İpek Fibroin Süngerleri Kullanılarak Optik Görüntüleme için 3D Hücre Kültürüne Dayalı Hibrit Biyoanalitik Platform

Özet

Makale, dinamik kültürü desteklemek için akış kontrollü koşullarda 4T1-iRFP720 meme kanseri hücrelerinin ipek iskelesi üretimi ve kültürü için basit, erişilebilir ve tekrarlanabilir bir metodolojiyi tanımlar. Hücresel büyüme ve göç, ana invaziv olmayan görüntüleme cihazı olarak in vivo optik görüntüleme cihazı kullanılarak kavram kanıtı olarak değerlendirildi.

Özet

Hücresel özelliklerin preklinik değerlendirmesi için tasarlanmış yenilikçi bir biyoanalitik hibrit platform sunuyoruz. Sistem, yapay ekstrasellüler matriks üzerinde yetiştirilen üç boyutlu (3D) hücre kültürünü kromatografiden ilham alan bir dizi konfigürasyonu ile birleştirir. Yapısal protein ipek fibroin'den yapılan süngerler, hem biyomimetik ekstrasellüler matriks hem de sabit bir faz olarak hizmet verir. İpek fibroin süngerleri, ham ipek liflerinden doğan serisin proteinlerinin çıkarıldığı, ardından fibroin çözeltisi arındırılması için çözünme ve diyaliz, organik çözücüde çözüntücü ve ardından tuz yatağı dökümü yapılarak kontrollü gözeneklilik/gözenek boyutlarına sahip ipek bazlı süngerler elde edilen çok aşamalı bir süreçle kendi içinde üretildi. Genetik olarak değiştirilmiş meme kanseri hücre hatları 4T1-iRFP720 ve 4T1-wt (floresan olmayan kontrol), pompa üzerinden sürekli bir ortam akışı kullanılarak ipek iskelelerde kültürlendi ve hücresel büyümeleri ile özellikleri, optik görüntüleme teknikleri (in vivo optik görüntüleme cihazı) kullanılarak invaziv olmayan şekilde analiz edildi. Kromatografik sistemlerin temel avantajlarını (otomasyon, tekrarlanabilirlik) gelişmiş 3D hücre kültürlerinin biyolojik önemiyle birleştirerek, platform doku benzeri mimari ve morfolojinin in vitro modellemesini sağlarken, dinamik hücresel davranışın izlenmesini kolaylaştırıyor. Paralel olarak, tıbbi görüntüleme teknolojisinin uygulanması, hücresel göç ve büyümenin gerçek zamanlı ve uzun süreli izlenmesini mümkün kılar. Bu yaklaşım, laminar benzeri bir akış sisteminde makroskobik ölçekte hücresel davranışların incelenmesi için önemli bir potansiyel sunar. In vitro modellerin fizyolojik önemini artırarak, bu yöntem in vivo çalışmalarla ilgili translasyonel boşluğu kapatmaya yardımcı olabilir ve hayvan deneyleri için azalt, değiştir, geliştir (3R) çerçevesiyle tutarlıdır.

Giriş

Canlı dokularda, hücre göçü ve büyümesi, biyofiziksel ve biyokimyasal ipuçları (örneğin ara akış ve hücre-hücre etkileşimleri) gibi üç boyutlu, heterojen hücre dışı bir matriks (ECM) içinde gerçekleşir. Bu faktörler, doku onarımı ve kanser istilası 1,2,3,4 gibi temel biyolojik süreçlerin temelini oluşturan hücre polaritesi, mekanik transdüksiyon ve koordineli hareketi düzenler.

Önemlerine rağmen, scratch ve Transwell testleri gibi çoğu in vitro göç testi, düz, statik substratlar üzerinde tek hücre hareketini değerlendirir. Basit ve maliyet etkin olmalarına rağmen, bu 2B yaklaşımlar in vivo mikro ortamın yapısal ve dinamik özelliklerini kötü bir şekilde^{yeniden üretmektedir 5,6}. Bu sınırlama, özellikle kanser metastazları bağlamında kritik hale gelir; burada tümör hücreleri mekanik ve kimyasal olarak çeşitli doku^{matrisleri 3,7,8} üzerinden topluca göç eder. 2D çizik testleri kolay yapıldığı için popülerliğini koruyor ancak ECM'nin karmaşıklığını veya sıvı akışının^{etkilerini yansıtmazlar.} Transwell tabanlı yaklaşımlar, yalnızca sabit uç noktalarda nicel okumalar sağlar ve göçün ^6,9'un sürekli gözlemini engeller.

Son çalışmalar, interstisyel akışın metastatik potansiyeli artırdığını, ECM sertliği ve bileşiminin ise epitelal-mezenkimal geçişi ve kolektif göçü teşvik^{ettiğini göstermiştir 4,10}. Küreler ve organoidler gibi daha gelişmiş 3D sistemler, doğal ECM ortamlarını daha iyi taklit eder; ancak kullanımları genellikle değişkenlik, sınırlı deneysel erişilebilirlik ve standartlaştırılmış analizdeki zorluklarla^{sınırlandırılır 11,12}. Mikrofluidik platformlar, mekanik ve akışkan koşullar üzerinde üstün kontrol sunar, ancak özel üretim yöntemleri ve ekipmanlarına bağımlılıkları yaygın kullanımlarını^sınırlar13. Bu nedenle, bu entegre ipuçlarını in vitro kontrollü, erişilebilir, invaziv olmayan ve maliyet etkin bir şekilde yeniden yaratmak büyük bir zorluk^{olmaya devam etmektedir 5,14}.

