Yöntem makalesi

TSC zebrafish larvalarının kanına interleukin-6'nın mikroenjeksiyonu ve nöropsikiyatrik bozukluk benzeri davranışların incelenmesi

152 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/71524

⸱

26 Haziran 2026

 , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, International Institute of Molecular Mechanisms and Machines, IMol, Polish Academy of Sciences, 2Warsaw-4-PhD doctoral school, International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

Bu makalede

Özet

Genetik olarak hassas organizmalarda inflamatuar sinyallerin nörogelişimi nasıl etkilediğini modellemek için, zebrafish larvalarının Cuvier (ortak kardinal damar) kanalına IL-6 mikroenjeksiyonu için bir protokol sunuyoruz; bu protokol iltihabın kontrollü indüklenmesini ve tüberoz skleroz kompleksi (TSC) bağlamında gelişimsel etkisinin değerlendirilmesini mümkün kılmaktadır.

Özet

Tüberoz skleroz kompleksi (TSC1/TSC2 mutasyonları) olan hastalarda otizm spektrum bozukluğunun (ASD) değişken ifade edilebilirliği vardır ve anne bağışıklık aktivasyonunun ASD riskini artırdığı bilinmektedir. Interlökin-6 (IL-6), bağışıklık regülasyonu, iltihaplanma ve nöroinflamatuar süreçlerde iyi bilinen rolleri olan pleiotropik bir sitokindir. Enfeksiyon veya doku hasarına yanıt olarak birden fazla bağışıklık hücresi tipi tarafından üretilir ve genellikle pro-inflamatuar bir aracı olarak tanımlanır. Özellikle, IL-6 kan-beyin bariyerini aşabilir ve otizm spektrum bozukluğu (ASD) ve entelektüel engel (ID) gibi nöroinflamasyon ve iltihapla ilişkili nöropsikiyatrik durumlarda rol oynamıştır. Burada, zebrabalıklarda IL-6'yı Cuvier kanalına enjeksiyon yoluyla kan dolaşımına ileterek sistemik inflamatuar sinyal indükleme protokolünü tanımlıyoruz. Bu yaklaşım, erken gelişimde iltihap kaynaklı değişiklikleri incelemek için kontrollü ve tekrarlanabilir inflamatuar yanıtlar sağlar. Protokol, IL-6 preparatları, mikroenjeksiyon ve hastalık ve nöroinflamasyon modellerinde zebrafish deneysel uygulamaları için temel adımları detaylandırıyor; gen-ortam etkileşimlerini incelemek için tasarlanan çalışmalar da dahil. Sistemik inflamatuar sinyalin kontrollü indüksiyonunu mümkün kılarak, bu yaklaşım genetik duyarlılık ve inflamatuar maruziyetlerin gelişim sonuçlarını şekillendirmek için nasıl kesiştiğini incelemek için çok yönlü bir platform sunar.

Giriş

İltihabi sinyallerin erken nörogelişimi nasıl şekillendirdiğini anlamak, özellikle genetik olarak hassas bağlamlarda nörogelişimsel bozuklukların altında yatan mekanizmaları incelemek için gereklidir. Bu protokolün temel amacı, zebrafish larvalarında sistemik inflamatuar sinyalin indüksiyonu sağlamak için Cuvier kanalına (ortak kardinal damar) doğrudan interleukin-6 (IL-6) mikroenjeksiyonu yoluyla hassas ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlamaktır.

Tüberoz skleroz kompleksi (TSC), bu tür gen-ortam etkileşimlerini örnek teşkil eder. TSC, hamartin ve tuberin proteinlerini kodlayan TSC1 veya TSC2'deki mutasyonlar nedeniyle oluşan nadir genetik bir bozukluktur; bu proteinler, normalde mTORC1 sinyalini bastıran bir kompleks oluşturur. Bu inhibisyonun kaybı, mTORC1 yolunun hiperaktivasyonuna yol açar; bu da anormal hücre büyümesine ve otizm spektrum bozukluğu (ASD)1,2 dahil olmak üzere geniş bir klinik gösteri yelpazesine yol açar. ASD'nin gelişmiş ülkelerde ortalama tanı yaşı ~3 olan bireylerin ~%1,5'ini etkilediği tahminedilmektedir 3. ASD, tekrarlayan davranışlar, bozulmuş sosyal etkileşimler ve azalmış bilişsel esnekliklekarakterize edilir 4 ve hastalar genellikle anksiyete, depresyon veya zihinsel engel gibi ek nörodavranışsal zorluklarlakarşılaşırlar 3. Özellikle, TSC'li bireylerin %40-%60'ı ASD ile ilişkili özelliklergösterir 2, ancak semptom şiddeti – benzer mutasyonlara sahip hastalar arasında bile – büyük farklılıklar gösterir; bu da çevresel faktörlerin genetik olarak riskleri modüle ettiğini gösterir.

Bunlardan biri iltihaptır. ASD'nin etiyolojisi büyük ölçüde bilinmese de, beyin bölgesinde nöroinflamasyon uzun süredir suçlanmıştır5. Artan preklinik ve klinik kanıtlar, anne bağışıklık aktivasyonu (MIA) tarafından tetiklenen fetal nöroinflamasyonun ve bunun sonucunda sitokin sinyalinin yükselmesininASD 6'nın patogenezine önemli ölçüde katkıda bulunabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, TSC gibi genetik olarak hassas sistemlerde inflamatuar sitokin maruziyetini modellemek, bağışıklık sinyallerinin bozulmuş mTORC1 düzenlemesiyle nasıl kesiştiğini ve erken beyin gelişimini nasıl etkilediğini inceleyen güçlü bir çerçeve sunar.

