, 60 × 15 mm boyutunda işleme tabi tutulmamış bir Petri kabında monte edilmiş kemik difüzyon kabının tasarımını göstermektedir. Kapak, petrolatum boncuğu ile mühürlenmiş küçük bir enjeksiyon deliği içerir. Kapağın iç yüzeyinde, difüzyon sırasında kapaktan sarkan florür iyonu (F⁻) tuzakları olarak üç damla NaOH konumlandırılmıştır. Kapak, petrolatum kullanılarak kabın tabanına hava sızdırmaz şekilde mühürlenmiştir. Petri kabının alt kısmı, florür salınımı ve ardından tuzaklama için reaksiyon ortamını birlikte oluşturan ultrapure su, heksametildisiloksan (HMDS)–doygun sülfürik asit ve kemik külü içerir. Bu şekil yazarlar tarafından Biorender kullanılarak oluşturulmuş olup CC BY lisansı ile lisanslanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. ISE ile florür ölçümü

  1. ISE kurulumu
    1. Çift kanallı florür seçici elektrodu uygun doldurma çözeltisiyle doldurun, potansiyometreye bağlayın ve elektrodu bir elektrot tutucusuna sabitleyin.
    2. İşlem görmemiş bir Petri kabını, elektrodun algılama yüzeyinin altına, bir makaslı kriket üzerine yerleştirin; algılama yüzeyinin Petri kabının tabanına paralel olduğundan emin olun ve makaslı kriketin tablasını, Petri kabı elektroda neredeyse değecek şekilde kaldırın (Şekil 2).
  2. Ölçüm için numunelerin hazırlanması
    NOT: Numuneler: Protokolde numune olarak yalnızca, difüzyon sonrası F¯ tuzağından oluşan ve ardından asetik asit ve su ile birleştirilerek iyon seçici elektrot (ISE) ile ölçülen nihai ürünler kastedilmektedir. 
    1. Numunenin pH değerini 5'e ayarlamak için, inkübasyon süresinin ardından difüzyon kabını sarsıcıdan çıkarın ve petrolatum sızdırmazlığını bozarak kapağı dikkatlice kaldırın. Üç F¯ tuzak damlasının bozulmadan kaldığından emin olarak kapağı düz bir yüzeye ters çevirin.
    2. P20 pipet ile bir damlaya 15–20 µL 0.2 N asetik asit ekleyin, ardından pipet ucunu değiştirmeden üç damlayı tek bir damla halinde birleştirin.
      NOT: Yüksek F¯ konsantrasyonuna sahip numuneler, düşük başlangıç pH'ına sahip olma eğilimindedir ve bu nedenle pH'ı 5'e ayarlamak için, daha az F¯ içeren numunelere kıyasla daha az 0.2 N asetik asit gerektirir. Elektrot potansiyeli kaydedildikten (adım 5.3) sonra kalan numune hacmi minimum olduğu için, pH'ı indikatör kağıdı ile doğrulamak amacıyla mevcut olan tüm kalıntı numuneyi kullanın.
    3. Numune hacmini ayarlamak için, P100 pipeti 75 µL'ye ayarlayın, hava girişi olmadan F¯ tuzağının tüm hacmini aspire edin ve ultra saf su kullanarak numuneyi tam olarak 75 µL'ye tamamlayın.
    4. Florür konsantrasyonu hesaplamaları için doğru hacmi sağlamak amacıyla bu adımı dikkatle gerçekleştirin. Numuneyi pipet ucunda tutun ve hemen adım 4.3'e geçin.
  3. Örnek, kalibrasyon ve kalite kontrol numunelerinin ölçümü
    1. Numunenin elektrot potansiyelini ölçmek için, numuneyi florür seçici elektrodun algılama yüzeyi ile Petri kabı arasına boşaltın. Elektrodun tüm algılama yüzeyinin, Petri kabına doğrudan temas etmeden tamamen sıvıya daldığından emin olun. Potansiyometrenin stabilize olmasını bekleyin ve ISE tarafından görüntülenen potansiyeli (mV) kaydedin.
    2. En düşük F¯ konsantrasyonundan başlayarak en yükseğe doğru sırayla ilk kalibrasyon standartlarını ölçerek kalibrasyon standart eğrisini belirleyin.
      1. Kalibrasyon eğrisini oluşturmak için elektrot potansiyelini (mV), F¯ (ng) logaritmasına karşı grafiğe dökün (Şekil 3). Standart eğri denklemini ve belirleme katsayısını (R2) elde etmek için eksponansiyel regresyon uygulayın. Kalibrasyon eğrilerini yalnızca R2 ≥ 0.99 olduğunda kabul edin.
    3. Her bir örnek numuneyi ölçün ve elektrot potansiyelini (mV) kaydedin.
    4. Elektrot stabilitesini izlemek ve olası analiz kaymalarını tespit etmek için, her analitik çalışma boyunca aralıklı olarak kalite kontrol numunelerini ölçün.
      1. Kalite kontrol numunesi değerlerini doğrudan karşılık gelen kalibrasyon numuneleriyle karşılaştırın ve elektrodun zaman içindeki stabil performansını doğrulamak için yaklaşık %5 dahilinde bir uyum olduğunu onaylayın.
      2. Numune hazırlama ve difüzyon sırasında florür kontaminasyonunun olmadığını doğrulamak için periyodik olarak boş bir difüzyon kabını ölçün.
  4. Her bir örnek numunedeki F¯ kütlesini (ng) hesaplamak için standart eğri denklemini kullanın. Ardından bu kütleyi, difüzyon kabına eklenen serumun hacmine (µL) veya kemik ya da diş külünün kütlesine (mg) bölün.
    1. Kemik külündeki F¯ konsantrasyonunun örnek hesaplaması (ng/mg)
      1. Difüzyon kabına eklenen kemik külü kütlesi: 5.1 mg ; 75 µL örnek numunenin elektrot potansiyeli: –31.6 mV
      2. Adım 1: Kalibrasyon denklemini kullanarak florür kütlesini hesaplayın
        1. F⁻ kütlesi (ng) = 3505.4 x e(-0.043x-31.6)
        2. F⁻ kütlesi (ng) = 13,641 ng
      3. Adım 2: Kemik külündeki florür konsantrasyonunu hesaplayın
        1. F⁻ konsantrasyonu =  13,641 ng  /  5.1  mg
        2. F⁻ konsantrasyonu =  2,675 ng / mg (ppm)