Bu zorlukları ele almak ve geleneksel 2B testler ile karmaşık in vivo modeller arasındaki boşluğu kapatmak için, ipek fibroin sünger iskelesi üzerine basit, akış özelliğine sahip 3D hücresel platform geliştirdik. Sistem, ECM benzeri bir iskele olarak ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip ipek bir sünger kullanır. İpek seçildi; gözenekli yapısı sayesinde nazik perfüzyon yapılabilir ve fizyolojik olarak önemli ara^{akışı destekler 15}. Biyouyumluluk ve biyomedikal ile doku mühendisliğinde yerleşik kullanımı, bu uygulama için uygun bir malzeme haline getirmektedir. Yakın zamanda yayımlanan bir yayın, iskelenin çevresel sürdürülebilirliği ve geri dönüşüm potansiyelini daha da^{göstermiştir 16}. Başka bir çalışmada, pozitron emisyon^{tomografisi 17} gibi farklı görüntüleme yöntemlerinde uyum sağlama yeteneklerini gösterdik. Bu önceki çalışma, aynı platform kavramını basitleştirilmiş in vivo optik görüntüleme tabanlı konfigürasyonda inşa ettiğimiz mevcut metodoloji açıklaması için temel oluşturdu. Bu çalışmalar birlikte, sistemin mühendislik doku yapılarının çoklu modal görüntüleme tabanlı değerlendirme potansiyelini göstermekte ve farklı kanser hücre modellerinde in vitro kültür ve in vivo ilgili okumaları entegre etmek için çok yönlü deneysel bir platform olarak kullanımını destekliyor.

Bir kavram kanıtı olarak, iRFP720 etiketli 4T1 üçlü negatif meme kanseri hücrelerini iskele içinde iki düşük kesme stresli akış koşulları altında beş gün boyunca kültürledik. İnvaziv olmayan in vivo optik görüntüleme izleme, statik kontrollere kıyasla belirgin akış yönlendirilmiş büyüme desenleri ve hücre popülasyonu dinamiklerinde önemli değişiklikler ortaya koydu. Mühendislik sadeliği ve tekrarlanabilirliği vurgulayarak, bu model 2D testler ile in vivo çalışmalar arasında pratik bir köprü sağlar ve araştırmacıların makroskopik ölçekte ve invaziv olmayan, akış aracılı hücresel özellikleri fizyolojik olarak ilgili ama erişilebilir bir formatta incelemelerini sağlar. Önceki metodolojilerin genellikle yıkıcı son nokta analizlerine dayanması veya standart tohumlama kriterlerinden yoksun olmasının aksine, bu protokol iskele üretimini optimize etmek için sistematik bir çerçeve sunar ve ardından hücre tohumlama ve görüntülemeyi sağlar. Bu yaklaşım, deneysel dayanıklılığı artırır ve 3D matrisler içindeki kolektif hücre dinamiklerinin daha kapsamlı, uzunlamasına bir bakış sunar; bu da büyüme ve göçü izlemek için mevcut yöntemlere göre önemli bir iyileştirme anlamına gelir.

Protokol

İlk bölüm, daha önce yayımlanmış çalışmalara dayanarak ipek fibroin iskelelerinin hazırlanmasını^{özetlemektedir 16}. Sonraki bölümler, hücre tohumlama yoğunluğunun optimizasyonu, akış entegrasyonu ve hücre hareketi ile büyümesini izlemek için optik görüntülemeyi açıklar. Bu çalışmada yalnızca yerleşik fare meme kanseri hücre hatları (4T1-wt ve 4T1-iRFP720) kullanıldı ve insan katılımcıları, hasta örnekleri, birincil dokular veya canlı hayvanlar dahil edilmedi. Kurumsal ve ulusal yönergelere uygun olarak, etik onay gerekmiyordu. İş akışının şematik bir özeti Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. İpek fibroin süngerinin hazırlanması