Bu protokolün geliştirilmesinin gerekçesi, IL-6 sinyal bildirimi dahil olmak üzere sitokin aracılı iltihapların genetik açıklıklarla etkileşime girip nörogelişimsel yörüngeleri etkileyebildiğinin artan kabulünden kaynaklanmaktadır. Sitokinler, bağışıklık sistemi içindeki iletişimi koordine eden düşük moleküler ağırlıklı glikoproteinlerdir. ASD'de, birçok çalışma, periferik kanda IL-6 dahil olmak üzere pro-inflamatuar sitokinlerin yüksek seviyelerinitutarlı olarak bildirmiştir ve bu da düzensiz IL-6 sinyalinin bozukluğun nörogelişimsel ve davranışsal özelliklerine katkıda bulunabileceği hipotezini desteklemektedir. IL-6, enfeksiyon veya doku hasarına yanıt olarak çeşitli bağışıklık hücre tipleri tarafından üretilen bağışıklık aktivasyonunun önemli bir aracısıdır. IL-6 kan-beyin bariyerini aşabildiği ve nöronları, astrositleri ve mikrogliya üzerinde doğrudan etkili olabileceği için, bu sitokinin sürekli yükselmesinin nörogelişimsel yolların, sinaptik plastikliğin ve nöroimmün homeostazın değişmesinde rol oynadığı düşünülmektedir – bu mekanizmalar ASD patofizyolojisinde giderek daha fazlaaraştırılır 11,12. Bu bağlantılar, hamilelik sırasında yüksek anne IL-6'nın fetal beyin gelişimini bozduğu ve ASD ile ilgili riski artırdığı MIA çalışmalarıyla daha dagüçlendirilmektedir. Ancak mevcut omurgalı modelleri genellikle patojenle ilişkili moleküller veya anne maruziyeti paradigmaları aracılığıyla sistemik bağışıklık uyarısına dayanır; bu da değişkenlik getirebilir, birden fazla bağışıklık yolunu aynı anda aktive edebilir ve IL-6'nın spesifik katkısını izole etme yeteneğini sınırlayabilir. Zebrabalıklarda doğrudan IL-6 mikroenjeksiyonu, şeffaf ve genetik olarak yönetilebilir bir organizmada tek bir sitokinin hedefli manipülasyonunu mümkün kılarak bu sınırlamaları aşmaktadır.

Zebra balıkları, sitokin kaynaklı gelişim etkilerini incelemek için çeşitli avantajlar sunar. Optik şeffaflıkları, bağışıklık ve sinirsel yanıtların gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlar; hızlı gelişimleri yüksek verimli deneyleri mümkün kılar; ve korunan sitokin sinyal yolları, onları inflamatuar mekanizmaları disseksiya için güçlü bir omurgalımodeli yapar 14,15,16,17,18. Deneysel çalışmalarda, zebrafish larvalarına dışsal maddelerin (bakteriler, kanser hücreleri, DNA, nanopartiküller vb.) taşınması gereklidir. Bir yaklaşım, larvaların ilgilenilen maddeyi içeren bir çözeltiye maruz bırakılması, böylece deri, solungaçlar veya gastrointestinal sistem yoluyla pasif alım sağlanmasını içerir. İkinci ve daha doğrudan yöntem ise mikroenjeksiyondur; burada dış malzemeler ince cam iğnelerle belirli embriyonik veya larva bölmelerine gönderilir 19,20,21. Önemli olarak, Cuvier kanalına mikroenjeksiyon, sistemik ulaşım için güvenilir bir yol sağlar ve IL-6'nın dolaşımda hızlı yayılmasını sağlar, ancak tüm organizma bağışıklık uyarısının karıştırıcı etkileri olmadan.

Bu protokolde, enjeksiyon şırıngalarının hazırlanmasından, döllenmeden 2 ve 3 gün sonra (dpf) zebrafish larvalarının Cuvier kanalı aracılığıyla kan dolaşımına IL-6 enjeksiyonlarına kadar adım adım bir prosedür sunuyoruz. Bu yöntem, spesifik inflamatuar ipuçlarının erken gelişim süreçlerini, nörogelişimsel veya bağışıklık kaynaklı bozuklukların modellerinde gen-ortam etkileşimlerini, sitokin maruziyetinin in vivo olarak hücresel ve moleküler sonuçlarını veya genetik mutasyonlar ile inflamatuar sinyal yolları arasındaki etkileşimi araştıran araştırmacılar için özellikle faydalıdır. Kontrollü, sitokin spesifik ve gelişimsel hassasiyet yaklaşımı sunarak, bu protokol IL-6 ve ilgili bağışıklık sinyallerinin erken bağışıklık, sinir ve davranışsal sonuçları şekillendirme mekanizmalarını incelemek için çok yönlü bir platform sunar.

Protokol

Burada tarif edilen prosedür için tsc2vu242/+ zebrafish hattı22,23 kullanıldı. Yapılan tüm deneyler ilgili tüm mevzuatlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir ve özellikle kullanılan gelişim aşaması (<5 dpf) zorunlu etik inceleme kapsamının dışında olduğu için ek etik komite onayı gerekmemektedir. Şekil 1, protokolün bir şemasını sunmaktadır.

1. Mikropipetlerin çekilmesi

  1. Borosilikat cam kapillyarlardan mikroenjeksiyon iğnelerini, mikropipet çekici kullanarak hazırlanır ve yerleşik prosedürlereuygun şekilde hazırlanır 24.
  2. 10 cm uzunluğunda borosilikat cam kapillyarlar (dış çapı 1,0 mm, ince duvarlı) kullanın ve bunları mikropipet çekiciye yükleyin.
  3. Kapilleri çekici taşıyıcının içine dikkatlice yerleştirin, belirlenen oluk içinde hassas hizalanmasını sağlayın ve çekme sırasında hareketi önlemek için alet kelepçeleriyle sıkıca sabitleyin.
  4. Kapilleri ısıtma filamentinin ortasında olacak şekilde ayarlayın; böylece iğnenin düzenli oluşumu için çekilecek bölge boyunca eşit bir ısınma sağlansın.
  5. Çekme programını, optimize edilmiş parametrelerle başlatın (örneğin, Sutter cihazında ısı: 533, çekme: 50, hız: 60, gecikme: 90 ve basınç: 200) kullanarak ince uçlu mikroenjeksiyon iğneleri üretin.
    DIKKAT: Cam kapillyarlardan çekilen mikro iğneler kırılgandır ve kolayca çatlayabilir, tıkanabilir veya enjeksiyon hacmini değiştiren düzensiz uç şekilleri geliştirebilir. Kullanmadan önce her iğneyi stereomikroskop altında inceleyin, ucunu sert yüzeylere değdirmekten kaçının ve direnç, sızıntı veya tutarsız damla boyutu tespit edilirse iğneleri hemen değiştirin.
    NOT: Çekme işleminin ardından, kapiler her iki ucunda da konik iğne uçları oluşur. Kullanımdan önce, uç dikkatlice açılarak ince forsepsle stereomikroskop altında nazikçe kırılmalıdır ve mikroenjeksiyon için istenen diyafram boyutuna ulaşılmalıdır.

