Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Atrial Fibrilasyonda Endoplazmik Retikulum Stresle İlgili İmmızıl İmza: Makine Öğrenimi ve Tek Hücreli Transkriptomik

146 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71532

⸱

7 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Basic Medical Sciences, Harbin Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, atrial fibrilasyonda endoplazmik retikulum stresle ilişkili imün impul imparazlarını, toplu transkriptomik, makine öğrenimi, bağışıklık infiltrasyon analizi ve tek hücreli transkriptomikleri entegre ederek tekrarlanabilir biyobelirteç önceliklendirmesi ve hücre tipi lokalizasyonu sunuyoruz.

Özet

Bu çalışma, toplu transkriptomik, makine öğrenimi, bağışıklık sızıntısı analizi ve tek hücreli transkriptomik entegre ederek atrial fibrilasyonda (AF) endoplazmik retikülüm stresi (ERS) ile ilişkili gen imzalarını belirlemek için tekrarlanabilir bir hesaplama iş akışını tanımlamaktadır. Gen İfadesi Omnibus'tan (GEO) kamuya açık toplu transkriptomik veri setleri alındı, ardından fenotip uyumlaştırması, normalizasyon, toplu etki düzeltmesi ve diferansiyel ifade analizi yapıldı. Ağırlıklı gen ortak ekspresyon ağı analizi (WGCNA), ERS ile ilişkili gen setleriyle birleştirilerek aday ERS ile ilişkili genler belirlendi. Daha sonra özellik seçimi ve model uyum stratejilerini karşılaştırmak için çok algoritmalı bir makine öğrenimi çerçevesi kullanıldı. Seçilen model, bağımsız bir dış doğrulama kohortunda (GSE115574) değerlendirildi ve ek bir kohortta (GSE14975) daha fazla değerlendirildi; ayırtıcı performans alıcı çalışma karakteristikleri (ROC) analizi ve eğri altındaki alan (AUC) ile nicelendirildi. Bu iş akışı kullanılarak, 22 ERS ile ilgili çekirdek gen tanımlandı ve 18 genlik Elastik Ağ (Enet) modeli, eğitim ve doğrulama kohortları arasında en yüksek genel ayırtıcı performansı gösterdi. SHapley Additive ExPlanations (SHAP) analizi, RPS11, NCF2 ve S100A4 gibi genlerin model tahminine büyük katkısını ortaya koydu. Bağışıklık dekonvolüsyonu ve tek hücreli transkriptomik analizler, ERS ile ilişkili imzayı ağırlıklı olarak monosit-makrofaj hattına daha da haritaladı ve bu da onun AF ile ilişkili bağışıklık yeniden modellenmesinde potansiyel rol olabileceğini gösterdi. Bu iş akışı, hastalıkla ilişkili transkriptomik imzaları belirli bağışıklık hücresi popülasyonlarına bağlamak için tekrarlanabilir bir strateji sunar ve uygun toplu ve tek hücreli veri setleriyle diğer hastalık bağlamlarına uyarlanabilir.

Giriş

Atrial fibrilasyon (AF), klinik uygulamada en yaygın süregelen aritmidir ve atriumlarda düzensiz elektriksel aktivite ve mekanik fonksiyon kaybı ile karakterize edilir. İnme, kalp yetmezliği ve tüm nedenlerle ölüm risklerini önemli ölçüde artırır ve küresel bir halk sağlığı yükü halinegelir 1. Mevcut klinik AF yönetimi önemli zorluklarla karşı karşıyadır: geleneksel antiaritmik ilaçların sinüs ritmini korumada uzun vadeli etkinliği sınırlıdır ve aritmiler ve kardiyotoksisite gibi yan etkileri sürekli kullanımınısınırlar 2,3. Kateter ablasyonu, kalıcı AF4 için uzun süreli sinüs ritmini korumakta da zordur. Yeni tedavi stratejileri, AF'nin üst akış mekanizmalarının moleküler peyzajının sistematik olarak anlaşılmaması nedeniyle sınırlıdır; bu da kesin hedeflerin tanımlanması ve çevrilmesini engeller. Araştırmalar, AF'nin patolojik ilerlemesinin, elektriksel, yapısal ve otonom sinir sistemi yeniden yapılandırması dahil olmak üzere birçok boyutta karmaşık etkileşimler içerdiğini göstermiştir. Bunlar arasında, miyokard fibrozisine odaklanan atriyal yapısal yeniden yapılandırma, AF 5,6,7'nin korunması için önemli bir mekanizmadır.

Bu nedenle, fibrozisi tetikleyen üst akım stres yollarını aydınlatmak, kalıcı AF'deki terapötik darboğazın aşılmasının anahtarlarından biridir. Son çalışmalar, hücrelerin iç ve ekstrahücre bozukluklarıyla başa çıkmasını sağlayan temel düzenleyici merkez olan endoplazmik retikülüm stresinin (ERS) ER homeostazı bozulduğunda tetiklenen ve ER lümeninde katlanmamış veya yanlış katlanmış proteinlerin aşırı birikmesine yol açtığı yüksek korunan adaptif bir yanıt olduğunu göstermektedir. ERS, proteostaz, kalsiyum döngüsü, inflamatuar yanıtlar ve apoptoz 8,9 düzenleyerek atriyal yeniden yapılandırmaya katılabilir. Ancak, AF'deki ERS'in yukarı tetikleyicileri, ana efektör molekülleri ve aşağı akış yolları henüz sistematik olarak tanımlanmamıştır; bu da atriyal yeniden modellemede kritik düğümlerini ve uygulanabilir müdahale noktalarını tanımlamayı zorlaştırmaktadır.