1. Koza temizleme ve gum temizleme.
   1. İpek kurdu Bombyx mori L. 'nin kozalarını bir güvenlik bistiltiyle kesin.
   2. Larvaları çıkarın ve en iç koza tabakasını (larva boşluğunu doğrudan çevreleyen kompakt tabaka) standart bir diseksiyon iğnesi ile çıkarın.
   3. Bir beaker'i 1,6 L çift damıtılmış su (_{ddH 2}O) ile doldurun.
   4. Manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin ve suyu kaynatarak kaynatın; Isınmayı hızlandırmak ve su kaybını azaltmak için bedekleri alüminyum folyo ile kaplayın.
   5. Su sıcaklığı yaklaşık 70 °C'ye ulaştığında 3,4 g Na₂CO₃ ekleyin.
   6. Karışım kaynamaya başladığında, 4 g hazırlanmış koza karışımını çözeltiye koyup cam çubukla karıştırın.
   7. Kozaları 30 dakika kaynatın, her 10 dakikada bir cam çubukla karıştırarak doğru şekilde maruz kalmanızı sağlayın.
   8. İpeği çözeltiden çıkarın ve kalan serisini çıkarmak için musluk suyla birkaç kez durulayın.
   9. Fazla suyu sıkıp ipek liflerini hazırlanmış bir alüminyum folyo kabın üzerine yay.
   10. İpek liflerini 50 °C'de önceden ısıtılan fırında tamamen kuruyana kadar (yaklaşık 18 saat) kurutun.
2. Çözülme ve diyaliz
   1. Sonraki adımlar için mutlak etanol ve susuz CaCl₂ kullanın. Çözünme matrisi, 1 parça CaCl₂, 2 parça etanol ve 8 parça ddH₂O içerir. Kuru sapsız ipeğin çözünme matrisine oranı 1:10 [w/w]'dir.
   2. Kurutulmuş ipeği tartın ve çözünme matrisi için doğru bileşenler miktarını hesaplayın.
   3. Ilgili miktardaki CaCl_2'yi karıştırma çubuğu ile donatılmış yuvarlak tabanlı bir şişeye doldurun.
   4. Gerekli miktarda etanol ve ddH_2Oölçüp birleştirin.
   5. Etanol-ddH_2Okarışımını karıştırırken CaCl_2'ye ekleyin.
   6. Bir reflü cihazı kurun ve karışımı yağ banyosunda 100 °C'ye kadar ısıtın, CaCl_2'nin çözünmesine izin verin ve karışımı kaynatın.
   7. Karışım kaynamaya başladığında, kurutulmuş ipeği ekleyin ve reflü altında 45 dakika ısıtın.
   8. 15 cm uzunluğunda, 3,5 kDa selüloz diyaliz tüplerini suyla birkaç kez durulayarak yeniden nemlendirerek hazırlayın, ardından bir ucunu cam çubuğun etrafına kapatıcı klipsle sararak sabitleyin.
   9. Kaynadıktan sonra, sıcak ipek çözeltiyi boruya aktarın ve karşı ucu bir klipsle mühürleyin; sıvı ile sızdırmazlık klipsi arasında 2–3 cm boşluk bırakın, hava muhazaları olmadan.
   10. Doldurulmuş diyaliz tüpünü ddH₂O ile doldurulmuş 2 L'lik bir beğere koyup oda sıcaklığında 72 saat diyaliz yapın; etkili arınma sağlamak için suyu günde iki kez değiştirin.
   11. Çözeltiyi 4500 × g sıcaklığında oda sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüjlendirin.
   12. Süpernatantı peleti rahatsız etmeden santrifüj tüplerine nazikçe dökün ve tüpleri -20 °C'de saklayın.
       NOT: Santrifüj tüplerini kapasitesinin yarısından fazla doldurun ve yatay pozisyonda dondurun.
3. Liyofilizasyon
   1. Vakum pompasını 20 dakika önceden ısıtın ve liyofilizacı üreticinin talimatlarına göre çalıştırın.
   2. Donmuş santrifüj tüplerini doğrudan dondurucudan çıkarak, yuvarlak tabanlı bir şişeye yerleştirin.
   3. Matayı liyofilizatöre takın ve 24 saat boyunca liyofilizasyon yapın.
   4. Daha fazla kullanıma kadar, liyofilize ipek fibroini oda sıcaklığında kuru bir yerde saklayın.
4. Çözücü dökümü ve partikül sızıntısı
   1. Gerekli miktarda liyofilize ipeği 1,1,1,3,3,3-heksafluoroizopropanol (HFIP) ile bir buhar kapçığında idrar örneği kabında ekleyerek %16 [w/v] bir çözelti elde edin ve son hacmi 30 mL ile alın ve kapı bir kapakla kapatın.
      DIKKAT: HFIP solulursa, yulursa veya cilt yoluyla emilirse aşındırıcı ve zararlıdır; Çözücüyü uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) takarak buharlı bir kaputu içinde kullanın ve cilt, göz ve buharlarla temas etmekten kaçının. Bir dökülme durumunda, sıvıyı emici malzemelerle toplayın ve etkilenen bölgeleri temizleyin. Kirlenmiş maddeleri belirlenmiş tehlikeli atık konteynerlerine aktarın.
   2. Kabı sıkıca kapatın ve ipeğin erimesi için 70 rpm'de 18 saat boyunca orbital sallayıcıya koyun.
   3. Farklı ağlar kullanarak NaCl elek yapın ve 500–800 μm oranını bir kenara bırakın.
   4. Petri kabını (9 cm çap, 8,5 cm taban çapı) 100 g elek tuzu (500–800 μm fraksiyonu) ile doldurun, böylece yükseklik 1,2 cm elde edilir. Yüzeyin eşit şekilde düz olduğundan emin olun.
   5. Hazırlanmış ipek çözeltisinden 25,5 mL nazikçe tuz tabakasına (sünger gözenek oluşumu için porojen) dökün.
   6. Petri kabını kapağıyla kapatın ve ipek çözeltinin tuz yatağına eşit şekilde sızması için 70 rpm'de 10 dakika boyunca yörünge silkeleyicisine koyun.
   7. Petri kabını kapağı kapalı şekilde 37 °C'de 1 saat kuluçka edin; ardından 37 °C'de ortaya çıkarılan Petri kabını 18 saat daha kuluçka altına alınır.
   8. Beta levha oluşumunu tetiklemek için, ipek kompoziti metanol içeren bir bedekte 20 dakika daldırın, ardından çıkarıp 50 °C (yaklaşık 1 saat) sıcaklıkta fırında kurutulun.
      DIKKAT: Metanol son derece toksiktir; Uygun PPE giyerek buharlı bir kapüşon takın, cilt temasından ve buhara maruz kalmaktan kaçının. Bir dökülme durumunda, sıvıyı emici malzemelerle toplayın ve etkilenen bölgeleri temizleyin. Kirlenmiş maddeleri belirlenmiş toksik atık konteynerlerine aktarın.
   9. Porojen NaCl'yi, ipek kompoziti sıcak musluk suyu içeren bir bedekte en az 3 saat daldırarak çıkarır ve her 20–30 dakikada bir su değişimi yapılır; malzeme sert parçalar kalmadan yumuşak ve sünger benzeri bir dokuya ulaşana kadar.
   10. İpek süngeri dezenfeksiyon ve kısa süreli koruma için %70 etanol içinde 4 °C'de sakla.
       NOT: HFIP içeren çözeltiler halojenlenmiş çözücü atığı olarak toplanmışken, metanol atığı ise kurumsal kimyasal güvenlik yönergelerine uygun olarak ayrı olarak halojenlenmemiş organik çözücü atığı olarak bertaraf edilmiştir. Kullanım sonrası dekontaminasyon için, HFIP veya metanole maruz kalan kaplar ve çalışma yüzeyleri uyumlu bir çözücüyle duruldu ve deterjan çözeltisiyle temizlendi. İlk durulamalar ve kirlenmiş tüketim malzemeleri kimyasal tehlikeli atık olarak toplandı.