2. Tamponların ve stok çözeltinin hazırlanması

  1. E3 embriyo ortamından oluşan 60× stok çözeltisi hazırlayın (bkz. Tablo 1). Çözeltiyi otoklavlayarak sterilize edin ve 4 °C'de saklayın. Kullanım için, stok çözeltiyi ultra saf suda seyreltirerek 1× E3 çalışma çözeltisi elde edilir.
    NOT: E3 embriyo ortamının 60× stok çözeltisi uzun süreli depolama için 4 °C'de saklanabilir.
  2. Tablo 1'de açıklandığı gibi 20x stok trikain (MS-222) bir parça çözeltisi hazırlayın. Bozulmayı önlemek için çözeltiyi karanlıkta 4 °C sıcaklıkta sakla. Kullanımdan önce, E3 ortamında 1× çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin.
    NOT: Trikain stok çözeltisinin pH'ını 1 M Tris pH 9.0 kullanarak 7.5'e ayarlayın. Bu çözelti aliquote ile -20 °C (donmuş) sıcaklıkta uzun süreli depolama için veya 4 °C'de saklanabilir. Trikain, RT ve ışıkta zehirli bir bileşiğe dönüşür.
    DIKKAT: Anestezi için trikain (MS-222) kullanılırken özel dikkat edilmelidir; çünkü hem az hem de aşırı maruz kalma larva fizyolojisini ve davranışını olumsuz etkileyebilir. Aşırı maruziyet, kalp fonksiyonunu olumsuz etkileyebilir ve sonraki davranışları değiştirebilirken, yetersiz anestezi montaj sırasında yaralanma riskini artırır. Sadece minimum etkili konsantrasyon ve süreyi kullanın ve davranışsal testlerden önce taze embriyo ortamında tam iyileşmeye izin verin.
  3. E3 ortamında %1 (w/v) agaroz çözeltisi hazırlayın, tamamen çözünene kadar ısıtın.
    NOT: Önceden hazırlanmışsa, çözelti 4 °C'de saklanabilir ve kullanımdan önce tekrar ısıtılabilir. Deney gününde, agarozu sıvı halde 55–60 °C sıcaklıkta tutarak erken katılaşmayı önleyin.
  4. %0,9 (w/v) NaCl çözeltisi hazırlayın ve oda sıcaklığında 1 haftaya kadar veya uzun süre saklamak için 4 °C'de saklayın. Kullanımdan önce, çözeltiyi oda sıcaklığında dengelendirin veya embriyoların fizyolojik koşullarına uygun olarak 28,5 °C'de kuluçka yapın.
  5. %0,9 NaCl içinde 2 pg/nL IL-6 çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi tekrar tekrar eden donma-erime döngülerini önlemek için Aliquot yapın ve -20 °C'de saklayın. Kullanmadan önce eritin ve alikotu oda sıcaklığına getirin.
  6. Ultrasaf suda hazırlanmış 20 mg/mL stok çözeltisinden E3 ortamında 0,5 mg/mL pronaza çalışma çözeltisi hazırlayın.

3. 2 dpf'ye kadar embriyo edinmek ve yetiştirmek

  1. Bir yumurtlama tankına birden fazla tsc2vu242/vu242 yetişkin zebra balığını yerleştirerek grup yumurtlamayı ayarlayın.
    NOT: Erkekler ve dişiler, erken yumurtlamayı önlemek için bir bölücü kullanılarak gece boyunca ayrılabilir; ayırıcı ertesi sabah çıkarılarak senkronize çiftleşmeyi teşvik edebilir. Alternatif olarak, balıklar ışık kontrollü bir ortamda ayırıcı olmadan tutulabilir; burada karanlıktan (gece) aydınlığa (sabah) geçiş yumurtlama işareti olarak işlev görür.
  2. Ertesi gün, bölücüyü (kullanılıyorsa) çıkarın ve yumurtlama yaklaşık 1 saat devam etsin.
  3. Döllenmiş embriyoları derhal toplayın ve onları 40 mL E3 embriyo ortamı içeren 100 mm Petri kablarına aktarın; böylece optimal gelişim sağlanır.
  4. Embriyoları 28,5 °C'de 14 saat ışık ve 10 saat karanlık kontrollü bir günlük döngü altında kuluçka altına alın.
  5. 1 dpf ve 2 dpf seviyelerinde, embriyoları stereomikroskop altında inceleyin ve kültür kalitesini korumak için ölü embriyoları, döllenmemiş yumurtaları ve kalıntıları çıkarın.
  6. Atık birikimini en aza indirmek ve normal embriyonik gelişimi desteklemek için E3 ortamını taze çözeltiyle değiştirin.

4. Mikroenjeksiyon ve dekoryonasyon için agaroz plakalarının hazırlanması

  1. E3 ortamında %1 (w/v) agaroz çözeltisi hazırlayın ve agaroz tamamen çözünene kadar ısıtın.
  2. Çözeltinin kısa bir süre soğumasına izin verin, ardından yaklaşık 30 mL sıvıyı 100 mm Petri kabına dökerek yüzeyde eşit bir tabaka oluşmasını sağlayın.
  3. Agaroz hâlâ sıvı ama katılaşmaya başlarken, yüzeye nazikçe silikon bir kalıp yerleştirerek düz oluklar oluşturun.
    NOT: Burada, piramidal şekilli desenlere sahip silikon kalıplar (Şekil 2), mikroenjeksiyon sırasında fazla E3'ü tutabilen kuyular oluşturmak için kullanılır. Bu kuyular, standart kuluçka koşulları dışında birkaç dakika boyunca embrionun yaşamını sağlamak için yeterli nem koruyarak işlem ve enjeksiyon sırasında geçici olarak stabilite sağlamak üzere tasarlanmıştır.
  4. Enzimatik dekoryonasyon için (50 mm çapında) agaroz kapları hazırlamak için yaklaşık 5 mL erimiş %1 (w/v) agaroz çözeltisi dökülür ve tabağı yüzeyi eşit şekilde kaplamak için nazikçe döndürür.
  5. Fazla agarozu çıkarın.
  6. Agarozun oda sıcaklığında 10–15 dakika katılaşmasına izin verin. Pişirildikten sonra, yemekler embriyoların enzimatik dekoryonasyonunda kullanıma hazır hale gelir.

