Yöntem makalesi

Nohut Simbiyoz Çalışmaları İçin nodC Kesintisi Yoluyla Mesorhizobium ciceri'de CRISPR-Cas9 Genom Düzenleme

0 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71513

⸱

25 Eylül 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Root Nodule Symbiosis Laboratory, National Institute of Plant Genome Research, 2Microbial Engineering Laboratory, International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, nohutla ilişkili rizobiyalarda fonksiyonel genomik çalışmaları yürütmek amacıyla, homoloji yönlendirmeli onarım ve GFP tabanlı tarama kullanarak Mesorhizobium ciceri'de nodC lokusunun CRISPR-Cas9 aracılı bozulmasını anlatmaktadır.

Özet

Mesorhizobium ciceri, nohutun (Cicer arietinum) azot sabitleyen bir simbiyontu olup, zahmetli olan ve genellikle istenmeyen seçilim belirteçleri bırakan geleneksel homolog rekombinasyon yaklaşımlarıyla genetik olarak manipüle edilmesi zor bir organizma olmaya devam etmektedir. Bu protokolde, M. ciceri için uyarlanmış, geniş konak yelpazesine sahip bir Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR)-ilişkili protein 9 (Cas9) sistemi kullanan kolaylaştırılmış bir genom düzenleme stratejisini tanımlıyoruz. Bu yöntemin etkinliğini, simbiyotik moleküler iletişimde yer alan temel sinyal molekülleri olan Nod faktörlerindeki kitin omurga sentezi için gerekli olan N-asetilglukozaminiltransferazı kodlayan nodC genini hedefleyerek kanıtlıyoruz. Bu protokol, tek kılavuz RNA'ların (sgRNA'ların) sistematik tasarımını ve homoloji yönlendirmeli onarım (HDR) şablonunun oluşturulmasını detaylandırmaktadır. HDR şablonu, nodC kesim bölgesini çevreleyen bir yeşil floresan protein (GFP) raporerinin bölgeye özgü entegrasyonunu kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. Cas9/sgRNA/HDR konstrüktünün biparental çiftleşme yoluyla aktarılmasının ardından, muhtemel mutantlar floresan tabanlı bir tarama yaklaşımı kullanılarak belirlenmiştir. Nodülasyon (nod) kaseti içindeki 1.3 kb'lık nodC lokusunun başarılı bir şekilde bozulması, başlangıçta mutant kolonilerdeki GFP ekspresyonunun floresan mikroskobu ile görüntülenmesiyle taranmıştır. Bozulma; restriksiyon sindirimi, genomik DNA'dan entegre kasetin amplifikasyonu ve Sanger dizileme ile daha fazla doğrulanmıştır. GFP ekspresyonu ek olarak ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ile nicelleştirilmiştir. Mutasyonun fonksiyonel etkisini doğrulamak için nohut enfeksiyon deneyleri gerçekleştirilmiş ve ΔnodC M. ciceri ile inoküle edilen bitkilerde, yabani tip suşa kıyasla bozulmuş nodülasyon olduğu gösterilmiştir. Genel olarak bu protokol, Mesorhizobium türlerinde hassas gen bozma ve fonksiyonel genomik çalışmaları için verimli ve tekrarlanabilir bir çerçeve sunmaktadır.

Giriş

Başlangıçta prokaryotlarda adaptif bir bağışıklık mekanizması olarak tanımlanan Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR)-ilişkili protein 9 (Cas9) nükleaz sistemi, genom düzenleme için etkili ve güvenilir bir araca dönüştürülmüştür1,2. Sistem, Watson-Crick baz eşleşmesi yoluyla hedef DNA dizilerini belirlemek için sentetik bir kılavuz RNA (sgRNA) kullanır. sgRNA, protospacer adjacent motif (PAM) dizisi NGG'ye komşu genomik bölgeye tamamlayıcı 20 nükleotidden oluşur. Cas9, hedef dizi içinde belirlenen bir bölgede, genellikle PAM bölgesinin 3 baz çifti (bp) yukarısında çift zincirli bir kırık (DSB) oluşturur1. Oluşan DSB'ler, ya homolog olmayan uç birleşmesiyle ya da bir donör şablon kullanılarak homoloji yönlendirmeli onarım (HDR) yoluyla onarılabilir3,4. Bu strateji, bakterilerde gen bozma, knock-in ve knock-out yaklaşımları için yaygın olarak uygulanmıştır5,6,7,8. Bu protokolün temel amacı, geniş konak yelpazeli bir CRISPR-Cas9 sistemi kullanarak Mesorhizobium ciceri için verimli bir genom düzenleme yöntemi geliştirmektir.

M. ciceri, nohutun (Cicer arietinum) temel azot sabitleyici endosimbiyotu olarak işlev gören Gram-negatif bir toprak bakterisidir9. Bir suş olan M. ciceri CC1192, yüksek nodülasyon verimliliği sergilemektedir ve genomu dizilenmiştir10. Tarımsal önemine rağmen, Mesorhizobium türlerinin genetik manipülasyonu sınırlı kalmaya devam etmektedir. CRISPR tabanlı sistemler daha önce, Rhizobium etli'de CRISPR interferansı (CRISPRi)11, Sinorhizobium meliloti'de genom düzenleme12 ve S. meliloti'de baz düzenleme13 dahil olmak üzere diğer rizobiyalarda uygulanmıştır. Ancak, M. ciceri için güçlü bir genom düzenleme platformu rapor edilmemiştir. Geleneksel yaklaşımlar, emek yoğun olan, çok sayıda seçim aşaması gerektiren ve sıklıkla genomik izler olarak antibiyotik direnç markerları bırakan intihar plazmidi aracılı homolog rekombinasyona dayanmaktadır14.

Bu sınırlamaları gidermek için, başlangıçta Paenibacillus polymyxa için geliştirilen pCasPP vektör sistemi, M. ciceri'de kullanılmak üzere uyarlandı15. pCasPP çerçevesi, yüksek-GC aktinomisetler için kodon optimize edilmiş bir Streptococcus pyogenes Cas9 kullanır ve konstitütif gapdh promotörü altında sgRNA klonlamasının mavi-beyaz taraması için bir lacZ kaseti içerir8. Düzenleme vektörünü aktarmak için donör Escherichia coli suşu ile resipiyent Mesorhizobium suşu arasında biparental çiftleşme gerçekleştirildi16. Tarama verimliliğini artırmak amacıyla, başlangıçta Bradyrhizobium diazoefficiens için kodon optimize edilmiş olan yeşil floresan protein (GFP) varyantı bjGFP, HDR donör şablonuna dahil edildi16. Bu floresan tabanlı tarama stratejisi, bakteri ile nohut arasındaki simbiyotik sinyalleşmenin erken aşamaları için gerekli olan esansiyel nodC lokusunu hedeflemek için uygulandı17,18.

Bu protokol, rastgele kimyasal veya ultraviyole (UV) mutajenez yaklaşımlarına kesin ve verimli bir alternatif sunmaktadır. Validasyon deneylerinde, geri kazanılan kolonilerin %80'inden fazlası GFP floresansı göstermiş ve temsilci düzenlenmiş koloniler polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve Sanger dizileme ile daha ileri düzeyde doğrulanmıştır. Elde edilen ΔnodC M. ciceri mutantları, simbiyotik sinyalizasyon ve konakçı-mikrop etkileşimlerini incelemek için faydalı bir kaynak sağlamaktadır. Genel olarak bu çerçeve, rizobiyum araştırma topluluğuna Mesorhizobium türlerinde fonksiyonel genomik çalışmaları için verimli ve ölçeklenebilir bir yaklaşım sunmaktadır.

Protokol

Bitki büyümesi, mikrobiyal inokülasyon ve genetiği değiştirilmiş bakterilerin kullanımıyla ilgili tüm deneysel protokoller, kurumsal kılavuzlara ve düzenlemelere uygun olarak yürütülmüştür. Bitki yetiştirme ve bakteriyel inokülasyonlar kontrollü büyüme odası koşulları altında gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan M. ciceri suşu, Biyogüvenlik Seviyesi 1 (BSL-1) mikroorganizma olarak sınıflandırılmıştır. Tüm deneyler, araziye salım yapılmadan kapalı laboratuvar koşulları altında yürütüldüğünden, kurumsal biyogüvenlik politikaları gereği resmi kurumsal biyogüvenlik onayı gerekmemiştir. Çalışma sırasında oluşan tüm biyolojik atıklar, imha edilmeden önce otoklavlanmıştır.

1. Kompetan Hücre Hazırlama

Kimyasal olarak kompetan E. coli DH5α ve E. coli S17-1λpir hücreleri, Ek Dosya 1'de açıklanan prosedüre uygun olarak hazırlanmış ve doğrulanmıştır.