2. İpek iskele hazırlanması ve dengelenmesi

1. 6 mm çapında bir biyopsi deliği kullanarak ipek fibroin süngerleri kesilerek 6 mm çapında ve 12 mm yükseklikte silindirik iskeleler elde edilir.
   NOT: Hazırlanmış ipek fibroin sünger iskeleleri, %70 etanol içinde 4 °C'de 4 aya kadar saklanabilir; Uzun süreli depolama için periyodik olarak taze etanol ile değiştirilmesi önerilir. Dengelenmiş iskeleler, hücre kültür ortamında 4 °C sıcaklıkta 1 aya kadar saklanabilir.
2. Örnekleri dezenfeksiyon için %70 etanol içeren santrifüj tüplerine yerleştirin.
3. Sonraki adımları sertifikalı biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirerek kirlenmeyi önleyin.
4. Etinolü pipetle aspire ederek süngeri cımbızla bastırın.
5. Süngerleri, tamamen batırmak için 10–20 mL takviyeli Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 malzemesi içeren bir Petri kabına yerleştirin.
6. Medyayı üç kez değiştirin, her alışveriş arasında hafif bir silkeleme yapın.
7. Üçüncü yıkamadan sonra taze malzeme ekleyin, kapağı sıkıca kapatın ve parafin filmiyle sarın.
8. Süngerleri hücre kültürü için kullanmadan önce en az bir hafta buzdolabında 4 °C sıcaklıkta saklayın. Bu süre zarfında medya 4–5 kez değiş tokuş edildi.
   NOT: Etanolün tamamen çıkarılmasını sağlayın, çünkü kalıntı etanol sitotoksiktir ve hücre bağlanmasını ve canlılığını zayıflatmaktadır.

3. Arka plan ölçümü ve görüntüleme optimizasyonu

1. Boş optik şeffaf filtrasyon tüplerini ve tohumlanmamış ipek iskeleler içeren optik olarak şeffaf filtrasyon tüplerini in vivo optik görüntülemeye taşıyor.
   NOT: Görüntüleme, 2D epifloresans modunda in vivo optik görüntüleme kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
2. Farklı filtre çiftlerinde görüntüleme (uyarılma: 675 nm, 745 nm; emisyon: 720 nm, 800 nm), pozlama süreleri (4–60 s), f-stop sayıları (1–8), görüş alanı (13,5–22,5 cm) ve değişken lamba seviyelerinde (düşük ve yüksek) görüntüleme yapılabilir.
3. Hücre tohumlu iskeleler kullanmadan önce her iki platformu aynı koşullarda görüntülemek için otofloresansı değerlendirin.
4. Erkek Luer kilidi girişini, sadece görüntüleme amaçlı kurulumlar için erkek Luer kilidi konnektöründen yüksek yoğunluklu otofloresan artefaktını ortadan kaldırmak için kesilmiş dişi Luer-kilitli konnektörle değiştirin. Tüm deneylerde malzemeler aynıysa, bu adım sadece bir kez gereklidir.
    

4. Hücre süspansiyonlarının hazırlanması ve ipek fibroin iskelelerine tohumlama

NOT: Sonraki tüm adımları steril koşullarda biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirin; çünkü bu prosedürler canlı hücreler ve hücre içeren örneklerin işlenmesini içerir.