5. 2 dpf balıkların enzimatik dekoryonasyonu

  1. Yaklaşık 100 embriyoyu 2 dpf hızında koryonlarda küçük (50 mm) agaroz kaplı Petri kabına transfer edin.
  2. Enzimatik çözeltinin seyrelmesini en aza indirmek ve verimli dekoryonasyonu sağlamak için mümkün olduğunca çok E3 ortamı alın.
  3. Tabakta 4 mL taze hazırlanmış pronaz çözeltisi (stok konsantrasyonu: 20 mg/mL [ultrasaf suda hazırlanmış], çalışma konsantrasyonu: 0,5 mg/mL [E3 ile seyreltilmiş şekilde]) ekleyerek embriyoların tamamen suya batmasını sağlar.
    DIKKAT: Pronaz tedavisi dikkatlice kontrol edilmelidir; aşırı sindirim larva dokularına zarar verebilir, bu da ele alma sırasında kırılganlığın artmasına ve hayatta kalma veya davranışı etkileyebilir. Sadece minimum etkili maruz kalma süresini kullanın ve embriyoları sonrasında iyice durulayarak enzimatik aktivitenin devam etmesini önleyin.
  4. Oda sıcaklığında 3–5 dakika kuluçka, koryonların salınımını stereomikroskop altında izleyin.
  5. Koryonların enzimatik olarak çıkarılmasını kolaylaştırmak için çafı aralıklı olarak nazikçe döndürün veya döndürün. Embriyoların çoğunluğu koryonlarından ayrılana kadar devam edin.
    NOT: Çıplak embriyoların her zaman çözeltinin içinde olduğundan emin olun; aksi takdirde, sarı kesesi yırtılabilir ve embriyolar ölebilir.
  6. Dekoryonasyon sağlandıktan sonra, embriyoları 5–6 kez taze E3 ortamından geçirerek iyice yıkayın.
    NOT: Çıplak embriyoların her zaman çözeltinin içinde olduğundan emin olun; aksi takdirde, sarı kesesi yırtılabilir ve embriyolar ölebilir.
  7. Tüm koryonlar ve pronaz kalıntılarının çıkarıldığından emin olun; böylece larvalara zarar verilmesini önlemek ve optimal kültür koşullarını korumak sağlanır.
  8. ~50 dekoryonlu larvayı, cam bir Pasteur pipeti ile 40 mL E3 ortamı içeren 100 mm Petri kabına aktarın.
  9. Larvaları mikroenjeksiyon yapılana kadar bu koşullarda tutun.

6. Zebrafish embriyolarına enjekte etmek

  1. Stereomikroskop altında (≥150× büyütme), ince forseps kullanılarak çekilen cam kapillerin ucunu dikkatlice kırın (bölüm 1), yaklaşık 3 μm çapında bir açıklığa sahip bir mikropipet oluşturulur.
    NOT: Uygun bir mikropipet, ucu ince açıldığından, görünür düzleşme veya ucunda büyük açık bir yüzey olmadan tanınabilir. Ucu çok geniş kırılırsa, balık derisine etkili şekilde nüfuz etmez ve kötü veya tutarsız enjeksiyonlara yol açabilir. Bu nedenle, uç açılışı yüksek büyütmede stereomikroskop altında dikkatlice yapılmalı, böylece kapillerin en ucunda minimal ve kontrollü bir kırılma sağlanmalıdır.
  2. %0,9 NaCl içinde %0,9 (w/v) NaCl veya IL-6 (2 pg/nL) enjeksiyon çözeltileri hazırlayın ve enjeksiyon sırasında görselleştirmeyi kolaylaştırmak için her 10 μL çözeltiye %0,1 tripan mavisi ekleyin.
  3. Hazırlanan mikropipet, mikroloader ucu kullanarak ~3 μL enjeksiyon çözeltisi ile doldurun, böylece hava kabarcıkları oluşmadığından emin olun.
  4. Yüklü mikropipeti mikroenjeksiyon sistemine bağlı kapiler tutucuya (Şekil 2) sabitleyin.
  5. Kalibrasyon slaytına küçük bir mineral yağ damlası koyun.
  6. Enjeksiyon hacmini, mineral yağa damlacıklar atarak ve 0,01 mm ölçekli kalibrasyon slaytı (Şekil 2) kullanılarak çaplarını ölçerek kalibre edin. Enjeksiyon basıncını (300–500 hPa arasında) ayarlayarak ~1 nL damla hacmi elde edin.
  7. Anestezi için anestezi için larvaları içeren E3 ortamına 1× konsantrasyona trikain (MS-222) ekleyin. Stresi en aza indirmek ve tutarlı sedasyonu sağlamak için larvaları küçük partiler halinde kullanın.
  8. Bireysel 2 dpf larvaları katılaşmış agaroz enjeksiyon plakasına aktarın. Her kaba için birden fazla larva (örneğin 10'a kadar) işlem kapasitesine bağlı olarak konumlandırılabilir.
  9. Kabı stereomikroskopun altına yerleştirin. Cam pipet kullanarak, her larvanı Cuvier kanalının net şekilde görünecek ve erişilebilir olacak şekilde nazikçe yönlendirin.
    NOT: Birden fazla larva ile çalışırken, kurumayı önlemek için trikain (1×) içeren E3 ortamı damlaları ekleyerek agaroz yüzeyinin nemlendirilmiş kalmasını sağlayın.
  10. Mikropipet ucu, Cuvier kanalının giriş noktasına ( Şekil 3'te gösterildiği gibi) konumlandırın; bu nokta, kan hücrelerinin kalbe doğru hareket etmesini stereomikroskop altında takip ederek tanımlanabilir.
  11. Hazırlanan çözeltinin ardışık iki damlasını (~1 nL) Cuvier kanalına enjekte edin; enjeksiyonlar arasında yaklaşık 20 saniye aralık bırakarak doğru dağılım sağlanır.
  12. Enjeksiyondan sonra, larvaları agarose plakasından nazikçe 40 mL E3 ortamı içeren taze 100 mm Petri kabına aktarın. Transfer sırasında mekanik stresi en aza indirin.
  13. Larvaları 28,5 °C'de inkubatöre geri getirin ve iyileşme sağlanır.
  14. Ertesi gün (3 dpf), 6.8–6.13 adımlarında tanımlanan mikroenjeksiyon prosedürü tekrarlanmaktadır.
    NOT: Tek enjeksiyon sadece kısa süreli sinyal gönderir ve tutarlı davranışsal yanıt vermezken, ikinci enjeksiyon erken larva gelişim penceresi boyunca inflamatuar yolların sürekli aktivasyonunu sağlar ve Temsilci sonuçlar bölümünde tanımlandığı gibi davranış değişiklikleri üretir.
  15. 5 dpf ile larvaları davranışsal testler, beyin görüntüleme veya immünoflüoresans analizi gibi sonraki uygulamalar için kullanın.