Potansiyometrik analiz şeması: Potansiyometre ile ISE, iyon tespiti için makaslı krik üzerindeki örneği ölçer.
Şekil 2: ISE ölçüm düzeneğinin şeması.Şekil 2, çift kanallı bir iyon seçici elektrot (ISE) ile florür iyonu ölçümleri için kullanılan konfigürasyonu göstermektedir. Bir Petri kabı, yüksekliğinin elektroda göre hassas bir şekilde ayarlanabilmesi için makaslı bir krik üzerine yerleştirilmiştir. ISE bir potansiyometreye bağlanmış ve algılama yüzeyi Petri kabının düzlemine paralel olacak şekilde, yaklaşık 1–2 mm mesafe korunarak konumlandırılmıştır. Mesafe ayarlandıktan sonra, örneğin küçük bir hacmi (75 µL) algılama yüzeyi ile Petri kabı arasındaki boşluğa pipetlenerek, ölçüm sırasında örneğin elektrodun algılama alanını tamamen kaplaması sağlanır. Bu şekil, yazarlar tarafından Biorender kullanılarak oluşturulmuştur ve şekil CC BY lisansı altındadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Florür iyonu kalibrasyon grafiği; doğrusal regresyon; mV/nanogram cinsinden elektrot potansiyeli ile konsantrasyon.
Şekil 3: Diş numune örneklerindeki florür iyonu kütlesinin miktar tayini için kalibrasyon eğrisi ve ilgili kalibrasyon tablosu. Üst panel: Diş numune örneklerindeki florür iyonu kütlesini belirlemek için kullanılan örnek kalibrasyon eğrisi. x‑ekseni elektrot potansiyelini (mV, doğrusal ölçek) ve y‑ekseni ilgili florür iyonu kütlesini (ng F⁻, logaritmik ölçek) göstermektedir. Ölçülen kalibrasyon noktaları düz bir çizgi olarak işaretlenmiş ve uydurulmuş eksponansiyel regresyon noktalı bir çizgi olarak gösterilmiştir. Bir ek kutucukta standart eğri denklemi ve belirleme katsayısı (R2 = 0.99) yer almaktadır. Alt panel: Kalibrasyon eğrisini oluşturmak için kullanılan sayısal değerleri içeren tablo. İlk satır, kalibrasyon örnekleri için kaydedilen beş elektrot potansiyelini (mV) listeler. İkinci satır, her bir kalibrasyon örneği için ilgili florür iyonu kütlelerini (ng F⁻) sağlar. Üçüncü satır, kalibrasyon difüzyon kaplarına eklenen 10 mM NaF stok çözeltisinin hacimlerini (µL) listeler; eklenen bu florür iyonu kütlesi, difüzyon sonrası her bir kalibrasyon örneğinde hapsolan kütleye eşittir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Sonuçlar