1. 4T1 vahşi tip (4T1-wt) ve 4T1-iRFP720 fare üçlü negatif meme kanseri hücrelerini düzenli olarak kontaminasyon ve iRFP720 ifadesinin stabilitesi için izleyin.
2. 4T1-wt ve 4T1-iRFP720 sare üç negatif meme kanseri hücrelerini, %10 fetal buzağı serumu, %1 L-glutamin ve %1 penisilin ile %1 penisilin ile %5_CO2 içeren bir kuluçka ünitesinde %10 fetal buzağı serumu ve %1 L-glutamin ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamında tutun.
3. Geçiş hücreleri, standart aseptik hücre kültürü prosedürlerine uygun olarak %0,25 tripsin-EDTA kullanılarak yaklaşık %80 birleşimde alınmıştır.
4. Tüm karşılaştırmalı deneyler için 4T1-wt ve 4T1-iRFP720 hücreleri için aynı geçiş sayıları ve kültür koşulları kullanın.
5. 5 × 10⁴ ile 5 × 10⁷ hücre/mL arasında değişen bir hücre tohumlama yoğunluğu hazırlayın (1 × 10⁴ ile 1 × 10 7 hücre 200 μL arasında bir aralık anlamına gelir). Farklı hücre yoğunluklarında sinyal yoğunluğunu değerlendirmek ve optimal konsantrasyonu belirlemek için görüntüleme analizi için aşağıdaki konsantrasyonları hazırlayın: 5 × 10⁴, 3,38 × 10⁵, 6,25 × 10⁵, 1,25 × 10⁶, 2,5 × 10⁶, 3,75 ×^{10 6}, 5 × 10⁶, 1,25 × 10⁷, 2,5 × 10⁷ ve 5 × 10^{7 hücre}/mL.
6. 4T1-iRFP720 hücreleriyle aynı konsantrasyon aralığında 4T1-wt hücrelerinin karşılık gelen süspansiyonlarını hazırlayın; böylece floresan olmayan kontrol olarak hizmet versin.
7. Bireysel iskeleleri (2. bölümde hazırlanmış) steril, işlenmemiş Petri kaplarına yerleştirin.
   NOT: Plastik yüzeye hücre tutunmasını en aza indirmek ve ipek iskeleye hücre tutunmasını teşvik etmek için işlenmemiş Petri kapları kullanın.
8. Her iskele çevresinden ve iskeleden pipet kullanarak fazla malzemeyi çıkarın, yapının deforme olmamasına dikkat edin.
9. Uygun hücre süspansiyonundan 200 μL pipetini doğrudan her iskelenin üst yüzeyine yerleştirerek tüm hacmin iskeleye emilmesini sağlar.
10. Iskeleleri, %5_CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçkada 37 °C'de 4 saat boyunca inkübe yapın, böylece hücrelerin bağlanmasına izin vermeden bakanlar rahatsız edilir.
11. 4 saat sonra, her hücre tohumlu iskele, 1 mL önceden ısıtılmış tam ortam içeren 24 kuyu bir plakanın içine dikkatlice aktarın.
12. İskeleleri gece boyunca (16–24 saat) 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde, %5_{CO 2} ile kuluçka edin.

5. Fritli kalibrasyon platformlarının montajı

NOT: Biyolojik güvenlik dolabında steril eldivenler, steril cımbızlar ve steril aletlerle tüm montaj adımlarını gerçekleştirin.

1. 24 delikli plakalardan steril cımbız kullanarak hücre tohumlu ipek iskeleleri çıkarın; sıkışmayı önlemek için her iskele nazikçe desteklenir.
2. Steril bir kolon itici çubuğu kullanarak optik olarak şeffaf katı fazlı ekstraksiyon tüpünün alt kısmına bir hücre tohumlu iskele yerleştirin.
3. Bir steril polietilen frit doğrudan iskelenin üstüne itici çubukla yerleştirin.
   NOT: Polietilen fritleri sadece sinyal optimizasyonu sırasında kullanın, çünkü gözenek büyüklükleri hücre çapından daha küçüktür ve hücre göçünü veya diğer hücre-hücre temasını engeller. Bu aynı zamanda sinyal ayrımını net bir şekilde sağlar ve her sinyale karşılık gelen hücre konsantrasyonunun tam olarak tanımlanmasını sağlar.
4. Üst üste yığma diresini tekrarlayın; bir iskele ve ardından bir frit, beş hücre tohumlu iskele ve beş frit yerleştirilene kadar.
5. Filtreleme tüpünün altını steril dişi Luer-kilitli konnektörle kapatın.
6. Ekstraksiyon tüpünün üst kısmını steril bir erkek Luer-kilitli konnektörle kapatın.

6. Flitli kalibrasyon platformları kullanılarak in vivo optik görüntüleme cihazıyla sinyal optimizasyonu (sistem doğrulaması için sadece bir kez)

1. Kalibrasyon için hücre tohumlu platformları, floresan hücreleri fotobeyazlamadan korumak için ışık geçirmez koyu bir kutu içindeki in vivo optik görüntüleme odasına taşının.
2. Kurumsal güvenlik ve işletim prosedürlerine uygun olarak in vivo optik görüntülemeyi hazırlayın.
3. Montaj edilmiş hücre tohumlu platformları görüntüleme aşamasına yerleştirin.
4. 675 nm'de uyarılma ve 720 nm'de emisyon kullanarak 2D epifloresans görüntüleri alın ve pozlama süresi, binning faktörü ve f-sayı dahil görüntüleme parametrelerini optimize ederek doğrusal algılama aralığında maksimum sinyal yoğunluğuna ulaşın ( bkz. Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2).
5. En az bir optik şeffaf ekstraksiyon tüpü, 4T1-wt hücreleriyle eşleşen hücre yoğunluklarında tohumlanmış iskeleler içeren floresan olmayan referans kontrol tüpünü ekleyin.
6. Tüm örnekler için aynı alım ayarlarıyla görüntü alın, böylece floresans yoğunluğunun nicel karşılaştırılması sağlanabilir ( bkz. Ek Şekil 3 ve Ek Şekil 4).
7. In vivo optik görüntüleme analiz yazılımı kullanarak floresans sinyallerini nicelikle ölçebilir ve doygunluk olmadan maksimum sinyal sağlayan optimal hücre tohumlama yoğunluğunu (yani iskele başına 5 ×^10-6 hücre) belirleyin (bkz. Ek Şekil 5).
   NOT: Nihai in vivo optik görüntüleme sistemi ayarları, sistemin doğrusal dinamik aralığında sinyal alımını sağlamak için optimizasyon deneylerine dayanarak seçildi; böylece iskele kapasitesi doygunluğunu önlem aldı ve deneysel ve kontrol koşullarında kararlı bir sinyal-arka plan oranı korundu. Optimize edilmiş ayarlara dayanarak, tüm deneysel biyoreaktörler 5 × 10⁶ hücre/iskele ile tohumlanacaktır. 2D epifloresans modunda aşağıdaki ayarlarla görüntüleme yapılabilir: uyarılma: 675 nm (bant genişliği 30 nm); Emisyon: 720 nm (bant genişliği 20 nm), pozlama süresi: 10 s, binning faktörü: 8, f-sayısı: 8.