Sonuçlar

IL-6 mikroenjeksiyonunun larva fizyolojisi ve davranışları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, IL-6 enjekte edilen larvaları hayatta kalma ve zebrabalıklarda kaygı benzeri ve tekrarlayan davranışları değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan iki davranışsal okuma ile NaCl enjekte edilen kontrollerle karşılaştırdık. IL-6 mikroenjeksiyonu, NaCl enjeksiyonlarına kıyasla larva canlılığını etkilemedi (Şekil 4A). 5 dpf'deki sağ kalma oranları, IL-6 enjekte edilen ve NaCl enjekte edilen gruplar arasında ayırt edilemezdi; bu da dozlama rejiminin iyi tolere edildiğini ve spesifik olmayan toksisite getirmediğini gösterir. Mikroenjeksiyonlar, enjekte edilmemiş kardeşlere kıyasla canlılığı biraz azalttı; bu da IL-6 maruziyetinden bağımsız olarak ılımsız bir tutum etkisini gösteriyordu. Bu, protokolün aşağı yönlü davranış analizleri için uygun olduğunu doğrular.

IL-6 mikroenjeksiyon paradigmasının 5 dpf'de ölçülebilir bir inflamatuar yanıt tetiklediğini doğrulamak için, sitokin kaynaklı inflamatuar sinyal25'in aşağı akım aracı olan prostaglandin E2'yi (PGE2) nicelikle ölçüldük. tsc2-/- homozigot mutantlar, IL-6 enjeksiyonu olmadan bile temel PGE2 seviyelerinin yükseldiğini gösterdiler; bu, vahşi tip (WT) tsc2+/+ kardeşlerinden önemli ölçüde daha yüksek (Şekil 4B). Heterozigot tsc2+/- mutantlar, WT larvalarına kıyasla başlangıç PGE2'de mütevazı ve anlamlı olmayan bir artış gösterdi, ancak önemli olarak, IL-6 mikroenjeksiyonu sonrası PGE2 seviyeleri keskin bir şekilde arttı. Bu desen, gen × ortam etkileşimlerini modelleme hedefimizle uyumludur: WT larvaları hafif, geçici IL-6 maruziyetinden büyük ölçüde etkilenmezken, genetik olarak hassas tsc2+/- mutantları belirgin bir inflamatuar yanıt gösterir.

Bu genotipe bağlı inflamatuar tondaki farklılıklarla uyumlu olarak, IL-6 kaynaklı sinyalin açık alan testinde ölçülebilir davranışsal değişikliklere dönüşüp dönüşmediğini inceledik. 5 dpf'de yapılan açık alan testi (daha önceaçıklandığı gibi 22), tsc2 mutant larvalarının WT kardeşlere kıyasla artan kaygı benzeri davranışlar sergilediğini ortaya koydu (Şekil 4C); ancak IL6'nın mikroenjeksiyonları bu davranışı etkilemedi. Özellikle, tsc2+/- ve tsc2-/- larvaları, arenanın dış bölgesinde anlamlı şekilde daha fazla zaman geçirdi ve tsc2+/+'ya kıyasla merkez keşfi azaldı; bu, zebrafish larvalarında yerleşik anksiyete kaynaklı fenotiplerle uyumludur.

IL-6 enjeksiyonları, özellikle tsc2+/- mutant larvalarda tekrarlayan ve stereotipik yüzme kalıplarını artırdı (Şekil 4D–E), zebrafish modellerinde ASD ile ilgili bir okuma olarak yaygın kullanılan bir davranışsal özellik26. Üç veya daha fazla ardışık dairesel yüzme olarak tanımlanan tekrarlayan döngünün ayrıntılı nicelenmesi, IL-6 enjekte edilen tsc2+/- mutantlarının bu davranışı NaCl enjekte edilen kontrollere kıyasla oranında önemli bir artış gösterdi. Genetik olarak hassas larvalarda tekrarlayan yüzmenin bu seçici artması, hafif inflamatuar uyarımların özellikle tsc2+/- mutant arka planında ASD benzeri davranış eğilimlerini ortaya çıkardığı veya güçlendirdiği gen × ortam etkileşimini daha da destekler.