Biyolojik materyallerdeki florür (F-) konsantrasyonlarını ölçmek için bu protokolün uygulamasını göstermek amacıyla, kontrollü florür tedavilerine maruz bırakılan farelerden toplanan serum, kemik ve mandibular kesici diş örneklerinden numuneler oluşturulmuştur. Erkek C57BL/6J fareleri, ergen (6 hafta) ve yetişkin (18 hafta) olmak üzere iki yaş kategorisine ayrılmış ve 6 haftalık maruziyet süresi boyunca ya florürsüz deiyonize su (0 ppm F⁻) ya da sodyum florür takviyeli içme suyu (125 ppm F⁻) ile beslenmişlerdir. Her yaş ve tedavi grubu beş hayvanı içermektedir. Maruziyet süresinin sonunda serum, femur ve mandibular kesici dişler toplanmış; numuneler protokole uygun olarak hazırlanmış ve analiz edilmiştir. Serum, kemik ve dişlerde ölçülen temsili florür konsantrasyonları aşağıda özetlenmiştir.

Florür konsantrasyonu sütun grafiği; serum, femur, kesici diş; ergen ve yetişkin analizi.
Şekil 4: Serum, femoral kemik ve mandibular kesici dişlerde ölçülen florür konsantrasyonları. Erkek C57BL/6J fareleri, ergen (6 haftalık, boş sütun) ve yetişkin (18 haftalık, dolu sütun) olmak üzere iki yaş kategorisine ayrılmış ve 6 haftalık bir maruziyet süresi boyunca florürsüz deiyonize su (0 ppm F⁻) veya sodyum florürle desteklenmiş içme suyu (125 ppm F⁻) ile beslenmiştir. Maruziyet süresinin sonunda, aynı tedavi gruplarındaki (A) serum, (B) femoral kemik ve (C) mandibular kesici dişlerdeki florür seviyeleri ölçülmüştür. Tespit limitinin altındaki serum değerleri (<0.02 ppm) görselleştirme amacıyla grafiğe eklenmiş ancak istatistiksel analizden hariç tutulmuştur. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir. Ergen ve yetişkin gruplar arasındaki karşılaştırmalar, çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni–Dunn düzeltmesi yapılmış Mann–Whitney U testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/grup). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Serumdeki florür konsantrasyonları
0 ppm florür ile tedavi edilen hem ergen hem de yetişkin gruplarda, serum florür konsantrasyonları iyon seçici elektrodun saptama sınırının altındaydı (<0.02 ppm). 125 ppm tedavi gruplarında serum florür düzeyi, ergen grubunda 0.3 ± 0.2 ppm'e, yetişkin grubunda ise 0.7 ± 0.2 ppm'e yükseldi (p = 0.06). 125 ppm tedavi gören ergen ve yetişkin gruplar arasındaki karşılaştırma, çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni–Dunn düzeltmesi ile birlikte Mann–Whitney U testi kullanılarak gerçekleştirildi. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/grup). 0 ppm tedavi grupları istatistiksel analizden hariç tutuldu. (Şekil 4A, Tablo 1).