Geleneksel toplu transkriptomik çalışmalarla karşılaştırıldığında, çoklu omik entegrasyon daha sağlam popülasyon düzeyinde hastalıkla ilişkili sinyaller verebilir. Ayrıca, tek hücreli transkriptomiklerin dahil edilmesi, hücresel heterojenliğin diseksiyonunu ve bu sinyallerin hücresel kaynaklarının tanımlanmasını mümkün kılarak, ilişki sonuçlarını belirli hücre tiplerine ve potansiyel etkileşim yollarına eşlemeyi sağlar. Bu, sonraki mekanik araştırmalar ve hedef önceliklendirme için bir temel sağlar. Mevcut çalışmada, AF ile ilgili toplu transkriptomik ve tek hücreli transkriptomik veri setleri Gen İfadesi Omnibus (GEO) veritabanından alındı. ERS ile ilgili çekirdek modüller, diferansiyel ifade analizi ve ağırlıklı gen ortak ekspresyon ağı analizi (WGCNA) ile tanımlanmıştır. Tek hücre analizleri entegre edilerek, anahtar moleküller belirli hücre tiplerine ve onların etkileşim ağlarına daha da lokalize edildi. Bu çalışma, topluca AF'deki ERS ile ilgili anahtar ağları ve bunların yapısal yeniden yapılanma ile ilişkilerini ayırmayı amaçlar; böylece hedef keşfi ve mekanizma odaklı, tabakalı terapötik stratejiler için gerekçe sağlamaktadır.

Tek veri seti diferansiyel ifade analizi veya tek algoritma biyobelirteç taraması ile karşılaştırıldığında, bu iş akışı çapraz kohort doğrulama, biyolojik olarak kısıtlanmış özellik seçimi, çoklu algoritma model karşılaştırması, bağışıklık dekonvolüsyonu ve tek hücreli transkriptomiği entegre ederek sağlamlığı ve yorumlanabilirliği artırır. Bu adımlar, tekrarlanabilir ERS ile ilgili imzaların önceliklendirilmesine ve toplu türeme sinyallerin belirli bağışıklık hücre popülasyonlarına ve etkileşim ağlarına lokalize edilmesine yardımcı olur. Bu iş akışı, iyi tanımlanmış hastalık ve kontrol grupları, karşılaştırılabilir doku kaynakları, yeterli örneklem büyüklüğü ve mevcut fenotip notasyonları içeren kamu veya kurum içi transkriptomik veri setleri kullanılarak yapılan çalışmalar için uygundur. Özellikle hipotez oluşturma, biyobelirteç önceliklendirmesi ve hastalıkla ilişkili moleküler programların hücre tipi lokalizasyonu için faydalıdır. Ancak performansı, veri seti kalitesine, fenotip tutarlılığına ve etkili toplu etki düzeltmesine bağlıdır; Bu nedenle, bu iş akışı tarafından tanımlanan aday imzaları, klinik çeviri öncesi bağımsız kohortlarda ve deneysel modellerde doğrulama gerektirir. Genel çalışma çalışma akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çin'de 18 Şubat 2023'te yayımlanan İnsan Özekleri İçeren Yaşam Bilimleri ve Tıbbi Araştırmaların Etik İnceleme Ölçümleri'ne göre, kamuya açık veriler kullanılarak yapılan araştırmalar, etik incelemeden muafiyet kriterlerini karşılayabilir. Bu çalışma yalnızca kamuya açık olan, kimliği yok olan ikincil transkriptomik verileri kullandı ve yeni insan katılımcı alımı, insan örnek toplama veya hayvan deneyleri içermedi. Bu nedenle, ek kurumsal etik onay gerekmiyordu. Bu çalışmada hayvan deneyleri yapılmadı. Bu nedenle, kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesinin onayı geçerli değildi.

Atrial fibrilasyonda endoplazmik retikülüm stresine bağlı genler için veri kaynakları
Bu çalışmada, GEO veritabanından kamuya açık AF ile ilgili transkriptomik veri setleri alındı; bunlar arasında GSE41177, GSE79768, GSE115574, GSE14975 ve GSE165838 yer aldı. GSE veri setleri hakkında ayrıntılı bilgiler, Ek Dosya 1—Ek Tablo S1'de sunulmaktadır. GSE41177 ve GSE79768 entegre toplu transkriptomik eğitim kohortunu oluşturmak için kullanılırken, GSE115574 ve GSE14975 iki bağımsız dış doğrulama kohortu olarak kullanıldı. GSE165838 tek hücreli transkriptomik analiz için kullanıldı. Bu veri setleri farklı platformlarda oluşturulduğu ve doku kaynağı, klinik arka plan ve örnek bileşimi açısından farklılık gösterebileceği için, her veri seti platform özelliklerine göre entegrasyon veya doğrulama öncesinde ayrı ayrı ön işlenmiş durumda. Toplu etki düzeltmesi, birleşen eğitim grubu için sva R paketiyle gerçekleştirildi. Endoplazmik retikulum stresle ilişkili gen seti, GeneCards veritabanından 3 ≥ alaka puanı ile alındı ve dedlikalisiyondan sonra bu çalışmada kullanılan hedef gen listesini oluşturdu.