2. Kılavuz RNA Tasarımı

  1. Kılavuz RNA'ların Tasarımı
    1. Benchling platformunu (https://benchling.com/) açın. Mevcut bir Benchling hesabıyla giriş yapın veya yeni bir hesap oluşturun.
    2. Yeni bir proje oluşturun ve CRISPR Kılavuz Tasarım Aracını açın.
    3. Kılavuz RNA tasarımı için hedef DNA dizisinin tamamını yükleyin veya yapıştırın. “Tek Kılavuz” (Single Guide) tasarım seçeneğini seçin ve kılavuz uzunluğunu 20 bp olarak ayarlayın.
    4. Mevcut seçenekler arasından genom referansını seçin. Hedeflenen kılavuz RNA tasarımı için M. cicerireferans genom olarak Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110'u seçin. Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) aktivitesi için gerekli olan protospacer komşu motif (PAM) dizisi olarak NGG'yi kullanın.
    5. Hsu ve ark. yöntemini kullanın.19 tahmini hedef dışı kesim frekanslarını hesaplamak için kullanılan algoritma. Referans genom arka planında spesifik olmayan kesimleri en aza indirmek için ≥50 eşik puanını koruyun.
    6. Doench-Root algoritmasını kullanın20 tahmini hedef bölge verimlilik skorlarını hesaplamak için. Hedef lokustaki tahmini Cas9 kesim verimliliği uygun olan kılavuzları belirlemek için ≥60 değerinde bir hedef seçim eşiği belirleyin.
    7. Aday rehber RNA listesini oluşturmak için “Finish” seçeneğine tıklayın.
  2. Kılavuz RNA'ların Seçimi
    1. Kılavuz RNA çıktı panelini açın.
    2. Translasyonel başlangıç kodonuna (ATG) 100 bp mesafede çift zincirli kırılma oluşturacağı öngörülen aday sgRNA'lara öncelik verin; bu, fonksiyonel olmayan bir protein üretme olasılığını artıracaktır.
    3. Hedef dışı (off-target) ve hedef içi (on-target) skorlarını değerlendirin. İstenmeyen hedef dışı kesim riskini azaltmak için, daha yüksek bir hedef dışı skoruna, biraz daha yüksek olan bir hedef içi skordan daha fazla öncelik verin.
    4. Tüm seçim kriterlerini karşılayan bir veya iki aday tek kılavuz RNA (sgRNA) seçin.
  3. gRNA Oligonükleotidlerinin Hazırlanması
    1. Seçili kılavuz RNA'nın ters-tamamlayıcı dizisini oluşturun.
    2. 5 numaralı diziyi ekleyin′5' ucuna -ACGC′ rehber RNA'nın sonuna ve 5' dizisini ekleyin′5' ucuna -AAAC′ ters-tamamlayıcı zincirin sonu.
    3. Her iki oligonükleotidi de 5' ucundan modifikasyonla sipariş edin′ 25 nmol sentez ölçeğinde fosforilasyon ve PAGE saflaştırması.
  4. gRNA Oligonükleotitlerinin Tavlanması
    1. 7,15 g HEPES serbest asidini yaklaşık 800 mL distile su içerisinde çözerek 30 mM HEPES tamponu hazırlayın. Sodyum hidroksit kullanarak pH değerini 7,8'e ayarlayın ve nihai hacmi 1 L'ye tamamlayın.
    2. Her bir fosforile oligonükleotidi, nükleaz içermeyen su ile şu nihai konsantrasyona gelecek şekilde yeniden süspande edin: 100 µMBirleştirin 5 µL her bir oligonükleotidin ... ile 90 µL steril bir mikrosantrifüj tüpünde 30 mM HEPES tamponu içerisinde.
    3. Kısa süre vorteksleyin ve sıvıyı toplamak için santrifüjleyin. Oligonükleotitleri, bir termosikletörde şu sıcaklıkta inkübe ederek tavlayın: 95°C 5 dakika boyunca ve ...'ya soğutulmasıyla 4°C ... artış hızıyla 0.1°C/s.
    4. Tavlanmış oligonükleotidleri nükleaz içermeyen su kullanarak 10 kat seyrelttirin.
  5. gRNA'nın pCasPP Vektörüne Montajı
    1. Rütering ve ark. tarafından daha önce açıklanan pCasPP vektörünü temin edin.15.
    2. Plazmit dizisi Jochen Schmid tarafından sağlanmış ve bu çalışmada kullanılan konstrükt Dr. Syed Shams Yazdani (ICGEB) aracılığıyla elde edilmiştir.  
    3. 100 ng pCasPP vektörü içeren bir Golden Gate reaksiyonu hazırlayın, 0.3 µL tavlanmış oligonükleotid insert, 2 µL 10× T4 DNA ligaz tamponu, 1 µL T4 DNA ligaz, 1 µL BbsI restriksiyon enzimi ve son hacim şu olacak şekilde nükleaz içermeyen su ekleyin: 20 µL.
    4. İnsert yerine nükleaz içermeyen su kullanarak bir negatif kontrol reaksiyonu hazırlayın.
    5. Reaksiyonları nazikçe karıştırın ve kısa süreliğine santrifüjleyin.
  6. Golden Gate Montajı Döngü Koşulları
    1. Reaksiyon tüplerini bir termosikletöre yerleştirin. Aşağıdakilerden oluşan dokuz döngü gerçekleştirin: 37°C 10 dakika boyunca, ardından 16°C 10 dk boyunca.
    2. Reaksiyonları şu sıcaklıkta inkübe edin: 50°C 5 dakika boyunca ve ardından 65°C 20 dk boyunca. Reaksiyonları şurada bekletin: 4°C kullanılana kadar.
  7. Montaj Reaksiyonlarının Transformasyonu
    1. Çözdürün 50 µL kompetan Escherichia coli DH5α hücreleri buz üzerinde 10–15 dk bekletin.
    2. Ekle 3 µL her bir Golden Gatele birleştirme reaksiyonunu kompetan hücrelere aktarın. Negatif kontrol reaksiyonunu paralel olarak işleyin. Karışımları 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
    3. Hücrelere şu sıcaklıkta ısı şoku uygulayın: 42°C 45 saniye boyunca santrifüjleyin ve tüpleri hemen 2 dakika boyunca buza geri koyun. Ekleyin 950 µL Katabolit baskılamalı Süper Optimal besiyeri (SOC) ortamı.
    4. %0,5 maya özütü, %2 tryptone, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl ve 10 mM MgCl içeren SOC besiyeri hazırlayın.₂, 10 mM MgSO₄₄ve 20 mM glukoz. Besiyerini şu kullanarak filtre sterilizasyonuna tabi tutun: 0.4 µm aseptik koşullar altında şırınga filtresi.
    5. Kültürleri şu koşullarda inkübe edin: 37°C ve 1 saat boyunca 180 rpm'de.
  8. Pozitif Transformantların Seçimi
    1. Şunlarla desteklenmiş LB agar plakaları hazırlayın: 50 µg/mL neomisin, 0,2 mM izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranozid (IPTG) ve 32 mg/L 5-bromo-4-kloro-3-indolil β-D-galaktopiranozid (X-gal). Plaka 100 µL geri kazanım kültürünü selektif plakalara ekleyin. Plakaları şu sıcaklıkta inkübe edin: 37°C 12–16 saat boyunca.
    2. Beyaz kolonileri seçin ve mavi kolonileri atın. Negatif kontrol plağının beşten az koloni içerdiğini doğrulayın.
  9. Pozitif Klonların Taranması ve Genişletilmesi
    1. Üç ila dört bağımsız beyaz koloniyi taze seçici LB agar plakalarına ekle.
    2. Plakaları şu sıcaklıkta inkübe edin: 37°C 12-16 saat boyunca. Münferit kolonileri, içeriği ... ile takviye edilmiş 10 mL LB besiyerine ekleyin. 50 µg/mL neomisin
    3. Her bir rehber RNA konstrüktünü, sonraki iş akışı boyunca bağımsız olarak işleyin.
  10. pCasPP-gRNA Konstrüktlerinin Doğrulanması
    1. Bakteri kültürlerini santrifüjleme yoluyla toplayın. Silika kolonlu plazmit saflaştırma kiti kullanarak plazmit DNA'sını izole edin.
    2. İzole edilen plazmid DNA'yı, uygun reaksiyon tamponu içerisinde 1 saat boyunca XbaI ve EcoRI ile sindirin. 37°C.
    3. Sindirim ürünlerini 1X'de hazırlanmış %1'lik agaroz jelinde ayırın.× son konsantrasyonu şu olan etidyum bromür içeren Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponu 0.5 µg/mL.
    4. Boya cephesi jel uzunluğunun yaklaşık %70-80'ini kat edene kadar jeli 90-110 V'da çalıştırın. DNA fragmanlarını bir UV transillüminatör kullanarak görüntüleyin.
    5. 1.280 bp'lik bir fragman tespit ederek pozitif klonları doğrulayın ve 1.630 bp'lik bir fragman tespit ederek boş vektör kontrollerini tanımlayın. Boş pCasPP vektörü yaklaşık 9.663 bp'dir ve bir lacZ geni içerir; 24 bp'lik gRNA oligonükleotidinin eklenmesi lacZ fragmanını uzaklaştırarak daha küçük, gRNA içeren bir pCasPP konstrüktü oluşturur. lacZ bölgesini çevreleyen XbaI ve EcoRI restriksiyon bölgeleri, gRNA klonlamasının tanısal doğrulanması için kullanılır.
  11. Gliserol Stoklarının Hazırlanması
    1. Onaylanmış pozitif klonu seçici LB besiyerinde büyütün.
    2. Karıştırarak gliserol stok hazırlayın 700 µL şunları içeren log fazı kültürü 300 µL steril %50 gliserol. Karışımı steril kriyotüplere aktarın. Gliserol stoklarını −de saklayın.80°C.
      NOT: Tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçının. Plazmit stabilitesini ve bakteriyel canlılığı korumak için birden fazla alikot hazırlayın. Tamamlanmış Golden Gate birleştirme reaksiyonu şurada saklanabilir: 4°C gece boyunca veya −'de20°C transformasyondan 1–2 hafta önce.