Femoral kemikteki florür konsantrasyonları
0‑ppm tedavi gruplarında, ergenlerdeki femoral florür konsantrasyonları (292 ± 39 ppm), yetişkin hayvanlara (896 ± 55 ppm) kıyasla anlamlı derecede daha düşüktü (p < 0.01). Buna karşılık, 125‑ppm gruplarında, ergenlerdeki florür konsantrasyonları (4,108 ± 482 ppm), yetişkin hayvanlardan (2,966 ± 612 ppm) anlamlı derecede daha yüksekti (p = 0.04). Ergen ve yetişkin gruplar arasındaki karşılaştırmalar, çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni–Dunn düzeltmeli Mann–Whitney U testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/grup). (Şekil 4B, Tablo 1). Şekil 5A, her yaş grubu için 0‑ppm ve 125‑ppm tedavileri arasındaki femoral florür kat değişimini göstermektedir. Ergenler 125 ppm'de florür seviyelerinde 14 kat artış sergilerken, yetişkin fareler 3 kat artış göstermiştir.

Alt çene kesici dişlerdeki florür konsantrasyonları
0 ppm gruplarında, alt çene kesici diş florür konsantrasyonları ergenlerde (35 ± 4 ppm), yetişkin hayvanlara (123 ± 23 ppm) kıyasla anlamlı derecede daha düşüktü (p = 0.03). 125 ppm tedavi gruplarında, kesici diş florür konsantrasyonları ergenlerde 5641 ± 955 ppm'e ve yetişkin hayvanlarda 4392 ± 1694 ppm'e yükseldi. Ergen ve yetişkin gruplar arasındaki karşılaştırmalar, çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni–Dunn düzeltmeli Mann–Whitney U testi kullanılarak gerçekleştirildi. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/grup). (Şekil 4C, Tablo 1). 125 ppm'deki mutlak florür konsantrasyonları yaş grupları arasında anlamlı bir farklılık göstermese de, 0 ppm'den 125 ppm'e olan kat değişimi ergen farelerde (161 kat artış), yetişkin farelere (36 kat artış) göre anlamlı derecede daha fazlaydı (Şekil 5B).

Florürün femur ve kesici diş dokularındaki kat değişim üzerindeki etkisini gösteren bar grafiği, ergen vs. erişkin.
Şekil 5: Ergen fareler, erişkin farelere göre kemik ve kesici diş florür birikiminde daha yüksek bir kat artış sergiler. Ergen (açık bar) ve erişkin (dolu bar) farelerde 0 ppm'den 125 ppm florür uygulamasına kadar florür konsantrasyonlarındaki kat değişim. (A) Aynı tedavi gruplarından femoral kemik ve (B) mandibüler kesici diş. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir. Ergen ve erişkin gruplar arasındaki karşılaştırmalar bağımsız t-testi kullanılarak yapılmıştır. * p < 0.05, (N = 5/grup). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NumuneSerumFemurMandibuler Kesici Diş
Yaş GrubuErgenYetişkinErgenYetişkinErgenYetişkin
Tedavi Grubu0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192N/A72711114909
Ortalama< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
SSNA0.2NA0.239482556123955231694

Tablo 1: Serum, femoral kemik ve mandibüler kesici dişlerdeki bireysel florür ölçümleri. Tablo 1, 0 ppm veya 125 ppm florüre maruz kalan ergen ve yetişkin farelerden alınan serum, femoral kemik ve mandibüler kesici diş örneklerinde ölçülen bireysel florür konsantrasyonlarını (ppm F⁻) listelemektedir. Her doku tipi için veriler, dört tedavi grubuna karşılık gelen sütunlarda sunulmuştur: ergen 0 ppm, ergen 125 ppm, yetişkin 0 ppm ve yetişkin 125 ppm. Her sütun, beş bireysel kayıtlı değeri (N = 5) ve ardından hesaplanan ortalama ile standart sapmayı (SD) içermektedir. Ergen 0 ppm serum grubunda, tüm kayıtlı değerler iyon seçici elektrodun saptama limitinin altında kalmıştır (<0.02 ppm). Tablo, Şekil 4'te gösterilen özet değerlerin ve istatistiksel karşılaştırmaların temelini oluşturan ham sayısal verileri sağlamaktadır.