Diferansiyel olarak ifade edilen genlerin analizi
Veri standartlaştırılması ve normalizasyonundan sonra, entegre eğitim setinde farklı olarak eksprese edilen genleri (DEG) tanımlamak için R paket limma kullanıldı. DEG'ler aşağıdaki anlamlılık kriterleriyle tanımlanmıştır: yanlış keşif oranına göre ayarlanmış P değeri (sıf. P.Val) < 0.05 ve |log2FC| > 0.58510. DEG'lerin ifade desenlerini görselleştirmek için, sırasıyla ggplot2 ve pheatmap paketleri kullanılarak volkan grafikleri ve ısı haritaları oluşturuldu.

WGCNA analizi
Koordineli gen düzenlemesinin potansiyel mekanizmalarını aydınlatmak, ortak ekspresyon modülleri ile klinik özellik değişkenleri arasındaki ilişki kalıplarını tanımlamak ve translasyon potansiyeline sahip çekirdek biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri belirlemek için WGCNAuygulanmıştır 11.

R'deki WGCNA paketi kullanılarak ağırlıklı bir ortak ifade ağı oluşturuldu. Yumuşak eşik gücü (β) ölçeksiz topoloji kriterine göre seçildi; karşılık gelen β değeri, ölçeksiz topoloji uyum indeksi (R 2) 0.8512'ye ulaştığında ve üzerinde kaldığında sonraki analizler için seçildi. Modül tanımlama sırasında, dinamik ağaç kesimi ve modül algılama hassasiyetiyle ilgili parametreler, modül sınır çözünürlüğü ve kararlılığını artırmak için optimize edildi. Son olarak, hedef özellikle anlamlı ilişkili modüller çıkarıldı ve modüler içi genler, sonraki analizler için aday gen setleri olarak tanımlandı.

AF ile ilgili DEG'lerin zenginleştirme analizi
Hub genlerini kesin olarak tanımlamak için, DEG'ler önce anahtar WGCNA modüllerinden genlerle kesiştirilerek AF patogenezinde rol oynayan bir gen seti tanımlandı. Sonrasında, bu AF gen seti ERS ile ilgili genlerle daha fazla kesiştirildi ve ortaya çıkan örtüşen genler sonraki analizler için korundu.

Tarama genlerinin fonksiyonel zenginleşmesi, Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) analizleri kullanılarak değerlendirildi. GO terimleri, biyolojik süreç (BP), hücresel bileşen (CC) ve moleküler fonksiyon (MF) kategorileri13 boyunca zenginleşmeyi özetlemek için R paket clusterProfiler ile analiz edildi. KEGG analizi daha sonra hedef genlerle ilişkili zenginleştirilmişyolları belirlemek için kullanıldı 14. Düzeltilmiş P değeri 0,05 < zenginleştirme sonuçları istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. Önde gelen GO terimleri ve KEGG yolları, ggplot2 kullanılarak bar grafikleri ve baloncuk grafikleri olarak gösterildi.

Protein-protein etkileşimi (PPI) analizi
PPI analizi, kesişen gen setinin STRING veritabanına yüklenmesiyle gerçekleştirildi ve organizma Homo sapiens ile sınırlandırıldı. Bağlantısı kopuk düğümler kaldırıldı ve etkileşimler orta bir güven puanı eşiği kullanılarak (birleşik puan 0,4≥ alındı). Ortaya çıkan PPI ağı, daha sonra ana düğümleri belirlemek için topolojik analiz için bir ağ görselleştirme ve analiz aracına aktarıldı.

12 makine öğrenimi algoritmasına dayalı bir aday AF-ERS sınıflandırma modelinin oluşturulması
Bu çalışmada, AF ile ilişkili ERS ile ilişkili aday imza genlerini taramak ve sınıflandırma performansını optimize etmek için on iki geleneksel makine öğrenimi algoritmasına dayalı bir topluluk sınıflandırma çerçevesi geliştirilmiştir. Veri bölmesi için, standartlaştırma ve normalizasyondan sonra, GSE41177 ve GSE79768 birleştirilerek eğitim kohortu ifade matrisi oluşturuldu. GSE115574, model genellenebilirliğini değerlendirmek için bağımsız bir dış doğrulama kohortu olarak kullanıldı. Özellikle, DEG'ler ilk olarak eğitim kohortunda tanımlanmıştır (|log2FC| >0.585, p < 0.05 olarak ayarlanmıştır). Bu DEG'ler, daha sonra anahtar WGCNA modüllerinden ve ERS ile ilgili genlerden gelen genlerle kesiştirildi ve ortaya çıkan gen seti model inşası için giriş özellikleri olarak kullanıldı.