3. Homoloji Yönlendirmeli Onarım Şablonunun Birleştirilmesi

  1. Yeşil floresan protein (GFP) İnsertinin Hazırlanması
    1. Floresan rapor kasetini içeren pRJPaph-bjGFP plazmidini temin edin16 (Tablo 1)10,15,16,21,22,23. Plazmid, Prof. Hans-Martin Fischer (ETH Zürih, İsviçre) tarafından sağlanmış olup Addgene üzerinden (Plazmid #67032) temin edilebilir.
    2. Ek Dosya 2'de (Adım 3.1) açıklandığı şekilde, SacI ve KpnI restriksiyon sindirimi ile gfp kasetini pRJPaph-bjGFP'den kesin. pRJPaph-bjGFP'deki gfp dizisi, Bradyrhizobium diazoefficiens için kodon optimize edilmiş sentetik bir bjGFP genidir.
    3. Beklenen 1081 bp'lik gfp fragmanını saflaştırın.
  2. pUC18-gfp Konstruksiyonu
    1. pUC18 omurgasını temin edin (Addgene plazmid #50004)21.
    2. Ek Dosya 2'de (Adım 3.2) açıklandığı şekilde, SacI ve KpnI kullanarak pUC18'i lineerleştirin.
    3. Ek Dosya 2'de (Adım 3.2) açıklandığı şekilde, saflaştırılmış gfp fragmanını lineerleştirilmiş pUC18 vektörüne ligasyonla ekleyin.
    4. Golden Gate montaj reaksiyonu yerine Adım 3.2.3'te oluşturulan ligasyon karışımını kullanarak, Adım 2.7'de açıklanan transformasyon prosedürü ile kompetan E. coli DH5α hücrelerini transforme edin.
    5. Pozitif transformantları seçin ve Ek Dosya 2'de (Adım 3.2) açıklandığı şekilde koloni polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile gfp insersiyonunu doğrulayın.
  3. Homoloji Kollarının Amplifikasyonu
    1. M. ciceri genomik DNA'sından yaklaşık 400–500 bp boyutunda yukarı akış (UHA) ve aşağı akış (DHA) homoloji kollarını amplifiye etmek için primerler tasarlayın (Tablo 2).
    2. UHA primerlerine SacI/EcoRI restriksiyon bölgelerini ve DHA primerlerine XbaI/KpnI restriksiyon bölgelerini ekleyin. UHA amplifikasyonu için F_nodC_Up_EcoRI ve R_nodC_Up_SacI primerlerini, DHA amplifikasyonu için ise F_nodCdown_KpnI ve R_nodCdown_XbaI primerlerini kullanın (Tablo 2).
    3. Weerakkody ve ark.25 yöntemine göre M. ciceri genomik DNA'sını izole edin.
    4. Ek Dosya 2'de (Adım 3.3) açıklandığı şekilde UHA ve DHA fragmanlarını amplifiye edin ve saflaştırın.
  4. pUC18-UHA-gfp Konstruksiyonu
    1. Ek Dosya 2'de (Adım 3.4) açıklandığı şekilde, EcoRI ve SacI kullanarak UHA fragmanını pUC18-gfp'ye klonlayın.
    2. XbaI ve KpnI ile restriksiyon sindirimi yaparak plazmid montajının doğruluğunu onaylayın. Başarılı bir montaj, yaklaşık 500 ve 3725 bp'lik fragmanlar oluşturmalıdır.
    3. Doğrulanmış bir klon ile devam edin.
  5. pUC18-UHA-gfp-DHA Konstruksiyonu
    1. Ek Dosya 2'de (Adım 3.5) açıklandığı şekilde, KpnI ve XbaI kullanarak DHA fragmanını pUC18-UHA-gfp'ye klonlayın.
    2. SacI ve EcoRI ile restriksiyon sindirimi yaparak montajın doğruluğunu onaylayın. Başarılı bir montaj, yaklaşık 400 ve 4271 bp'lik fragmanlar oluşturmalıdır.
    3. Homoloji-Yönlendirmeli Onarım (HDR) kaset dizisinin büyük çoğunluğunu kapsayan F_nodC_Up_EcoRI, BjGFP_BP_F1 ve R_nodCdown_XbaI primerlerini (Tablo 2) kullanarak Sanger sekanslama ile 5–6 aday klonu doğrulayın.
  6. Final HDR Şablonunun Amplifikasyonu ve Saflaştırılması
    1. F_FL_nodCgfp_XbaI ve R_nodCdown_XbaI primerlerini (Tablo 2) kullanarak komple HDR kasetini amplifiye edin.
    2. Beklenen 2012 bp'lik HDR fragmanını saflaştırın ve Ek Dosya 2'de (Adım 3.6) açıklandığı şekilde saflaştırılmış PCR ürününü XbaI ile sindirin.
  7. pCasPP-gRNA Vektörlerinin Hazırlanması
    1. Adım 2'de oluşturulan pCasPP-gRNA1 ve pCasPP-gRNA2 plazmidlerini geri alın.
    2. Ek Dosya 2'de (Adım 3.7) açıklandığı şekilde, plazmidleri XbaI ile lineerleştirin ve vektör omurgasını defosforile edin.
  8. HDR Şablonunun pCasPP-gRNA Vektörlerine Klonlanması
    1. Ek Dosya 2'de (Adım 3.8) açıklandığı şekilde, HDR kasetini XbaI ile lineerleştirilmiş pCasPP-gRNA1 veya pCasPP-gRNA2'ye ligasyonla ekleyin.
    2. Kompetan E. coli DH5α hücrelerini transforme edin ve transformantları 50 µg/mL neomisin içeren LB agarda seçin.
  9. HDR İçeren Klonların Taranması
    1. Standart bir GFP filtre setine (eksitasyon 470–488 nm; emisyon 507–510 nm) sahip bir floresan stereomikroskop kullanarak transformantları GFP floresansı açısından tarayın.
    2. Düzenlenmemiş negatif kontrol kolonilerinde gözlenen zayıf otofloresansı açıkça aşan, belirgin ve tekdüze yeşil floresans varlığına dayanarak kolonileri GFP-pozitif olarak sınıflandırın.
    3. GFP-pozitif klonları çoğaltın ve plazmid DNA'sını izole edin.
  10. HDR Vektör Montajının Validasyonu
    1. XbaI restriksiyon sindirimi ile HDR insersiyonunu onaylayın.
    2. Beklenen 2012 bp'lik HDR fragmanının, yaklaşık 9,300 bp'lik bir pCasPP-gRNA vektör omurgasıyla birlikte salınmasıyla başarılı montajı doğrulayın.
      NOT: Restriksiyon enzimlerinin ve fosfatazın ısı ile inaktivasyonunun ardından, reaksiyon karışımları gecelik olarak 4°C'de veya 1 aya kadar −20°C'de saklanabilir. Doğrulanmış plazmid konstruktlarını uzun süreli koruma için −20°C'de saklayın.
Suş veya plazmidAçıklamaReferans
Mesorhizobium ciceri CC1192CRISPR-Cas9 genom düzenleme ve nohut nodülasyon analizlerinde kullanılan alıcı suşHaskett ve ark.10
pCasPPrehber RNA klonlaması ve HDR şablonu iletimi için kullanılan CRISPR-Cas9 genom düzenleme vektörüRütering ve ark.15
pRJPaph-bjGFPGFP kasetinin kaynağı olarak kullanılan GFP raporlayıcı plazmit
(Addgene plazmidi #67032)		Ledermann ve ark.16
pUC18HDR şablon montajı için kullanılan genel klonlama vektörü
(Addgene plazmid #50004)		Norrander ve ark.21
Escherichia coli S17-1λpirBiparental konjugasyon için kullanılan donör suşSimon ve ark.22
Escherichia coli DH5αPlazmit propagasyonu için kullanılan klonlama konakçısıHanahan ve ark.23

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan bakteriyel suşlar ve plazmidler. Bu tablo; plazmid çoğaltılması, CRISPR-Cas9 aracılı genom düzenleme, homoloji yönlendirmeli onarım (HDR) şablonu kurulumu, biparental çiftleşme ve Mesorhizobium ciceri CC1192'nin floresanla işaretlenmesi için kullanılan bakteriyel suşları ve plazmidleri listelemektedir.

KategoriAdSıralama (5′ figure-protocol-1 3′) veya açıklama
Bakteriyel suşEscherichia coli DH5αKlonlama konak suşu
Bakteriyel suşEscherichia coli S17-1λpirBiparental çiftleşme için donör suş
Klonlama vektörüpUC18Klonlama omurga vektörü
CRISPR vektörüpCasPPGeniş konakçı yelpazeli CRISPR-Cas9 vektörü
Raporlayıcı plazmitpRJPaph-bjGFPGFP reporter plazmidi
PrimerF_rehber1_BbsIpACGCTGTTTACAGAGGCATGCAAG
PrimerR_rehberi1_BbsIpAAACCTTGCATGCCTCTGTAAACA
PrimerF_guide2_BbsIpACGCGCTTGTTCGGATCCGACCGT
PrimerR_rehberi2_BbsIpAAACACGGTCGGATCCGAACAAGC
PrimerF_nodC_Up_EcoRIAAAGAATTCCTCATTGCAAGCCAGCAGT
PrimerR_nodC_Up_SacIAAAGAGCTCCGGAAAGCTTGTTTCGGATCC
PrimerF_nodCdown_KpnIAAAGGTACCTCGAGAGCACCGCATAAGAC
PrimerR_nodCdown_XbaIAATTCTAGATGGTTCGGTACTTTCGTGCA
PrimerF_FL_nodCgfp_XbaIAAATTCTAGACTCATTGCAAGCCAGCCAGT
PrimerBjGFP_BP_F1GAAGTTCATCTGCACCACCG
PrimerBjGFP_BP_R1GTCCTTGAACGAGATGGTGC
PrimerBjGFP_BP_F2CCAACTTCAAGATCCGCCAC
PrimerGFP_RCCAACTTCAAGATCCGCCAC
PrimerBjGFP_BP_R2CTTGTACAGCTCGTCCATGC
Primer16S_F1ATCCTGGCTCAGAACGAACG
Primer16S_R1ATTCCCACGCGTTACTCACC
Primer16S_F2AGTCCGAGAGGGTGAGTGG
Primer16S_R2GTCAGTACCGAGCCAGTGAG
PrimerF1_nodCCGATTTCCAGAACCGTCGTC
PrimernodC_RCGATTTCCAGAACCGTCGTC
PrimerR1_nodCTCCCCTGCTACAATGAGGAC
PrimerF2_nodCAGTGACTCCGCAATTCCAGA
PrimerR2_nodCTGTCGGTAAAAGTGTTTCCC
PrimerF1_nodBTGGTTCGGTACTTTCGTGCA
PrimerR1_nodBAGTCGCGTGGATCAATGGAC
PrimerF1_nodATGATCGTCGCTGAATTGGGC
PrimerR1_nodACAACTGATGGAGCACTGGGT
PrimerF1_nodDTGGCCTTAAGAGACGTGTCG
PrimerR1_nodDAAATGCCTGACCAGCCGTAA

Tablo 2: Bu çalışmada kullanılan bakteri suşları, plazmidler ve oligonükleotit primerler. Bu tablo; tek kılavuz RNA (sgRNA) yapımı, homoloji yönlendirmeli onarım (HDR) şablon montajı, tanısal polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), Sanger dizileme ve ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) için kullanılan bakteri suşlarını, plazmidleri ve oligonükleotit primerleri listelemektedir. Primer dizileri 5′ figure-protocol-2 3′ yönünde sunulmuştur. Not: BjGFP_BP_F2 ve GFP_R aynı oligonükleotit dizisine atıfta bulunur, ancak farklı deneysel analizlerde kullanıldıkları için farklı primer isimleri altında listelenmişlerdir.