7. Deneysel platform montajı (fritsiz)

1. Sinyal optimizasyonundan sonra, belirlenen optimal hücre yoğunluğuna sahip tohum deneysel iskeleler (yani 5 × 10⁶ hücre/200 μL, bkz. bölüm 4).
2. Toplam beş ipek sünger kullanılarak deneysel platformu monte edin: bir hücre tohumlu iskele ve hücre iletişimini sağlamak için polietilen fritsiz dört boş iskele.
3. Filtreleme tüpünün üst kısmını steril bir erkek Luer-kilitli konnektörle kapatın.
4. Kültür sistemini statik veya dinamik kültür koşulları için yapılandırmak
   1. Statik kültür: Alt portu steril bir dişi Luer-kilitli konnektörle sızdırdır. Sistem, daha sonra gevşek bir kapaklı bir santrifüj tüpüne yerleştirilir.
      NOT: Erkek Luer kilidi bir açıklığa sahip olduğundan, bu konfigürasyon gaz değişimine izin verir ve kontaminasyon riskini en aza indirir. Bu düzende, medya kaputu içinde günde bir kez manuel olarak değiştirilir.
   2. Dinamik kültür: Alt portu steril boruya bağlayın ve giriş hattını üst porttaki erkek Luer-kilidine bağlayarak perfüzyon kültürünü mümkün kılın. Peristaltik pompa sistemi kullanarak sürekli olarak ortamı besin ve çıkar (Ek Şekil 6).

8. Platformda dinamik kültür

1. Pompanın ve ilgili tüplerin dezenfekte edilmesine başlayın; maksimum akışta %70 etanol ile 10 dakika boyunca yıkamaya başlayın.
2. Pompayı ve boruyu steril tam bir ortamla en az 10 dakika durulayın, böylece kalan etanol giderilebilir. Taze ortamla değiştirin ve perfüzyona ek 10 dakika devam ettirin, böylece tam sistem dengesi sağlanır.
   NOT: Tüm bileşenlerin tamamen ortamla doldurulduğundan ve hücre tohumlamadan önce hava kabarcıklarından arındığından emin olun.
3. Monte edilmiş reaktörün erkek Luer-kilitli girişini (üst) pompanın çıkış hattına steril boru ve Luer kilitli konnektörler kullanarak bağlayın.
4. Pompa girişini tam ortam içeren steril bir rezervuara bağlayın.
5. Reaktör çıkışını (alt) ortam rezervuarına bağlayarak bir dolanım perfüzyon döngüsü oluşturulur. Bu konfigürasyon, kapalı döngü sistemini korurken ortamın iskele üzerinden sürekli perfüzyon olmasını sağlar.
   NOT: Bu protokolde, perfüzyon tekrar döngüsel konfigürasyon kullanılarak yapılır; ortam rezervuar ile reaktör arasında sürekli döngüye alınır. Bu yaklaşım, sürekli akışı korurken ortam tüketimini en aza indirir.
6. Pompada istenen akış hızını, kanal iç yarıçapını ( = 3 mm) kullanarak nominal duvar kesme gerilimini hedefleyecek şekilde ayarlayın (örneğin, 1 dyn/^{cm 2} ve 4 dyn/^cm2), Poiseuille^{akışı varsayımına göre} ( = 3 mm):
   
   burada τ duvar kesme gerilimidir (dyn/^{cm 2}), Q ise hacimsel akış hızıdır (^{cm 3}/s), RPMI-1640 ortamının sıvı viskozitesidir (0.958 × 37 °C'de ^10-3 N·s/^{m 2} )²⁰. Gerçek sistem gözenekli ipek bir iskele içerse ve bu nedenle bu idealize geometriden sapsa da, hesaplanan değerler akış koşulları arasında tekrarlanabilir karşılaştırmalar yapılmasını sağlamak için standart operasyonel kıyaslamalar olarak kullanılmıştır. Karşılık gelen akış oranları 0,133 mL/dakika ve 0,531 mL/dakika olup, kültür için perfüzyon koşulları olarak kullanıldı.
7. Perfüzyon başlatın ve sistemi sızıntı, baloncuk oluşumu ve stabil akış açısından izleyin.
8. Perfüzyona göç inhibitörü veya bir test bileşiği ile (örneğin, tam ortamda 0.05 μmol/L Cucurbitacin E (CuE) ile veya kontrol olmadan başlayıp tüm düzeni %5_CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C'de beş güne kadar tutun. Bu nedenle, pompa girişini, ilgili test bileşiği dahil olmak üzere tam ortamı içeren steril bir rezervuara bağlayın ve pompayı önceki ayarlarla başlatın.
   NOT: Pompa ve borulardan etanolün tamamen uzaklaştırılmasını belirtilen orta yıkama adımlarını uygulayarak garanti edin. Hücre tohumlu reaktörlere bağlanmadan önce durulama sonrası ortamın ilk kısmını atın ve sistemin tamamen taze ortamla doldurulduğundan ve hava kabarcıklarından arındığından emin olun.