ERS ile ilgili genleri AF fenotipiyle bağlamak için, 12 makine öğrenimi yaklaşımı kullanılarak bir aday sınıflandırma modeli geliştirildi: Lasso, Ridge, adımlı genelleştirilmiş doğrusal model (Stepglm), aşırı gradyan güçlendirme (XGBoost), rastgele orman (RF), elastik ağ (Enet), genelleştirilmiş doğrusal modeller için kısmi en küçük kare regresyon (plsRglm), genelleştirilmiş yükseltilmiş regresyon modelleme (GBM), saf Bayes, lineer ayrımcı analiz (LDA), glmBoost, ve vektör makinesini (SVM) destekledi. Sistematik bir kombinatoryal modelleme stratejisi, birincisine ikinci bir algoritma eklenip bunları α ayar parametresi üzerinden entegre ederek benimsendi ve kapsamlı şekilde değerlendirilen 113 özellik seçimi ve model uyumu kombinasyonu elde edildi. Model ayırtıcılığı, alıcının çalışma karakteristik eğrisinin (AUC) altındaki alan hesaplanarak değerlendirildi. Daha önce bildirilen model seçim kriterlerine göre, nihai aday çerçevesi, eğitim ve doğrulama kohortları arasında ortalama AUC ile değerlendirilen en iyi genel performansa sahip model olarak tanımlanmıştır.

Bu kombinatoryal modelleme stratejisi, biyomedikal makine öğrenimi (15,16,17) üzerine yapılan önceki çalışmalardan şekillenmiştir. Bu çalışmalar toplamda, veri setleri ve analitik görevlerde hiçbir algoritmanın diğerlerinden sürekli üstün performans göstermediğini göstermektedir. Bu varsayıma dayanarak, topluluk öğrenme ve kombinatoryal modelleme çerçevesinin benimsenmesi, daha kararlı genellenebilirliğe sahip yüksek performanslı bir aday modeli elde etme olasılığını artırabilir ve model seçiminin sağlamlığını artırabilir.

Daha sonra, makine öğrenimi modelini yorumlamak için SHapley Additive exPlanations (SHAP) değerleri uygulandı; AF sınıflandırmasını yönlendiren temel özellikler görselleştirildi; böylece her bir özelliğin tahmin edilen sonuca katkısını niceleştirdi ve bireysel imza genlerinin nihai modelçıktısını nasıl etkilediğini gösterdi 18.

Model performansının değerlendirilmesi ve optimal modelin dış doğrulaması
Optimal modelin performansı, eğitim kohortunda ve bağımsız dış doğrulama kohortunda (GSE115574) değerlendirildi. Model düzeyinde, tahmin edilen sınıf etiketlerine dayalı bir karışıklık matrisi oluşturuldu ve ilgili sınıflandırma metrikleri raporlandı. Alıcı çalışma karakteristikası (ROC) eğrileri R paketi pROC kullanılarak oluşturuldu ve AUC, ayırt edici performansı nicelikle ölçmek için hesaplandı.

Biyobelirteç düzeyinde, optimal modeldeki her anahtar gen için tek genli ROC eğrileri çizildi ve ilgili AUC'ler bireysel ayırt edici yeteneklerini değerlendirmek için hesaplandı. Ayrıca, anahtar genlerin farklı ekspresyonu volkan grafiki kullanılarak özetlenmiş ve hastalık ile sağlıklı örneklerdeki ifade dağılımlarını göstermek için kutu grafikleri kullanılmıştır. Daha önce tanımlanmış optimal model türetilmiş gen imzasının genellenebilirliğini daha fazla değerlendirmek için, GSE14975 kullanılarak ek bağımsız bir dış doğrulama gerçekleştirildi. GSE14975, sol atriyal ek örneklerinden alınan transkriptomik veriler içerir; beş atriyal fibrilasyon örneği ve beş sinüs ritmi/kontrol örneği bulunur. Kilitli imzaya dahil edilen tüm genler bu veri setinde mevcuttu. Orijinal çapraz kohort analitik iş akışıyla tutarlılığı korumak için, geliştirme grubu ve GSE14975, ComBat kullanılarak veri seti kaynağı olarak toplu değişken olarak uyumlandırıldı. Bu uyum denetimsiz bir şekilde gerçekleştirildi. Önemli olarak, GSE14975 hastalık/kontrol etiketleri özellik seçimi, katsayıyı tahmini, eşik belirleme veya hiperparametre ayarlaması için kullanılmamıştır.