4. Plazmidin M. ciceri CC1192'ye Aktarımı için Biparental Çiftleştirme

  1. Donör E. coli Hücrelerinin Transformasyonu
    1. Ek Dosya 3'te (Adım 4.1) açıklanan prosedüre uygun olarak, pCasPP-gRNA1-HDR veya pCasPP-gRNA2-HDR konstrüktları ile E. coli S17-1λpir hücrelerini transforme edin.
    2. Transformantları 50 µg/mL neomisin içeren LB agarda seçin.
    3. Yaklaşık 488 nm eksitasyon ve yaklaşık 510–520 nm emisyon deteksiyonu kullanarak transformantları GFP floresansı açısından tarayın.
    4. Aynı mikroskop ayarları altında incelendiğinde, transforme edilmemiş E. coli S17-1λpir kontrol kolonilerinde görülmeyen, üniform ve belirgin yeşil floresans sergileyen kolonileri GFP-pozitif olarak sınıflandırın.
    5. Onaylanmış GFP-pozitif donör klonlardan gliserol stokları hazırlayın.
  2. Tohum ve Başlangıç Kültürlerinin Hazırlanması
    1. Ek Dosya 3'e (Adım 4.2) uygun olarak donör E. coli S17-1λpir ve resipiyent M. ciceri başlangıç kültürlerini hazırlayın.
    2. Başlangıç kültürlerini, yaklaşık 1 × 108 CFU/mL tahmini hücre yoğunluğuna karşılık gelen 0.3–0.4 OD₆₀₀ değerine kadar büyütün.
  3. Biparental Çiftleşme için Subkültürlerin Hazırlanması
    1. Donör ve resipiyent subkültürleri hazırlayın ve bunları Ek Dosya 3'e (Adım 4.3) uygun olarak gerekli eksponansiyel büyüme fazına kadar büyütün.
    2. Ek Dosya 1'de (Adım 1.2.3) açıklanan optik yoğunluk ölçüm prosedürüne uygun olarak, bir UV–görünür spektrofotometre kullanarak 600 nm'deki optik yoğunluğu (OD600) ölçün.
  4. Biparental Çiftleşme Prosedürü
    1. Ek Dosya 3'e (Adım 4.4) uygun olarak membran filtre biparental çiftleşme işlemini gerçekleştirin.
    2. Çiftleşme süspansiyonunun dört alikotunu, karışmayı önlemek için spotlar arasında yeterli boşluk bıraktığınızdan emin olarak steril bir 0.22 µm poliviniliden florür (PVDF) membran filtreye (47 mm çap) damlatın.
  5. Transkonjugantların Geri Kazanımı ve Seçimi
    1. Ek Dosya 3'e (Adım 4.5) uygun olarak transkonjugantları geri kazanın ve çift antibiyotikli seçim uygulayın.
    2. Kalıntı plazmidleri ortadan kaldırmak için transkonjugantları sadece karbenisilin içeren ortamda tekrar tekrar pasajlayın.
    3. Kolonilerin neomisin içeren ortamda büyümemesi ve tanısal PCR ile kromozomal olarak entegre HDR kasetini korurken pCasPP omurgasının yokluğunun kanıtlanmasıyla plazmid eliminasyonunu onaylayın.
      NOT: Entegre modifikasyonun stabilitesini doğrulamak ve kalıntı episomal plazmidleri ortadan kaldırmak için ardışık pasajlama gereklidir.
  6. GFP-Pozitif Kolonilerin Taranması
    1. Ek Dosya 3'e (Adım 4.6) uygun olarak, saflaştırılmış transkonjugantları GFP floresansı açısından tarayın ve bunları yaban tip M. ciceri kontrolleri ile karşılaştırın.
    2. Floresan kolonileri muhtemel HDR-pozitif suşlar olarak seçin.
    3. Aynı mikroskop ayarları ve pozlama koşulları altında yaban tip M. ciceri kolonilerinde görülmeyen, üniform ve belirgin yeşil floresans gösteren kolonileri GFP-pozitif olarak sınıflandırın.
    4. Alt doğrulama işlemlerine geçmeden önce GFP-pozitif kolonileri tanısal PCR ile onaylayın.
    5. Onaylanmış kolonileri kısa süreli muhafaza için 4°C'de maya mannitol (YM) agarında veya uzun süreli saklama için −80°C'de %20–25 gliserol içeren gliserol stokları halinde saklayın.