9. Deneysel platformun floresans görüntülemesi

1. Pompayı durdurun, tüm boru bağlantılarını ayırın ve steril koşulları koruyun.
2. SPE tüpünün altını dişi Luer-kilitli konnektör ile mühürleyin, tüm sistemi steril 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin ve boruyu sıkıca kapatın.
3. Sistemi biyogüvenlik kabine aktararak sonraki tüm adımlara devam edin. Kaputun içinde, erkek Luer kilitli konnektörünü kesik dişi Luer-kilitli konnektörle değiştirerek sistemi tamamen kapatabilirsiniz.
4. Kapatılmış sistemi steril bir 50 mL santrifüj tüpüne geri koyun ve boruyu güvenli bir şekilde kapatarak taşıma için kullanın.
   NOT: Laboratuvar koşullarına bağlı olarak, sistem sıkı olduğunda akış görüntüleme için durdurulmaz. Ancak, verilen deneysel ortamlarda bu mümkün değildi.
5. Mühürlü reaktörleri, floresan hücreleri fotobeyazlamadan korumak için ışık geçirmez karanlık bir kutu içindeki in vivo optik görüntüleme sistemi odasına taşınır.
6. Reaktörleri uygun tutucuya in vivo optik görüntüleme sistemi aşamasına yerleştirin.
7. Daha önce optimize edilmiş parametrelerle (örneğin, uyarılma 675 nm, emisyon 720 nm, pozlama süresi 10 s, binning 8, f-sayı 8) kullanılarak 2D epifloresans görüntüleri alın.
8. Her görüntüleme oturumu için 4T1-wt tohumlu, tohumlanmamış iskele ve boş reaktör kontrolleri ekleyin.
9. Floresans sinyallerini in vivo optik görüntüleme analiziyle nicelikle ölçülür.
10. Kontrol ve tedavi grupları için nicel sonuçları çizin ve test bileşiğinin ölçülen sonuç üzerindeki etkisini görselleştirmek için karşılaştırmalı grafikler oluşturun.

10. Deneysel platformun görüntü analizi

1. 0. Gün, 3. Gün ve 5. Gün floresans görüntüleri alın ve görüntü analiz yazılımı kullanarak analiz edin.
2. Her görüntü için, analizden önce mekansal kalibrasyon yapılacaktır. Deneysel platformun bilinen fiziksel uzunluğunu çizgi aracı ile piksel cinsinden ölçün ve piksel-uzunluk dönüşümünü tanımlamak için Analyze > Set Scale ile ilgili gerçek dünya mesafesini (85 mm) girin.
3. Kalibrasyondan sonra, serbest el seçim aracı kullanılarak ilgi alanını (ROI) manuel olarak belirterek floresan alanını nicelikle ölçebilirsiniz.
4. Kullanıcı yanlılığını en aza indirmek için, geri plana göre floresan sinyal yoğunluğuna dayalı tutarlı görsel kriterler kullanarak yatırım getirisi sınırlarını belirleyin. Tüm analizleri aynı ayarlarda yapmak ve mümkün olduğunda analizi tek bir eğitimli operatöre sunmak.
5. Flüoresan sinyali, in vivo optik görüntüleme analiz yazılımı görüntülerinde koyu arka plandan net ayırt edilebilen parlak bölgeler olarak tanımlayın ve bu sinyalleri tutarlı manuel segmentasyonu yönlendirmek için kullanın.
6. Seçilen bölgeleri Analiz > Ölç ile ölçün ve her zaman noktası için alan değerlerini kaydedin. Bu prosedürü tüm deneysel gruplardaki tüm görüntüler için tekrarlayın.
7. Alan ölçümlerini, başlangıç boyutlarındaki farkları hesaba katmak için elektronik tablo yazılımı kullanarak her örnek için karşılık gelen Gün 0 değerine normalleştirin ve sonuçları başlangıç değerine göre katlama değişimi olarak ifade edin (Gün 0 = 1).

11. İstatistiksel analiz

1. Tüm deneyleri en az üçlü olarak yapın.
2. Tüm deneyleri en az üç kez tekrarlayın (n = 3), ortalama değerleri ve standart sapmaları (SD) belirleyin.
3. İstatistiksel anlamlılığı iki yönlü ANOVA ile belirleyin ve ardından Tukey'nin α = 0.05 ile çoklu karşılaştırma testi yapıldı.

Sonuçlar

Bu protokol, fizyolojik olarak ilgili 3D ortamda hücre büyümesi ve hareketinin makroskopik gözlemi için kullanıcı dostu ve düşük maliyetli bir platformu tanımlar. Yöntem, ECM taklidi olarak ipek fibroin süngerlerini kullanır ve dinamik doku koşullarını modellemek için kontrollü ara akışı içerir. İpek sünger ve iskele üretiminden hücre tohumlamasına ve deneysel platform montajına kadar adım adım prosedürlerin şematik bir özeti Şekil 1'de gösterilmiştir.

<...