Optimal modelden türetilen puanlama modeli yalnızca geliştirme grubu kullanılarak uygulandı ve ardından dış doğrulama için GSE14975'ye uygulandı. GSE14975 model performansı, alıcı çalışma karakteristik eğrisi analizi, eğri altındaki alan, %95 güven aralığı (CI), hassasiyet, özgülük, doğruluk, pozitif ve negatif öngörü değerleri ile Brier skoru kullanılarak değerlendirildi. Ayrıca, GSE14975'de tüm optimal model kökeni genleri için bireysel ayırt etme yeteneklerini göstermek için tek gen ROC eğrileri oluşturuldu. Geliştirme kohortunda olası aşırı uyumu daha iyi değerlendirmek için, kilitli optimal modelden türetilen gen imzası kullanılarak tekrarlanan 10 katlı çapraz doğrulama ve bootstrap iyimserlik düzeltmesi gerçekleştirildi. Tekrarlanan çapraz doğrulama için, geliştirme kohortu tekrar tekrar 10 kata bölündü ve model ayrımcılığı tüm yinelemelerde özetlendi. Bootstrap doğrulaması için, görünüş geliştirme seti performansının iyimserliğini tahmin etmek ve iyimserlik düzeltilmiş AUC'yi hesaplamak amacıyla 1.000 bootstrap yeniden örnekleme oluşturuldu. Son imza optimal modelden türetildiği için, her genin katkısı öncelikle model katsayılarının mutlak büyüklüğü ve yönüne göre yorumlanmıştır. Ayrıca, her bileşen genin bireysel ayırt etme yeteneğini göstermek için GSE14975 tek gen ROC analizleri yapıldı. Görselleştirme amaçları için, tek genli ROC eğrileri, AF ile ilişkili yüksek ya da düşük ekspresyonun ilişkili olup olmamasına bakılmaksızın ayırt edici yeteneği yansıtacak şekilde yönlendirildi.

Gen seti zenginleştirme analizi (GSEA)
Ana genlerin işlevsel etkilerini incelemek için, GSEA hastalık grubu19'dan örneklerle gerçekleştirildi. Her anahtar gen için, örnekler hastalık grubundaki medyan ekspresyon değeri kullanılarak yüksek ve düşük ekspresyonlu alt gruplara ayrıldı. Her gen için iki alt grup arasındaki ortalama ifade farkı hesaplandı ve zenginleştirme analizi için girdi olarak azalan sıralanmış bir gen listesi oluşturuldu. GSEA, MSigDB koleksiyonu c2.cp.kegg.Hs.symbols.gmt'den alınan gen setleriyle R paket kümesi Profiler kullanılarak gerçekleştirildi. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 olarak tanımlandı. Zenginleştirme yönü, normalleştirilmiş zenginleştirme skorunun (NES) işaretiyle belirlendi ve temsil yolları için zenginleştirme grafikleri oluşturuldu.

İmmün hücre alt tip bolluğu ve diferansiyel ifadenin değerlendirilmesi
CIBERSORT dekonvolüsyon algoritması, infiltrasyon yapan bağışıklık hücresi alt kümelerinin göreceli bolluğunu ve örnekler arasındaki ilişkilerini tahmin etmek için uygulanmıştır. LM22 lökosit imza matrisine dayanarak, bağışıklık hücresi bileşimi gen ifade profillerinden R paketi CIBERSORT20 kullanılarak nicel olarak çıkarılmıştır. Sonuçları filtrelemek için p < 0.05 eşiği kullanıldı ve sadece bu kriterden geçen örnekler sonraki analizler için tutuldu. AF ve kontrol grupları arasındaki tahmini immigr-hücre alt kümelerinin göreli fraksiyonlarını karşılaştırmak için kutu grafikleri oluşturuldu. Ayrıca, Spearman'ın korelasyon analizi, bağışıklık hücresi infiltrasyon seviyeleri ile hub gen ekspresyonu arasındaki ilişkileri değerlendirmek için yapılmıştır.

Tek hücreli analiz
Tek hücreli transkriptomik analiz, GEO veri seti GSE165838 kullanılarak gerçekleştirildi. Ham gen hücresi sayı matrisleri R'ye ithal edilip Seurat v4.4.0 kullanılarak işlendi. Her örnek için, min.cells = 5 ve min.features = 300 olan CreateSeuratObject kullanılarak bir Seurat nesnesi oluşturuldu. Her hücre için tespit edilen genlerin sayısı, toplam benzersiz moleküler tanımlayıcı (UMI) sayıları, mitokondriyal gen yüzdesi, ribozomal gen yüzdesi ve hemoglobin gen yüzdesi gibi kalite kontrol metrikleri hesaplandı. Hücreler, 500'den fazla tespit edilen gen, 5.000'den az UMI sayısı, mitokondriyal gen yüzdesi < 25, ribozomal gen yüzdesi %3 >ve hemoglobin gen oranı %1< varsa tutulurdu. Üçten az hücrede tespit edilen genler çıkarıldı. MALAT1 ve mitokondriyal genler de aşağı akış analizinden önce dışlandı. DoubletFinder, potansiyel dubletleri tespit etmek ve dışlamak için kullanıldı. Kısaca, hücreler örnek kimliğine göre ayrıldı ve her örnek için ayrı ayrı olarak ana bileşenler 1–30 kullanılarak dublet tespiti yapıldı.