5. nodC Mutanlarının Doğrulanması

  1. nodC Lokusunda GFP Entegrasyonunun Doğrulanması
    1. GFP eksprese eden tek bir hücreyi inoküle edin M. ciceri koloniyi, içeriğinde ... bulunan 10 mL maya mannitol besiyerine (YMB) 100 µg/mL karbenisilin24Kültürü şu koşullarda inkübe edin: 28°C 180 rpm'de çalkalanarak 20–24 saat boyunca.
    2. Bakteri hücrelerini 8.000'dele santrifüj ederek hasat edin × 10 dakika boyunca ... g'de santrifüjleyin 25°CHücre peletini toplayın ve genomic DNA'yı Weerakkody ve ark. yöntemine göre izole edin.25.
    3. Genomik DNA'yı kalıp olarak kullanarak diyagnostik PCR gerçekleştirin (Tablo 2). Hazırlayın 10 µL şunları içeren PCR reaksiyonu 5 µL 2× PCR Master Mix, 0.2 µM F1_nodB ve nodC_R primerleri veya F1_nodB ve gfp_R primerleri ile 50 ng genomik DNA.
    4. Termosikletleyiciyi başlangıç denatürasyonu için şu değerde programlayın: 95°C 5 dakika boyunca, ardından 35 döngü boyunca 95°C 1 dakika boyunca, 62°C 30 saniye boyunca ve 72°C 45 s boyunca, ardından son uzama aşaması şurada: 72°C 5 dk boyunca.
    5. PCR ürünlerini, daha önce açıklandığı üzere %1 (a/h) agaroza jelde yürütün. F1_nodB/nodC_R primerlerini kullanarak vahşi tipte (WT) yaklaşık 430 bp'lik bir ürün ve bozulmuş mutantta yaklaşık 1500 bp'lik bir ürün saptayarak; F1_nodB/gfp_R primerlerini kullanarak ise mutantta yaklaşık 1000 bp'lik bir ürün (WT'de ürün yok) saptayarak GFP entegrasyonunu doğrulayın.
    6. PCR validasyonu sırasında uygun kontrolleri dahil edin. Pozitif kontrol olarak hedef diziyi içeren plazmid DNA'yı ve negatif kontrol olarak nükleaz içermeyen su içeren şablon kontrolünü (NTC) kullanın.
  2. Ters Transkripsiyon Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-qPCR) ile GFP Ekspresyonunun Kantifikasyonu
    1. WT ve mutantlardan toplam RNA izole edin M. ciceri üretici talimatlarına uygun olarak TRIzol reaktifi kullanılarak kültürler.
    2. Kontamine genomik DNA'yı uzaklaştırmak için RNA'yı, üretici talimatlarına uygun olarak DNase I ile işleyin. DNA'nın tamamen uzaklaştırıldığını, qPCR sırasında ters transkriptaz içermeyen (−RT) bir kontrol kullanarak doğrulayın.
    3. ...'den birinci zincir cDNA sentezleyin 1 µg üretici talimatlarına uygun olarak, ticari olarak temin edilebilen bir birinci zincir cDNA sentez kiti kullanılarak toplam RNA. Hazırlayın 20 µL RNA, oligo(dT) primerleri, dNTP'ler, reaksiyon tamponu, RNaz inhibitörü ve ters transkriptaz içeren reaksiyon.
    4. cDNA sentez reaksiyonunu şu sıcaklıkta inkübe edin: 42°C 60 dk boyunca bekletin, ardından şu sıcaklıkta ısı ile inaktive edin: 70°C 5 dakika boyunca. cDNA'ı − derecede saklayın.20°C kullanıma kadar.
    5. RT-qPCR reaksiyonlarını teknik üçte bir (triplik) şeklinde hazırlayın. Birleştirin 10 µL içeren reaksiyonlar 5 µL 2× SYBR Green Master Mix, 0.2 µM GFP amplifikasyonu için BjGFP_BP_F1 ve BjGFP_BP_R1 primerleri veya referans gen amplifikasyonu için 16S_F1 ve 16S_R1 primerleri (Tablo 2), 2 µL cDNA kalıbı (yaklaşık 20 ng) ve nükleaz içermeyen su.
    6. Aşağıdaki döngü koşullarını kullanarak RT-qPCR gerçekleştirin: başlangıç denatürasyonu şu değerde... 95°C 2 dakika boyunca, ardından 40 döngü boyunca 95°C 15 saniye boyunca ve 58°C 45 s boyunca, ardından ...'dan itibaren erime eğrisi analizi ile 65°C Sizinle paylaşılacak olan kaynak metni lütfen buraya ekleyin. Metni aldığımda, belirttiğiniz profesyonel çeviri standartlarına ve akademik kriterlere uygun şekilde Türkçe çevirisini gerçekleştireceğim. 95°C.
    7. Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Tespit Sistemi kullanarak qRT-PCR gerçekleştirin. Amplifikasyon grafiklerini, Ct değerler ve Bio-Rad CFX Manager yazılımı kullanılarak eritme eğrileri.
    8. 2^-ΔΔCt yöntemini kullanarak bağıl gen ekspresyonunu hesaplayın−ΔΔCt yöntem. İfadeyi 16S rRNA referans genine göre normalize edin ve WT'yi kullanın M. ciceri kalibratör örnek olarak suşu kullanın. Her biri teknik olarak üç kez ölçülen üç biyolojik replikatı analiz edin.
  3. Nodülasyon Potansiyelinin Değerlendirilmesi
    1. Bakteriyel İnokulum Hazırlanması
      1. WT ve mutant suşların tek kolonilerini, içeriğinde ... bulunan seçici YMB ortamına inoküle edin 100 µg/mL karbenisilin. Kültürleri şu sıcaklıkta inkübe edin: 28°C 180 rpm hızında çalkalamayla 30–36 sa boyunca.
      2. Kültürleri taze selektif YMB içerisinde 1:100 oranında seyreltin ve OD ölçümü yaparak büyümeyi izleyin.600 bir UV-Görünür spektrofotometre kullanarak. Cihazı ekleme yapılmamış YMB ile sıfırlayın ve kültürler yaklaşık 1'e karşılık gelen 0,3–0,4'lük bir OD600 değerine ulaşana kadar inkübasyona devam edin × 108 CFU/mL.
      3. Her bir bitkinin inokülasyonu için 3 mL standardize edilmiş bakteri süspansiyonu kullanın.
    2. Nohut Bitkisi Enfeksiyon Deneyi
      1. ... tohumlarını temin edin C. arietinum BDG256 kültivarı18,24 ICAR–Indian Agricultural Research Institute (IARI), Yeni Delhi, Hindistan'dan.
      2. Tohumları önce akan musluk suyu, ardından Milli-Q saflaştırılmış su ile iyice yıkayın. Tohumları %1 sodyum hipoklorit içerisinde, ajitasyon eşliğinde 5 dakika boyunca yüzey sterilizasyonuna tabi tutun ve steril saflaştırılmış su ile beş kez durulayın.
      3. Tohumları oda sıcaklığında 2-3 saat boyunca %0,1'lik Bavistin fungisidi (%50 karbendazim ıslanabilir toz) ile muamele edin. Muamele edilen tohumları steril saflaştırılmış su ile iki kez yıkayın.
      4. Tohumları, steril Petri kaplarındaki (110 mm) nemli steril filtre kağıtlarının üzerine yerleştirin × 40 mm), Parafilm ile kapatın ve karanlıkta şu sıcaklıkta inkübe edin: 28°C ± 2°C 3 gün boyunca.
      5. Çimlendirilmiş fideleri tek tek steril kuma transfer edin. Kumu şu sıcaklıkta sterilize edin: 121°C ve kullanmadan önce 20 dakika boyunca 15 psi basınç uygulayın.
      6. 6,0 g CaSO4'ü çözerek azot içermeyen McKnight besin çözeltisini hazırlayın₄, 1,0 g MgSO4₄·7H₂O, 1,0 g KH₂PO₄, 1,5 g KCl, 14,3 mg H₃BO₃, 0,4 mg CuSO4₄·5H₂0,08 mg MnSO4₄·4H₂O, 0,45 mg H₂MoO₄ve 1,1 mg ZnSO4₄·7H₂Steril distile su ile son hacim 5 L olana kadar tamamlayın.
      7. Fideleri, her saksıda dört bitki olacak şekilde, steril kum içeren 10 cm çapındaki saksılarda yetiştirin. Her saksıyı haftada iki kez 20 mL azotsuz McKnight çözeltisi ile sulayın.
      8. Bitkileri şu kontrollü koşullar altında yetiştirin: 22°C ± 2°C (gün), 18°C ± 2°C (gece), %55-60 bağıl nem, 16 saat ışık/8 saat karanlık şeklinde bir fotoperiyod ve şu değerde bir ışık şiddeti 200 µmol fotonlar m⁻2 s⁻1İnokülasyondan önce fideleri 6–7 gün boyunca büyütün.
      9. Her bir fideye doğrudan 3 mL bakteri süspansiyonu uygulayın. 3 mL steril YMB uygulayarak yalancı işlem görmüş (mock) kontrolleri sürdürün. İşlem grubu başına 16 biyolojik replika bitki kullanın.
      10. İnokülasyondan 20 gün sonra kökleri ve sürgünleri hasat edin. Nodülleri manuel olarak sayın ve taze biyokütleyi hasat sonrası hemen kaydedin.
      11. Dokuları şu sıcaklıkta kurutun: 65°C sabit ağırlığa ulaşıncaya kadar. Sabit ağırlığı, 24 saatlik kurutma aralıklarından sonra elde edilen ve arasındaki fark şu değerden küçük olan iki ardışık ölçüm olarak tanımlayın: <0,01 g, ardından kuru biyokütleyi kaydedin.
      12. Sonuçları ortalama olarak ifade edin ± standart hata (SE). GraphPad Prism versiyon 10.0 kullanarak, P değerini dikkate alarak tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey çoklu karşılaştırma testi gerçekleştirin. < 0,05 istatistiksel olarak anlamlıdır.
        NOT: Tohum sterilizasyonu, çimlendirme, inokülasyon ve bitki büyümesi boyunca steril koşulları koruyun.
        DİKKAT: Sodyum hipoklorit ve fungisit çözeltileri, eldiven ve göz koruması dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılarak işleme alınmalıdır.

Sonuçlar

Bu protokolde, CRISPR-Cas9 genom düzenlemesi şunlar için uyarlanmıştır M. ciceri ...yı hedefleyerek CC1192 nodC lokus. Fonksiyon kaybını teşvik etmek amacıyla, 5' uçlarını hedefleyecek şekilde sgRNA'lar tasarlanmıştır′ ...nın proksimal bölgesi nodC kodlama dizisi; böylece, kodlanan proteinin translasyonunu bozmak için başlangıç kodlama bölgesi içinde bir DSB oluşturarak (Şekil 1A).

figure-results-1
Şekil 1. Mesorhizobium ciceri'de nodC lokusunu hedefleyen tek kılavuz RNA'ların (sgRNA) tasarımı. (A) CRISPR-Cas9 aracılı hedefleme için tasarlanan iki adet 20-bp sgRNA'nın konumlarını gösteren M. ciceri nodC lokusunun şematik temsili. sgRNA hedef bölgeleri mavi renkte gösterilmiştir. (B) nodC lokusunu hedefleyen sgRNA1 ve sgRNA2'nin nükleotid dizileri. Protospacer komşu motifi (PAM; 5′-NGG-3′) kırmızı ile belirtilmiş ve nodC translasyon başlangıç kodonu (ATG) sarı ile vurgulanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5' bölgesinin hemen yukarısında iki adet 20 bp'lik hedef dizi belirlendi′-NGG-3′ PAM dizisi (Şekil 1B). Bu aday sgRNA'ların Hsu ve ark. tarafından geliştirilen algoritma kullanılarak in silico analizi.19 100 olan özgünlük skorları elde edilmiş olup, bu durum, belirlenen bölge içerisinde anlamlı bir hedef dışı komplementerliğin tespit edilmediği ve öngörülen hedefleme özgünlüğünün yüksek olduğu anlamına gelmektedir. M. ciceri genom. Seçilen sgRNA'ların öngörülen hedef üzerindeki etkinlik skorlarında küçük farklılıklar gözlemlenmiştir (Tablo 3), bu durum sonraki deneysel değerlendirme için kılavuz seçimini bilgilendirmiştir.

Hedef pozisyon
(bp)		ZincirsgRNA dizisi (5′ figure-results-2 3′)PAMÖzgüllük puanıVerimlilik puanı
77+TGTTTACAGAGGCATGCAAGCGG10043.58
139+GCTTGTTCGGATCCGACCGTTGG99.747.63

Tablo 3: Mesorhizobium ciceri'de nodC geninin CRISPR-Cas9 aracılı düzenlemesi için tasarlanan aday tek kılavuz RNA'lar (sgRNA'lar).Aday sgRNA'lar, referans genom olarak Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 kullanılarak Benchling CRISPR Kılavuz Tasarım Aracı ile tasarlanmıştır. Kılavuzlar, öngörülen özgünlük ve hedef üzerindeki etkinlik skorlarına göre sıralanmış; nodC translasyonel başlangıç kodonuna yakın dizileri hedefleyen ve Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) için gerekli olan NGG protospacer komşu motifunu (PAM) içerenler seçilmiştir.

HDR'yi ve olası mutantların floresan tabanlı taramasını kolaylaştırmak için, pUC18 klonlama vektörü kullanılarak bir HDR kaseti oluşturuldu (Şekil 2). gfp raporlayıcı kaseti, SacI ve KpnI restriksiyon sindirimi ile pRJPaph-bjGFP'den kesildi ve lineerize edilmiş pUC18 omurgasına ligandı (Şekil 2A). E. coli'ye transformasyonun ardından, olası pozitif klonlar mavi-beyaz tarama ile belirlendi. gfp insertinin pUC18 omurgasına entegrasyonu, pozitif klonlarda beklenen 500 bp amplikonu üreten gene spesifik primerler kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonu ile ayrıca doğrulandı (Şekil 2A).

figure-results-3
Şekil 2. nodC bozunumu için CRISPR-Cas9 homolojiye yönelimli onarım (HDR) sisteminin kurulumu. (A) pUC18-gfp ara plazmidinin kurulumu ve doğrulaması. Üst panel, yeşil floresan protein (gfp) kasetinin pUC18 omurgasına yerleştirilmesiyle oluşturulan pUC18-gfp plazmid haritasını göstermektedir. Orta panel, mavi-beyaz tarama sonrası temsilci kolonileri göstermektedir. Alt panel, BjGFP_BP_F1 ve BjGFP_BP_R2 primer çifti kullanılarak yapılan koloni polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) doğrulamasını göstermektedir. (B) pUC18 omurgasında HDR şablonunun ardışık montajı. Plazmid haritaları ve restriksiyon sindirim analizleri; yukarı akış homoloji kolunun (UHA), aşağı akış homoloji kolunun (DHA) ve eksiksiz UHA-gfp-DHA HDR kasetinin eklenmesini doğrulamaktadır. (C) UHA-gfp-DHA HDR kasetinin pCasPP CRISPR-Cas9 vektörüne klonlanması ve doğrulanması. Üst panel final pCasPP-HDR plazmid haritasını, alt panel ise HDR kasetinin eklenmesini doğrulayan restriksiyon sindirimi göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