Tartışma

Bu protokolde tanımlanan ipek sünger üretim süreci standartlaştırılmıştır ve önceki bir çalışmada bildirildiği gibi, tekrarlanabilir iskele üretimini^{sağlar 16}. Süngerlerin tuz yatağı yüksekliği/miktarı, ipek çözeltisi hacmi ve metanol kuluçka gibi tam standartlaştırılmış koşullarda üretimi, eşit ve karşılaştırılabilir süngerler elde etmek için çok önemlidir. Üretilen süngerler, daha önce yayımlanan kalite kontrol protokolü kriterlerine^uymalı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol (HFIP)	Sigma-Aldrich	8.04515	Dikkat: Tehlikeli. Dondurularak kurutulmuş ipekböceği çözülmesi için kullanılır
24-Well plakası	Cellstar, Greiner Bio-One	662102	Hücre ekilmiş scaffoldların inkübasyon sırasında saklanması
4T1-iRFP720 murin üçlü-negatif meme kanseri hücreleri	Makromoleküler Kanser Terapötik Laboratuvarı (MMCT), Viyana Üniversitesi	N/A	Hücre kültürü deneyleri; 4T1-iRFP720, ana 4T1 (ATCC: CRL-2539) 'dan evde türetilmiş
4T1-wt murin üçlü-negatif meme kanseri hücreleri	Makromoleküler Kanser Terapötik Laboratuvarı (MMCT), Viyana Üniversitesi	ATCC: CRL-2539	Hücre kültürü deneyleri
Bruker Alpha Compact FTIR Platin-ATR Örnekleme Modülü ile	Bruker	A220/D-01	FT-IR analizi
Kalsiyum klorür, susuz, ≥93% reaktif sınıf	Sigma-Aldrich	902179	Dissolusyon matrisinin hazırlanması için
Hücre kültürü şişesi, T25	Cellstar, Greiner Bio-One	690175	Sarf malzemeleri; hücre kültürü için
Hücre kültürü şişesi, T75	Cellstar, Greiner Bio-One	658175	Sarf malzemeleri; hücre kültürü için
Santrifüj 5804 R	Eppendorf	5805000010	Santrifüjleme ile numune ayırma için kullanılır
Kombi-tıkaç (dişi Luer-lock bağlayıcısı)	Braun Melsungen AG	4495101	Platform düzeneği için kullanılır
Cucurbitacin E	Sigma-Aldrich	SML0577	Hücre göçü inhibitörü
Dermal biyopsi delici, ø 6 mm	Dahlhausen	1190001006	Silindirik sünger scaffoldlarının elde edilmesi için kullanılır
Diyaliz tüpleri (3.5 kDa, selüloz)	Spectra/Por by Spectrum Labs	SPEC132724	İpek fibroin çözeltisinin diyaliz edilmesi için
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin	Sigma-Aldrich	D8537	Hücrelerin korunması için
Etanol, mutlak	Merck	1.07017	Dissolusyon matrisinin hazırlanması için
Excel	Microsoft	v2604	Veri organizasyonu, temel hesaplamalar ve çizim
Fetal dana serumu (FCS) ısı ile inaktive edilmiş	Biowest	S181H-500	Hücre kültürü ortamı için takviye
Fiji (eski ImageJ)	Açık kaynak (https://imagej.net/software/fiji/)	N/A	Görüntü işleme ve analizi
GraphPad Prism	GraphPad Software	v8.2.1	İstatistiksel analiz ve grafik oluşturma
HPLC pompası Hitachi L-7120 LaChrom	Merck	K-5244	Birleştirilmiş platformda dinamik kültür koşulları için
IVIS 200 Spectrum CT sistemi	PerkinElmer	128201	CT yeteneğine sahip optik görüntüleme sistemi
IVIS Living Image Yazılımı	PerkinElmer	v4.5.2	IVIS görüntüleme verilerinin alımı, görselleştirilmesi ve nicel analizi için yazılım
JEOL JSM-6510 Taramalı elektron mikroskobu	JEOL GmbH	JSM-6510	SEM görüntüleri
L-glutamin, 200 mM çözelti, hücre kültürü için uygun (L-Glu)	Sigma-Aldrich	G7513	Hücre kültürü ortamı için takviye
Liofilizatör Alpha 2-4 LD Plus	Martin Christ	101542	İpek fibroin liofilizasyonu için
Erkek Luer-lock bağlayıcısı	Supelco (Sigma-Aldrich)	57020-U	Numune rezervuarları için adaptör
Metanol, ≥99.9 %, HPLC Gradyan Sınıf	Carl Roth	7342.1	Dikkat: Toksik. İpek kompozitlerinde beta-tabaka oluşumunun indüksiyonu
Optik olarak şeffaf Katı Faz Ekstraksiyon (SPE) tüpleri, süzgeçsiz	Sigma Aldrich	57240-U	Platform düzeneği için kullanılır
OPUS Spektroskopi yazılımı	Bruker	v7.5	FT-IR analizi
Orbital ve Doğrusal Çalkalayici MI0103002	Four E'S Scientific	MI0103002	Homojen dağılım/karıştırma
Parafilm PM996	Sigma-Aldrich	P7793	Depolama (örneğin, soğutma) için plakaların ve kapların kapatılması/sarılması için
Penisilin-Streptomisin, sıvı, hücre kültürü için uygun (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	Hücre kültürü ortamı için takviye
Petri kabı, 9 cm	VWR	391-0598	Tuz yatağı sünger döküm için; ipek scaffoldlar üzerinde ekim için
1 mL SPE tüpleri için polietilen süzgeçler	Supelco (Sigma Aldrich)	57244	Platform düzeneği için kullanılır
RPMI-1640 Ortamı, hücre kültürü için uygun	Sigma-Aldrich	R0883	Eklenmiş ortam ipek sünger eşiklemesi, hücre kültürü bakımı ve ilgili deneyler için kullanılır
Serolojik pipet, 10 mL	Sarstedt	86.1254.025	Sarf malzemeleri; hücrelerin korunması için
Serolojik pipet