figure-results-1
Şekil 1: Protokolün şeması. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Mikroenjeksiyon iş istasyonu kurulumu. Larva zebrafish enjeksiyonları için kullanılan mikroenjeksiyon iş istasyonunun şeması. (1) Enjektör tutucuya monte edilmiş cam mikropipet; (2) larva konumlandırması için kalıplanmış kuyulara sahip agaroz kaplı Petri kabı; (3) kalibrasyon için mineral yağ; (4) tripan mavi çözeltisi; (5) çekilen cam iğneler; (6) kalibrasyon slaytı; (7) genişletilmiş pipet uçları; (8) Pasteur pipeti; (9) Silikon küf. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Cuvier kanalına enjeksiyon . (A) Larva zebrafishlerde Cuvier (ortak kardinal damar) enjeksiyon bölgesinin şematik temsili ve temsil açık alan lokomotor izleri 5 dpf. (B) Kontrol (enjeksiyonsuz) ve NaCl ile IL-6 enjeksiyonlarının temsil eden görüntüleri. Ölçek çubuğu: 250 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Tsc2 mutant hattı kullanılarak gen x ortam etkileşiminin temsil eden sonuçları. (A) Kontrol (enjekte edilmemiş), NaCl enjekte edilen ve IL-6 enjekte edilen gruplar arasında deney boyunca tsc2vu242 larvalarının sağkalım oranları (%). Veriler, ortalama SEM ± 5 dpf olarak sunulur (n = 4 bağımsız deneysel replikasyon, her genotip × tedavi kombinasyonu 60–70 balık içerir). İstatistiksel analiz, ANOVA kullanılarak yapıldı ve ardından çiftli karşılaştırma için Tukey post hoc testi yapıldı. Kontrol ve IL-6 enjekte edilen gruplar arasında (p = 0.00150) ve kontrol ile NaCl enjekte edilen gruplar arasında (p = 0.00243) anlamlı farklılıklar gözlemlendi. (B) Üretici protokolüne göre (genotip için 2-yönlü ANOVA: F = 7.4503; P = 0.01234). Her örnekte 20 yazı bulunur (genotipleme için kuyruk kullanılmıştır). Kutu grafiklerindeki noktalar biyolojik kopyaları temsil eder. (C) NaCl ve IL-6 enjeksiyonlarından sonra her genotipin duvarların yanında geçtiği göreli zamanı gösteren tsc2 mutant balıkları için açık alan testinin sonuçlarının kutu grafikleri (genotip için 2 yollu ANOVA: F = 7.021; P = 0.00106). Açık alan testi, daha önce bildirilen protokole göre otomatik analiz odası (Materyal Tablosu) kullanılarakgerçekleştirildi. 22. (D) NaCl enjeksiyonu sonrası rastgele keşif davranışını ve IL-6 enjeksiyonlarından sonra tekrarlayan döngüleri gösteren örnek bir figür. (E) NaCl veya IL-6 enjeksiyonundan sonra her tsc2 genotipi için normal ve tekrarlayan döngü davranışları gösteren hayvan sayısını temsil eden kutu grafikleri ve enjekte edilmemiş kontrol balıkları için (genotip için 2 yollu ANOVA: F = 5.7615; P = 0.005849). Bunun için her genotip × tedavi kombinasyonu 60–70 balık içeren üç bağımsız deneysel replikasyon kullanıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

60 x E3 stok çözümü
ReaktifSon yoğunlaşmaMiktar
NaCl297 mM17,4 g
KCl10.7 mM0.8 g
CaCl219,6 mM2.18 g
MgCl2·6H2O24 mM4.89 g
Ultrasaf H2OYok1 L'ye kadar doldur
ToplamYok1 L
Trikain stok çözeltisi
ReaktifSon yoğunlaşmaMiktar
Trikain15,3 mM1 g
1 M Tris-HCl pH 921 mM5.25 mL
Ultrasaf H2OYok244.75 mL
ToplamYok250 mL

Tablo 1: E3 ve Trikaine çözeltilerinin bileşimi.

Tartışma

Beklendiği gibi, tsc2 homozigot mutantları daha önce bildirilenfenotipler 22,27 ile uyumlu yüksek başlangıç kaygı seviyeleri gösterdi. Bu larvalar zaten ciddi davranışsal anormallikler gösterdiği için, IL-6 enjeksiyonu fenotiplerini daha da kötüleştirmedi. Buna karşılık, tsc2 heterozigotlarında IL-6 kaynaklı net değişiklikler görüldü. Bu seçici hassasiyet, hafif ama uzun süreli inflamatuar sinyallerin alt genetik açıklıkla etkileşimde nörodavranışsal sonuçları şekillendirmek için gen × ortam etkileşimlerini incelemesi için bu protokolün faydasını vurgular.

LPS maruziyeti, zebrabalıklarda en yaygın kullanılan iltihap indükleyici paradigma olmaya devam eder ve güçlü pro-inflamatuar sitokinlerin indüksiyonu, doğuştan bağışıklık hücrelerinin katılımı ve doza bağlı ölüm ile tanımlanan geniş ve sağlam bir bağışıklık yanıtıüretir 28. Güçlü olmasına rağmen, LPS aynı anda birden fazla Toll benzeri reseptör yolunuaktive eder (28,29,30), bu da bireysel sitokinlerin nörogelişimsel etkilere katkısını izole etmeyi zorlaştırır. Buna karşılık, burada tanımlanan IL-6 mikroenjeksiyon protokolü, anne bağışıklık aktivasyonunda merkezi olduğu bilinen tek bir sitokini yükselterek hedefli ve kontrollü bir yaklaşım sunar. Önemli olarak, IL-6 enjeksiyonları NaCl enjekte edilen kontrollere göre ölüm oranını artırmaz; bu da toksisiteyi karıştırmadan davranışsal ve moleküler fenotiplerin incelenmesini sağlar. Ayrıca, IL-6 mikroenjeksiyonu, yüksek PGE2 seviyeleriyle gösterildiği gibi spesifik aşağı akış inflamatuar sinyal üretir ve ölçülebilir davranış değişiklikleri - özellikle tsc2 heterozigot larvalarda artan tekrarlayan yüzme - tetikler; burada genetik duyarlılık sitokin maruziyetiyle etkileşime girer. Bu ayrımlar birlikte, LPS'nin küresel bağışıklık aktivasyonunu modellediğini, IL-6 mikroenjeksiyonunun ise nörogelişimsel riskle ilgili sitokin spesifik mekanizmaların hassas şekilde incelenmesini sağladığını vurgular.