pN parametresi 0.25 olarak ayarlandı ve optimal pK değeri, parametre süpürmesinden elde edilen maksimum BC metriğine göre seçildi. Beklenen çift tutma oranı, her örnekteki kurtarılan hücre sayısına göre tahmin edildi; oranlar sırasıyla %2,5, %5 ve %6,5 olarak nispeten düşük, orta ve yüksek hücre sayılarına sahip örnekler için kullanıldı. Sadece tekil olarak sınıflandırılan hücreler tutuldu. Çevresel RNA kontaminasyonu DecontX kullanılarak ayrıca tahmin edildi ve 0,2 ≥ kontaminasyon puanına sahip hücreler hariç tutuldu. Kalite kontrol, çift kat çıkarma ve ortam RNA filtrelemesinden sonra, 40.886 hücre ve 23.947 gen sonraki analiz için tutuldu. Filtrelenmiş tek hücreli veri seti, 10.000 ölçek faktörü kullanılarak LogNormalize yöntemiyle normalleştirildi ve ardından yüksek değişkenlikli genler tanımlandı. Veriler ana bileşen analizinden önce ölçeklendirildi.

Örnekle ilgili toplu etkileri azaltmak için, Harmony parti değişkeni olarak orig.ident kullanılarak uygulanmıştır. Uniform Manifold Yaklaşımı ve Projeksiyon (UMAP) görselleştirmesi ve en yakın komşu grafik yapısı, ilk 15 Harmony düzeltilmişboyut 21 kullanılarak gerçekleştirildi. Kümeleme işlemi Louvain algoritması kullanılarak gerçekleştirildi ve birden fazla kümeleme çözünürlüğü değerlendirildi. Son ana hücre tipi notasyon, 0.05 çözünürlükteki küme sonucuna dayanıyordu. Hücre kümeleri, kanonik işaret-gen ifadesine göre manuel olarak notlandı. Bu belirteç tabanlı açıklama stratejisi, önceki tek hücreli bağışıklık profilleme çalışmalarıylatutarlıdır 22. T hücreleri CD3D, CD3E ve TRAC ile tanımlandı; doğal katil (NK) hücreleri NKG7, GNLY, NCAM1 ve KLRG1 tarafından; LYZ, CD14, FCGR3A, CD68, CD163, FCN1, TYROBP, S100A8 ve S100A9 tarafından monosit-makrofaj hücreleri; MS4A1 ve CD79A tarafından B hücreleri; plazma hücreleri MZB1 ve XBP1 ile uygulandı; endotel hücreleri PECAM1, VWF ve CDH5 ile; damar düz kas hücreleri ACTA2, TAGLN, MYH11 ve MYL9 ile; DCN, LUM, COL1A1, COL1A2 ve PDGFRA tarafından kullanılan fibroblastlar; FCGR3B, CXCR2, S100A8 ve MPO tarafından nötrofil benzeri hücreler; mast hücreleri TPSB2 ile; ve LILRA4, CD1C ve XCR1 tarafından dendritik hücreler kullanıldı. Kümeler arasında belirteç-gen ifadesi nokta grafikleri kullanılarak görselleştirildi ve son ERS ile ilgili hub genlerinin ifade dağılımı UMAP gömmelerinde görselleştirildi.

ERS ile ilgili transkripsiyon aktivitesini tek hücre düzeyinde nicelendirmek için, son merkez-gen seti AUCell, tek örneklem gen seti zenginleştirme analizi ve Seurat AddModuleScore kullanılarak hücre bazında imza puanlarını hesaplamak için kullanıldı. AUCell için hücre sıralamaları normalize edilmiş RNA ekspresyon matrisinden oluşturuldu ve AUC puanları, sıralanan genlerin en üst %10'u maksimum sıralama eşiği olarak kullanılan merkez-gen seti kullanılarak hesaplandı. ssGSEA için, zenginleştirme puanları GSVA paketi kullanılarak hesaplandı. Üç puanlama çıktısı ortalanıp ölçeklendirildi, ardından minimum maksimumu normalleştirildi ve sonunda her hücre için entegre ERS ile ilgili bileşik skor oluşturuldu. Bileşik skorun dağılımı annotasyonlu hücre popülasyonları arasında karşılaştırıldı ve ERS ile ilgili programın hücre tipi heterojenliği değerlendirildi. Monosit-makrofaj hattı belirgin ERS ile ilgili imza zenginleşmesi gösterdiği ve bağışıklık inflamatuar yeniden şekillendirme ile yakından ilişkili olduğu için, sonraki hatlar içi analizler için seçildi. Monosit-makrofaj hücreleri, medyan ERS ile ilgili bileşik skora göre yüksek ve düşük puanlı gruplara ayrıldı. Daha sonra monosit-makrofaj hücreleri üzerinde Monocle kullanılarak pseudotime yörünge analizi yapıldı.