Tartışma

Florür ölçümleri, lantan florür (LaF₃) kristal membran içeren florürle seçici bir iyon seçici elektrot (ISE) kullanılarak elde edilmiştir38,39. Bu membran, diğer halidlere kıyasla florür iyonlarına karşı güçlü bir tercih sağlayan, oldukça stabil La–F bağları oluşturur. Yerleşik elektrokimya literatürüne ve üretici spesifikasyonlarına göre, LaF₃ membran klorür için çok düşük seçicilik katsayıları sergilemektedir; bu da klorür iyonlarının bu protokolde kullanılan koşullar altında ölçülebilir bir girişime neden olmadığını göstermektedir. Klorür doğal olarak dişlerde ve kemikte bulunsa da, aktivitesi elektrot potansiyelini etkilemez ve kaydedilen sinyalle özellikle florür aktivitesi yansıtılır. 0,02 ppm alt saptama sınırı, Orion florür seçici elektrot için üretici tarafından onaylanmış minimum ölçülebilir konsantrasyona karşılık gelmektedir. Bu sınır, elektrodun stabil bir Nernst yanıtı ve kalibrasyon eğrisiyle doğrusal bir ilişki sürdürdüğü en düşük florür konsantrasyonunu yansıtır. Saptama sınırı, elektrodun membran özellikleri tarafından tanımlandığı ve üretici tarafından doğrulandığı için bu protokol için ek bir deneysel belirlemeye gerek duyulmamıştır; ancak üst saptama aralığına ilişkin olarak yazarlar, 50 µL NaOH tuzağındaki yaklaşık 38.000 ng'i aşan florür kütlelerinin doğrusal olmayan bir elektrot yanıtına yol açtığını gözlemlemişlerdir; bu da kalibrasyon eğrisinin çok yüksek florür yüklerinde artık güvenilir olmadığını göstermektedir. Bu doğrusallık kaybı, muhtemelen ISE'nin kendi içsel üst sınırını yansıtmaktan ziyade, verilen deneysel koşullar altında elektrot için optimal iyonik şiddet ve aktivite aralığının aşılmasından kaynaklanmaktadır. Bu eşiğin üzerinde florür kütleleri içermesi beklenen numuneler için, ölçümleri elektrodun doğrusal dinamik aralığında tutmak amacıyla NaOH tuzak hacminin artırılması önerilir.

Protokol, olağandışı derecede yüksek florür içeriğine sahip örneklere uygulandığında bu husus göz önünde bulundurulmalıdır. Difüzyon basamağı tüm örnek hacmini tükettiği için, biyolojik örnekler üzerinde mükerrer ölçümler ve spike‑and‑recovery (ekleme ve geri kazanım) deneyleri gerçekleştirilememiştir. Analitik doğruluk ve kesinliği sağlamak amacıyla, bilinen florür konsantrasyonlarını içeren kalite kontrol (QC) standartları her ölçüm serisine dahil edilmiştir. Bu QC standartları, deneysel örneklerle aynı şekilde işlenmiş ve ölçülmüştür. Tüm çalıştırmalar boyunca, QC standartlarının ölçülen florür konsantrasyonları tutarlı bir şekilde beklenen değerlerin %5'i dahilinde kalmıştır. 10–20 örneklik her bir spesimen serisi için, spesimen örneklerle paralel olarak 5–6 kalibrasyon örneğinden oluşan iki bağımsız set hazırlanmış ve her ölçüm oturumu öncesinde bir kalibrasyon eğrisi kaydedilmiştir. Kalibrasyon aralığı; spesimen tipine, difüzyon kabına eklenen materyal kütlesine, hayvanın tedavi grubuna ve yaşına bağlı olarak değişen, spesimen örneklerin beklenen florür kütlelerine yakın olacak şekilde her çalıştırma için ayarlanmıştır. Serum ölçümleri için kalibrasyon standartları, spesimendeki yaklaşık 0.06–1.20 ppm florür konsantrasyonlarına karşılık gelmekteydi. Kemik ve diş ölçümleri için kalibrasyon standartları ise spesimendeki yaklaşık 19–7,600 ppm florür konsantrasyonlarına karşılık gelmekteydi.