Burada sunulan temsilci sonuçlar, tsc2-mutant arka planda IL-6 etkilerini gösterir, ancak protokolün kendisi geniş çapta uygulanabilir. Bu yöntem, erken nörogelişim sırasında tanımlanmış inflamatuar ipuçlarının çeşitli genetik bağlamlarla nasıl kesiştiğini incelemek için vahşi tip larvalarda veya diğer genetik modellerde kolayca uygulanabilir. TSC2 modelinin ötesindeki uygulamalar için, sitokin hassasiyeti ve inflamatuar eşikler genotipler ve deneysel hedefler arasında değişebileceği için optimal IL-6 dozunun ampirik olarak belirlenmesini öneriyoruz.

Bu protokolde önemli bir teknik husus, enjeksiyon hacminin tutarlılığıdır; çünkü IL-6'nın biyolojik etkileri, enjeksiyon başına yaklaşık 1 nL doğru teslimata bağlıdır. Damla boyutundaki değişkenlik genellikle iğne açıklığı veya enjeksiyon basıncındaki farklılıklardan kaynaklanır. Damlacıklar çok küçükse, yüksek büyütme altında basıncı kademeli olarak artırmak veya iğne ucunu hafifçe genişletmek genellikle doğru akışı geri kazandırır. Buna karşılık, hedeflenen hacmi aşan damlalar genellikle iğne açıklığının çok geniş olduğunu gösterir; bu durumda basıncı azaltmak veya daha dar uçlu yeni bir iğne hazırlamak gerekir. Hassas enjeksiyon hacimlerini korumak önemlidir, çünkü sapmalar inflamatuar yükü değiştirebilir ve tekrarlanabilirliği zayıflatabilir. Bazen kullanıcılar, iğneden hiçbir çözüm atılmadığı durumlarla karşılaşabilir. Bu genellikle iğne ucundaki hava kabarcıkları, kalıntılar veya tıkanıklıklardan kaynaklanır. İğneyi stereomikroskop altında incelemek ve enjektör sisteminde sızıntı veya gevşek bağlantılar için kontrol etmek genellikle sorunu çözer. Temiz ve engelsiz bir iğne ucu sağlamak, düzenli teslimat ve larvalara zarar verebilecek basınç birikmesini önlemek için gereklidir.

Bir diğer önemli faktör ise enjekte edilen hacmin fizyolojik toleransıdır. Larvalar genellikle ~1 nL iyi tolere eder, ancak daha büyük hacimler, özellikle ardışık günler boyunca birden fazla enjeksiyon yapıldığında ölüm riskini artırabilir. Tekrar doz gerektiren deneyler için mekanik stresi en az azaltmak, enjeksiyonlar arasında yeterli iyileşme süresi tanımak ve istenen doza ulaşmak için hacim yerine IL-6 konsantrasyonunu ayarlamak çok önemlidir. Bu hususlar, gözlemlenen fenotiplerin enjeksiyonla ilgili yaralanma yerine sitokin maruziyetini yansıtmasını sağlar.

Son olarak, enjeksiyonla ilişkili ölüm oranı kullanıcı deneyimine bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. Yetenekli kullanıcılar genellikle ölüm oranı yaklaşık %5'e ulaşırken, deneyimsiz kullanıcılar oranların %50'ye kadar çıktığını görebilir. Çoğu kayıp, montaj sırasında mekanik hasardan, iğnelerin yanlış yerleştirilmesinden veya sarı kesesinin veya çevresindeki dokuların kazara delinmesinden kaynaklanır. Deneysel enjeksiyonlara başlamadan önce bu prosedürü vahşi tip larvalarda uygulamak, tutarlılığı büyük ölçüde artırır ve ölüm riskini azaltır. Larvaların Cuvier kanalını net görselleştirecek şekilde doğru konumlandırılması ve montaj ve iyileşme sırasında nazik müdahale ile birlikte, prosedürel zararı daha da en aza indirir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Kevin Ess ve Vanderbilt Üniversitesi'nden Lilianna Solnica-Krezel'e tsc2vu242/+ balıkları için ve IIMCB ZCF'ye yetişkin balıklara yardım eden teşekkürlerimiz. Bu çalışma, Polonya'daki Ulusal Bilim Merkezi'nden JZ'ye verilen 2023/50/E/NZ3/00252 numaralı SONATA BIS hibe ile desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Borosilikat Cam kılcal damarlar (Dış çap 1.0 mm/ iç çap 0.75 mm)Sutter InstrumentBF150-75-10
CaCl2 (kalsiyum klorür)Chempur118748703
Eğimli Slayt (1/100 mm)Bresser5916710
Kılcal tutucu (Grip başlık seti 4 boyut 0)Fertilart Sp. z o.o5196082001
Alev/Brown mikropipet çekiciSutter InstrumentP-1000
HClChempur115752837
İnsan IL6Thermo Fischer Scientific200-06-20UGStok konsantrasyon: 10 µg/mL, Çalışma konsantrasyonu: 2 pg/nL (0.9% NaCl içinde seyreltilmiş)
Enjektör pompası FemtoJet 4iEppendorfE5252000021
KCl (potasyum klorür)Chempur117397402
MgCl2·6H2O (magnezyum klorür hekzahidrat)Chempur116120500
Femtotips Mikroyükleyici Uçlar Femtojet Mikroenjektör içinEppendorfEPE 5242956003
Mikroskop Leica M165 FC 1983 büyütmeLeica Microsysytemshttps://www.leica-microsystems.com/products/
ışık-mikroskopları/stereo-mikroskoplar/p/leica-m165-fc/
Mineral yağSigma-AldrichM5904
NaCl (sodyum klorür)Chempur117941206
PronaseSigma-AldrichP5147-1GStok konsantrasyon: 20 mg/mL (ultra saf suda hazırlanmış), Çalışma konsantrasyonu: 0.5 mg/mL (E3 içinde seyreltilmiş)
TricaineSigma-Aldrich/MerckA-5040
Tris bazCarl Roth4855.3
Trypan MavisiThermo Fischer Scientific15250061
UltraPure Düşük Erime Noktasılı AgaroseThermo Fischer Scientific16520050
ZebraBox eklentisi - Foto Motor Yanıtı EZBPMRAnimalabhttps://animalab.eu/zebrabox-high-throughput-monitoring-system
ZebraboxViewPointhttps://www.viewpoint.fr/product/zebrafish/fish-behavior-monitoring/zebraboxOtomatik analiz odası