Sözde zaman analizi için, ham sayım matrisinden negatif binomial ifade modeli kullanılarak bir CellDataSet nesnesi oluşturuldu. Boyut faktörleri ve dağılım daha sonra tahmin edildi. Sıralayan genler, ortalama ekspresyon eşiği ≥ 0.1 ve ampirik dispersiyanın uygun dispersyondan daha yüksek olması kullanılarak seçildi. DDRTree algoritması ile boyutluluk azaltıldı ve hücreler çıkarılan yörüng boyunca sıralandı. ERS ile ilgili hub genlerinin sözde zaman boyunca dinamik ifade desenleri görselleştirildi. Hücre-hücre iletişim analizi, farklı ERS ile ilgili skorlara sahip monosit-makrofaj hücrelerini içeren potansiyel ligand-reseptör etkileşimlerini incelemek için CellChat kullanılarak gerçekleştirildi. Bu analiz için, monosit-makrofaj hücreleri medyan bileşik skoruna göre yüksek veya düşük puanlı olarak etiketlenmiş, diğer hücreler ise orijinal hücre tipi etiketlerini korudu. Normalize RNA ifade matrisi ve buna karşılık gelen hücre grubu açıklamaları kullanılarak CellChat nesnesi oluşturuldu. Hücre-hücre iletişim analizi için insan CellChatDB veritabanı seçildi ve yalnızca salgılanan sinyal etkileşimleri değerlendirildi. İletişim olasılıkları hesaplanmadan önce aşırı ekspreslenen genler ve ligand-reseptör çiftleri tespit edildi. 10'dan az hücre içeren hücre grupları etkileşim analizinden dışlandı. Yol düzeyindeki iletişim olasılıkları daha sonra tahmin edilip hücre popülasyonları arasındaki etkileşim sayısı ve gücü karşılaştırılmak için toplanmıştır. Tekrarlanabilirliği kolaylaştırmak için, aşağıda her protokol adımını kendi beklenen çıktı şekli veya tablosuna (Ek Dosya 1—Ek Tablo S2) bağlayan bir kontrol noktası tablosu sunulmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

AF'de farklı şekilde ifade edilen genlerin tanımlanması
Kohortlar arasında karşılaştırılabilirliği artırmak için, iki AF ile ilgili transkriptomik veri seti (GSE41177 ve GSE79768) entegre edildi ve birleşen ifade matrisi üzerindeki parti etkileri düzeltildi. Şekil 2A,B, toplu etki düzeltmesinden önce ve sonra küresel ifade dağılımlarının kutu grafiklerini gösterir; bu dağılımlar, örnekler arasında ifade yoğunluğu dağılıml...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, ERS'nin AF'deki rolünü araştırmak için toplu ve tek hücreli transkriptomları entegre etti. Olumlu çapraz kohort ayrımcılığına sahip ERS ile ilişkili bir gen imzası türetildi ve bu sinyaller ağırlıklı olarak monosit-makrofaj hattına eşlendi ve kapsamlı hücreler arası iletişimle ilişkilendirildi. Bulgular topluca, ERS ile ilişkili programların AF'de bağışıklık hücresi merkezli yeniden şekillendirme ile bağlantılı olduğunu gösteriyor. Toplu biyobelirteç taraması ile karşılaştırı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar bu çalışmada çıkar çatışması belirtmemiştir. Bu makalenin revizyonu sırasında, OpenAI'den ChatGPT yalnızca İngilizce cila geliştirme için kullanıldı. Yazarlar, tüm yapay zeka destekli metinleri incelemiş, doğrulamış ve düzenlemiş ve nihai makalenin doğruluğu ve bütünlüğünden tam sorumluluğu üstlenmektedir. Araştırma fikirleri üretmek, veri analizi yapmak, sonuçları yorumlamak, şekiller veya tablolar oluşturmak veya bilimsel sonuçlar çıkarmak için yapay zeka destekli araçlar kullanılmadı. Makalede bildirilen çalışmalar yazarlar tarafından yapılmıştır. F.T, PR. W: Yazma-özgün taslak, Yazılım, Metodoloji, Görselleştirme, Doğrulama ve Veri Kürası. SY. T: Araştırma ve Metodoloji. FF. B: Denetim. QR. L: Denetim, Metodoloji, Veri küratörlüğü. XY. J, YX. X: Literatür bulgusu ve veri yorumlama.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AddModuleScoreSeurat işlevisürüm 4.4.0NA
AUCellBioconductorsürüm 1.32.0RRID:SCR_021327
caretCRANsürüm 7.0.1RRID:SCR_022524
celda / decontXBioconductorsürüm 1.24.0NA
CellChatGitHub / CellChatsürüm 2.2.0RRID:SCR_021946
CIBERSORT / LM22 imza matrisiCIBERSORTLM22NA
clusterProfilerBioconductorsürüm 4.12.6RRID:SCR_016884
CytoscapeCytoscape Consortiumsürüm 3.10RRID:SCR_003032
DoubletFinderGitHub / McGinnis Labsürüm 2.0.4NA
e1071CRANsürüm 1.7.16NA
gbmCRANsürüm 2.2.2NA
Gen Ekspresyon Omnibus (GEO) veritabanıUlusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI)GSE41177NA
Gen Ekspresyon Omnibus (GEO) veritabanıNCBIGSE79768NA
Gen Ekspresyon Omnibus (GEO) veritabanıNCBIGSE115574NA
Gen Ekspresyon Omnibus (GEO) veritabanıNCBIGSE14975NA
Gen Ekspresyon Omnibus (GEO) veritabanıNCBIGSE165838NA
glmnetCRANsürüm 4.1.8NA
HarmonyCRANsürüm 1.2.4NA
limmaBioconductorsürüm 3.60.6RRID:SCR_010943
MASSCRANsürüm 7.3.61NA
mboostCRANsürüm 2.9.11NA
MonocleBioconductorsürüm 2.38.0RRID:SCR_016339
org.Hs.eg.dbBioconductorsürüm 3.19.1NA
plsRglmCRANsürüm 1.5.1NA
pROCCRANsürüm 1.18.5RRID:SCR_024286
R istatistik yazılımıR Foundation for Statistical Computingsürüm 4.4.2RRID:SCR_001905
randomForestCRANsürüm 4.7.1.2RRID:SCR_015718
RStudioPosit Software, PBCsürüm 2024.4.1.748RRID:SCR_000432
SeuratCRAN / Satija Labsürüm 4.4.0RRID:SCR_016341
shapvizCRANsürüm 0.10.2NA
svaBioconductorsürüm 3.52.0NA
WGCNACRANsürüm 1.73RRID:SCR_003302
xgboostCRANsürüm 1.7.8.1NA