Bu protokol, heksametildisiloksan destekli difüzyon ve ardından gelen ISE analizi kullanılarak serum, kemik ve dişlerdeki florür iyon kütlesinin miktarlarını belirlemek için hassas ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunmaktadır. Yöntem, çeşitli biyolojik matrislerden salınan florürü güvenilir bir şekilde yakalar ve kontrollü maruziyet sonrası florür birikiminin kantitatif değerlendirmesine olanak tanır. Ergen ve yetişkin farelerden elde edilen temsili sonuçlar, dokular genelindeki florür birikiminde belirgin yaş ve doz bağımlı farklılıklar olduğunu göstermekte; bu da yaklaşımın florür metabolizması ve in vivo toksikokinetiği çalışmadaki faydasını vurgulamaktadır.

Bu protokolün temel bir güçlü yönü, florür salım reaksiyonunu florür tutucu ortamdan fiziksel olarak ayıran difüzyon kaplarının kullanılmasıdır. Petrolatum ile mühürlenmiş tasarım, atmosferik değişimi minimize eder ve serbest kalan florür iyonlarının kapaktaki sodyum hidroksit damlacıkları tarafından verimli bir şekilde yakalanmasını sağlar. HMDS doyurulmuş sülfürik asit, kemik ve dişler gibi yüksek derecede kalsifiye olmuş yapılar da dahil olmak üzere mineralize dokulardan florür salınımı için güçlü ve tutarlı bir itici güç sağlar. Difüzyonla eşleştirilmiş standartlarla kalibre edilen ardından gelen ISE ölçümü, geniş bir dinamik aralıkta doğru miktar belirlemeye olanak tanır. Bu yaklaşımın bir başka avantajı ise son derece küçük biyolojik örneklerdeki florürü miktar belirleme yeteneğidir. Farelerden alınan mineralize dokular, özellikle mandibüler kesici dişler, diş başına yalnızca 3–5 mg kül verir. Geleneksel analitik yöntemler, güvenilir tespit elde etmek için genellikle daha büyük örnek kütleleri veya daha yüksek florür içeriği gerektirir. Buna karşılık, difüzyon tabanlı tasarım, tüm örnekten salınan tüm florürü küçük ve tanımlanmış bir hacimde yoğunlaştırarak, düşük mutlak florür kütlesine sahip küçük örneklerde bile doğru miktar belirlemeye imkan tanır. Bu özellik, özellikle küçük hayvanları içeren çalışmalar, sınırlı doku mevcudiyeti veya mikro-disekte edilmiş mineralize yapılar için oldukça değerlidir.

Bu yöntemin temel bir kısıtlaması, bu çalışmada kullanılan ISE'nin tespit limitidir (0.02 ppm). Florür içermeyen kontrol hayvanlarından alınan serum örnekleri sıklıkla bu eşiğin altında kalmış ve bu durum oldukça düşük florür konsantrasyonlarının miktar tayininin yapılmasını engellemiştir. Mevcutsa, difüzyon kabına eklenen numune kütlesinin veya hacminin artırılması ya da tespit limitine yakın veya altındaki eser konsantrasyonların ölçümünde alternatif analitik tekniklerin kullanılması gerekebilir. Ayrıca yöntem, gece boyunca süren bir difüzyon süreci ve korozif reaktiflerin dikkatli kullanımını gerektirir; bu durum yüksek hacimli çalışmalarda işlem kapasitesini sınırlayabilir. ISE, toplam florür miktarının hassas bir şekilde belirlenmesini sağlasa da dokular içindeki uzamsal dağılımı değerlendiremez. Mikro ve makro ölçekte florür dağılımını görselleştirmek ve haritalamak için enerji dağılımlı X-ışını spektroskopisi ile birleştirilmiş taramalı elektron mikroskopisi (SEM-EDX) veya parçacıkla uyarılmış gama ışını emisyonu (PIGE) gibi tamamlayıcı yaklaşımlar sisteme dahil edilebilir. Bu görüntüleme tabanlı modaliteler, mineralize veya yumuşak dokulardaki lokalize florür birikiminin değerlendirilmesine olanak tanıyarak ISE ölçümlerini tamamlar ve doku florür içeriğinin daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağlar.