HDR konstrüktü, gfp kasetini çevreleyen nodC homoloji kolları eklenerek birleştirilmiştir. Tahmin edilen Cas9 kesim bölgesinin yanına yerleştirilen 500 bp'lik bir UHA ve 400 bp'lik bir DHA, restriksiyon sindirimi ve ligasyon yoluyla pUC18-gfp konstrüktüne sırasıyla klonlanmıştır (Şekil 2B). UHA-gfp-DHA kasetinin birleştirilmesi, beklenen 2012 bp'lik fragmanı veren restriksiyon sindirimi analizi ile doğrulanmıştır (Şekil 2B). Tamamlanmış HDR kaseti daha sonra geniş konak yelpazeli CRISPR vektörü pCasPP'ye alt-klonlanmıştır (Şekil 2C). Restriksiyon sindirimi analizi, final konstrüktün bütünlüğünü ve M. ciceri için genom düzenleme iletim vektörünün başarılı bir şekilde birleştirildiğini doğrulamıştır (Şekil 2C).

pCasPP-gRNA-HDR konstrüktünü M. ciceri içine aktarmak için donör E. coli S17-1λpir ve resipiyent M. ciceri suşu arasında biparental çiftleştirme gerçekleştirildi (Şekil 3A). Şekil 3B, nod operon organizasyonunu ve HDR şablonu kullanılarak homolog rekombinasyon yoluyla nodC lokusunun gfp kaseti ile öngörülen değişimini göstermektedir. Transkonjugant koloniler, biparental çiftleştirmenin ardından başlangıçta GFP floresan taraması ile tanımlandı (Şekil 3B ve 3C). Geri kazanılan kolonilerin %80'inden fazlası gRNA2 ile GFP floresansı gösterdi ve kolonilerin %65'inden fazlası gRNA1 girişini takiben floresans sergiledi (Şekil 3C). Sadece floresan taramasının plazmit kaynaklı GFP ekspresyonu ile başarılı genomik entegrasyonu ayırt edememesi nedeniyle, reporter kasetinin lokusa özgü insersiyonunu doğrulamak için aşağı akış moleküler validasyonu gerçekleştirildi.

figure-results-4
Şekil 3CRISPR-Cas9 aracılı ... bozulması/yıkımı nodC lokusunda Mesorhizobium ciceri. (A) pCasPP-gRNA-HDR konstrüktünün aktarılması için kullanılan biparental çiftleşmenin şematik gösterimi Escherichia coli S17-1λdonör hücreleri pipetle aktarın M. ciceri alıcı hücreler. (B) Homolojiye yönlendirilmiş onarım (HDR) aracılı yer değiştirmeyi gösteren diyagram nodC şuna sahip lokus gfp CRISPR-Cas9 kesimini takiben kaset. HDR şablonu, kaseti çevreleyen yaklaşık 500 bp'lik yukarı akış (upstream) ve 400 bp'lik aşağı akış (downstream) homoloji kolları içerir gfp kaset (C) Transkonjugantların floresan tabanlı taraması M. ciceri koloniler. GFP-pozitif kolonilerin temsilci floresan ve parlak alan stereomikroskopi görüntüleri, sgRNA1 veya sgRNA2 içeren konstrüktlar kullanılarak yapılan biparental eşleşme sonrası elde edilen floresan transkonjugantların yüzdesiyle birlikte gösterilmiştir. Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. Lütfen bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.

gfp kasetinin nodC lokusuna entegrasyonunu doğrulamak için, temsili GFP-pozitif koloniler PCR analizine tabi tutulmuştur. nodB ve nodC bölgelerini kapsayan genomik bölgenin amplifikasyonu, editlenmiş klonlarda rapor kasetinin entegrasyonu ile uyumlu olarak 1511 bp'lik bir fragman üretirken, yabanıl tip (WT) suş 430 bp'lik bir amplikon üretmiştir (Şekil 4A). gfp-spesifik ve nodC-flanking primerlerin kullanıldığı PCR amplifikasyonu, editlenmiş klonlarda belirgin bir 997 bp'lik fragman oluştururken, WT kontrolde herhangi bir amplifikasyon saptanmamış olup bu durum lokusa özgü insersiyonu desteklemiştir. Rapor kasetinin oryantasyonu Sanger sekanslama ile doğrulanmıştır. Ek olarak, editlenmiş suşlardaki GFP ekspresyonu RT-qPCR kullanılarak değerlendirilmiş ve WT suşa kıyasla artmış GFP transkript birikimi gözlemlenmiştir (Şekil 4B). Ekspresyon değerleri, WT suş kontrol alınarak 2−ΔΔCt yöntemi ile hesaplanmış ve referans 16s genine göre normalize edilmiştir. Veriler, üç biyolojik tekrardan elde edilen ortalama ± SD değerlerini temsil etmektedir (n = 3). İstatistiksel anlamlılık, tek yönlü ANOVA ve ardından WT kontrolüne karşı Dunnett testi ile belirlenmiştir.

Çalışmanın mevcut sınırlılığı, temel rekombinasyon katsayısını belirlemek için boş-gRNA pCasPP-HDR gibi bir kontrol vektörünün yokluğudur. Gelecek çalışmalar böyle bir kontrolü içermelidir.

figure-results-5
Şekil 4. ΔnodC Mesorhizobium ciceri mutantlarının moleküler doğrulaması. (A) nodC bozulmasının PCR tabanlı doğrulanması. Sol panel, F1_nodB ve nodC_R primer çifti kullanılarak yapılan amplifikasyonu göstermektedir. M şeridi, DNA merdiveni; 1–4 şeritleri, ΔnodC M. ciceri mutantları; WT şeridi, yabanı tip M. ciceri. Sağ panel, F1_nodB ve gfp_R primer çifti kullanılarak yapılan amplifikasyonu göstermektedir. M şeridi, DNA merdiveni; 1–4 şeritleri, ΔnodC M. ciceri mutantları; WT şeridi, yabanı tip M. ciceri. Beklenen amplikon boyutları belirtilmiştir. (B) Ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile belirlenen ΔnodC M. ciceri mutantlarındaki göreli yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonu. Gen ekspresyonu, M. ciceri 16S ribozomal RNA (16S rRNA) referans genine göre normalize edilmiş ve 2^−ΔΔCt yöntemi kullanılarak yabanı tip (WT) kontrole göre göreli olarak ifade edilmiştir. Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. İstatistiksel anlamlılık, WT kontrole göre belirlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

nodC bozulmasının biyolojik etkisi, nohut enfeksiyon deneyleri kullanılarak değerlendirildi. WT M. ciceri ile inoküle edilen bitkiler görünür kök nodülleri oluştururken, ΔnodC M. ciceri ile inoküle edilen bitkiler nodülasyonda belirgin bir azalma veya nodül yokluğu sergiledi (Şekil 5A). İnoküle edilmemiş kontrol bitkiler nodülsüz kaldı ve bu da steril deney koşullarının korunduğunu destekledi (Şekil 5A). Bitki büyüme parametrelerinin kantitatif analizi; kök uzunluğu, taze kök ağırlığı, kuru kök ağırlığı, sürgün uzunluğu, taze sürgün ağırlığı, kuru sürgün ağırlığı ve nodül sayısı dahil olmak üzere WT ve ΔnodC M. ciceri ile inoküle edilmiş bitkiler arasındaki farkları daha ayrıntılı olarak ortaya koydu (Şekil 5B). WT ile inoküle edilen bitkiler, ΔnodC M. ciceri ile inoküle edilen ve inoküle edilmemiş kontrol bitkilerine kıyasla daha yüksek nodül sayıları ve gelişmiş büyüme ile ilişkili parametreler sergiledi. Bu bulgular, nodC ile ilişkili nodülasyon fonksiyonunun bozulmasıyla tutarlıdır ve bu CRISPR-Cas9 tabanlı iş akışının M. ciceri'de fonksiyonel genomik çalışmalar için uygulanabilirliğini desteklemektedir. Tedavi grupları arasındaki farkları karşılaştırmak için kantitatif bitki fenotip verileri değerlendirildi. Analize toplam 90 biyolojik tekrar dahil edildi (tedavi grubu başına n = 30 bitki). Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. İstatistiki anlamlılık, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey post hoc çoklu karşılaştırma testi kullanılarak değerlendirildi. Farklar P < 0,05 değerinde istatistiki olarak anlamlı kabul edildi.