Kaynaklar

  1. Winden, K., et al. Tuberous sclerosis complex. Nat Rev Dis Primers. 12, 11(2026).
  2. Ramani, R., et al. The clinical interface of tuberous sclerosis complex and autism spectrum disorder: insights and future directions. Neurol Sci. 46 (6), 2571-2580 (2025).
  3. Lyall, K., et al. The changing epidemiology of autism spectrum disorders. Annu Rev Public Health. 38, 81-102 (2017).
  4. Nazeer, A., Ghaziuddin, M. Autism spectrum disorders: clinical features and diagnosis. Pediatr Clin North Am. 59, 19-25 (2012).
  5. Kern, J. K., Geier, D. A., Sykes, L. K., Geier, M. R. Relevance of neuroinflammation and encephalitis in autism. Front Cell Neurosci. 9, 519(2016).
  6. Careaga, M., Murai, T., Bauman, M. D. Maternal immune activation and autism spectrum disorder: from rodents to nonhuman and human primates. Biol Psychiatry. 81 (5), 391-401 (2017).
  7. Croonenberghs, J., Bosmans, E., Deboutte, D., Kenis, G., Maes, M. Activation of the inflammatory response system in autism. Neuropsychobiology. 45, 1-6 (2002).
  8. Girgis, R. R., Kumar, S. S., Brown, A. S. The cytokine model of schizophrenia: emerging therapeutic strategies. Biol Psychiatry. 75 (4), 292-299 (2014).
  9. Heuer, L. S., et al. An exploratory examination of neonatal cytokines and chemokines as predictors of autism risk: the early markers for autism study. Biol Psychiatry. 86 (4), 255-264 (2019).
  10. Sasayama, D., et al. Negative correlation between serum cytokine levels and cognitive abilities in children with autism spectrum disorder. J Intell. 5 (2), 19(2017).
  11. Banks, W. A., Kastin, A. J., Gutierrez, E. G. Penetration of interleukin-6 across the murine blood-brain barrier. Neurosci Lett. 179 (1-2), 53-56 (1994).
  12. Otkıran, G., Erdoğan, M. A., Uyanıkgil, Y., Erbaş, O. Prenatal interferon-alpha exposure induces autism-like neurobehavioral and neurochemical alterations in male offspring. J Neuroimmune Pharmacol. 21, 4(2026).
  13. Smith, S. E. P., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  14. Bedell, V. M., Meng, Q. C., Pack, M. A., Eckenhoff, R. G. A vertebrate model to reveal neural substrates underlying the transitions between conscious and unconscious states. Sci Rep. 10, 15789(2020).
  15. Belo, M. A. A., et al. Zebrafish as a model to study inflammation: a tool for drug discovery. Biomed Pharmacother. 144, 112310(2021).
  16. Ka, J., Pak, B., Han, O., Lee, S., Jin, S. -W. Comparison of transcriptomic changes between zebrafish and mice upon high fat diet reveals evolutionary convergence in lipid metabolism. Biochem Biophys Res Commun. 530 (4), 638-643 (2020).
  17. Li, Y., Hu, B. Establishment of multi-site infection model in zebrafish larvae for studying Staphylococcus aureus infectious disease. J Genet Genomics. 39 (9), 521-534 (2012).
  18. Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Res. 67 (7), 2927-2931 (2007).
  19. Cao, Z., et al. Carboxyl graphene oxide nanoparticles induce neurodevelopmental defects and locomotor disorders in zebrafish larvae. Chemosphere. 270, 128611(2021).
  20. Martini, D., Pucci, C., Gabellini, C., Pellegrino, M., Andreazzoli, M. Exposure to the natural alkaloid berberine affects cardiovascular system morphogenesis and functionality during zebrafish development. Sci Rep. 10, 17358(2020).
  21. Sun, M., et al. Robotic cardinal vein microinjection of zebrafish larvae based on 3D positioning. 2021 IEEE International Conference on Robotics and Automation (ICRA), Xi'an, China, , (2021).
  22. Kedra, M., et al. TrkB hyperactivity contributes to brain dysconnectivity, epileptogenesis, and anxiety in zebrafish model of tuberous sclerosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2170-2179 (2020).
  23. Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Dis Model Mech. 4 (2), 255-267 (2011).
  24. Konadu, B., Cox, C. K., Gibert, Y. Protocol for the microinjection of free fatty acids and triacylglycerol in zebrafish embryos. STAR Protoc. 5 (2), 103086(2024).
  25. Evans, S. S., Repasky, E. A., Fisher, D. T. Fever and the thermal regulation of immunity: the immune system feels the heat. Nat Rev Immunol. 15 (6), 335-349 (2015).
  26. Zabegalov, K. N., et al. Abnormal repetitive behaviors in zebrafish and their relevance to human brain disorders. Behav Brain Res. 367, 101-110 (2019).
  27. Scheldeman, C., et al. mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebrafish: phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108, 225-237 (2017).
  28. Ilyin, N. P., et al. Effects of intracerebroventricular lipopolysaccharide administration on behavioral, neurochemical, and neurogenomic responses in adult zebrafish. Behav Brain Res. 493, 115676(2025).
  29. Luo, R., Yao, Y., Chen, Z., Sun, X. An examination of the LPS-TLR4 immune response through the analysis of molecular structures and protein-protein interactions. Cell Commun Signal. 23, 142(2025).
  30. Grebennikova, D. V., Shandilya, U. K., Karrow, N. A. Beyond TLR4 and its alternative lipopolysaccharide (LPS) sensing pathways in zebrafish. Genes. 16 (9), 1014(2025).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

SinirbilimSay 232Say 232HepsiSayHepsiSayBu Ay JoVE deSayT beroz skleroz kompleksi TSCTSC ile ili kili n ropsikiyatrik bozukluklar TAND lernterl kin 6 IL 6Otizm spektrum bozuklu u OSBn roinflamasyonCuvier kanalMaternal immun aktivasyon MIA
TSC zebrafish larvalarının kanına interleukin-6'nın mikroenjeksiyonu ve nöropsikiyatrik bozukluk benzeri davranışların incelenmesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.