Bu protokolde florür difüzyonunun ve ölçümünün doğruluğu ile güvenilirliği birkaç tekrarlayan teknik faktörden etkilenebilir; gözlemlerimiz kalibrasyon hazırlığının, difüzyon kabı sızdırmazlığının, pH kontrolünün, elektrot performansının ve numune işlemenin veri kalitesini kolektif olarak nasıl şekillendirdiğini vurgulamaktadır. Lineer olmayan bir kalibrasyon eğrisi (R2 < 0,99) veya beklenen aralığın dışındaki doku örneği okumalarının olası nedenleri arasında, difüzyon kabına eklenen NaF stok çözelti hacminin yanlış hesaplanması veya kalibrasyon standartlarının hazırlanması sırasındaki pipetleme hataları yer alır. Önerilen işlem: Her çalışma için en az iki bağımsız kalibrasyon numune seti hazırlayarak, bir kalibrasyon eğrisi beklenen aralığın dışına çıktığında yedek bir setin mevcut olmasını sağlayın. Difüzyon kabının sızdırmazlığının yetersiz olması, difüzyon sırasında florür kaybına neden olarak yapay olarak düşük okumalarla sonuçlanabilir. Bu durum genellikle difüzyon kabı kapağının kenarına yetersiz petrolatum uygulandığında meydana gelir. Önerilen işlem: Difüzyon kabı kapağının kenarına bol miktarda petrolatum jeli uygulayın ve tam sızdırmazlık sağlamak için sıkıca bastırın. NaOH tuzağına asetik asit çözeltisi eklerken yapılan pipetleme hataları, numune pH'ını pH 5,0 olan optimal aralığın dışına çıkarabilir ve bu da yanlış florür geri kazanımına yol açabilir. Önerilen işlem: Her numunenin pH'ını pH kağıdı ile kontrol edin ve pH 5 dışındaki tüm numuneleri atın. Kalibrasyon numuneleri ayrıca florür seçici elektrodun geçerli kayıt sınırlarının dışında kalabilir. 0,02 ppm altındaki konsantrasyonlar elektrodun saptama sınırının altındadır. Önerilen işlem: 0,02 ppm'den daha az florür içeren kalibrasyon numuneleri kullanmayın. Aksine, aşırı yüksek florür konsantrasyonlarına sahip kalibrasyon numuneleri çözeltinin iyonikleliğini değiştirebilir ve lineer olmayan elektrot yanıtları üretebilir. Önerilen işlem: Projenin başlangıcında, kullanılan özel elektrodun lineer çalışma aralığını belirlemek için geniş bir florür konsantrasyon aralığını kapsayan kalibrasyon çözeltileri hazırlayın. Eğer doku numuneleri bu lineer aralığı aşarsa, doku kütlesini azaltın veya NaOH tuzağı hacmini artırın ve pH 5'i korumak için asetik asit hacmini buna göre ayarlayın. 0,02–1 ppm aralığında lineer kalibrasyon eğrileri elde etmedeki zorluk: Yaygın bir neden elektrot yaşlanmasıdır. Eski florür seçici elektrotlar, çok düşük florür konsantrasyonlarında hassasiyetlerini kaybederler. Önerilen işlem: Florür seçici elektrodu değiştirin. Kararsız potansiyometre okumaları (sinyal kayması veya sıçramaları), genellikle elektrodun algılama yüzeyi numune çözeltisine tamamen daldırılmadığında meydana gelir. Önerilen işlem: Algılama yüzeyi sıvı numune tarafından tamamen örtülecek şekilde elektrodu indirin.