figure-results-6
Şekil 5. Bir nohut enfeksiyon deneyi kullanılarak ΔnodC Mesorhizobium ciceri mutantlarının fonksiyonel doğrulaması. (A) Yabanı tip M. ciceri, ΔnodC M. ciceri veya inoküle edilmemiş kontrollerle inokülasyondan 20 gün sonraki temsili nohut (Cicer arietinum) bitkileri. (B) Kök uzunluğu, taze kök ağırlığı, kuru kök ağırlığı, sürgün uzunluğu, taze sürgün ağırlığı, kuru sürgün ağırlığı ve nodül sayısı dahil olmak üzere bitki büyüüme ve nodülasyon parametrelerinin kantitatif analizi. Veriler yabanı tip M. ciceri, ΔnodC M. ciceri veya inoküle edilmemiş kontrollerle inoküle edilen bitkiler için sunulmuştur. Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. İstatistiki anlamlılık, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi ile belirlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1. Kimyasal olarak yetkin Escherichia coli hücrelerinin hazırlanması ve doğrulanması için detaylı protokol.Bu ek dosya; bakteriyel kültür hazırlığı, yetkinlik indüklemesi, hücre hasadı, CaCl₂-gliserol tamponu ile yıkama, aliquotlama, kriyokorunma ve transformasyon verimliliği testi ile doğrulama dahil olmak üzere, kimyasal olarak yetkin Escherichia coli DH5α ve E. coli S17-1λpir hücrelerinin hazırlanması ve doğrulanmasına yönelik eksiksiz prosedürü sunmaktadır. Kritik kalite kontrol önlemleri, saklama önerileri ve yetkinlik kabul kriterleri de dahil edilmiştir. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Dosya 2. Homolojiye dayalı onarım (HDR) şablonlarının oluşturulması ve CRISPR-Cas9 genom düzenleme vektörlerinin montajı için ayrıntılı protokol.Bu ek dosya; yeşil floresan protein (GFP) kasetinin eksizyonu, pUC18-gfp ara plazmidinin oluşturulması, yukarı akış ve aşağı akış homoloji kollarının amplifikasyonu ve klonlanması, tam homolojiye dayalı onarım (HDR) şablonunun montajı, pCasPP-rehber RNA (gRNA) vektörlerinin hazırlanması, HDR şablonlarının CRISPR-Cas9 plazmidlerine yerleştirilmesi, floresan tabanlı klon taraması ve rekombinant plazmidlerin restriksiyon analizi ve Sanger dizileme ile doğrulanması için ayrıntılı prosedürleri içermektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3. Biparental çiftleşme ve GFP etiketli Mesorhizobium ciceri transkonjugantlarının oluşturulması için ayrıntılı protokol.Bu ek dosya; donör ve resipiyent suş hazırlığını, membran filtreli biparental çiftleşmeyi, transkonjugantların geri kazanımını ve antibiyotik seçimini, plazmit temizleme prosedürlerini, rekombinant kolonilerin floresan tabanlı taramasını, genomu düzenlenmiş suşların moleküler onayını ve onaylanmış GFP-pozitif M. ciceri transkonjugantlarının kısa ve uzun süreli saklanmasını açıklamaktadır. Ayrıntılı kültür koşulları, çiftleşme parametreleri ve seçim prosedürleri sunulmuştur. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

M. ciceri bünyesinde bir CRISPR-Cas9 genom düzenleme sisteminin kurulması, tarımsal açıdan önemli olan bu azot sabitleyici simbiyontun genetik manipülasyonundaki temel bir teknik kısıtlamayı gidermektedir. Bir gfp raporlayıcısı ve HDR kullanarak nodC lokusunun bozulmasıyla bu iş akışı, M. ciceri'de hedeflenmiş genomik modifikasyon için floresan destekli bir çerçeve sunmaktadır.

Rhizobialarda geleneksel genetik manipülasyon yaklaşımları, öncelikle Tn5 tabanlı rastgele mutajeneze veya sacB aracılı allelik değişime dayanmıştır19,26,27. Bu yaklaşımlar hala değerli olmakla birlikte, emek yoğundur, genellikle birden fazla karşı-seçilim aşaması gerektirir ve genomda sonraki düzenleme turlarına engel teşkil edebilecek antibiyotik direnç belirteçleri bırakabilir. Buna karşılık, CRISPR-Cas9 aracılı genom düzenleme, genomik mühendislik için daha hedefli ve optimize edilmiş bir alternatif sunar. Son çalışmalar, Cas9 ile ilişkili toksisiteyi azaltmak için S. meliloti'de CRISPR aracılı baz düzenleme ve Cas12e tabanlı sistemler rapor etmiş12,13, dCas9 aracılı transkripsiyonel baskılama ise R. etli'de araştırılmıştır11. Bildiğimiz kadarıyla, bu çalışma M. ciceri'de CRISPR-Cas9 aracılı kromozomal bozulmanın ilk uygulamalarından birini temsil etmektedir. Protokol; sgRNA rehberli hedefleme, biparental plazmid iletimi ve lokus spesifik düzenleme için HDR aracılı rekombinasyonu içermektedir. HDR kaseti içine gfp raporerinin entegrasyonu, düzenlendiği varsayılan kolonilerin floresan tabanlı hızlı taramasını kolaylaştırarak, alt süreçlerde moleküler doğrulama gerektiren kolonilerin sayısını azaltmaktadır.

İş akışının başarılı bir şekilde uygulanması için birkaç faktör önemliydi. Yüksek öngörülen özgüllüğe sahip sgRNA'ların seçimi, M. ciceri genomundaki potansiyel hedef dışı etkileri minimize ederken, homoloji kollarının bütünlüğünün korunması HDR aracılı rekombinasyon verimliliğini desteklemiştir. Ek olarak, biparental çiftleşme sırasında donör ve alıcı büyüme koşullarının optimize edilmesi, transkonjugantların geri kazanımını artırmıştır. Floresans tabanlı tarama, olası mutantların hızla tanımlanmasını sağlamıştır; ancak, raporlayıcı kasetin lokusa özgü entegrasyonunu doğrulamak için PCR ve Sanger sekanslama kullanılarak yapılan moleküler doğrulama hala gereklidir. Gelecekteki çalışmalarda, bazal rekombinasyon katsayısını nicelleştirmek için boş-gRNA pCasPP-HDR vektör kontrolü kullanılabilir.

Metodolojik ilerlemenin ötesinde, bu platform nohutla ilişkili rizobiyalarda simbiyotik sinyalleme ve fonksiyonel genomiği araştıran gelecekteki çalışmaları destekleyebilir28. Nohut (Cicer arietinum L.), küresel olarak önemli bir baklagil ürünüdür ve sürdürülebilir tarım sistemlerine önemli bir katkı sağlar29,30. Bu çalışmada oluşturulan ΔnodC M. ciceri suşu, konak-mikrop uyumluluğunu ve nodülasyonla ilişkili sinyal yollarını araştırmak için potansiyel olarak yararlı bir genetik arka plan sağlar. Önceki çalışmalar, sRNA'ların erken kök nodül simbiyozu sırasında düzenleyici efektörler olarak işlev gördüğünü öne sürmüştür31. Sonuç olarak, burada açıklanan nodülasyon yeteneği olmayan ΔnodC M. ciceri suşu, rizosfer iletişimi ve azot sabitleyici simbiyozun temelindeki moleküler mekanizmalara odaklanan gelecekteki çalışmaları kolaylaştırabilir.

Açıklamalar

Yazarlar, herhangi bir rakip finansal çıkar veya çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Dr. Nandita Pasari için Biyoteknoloji Departmanı (DBT)-MK Bhan Hibesi HRD-16016/15/2023-AFS-DBT tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma ayrıca, Yeni Delhi, Hindistan'daki Ulusal Bitki Genom Araştırmaları Enstitüsü tarafından Dr. Senjuti Sinharoy'a sağlanan bir Çekirdek Hibe ile desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgarozGenetixPG-40005Jel elektroforezi
Alüminyum folyoRolia’sGF83048115Genel laboratuvar kullanımı
Bakteriyolojik agarHiMediaGRM026Besiyeri hazırlama
Benchling CRISPR Kılavuz Tasarım PlatformuBenchlingN/AKılavuz RNA tasarımı
Borik asitHiMediaPCT0102McKnight’s çözeltisi hazırlama
Borosilikat cam erlenSigmaCLS5100500Kültür hazırlama
Borosilikat cam tüplerSigmaDWK73500-1075Kültür hazırlama
Kalsiyum klorür dihidratHiMediaMB034Kompetan hücre hazırlama
Kalsiyum sülfat dihidratHiMediaGRM328McKnight’s çözeltisi hazırlama
Karbenisilin disodyumDuchefa BiochemieDUC-C0109.005-18100 µg/mL konsantrasyonda kullanılır
cDNA sentez kitiThermo Fisher ScientificAB1543AcDNA sentezi
Stretch filmOA10954049Genel laboratuvar kullanımı
Klonlama kiti/T4 DNA ligazThermo Fisher ScientificK1422Ligasyon reaksiyonları
Kongo kırmızısıHiMedia573-58-0Mikrobiyal kültür çalışmaları
Bakır(II) sülfat pentahidratHiMediaPCT0104McKnight’s çözeltisi hazırlama
Kültür tüpüBorosil9800U08Birincil bakteri kültürünün üretimi; 15 cm × 2.5 cm
Dijital pH metreEutech InstrumentsEC PH TUTOR DSpH ayarı
Dipotasyum fosfatHiMediaTC596MYMB hazırlama
DNA merdiveniBIO-HELIXDM015-R500Jel elektroforezi
DNaz uzaklaştırma kitiInvitrogenAM1907İzole edilmiş RNA'dan DNA uzaklaştırma
dNTP karışımıThermo ScientificR0181PCR amplifikasyonu
EthanolSigma-Aldrich1.00983.0511%75 konsantrasyonda kullanılır
Etidyum bromürSigma-AldrichE1510DNA jel boyama
FastAP Termosensitif Alkalen FosfatazThermo Fisher ScientificEF0651Klonlama sırasında vektörün defosforilasyonu
FastDigest TamponuThermo Fisher ScientificB64Restriksiyon sindirimleri
Ferrik klorür anhidrozHiMediaTC583McKnight’s çözeltisi hazırlama
Floresan stereomikroskopNikonSMZ25GFP taraması
Fungisit, BavistinCrystal Crop ProtectionBavistin Carbendazim 50% WPTohum uygulaması
Gel ekstraksiyon kitiQIAGEN28704DNA saflaştırma
GliserolThermo Fisher ScientificQ24505Kompetan hücreler/gliserol stokları
Orbital çalkalayıcıya sahip büyüme inkübatörüMRCLOM-150Bakteriyel kültür
EldivenKimtech97612Kişisel koruyucu ekipman
HEPESHiMediaMB016Oligonükleotid tavlama
IPTGG BiosciencesRC1113DMavi-beyaz tarama
Laminer hava akış kabiniBiolinkBL-H1300Steril işlem
LB agarHiMediaM1151Bakteriyel kültür plakları
LB sıvı besiyeriHiMediaG1245Bakteriyel kültür
Magnezyum sülfatHiMediaGRM1281-500GYMB hazırlama
Magnezyum sülfat heptahidratHiMediaPCT0008McKnight’s çözeltisi hazırlama
Manganez(II) sülfat tetrahidratSigma-AldrichM3634McKnight’s çözeltisi hazırlama
MannitolHiMediaMB198YMB hazırlama
McKnight’s çözeltisiLaboratuvar hazırlamasıN/ABitki besin çözeltisi
Mikro uçlar, 0.2–10 µLTarsons521000Sıvı aktarımı
Mikro uçlar, 2–200 µLTarsons521010Sıvı aktarımı
Mikro uçlar, 200–1000 µLTarsons521020XSıvı aktarımı
Mikrosantrifüj tüpü, 0.5 mLTarsons500000Numune işleme
Mikrosantrifüj tüpü, 1.5 mLTarsons500010Numune işleme
Mikrosantrifüj tüpü, 2.0 mLTarsons500020Numune işleme
Molibdik asitSigma-Aldrich232084McKnight’s çözeltisi hazırlama
NanoDrop spektrofotometreThermo Fisher Scientific13-400-519DNA/RNA kantifikasyonu
NeomisinDuchefa BiochemieM013550 µg/mL konsantrasyonda kullanılır
Nükleaz içermeyen suHiMediaML064-100MLMoleküler biyoloji kullanımı
PCR master mixThermo Fisher ScientificK01712× master mix
PCR tüp şeritleri, 0.2 mLTarsons610040PCR kurulumu
Petri plakları, 90 mmPSC2041Agar plakları
Pipet, 0.1–2.5 µLEppendorfN10178MSıvı aktarımı
Pipet, 0.5–10 µLEppendorfH40069LSıvı aktarımı
Pipet, 2–20 µLEppendorfH30046MSıvı aktarımı
Pipet, 10–100 µLEppendorfI00395MSıvı aktarımı
Pipet, 20–200 µLEppendorfM38186MSıvı aktarımı
Pipet, 100–1000 µLEppendorfN20610MSıvı aktarımı
Plazmid DNA ekstraksiyon kitiQIAGEN12143Plazmid izolasyonu
Potasyum klorürHiMediaTC010McKnight’s çözeltisi hazırlama
Potasyum dihidrojen fosfat anhidrozHiMediaTC011MMcKnight’s çözeltisi hazırlama
PVDF membran filtre, 0.22 µm, 47 mmMilliporeSigmaGVWP04700Biparental çiftleşme
Kantitatif gerçek zamanlı PCR cihazıBio-RadCFX96RT-qPCR
Soğutmalı masaüstü santrifüjEppendorf04-987-373Hücre hasadı
Restriksiyon enzimi, BbsIThermo Fisher ScientificER1011gRNA klonlama
Restriksiyon enzimi, EcoRIThermo Fisher ScientificFD0274Klonlama
Restriksiyon enzimi, KpnIThermo Fisher ScientificFD0524Klonlama
Restriksiyon enzimi, SacIThermo Fisher ScientificFD1133Klonlama
Restriksiyon enzimi, XbaIThermo Fisher ScientificFD0684Klonlama
RNaz içermeyen DNazQIAGEN79254RNA temizleme
KumRam SuratSandBitki büyüme substratı
SıralayıcıApplied BiosystemsABI3730xl DNA AnalyzerSanger dizileme
SOC besiyeriLaboratuvar hazırlamasıN/ATransformasyon toparlanması
Sodyum klorürHiMediaTC046Besiyeri hazırlama
Sodyum hidroksitHiMediaPCT1325HEPES pH ayarı
Steril cerrahi bıçakMedicare Surgical16020Gel eksizyonu/doku işleme
Steril şırıngaHMD Dispovan10ml syringe without needleSteril filtrasyon
Steril şırınga filtresi, 0.22 µmMerck Millex Durapore12766842Filtre sterilizasyonu
SYBR Green master mixNew England BiolabsM3003ERT-qPCR
TetrasiklinDuchefa BiochemieT010505 µg/mL konsantrasyonda kullanılır
Termal döngüleyiciApplied BiosystemsA24811PCR amplifikasyonu
Kağıt havluRolia’s07AAECR4885K1ZTGenel laboratuvar kullanımı
TRIzol reaktifiInvitrogen15596026RNA izolasyonu
UV transilüminatörAnalytik JenaTW-43Gel görselleştirme
UV-Vis spektrofotometreEppendorfD30OD600 ölçümü
Vis küvetlerEppendorf30079345OD600 ölçümü
Vorteks karıştırıcıNeuationiSWIX-VTNumune karıştırma
X-galG BiosciencesRC1233Mavi-beyaz tarama
Maya özütüHiMediaRM668-500GBesiyeri hazırlama
Çinko sülfat heptahidratSigma-AldrichZ0251McKnight’s çözeltisi hazırlama

Kaynaklar

  1. Doudna JA, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.
  2. Jiang W, Bikard D, Cox D, Zhang F, Marraffini LA. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology. 2013;31(3):233-9.
  3. Bertrand C, Thibessard A, Bruand C, Lecointe F, Leblond P. Bacterial NHEJ: a never ending story. Molecular microbiology. 2019;111(5):1139-51.
  4. Loureiro A, da Silva GJ. Crispr-cas: Converting a bacterial defence mechanism into a state-of-the-art genetic manipulation tool. Antibiotics. 2019;8(1):18.
  5. Altenbuchner J. Editing of the Bacillus subtilis genome by the CRISPR-Cas9 system. Applied and environmental microbiology. 2016;82(17):5421-7.
  6. Wang Y, et al. Bacterial genome editing with CRISPR-Cas9: deletion, integration, single nucleotide modification, and desirable “clean” mutant selection in Clostridium beijerinckii as an example. ACS synthetic biology. 2016;5(7):721-32.
  7. Oh J-H, van Pijkeren J-P. CRISPR–Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic acids research. 2014;42(17):e131-e.
  8. Cobb RE, Wang Y, Zhao H. High-efficiency multiplex genome editing of Streptomyces species using an engineered CRISPR/Cas system. ACS synthetic biology. 2015;4(6):723-8.
  9. Wanjofu EI, et al. Nodulation and growth promotion of chickpea by Mesorhizobium isolates from diverse sources. Microorganisms. 2022;10(12):2467.
  10. Haskett T, et al. Complete genome sequence of Mesorhizobium ciceri strain CC1192, an efficient nitrogen-fixing microsymbiont of Cicer arietinum. Genome Announcements. 2016;4(3):10.1128/genomea. 00516-16.
  11. Bellahsen O, Díaz-Méndez R, Romero D. Genomic engineering in Rhizobium etli: implementation and evaluation of systems based on dCas9. Frontiers in Microbiology. 2025;16:1604430.
  12. Liu G, et al. An efficient CRISPR/Cas12e system for genome editing in Sinorhizobium meliloti. ACS Synthetic Biology. 2023;12(3):898-903.
  13. Wang L, Xiao Y, Wei X, Pan J, Duanmu D. Highly efficient CRISPR-mediated base editing in Sinorhizobium meliloti. Frontiers in Microbiology. 2021;12:686008.
  14. Schäfer A, et al. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. 1994;145(1):69-73.
  15. Rütering M, et al. Tailor-made exopolysaccharides—CRISPR-Cas9 mediated genome editing in Paenibacillus polymyxa. Synthetic Biology. 2017;2(1):ysx007.
  16. Ledermann R, Bartsch I, Remus-Emsermann MN, Vorholt JA, Fischer H-M. Stable fluorescent and enzymatic tagging of Bradyrhizobium diazoefficiens to analyze host-plant infection and colonization. Molecular Plant-Microbe Interactions. 2015;28(9):959-67.
  17. Göttfert M. Regulation and function of rhizobial nodulation genes. FEMS microbiology reviews. 1993;10(1-2):39-63.
  18. Kant C, Pradhan S, Bhatia S. Dissecting the root nodule transcriptome of chickpea (Cicer arietinum L.). PLoS One. 2016;11(6):e0157908.
  19. Hsu PD, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 2013;31(9):827-32.
  20. Doench JG, et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature biotechnology. 2016;34(2):184-91.
  21. Norrander J, Kempe T, Messing J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 1983;26(1):101-6.
  22. Simon R, Priefer U, Pühler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Bio/technology. 1983;1(9):784-91.
  23. Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. [4] Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods in enzymology. 1991;204:63-113.
  24. Alexandre A, et al. Natural populations of chickpea rhizobia evaluated by antibiotic resistance profiles and molecular methods. Microbial Ecology. 2006:128-36.
  25. Weerakkody LR, et al. A rapid, inexpensive and effective method for the efficient isolation of genomic DNA from Gram-negative bacteria. Molecular Genetics and Genomics. 2024;299(1):26.
  26. Selbitschka W, Niemann S, Pühler A. Construction of gene replacement vectors for Gram− bacteria using a genetically modified sacRB gene as a positve selection marker. Applied microbiology and biotechnology. 1993;38(5):615-8.
  27. Yadav A, Singh RP, Singh AL, Singh M. Identification of genes involved in phosphate solubilization and drought stress tolerance in chickpea symbiont Mesorhizobium ciceri Ca181. Archives of microbiology. 2021;203(3):1167-74.
  28. Dicenzo GC, et al. Multidisciplinary approaches for studying rhizobium–legume symbioses. Canadian Journal of Microbiology. 2019;65(1):1-33.
  29. Calia C, et al. A bibliometric analysis of chickpea agronomic practices in the world during 45 years of scientific research. Legume Science. 2024;6(1):e219.
  30. Sandhu J, Tripathi S, Chaturvedi S. Chickpea nutritional status and value chain for sustainable development.  Sustainable food value chain development: Perspectives from developing and emerging economies: Springer; 2023. p. 175-83.
  31. Ren B, Wang X, Duan J, Ma J. Rhizobial tRNA-derived small RNAs are signal molecules regulating plant nodulation. Science. 2019;365(6456):919-22.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

CRISPR-Cas9 DüzenlemeHomoloji Yönlendirmeli OnarımGFP ReporterFloresan MikroskopiSanger DizilemeNohut Enfeksiyon AnaliziFonksiyonel Genomik

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.