Genel olarak bu protokol, çeşitli biyolojik matrislerde florür miktarını belirlemek için kalibrasyon tabanlı, sağlam bir yaklaşım sunmakta olup; fare modellerinde florür maruziyetini, doku birikimini ve toksikolojik sonuçları araştıran çalışmalar için oldukça uygundur.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu yayında bildirilen araştırmalar; Japan Society for the Promotion of Science; JSPS Overseas Research Fellowships 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.) ve National Institutes of Health bünyesindeki National Institute of Dental and Craniofacial Research; R01DE027648 (M.S.) ve K02DE029531 (M.S.) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetik Asit, GlasiyalSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
Alümina Porselen PotlarAdvalue Technology12 mm dış çap × 25 mm Y, AL-6212AL-6212
Analitik TeraziVWRVWR 124B2, d = 0,1 mg—
Boncuklu HomojenizatörKıyaslamaBeadBug 6—
Küt Uçlu Şırınga İğnesiAmazonEndüstriyel Küt Uçlu İğne, 14 G × 0,5 inçX001TT8KX1
KarbondioksitAirGas——
Kimyasal Çeker OcakMott ManufacturingModel 7421040—
D(+)-SükrozThermo ScientificBiyokimya için %99,7177142500
Elektrot Dolgu ÇözeltisiThermo ScientificOrion IonPlus Dolgu Çözeltisi900061
Etil Alkol ÇözeltisiKoptec140 Proof2401
Dondurucu, −80 °CThermo ScientificRevco RDE Serisi—
Isıya Dayanıklı EldivenlerFisher ScientificBel-Art Clavies Biyotehlike Otoklav EldivenleriH13201
Heksametildisiloksan (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
Hidrojen PeroksitVWRJ.T. Baker, %302204-01
İyon Seçici ElektrotThermo ScientificOrion Florür ISE, Çift Kanallı9609BNWP
Manyetik KarıştırıcıVWR360 Karıştırıcı—
Mikro SpatulaAmazonMum Oyma Spatulası #7A, Paslanmaz Çelik—
MikrosantrifüjEppendorf5427R5404000131
Kül FırınıThermo ScientificThermolyne Küçük Tezgah Üstü Kül Fırını, 1,3 L, FB1315MFB1315M
FırınBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
PBS İçinde Paraformaldehit ÇözeltisiThermo ScientificPBS içinde %4 ParaformaldehitJ19943-K2
Petri KabıVWR60 × 15 mm, İşlem Görmemiş25384-092
PetrolatumThermo ScientificPetrolatum, Beyaz, Saf417090010
pH İndikatör KağıdıFisher ScientificpH-Fix 4.5–10.092120.3
Porselen KapFisher ScientificFisherbrand Pota, 5 mL, 20 mm Yükseklik, Yüksek FormFB-965-B
PotansiyometreThermo ScientificOrion Dual Star pH/ISE Metre2115102
Klempli Ring StandVWRHalka Kelepçe, 15 cm470104-526
Kemirgen DiyetiBio-ServF1515, AIN-76A, ½ PeletlerF1515
Makaslı KrikoAmazonLaboratuvar Makaslı Kriko—
Ayırma HunisiFisher ScientificEisco, Borosilikat Cam, 2 LS89285
Sodyum KlorürFisher ScientificSertifikalı ACS, KristalizeS271-1
Sodyum FlorürFisher ScientificSertifikalı ACS, TozS299-100
Sodyum HidroksitFisher ScientificBeyaz PeletlerBP359-500
Paslanmaz Çelik BoncuklarFisher ScientificScientific Industries, 5 mm, 100 adetSI-CS05
Sülfürik AsitFisher ScientificACS DerecesiA300-500
TISAB IIThermo ScientificOrion IonPlus Uygulama Solüsyonu940909
Vakum DesikatörüFisher ScientificBel-Art Space Saver Vakumlu Desikatör, 10 inçF42010-0000
Vakum FiltresiFisher ScientificAkış Şişe Üstü Filtre, PES, 90 mm, 0.2 µm597-4520
Değişken Hızlı SallayıcıMidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

Kaynaklar

  1. Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x
  2. Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O'Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2
  3. Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885
  4. Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273
  5. Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279
  6. Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038
  7. Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302
  8. Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629
  9. Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.
  10. Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948
  11. Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.
  12. Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.
  13. Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200
  14. Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600
  15. Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.
  16. Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436
  17. Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495
  18. Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2
  19. Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.
  20. Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486
  21. Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.
  22. Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.
  23. Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.
  24. Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2
  25. Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.
  26. Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339
  27. Martínez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657
  28. Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.
  29. Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.
  30. Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.
  31. Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.
  32. Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.
  33. Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.
  34. Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.
  35. Kučera J, Štefánik, M. & Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.
  36. Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583
  37. Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.
  38. Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.
  39. Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Florür KantifikasyonuHMDS DifüzyonuSerum FlorürüKemik FlorürüDiş FlorürüBiyolojik ÖrneklerStandart EğriDoku Birikimi

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.