Kaynaklar

  1. Saleh K, Haldar S. Atrial fibrillation: a contemporary update. Clin Med (Lond). 2023;23(5):437-41.
  2. Lemme M, et al. Atrial-like engineered heart tissue: an in vitro model of the human atrium. Stem Cell Reports. 2018;11(6):1378-90.
  3. van Gorp PRR, Trines SA, Pijnappels DA, de Vries AAF. Multicellular in vitro models of cardiac arrhythmias: focus on atrial fibrillation. Front Cardiovasc Med. 2020;7:43.
  4. Scherr D, et al. Five-year outcome of catheter ablation of persistent atrial fibrillation using termination of atrial fibrillation as a procedural endpoint. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2015;8(1):18-24.
  5. Staerk L, et al. Atrial fibrillation: epidemiology, pathophysiology, and clinical outcomes. Circ Res. 2017;120(9):1501-17.
  6. Schotten U, Verheule S, Kirchhof P, Goette A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiol Rev. 2011;91(1):265-325.
  7. Van Wagoner DR, Chung MK. Inflammation, inflammasome activation, and atrial fibrillation. Circulation. 2018;138(20):2243-6.
  8. Yuan M, et al. IP3R1/GRP75/VDAC1 complex mediates endoplasmic reticulum stress-mitochondrial oxidative stress in diabetic atrial remodeling. Redox Biol. 2022;52:102289.
  9. Wang M, Kaufman RJ. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 2016;529(7586):326-35.
  10. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47.
  11. Langfelder P, Horvath S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 2008;9:559.
  12. Hu H, et al. Dissection of metabolome and transcriptome: insights into capsaicin and flavonoid accumulation in two typical Yunnan Xiaomila fruits. Int J Mol Sci. 2024;25(14):7761.
  13. Chen GY, et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong Recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022;2022:7858925.
  14. Chen GY, et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:5233462.
  15. Díaz-Uriarte R, Alvarez de Andrés S. Gene selection and classification of microarray data using random forest. BMC Bioinformatics. 2006;7:3.
  16. Saeys Y, Inza I, Larrañaga P. A review of feature selection techniques in bioinformatics. Bioinformatics. 2007;23(19):2507-17.
  17. Statnikov A, Wang L, Aliferis CF. A comprehensive comparison of random forests and support vector machines for microarray-based cancer classification. BMC Bioinformatics. 2008;9:319.
  18. Liu H, et al. Unraveling diethyl phthalate-induced prostate carcinogenesis: core targets revealed by integrated network toxicology, machine learning, and structural validation. Hum Genomics. 2025;19(1):149.
  19. Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545-50.
  20. Newman AM, et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nat Methods. 2015;12(5):453-7.
  21. Xu H, et al. Single-cell transcriptomics reveals CCL3+ classical monocyte subset linked to autoimmune pathogenesis. J Inflamm Res. 2025;18:16273-91.
  22. Wang Y, et al. Immunological profiling of rheumatoid factor-positive primary Sjögren’s syndrome by single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 2026;17:1822615.
  23. Wiersma M, et al. Endoplasmic reticulum stress is associated with autophagy and cardiomyocyte remodeling in experimental and human atrial fibrillation. J Am Heart Assoc. 2017;6(10):e006458.
  24. Hu HJ, et al. Hydrogen sulfide ameliorates angiotensin II-induced atrial fibrosis progression to atrial fibrillation through inhibition of the Warburg effect and endoplasmic reticulum stress. Front Pharmacol. 2021;12:690371.
  25. Liu Y, et al. Integrative transcriptomic, proteomic, and machine learning approach to identifying feature genes of atrial fibrillation using atrial samples from patients with valvular heart disease. BMC Cardiovasc Disord. 2021;21(1):52.
  26. Fu S, et al. Using integrative bioinformatics approaches and machine-learning strategies to identify potential signatures for atrial fibrillation. Int J Cardiol Heart Vasc. 2025;56:101592.
  27. Wu S, et al. Multiplex proteomics identifies inflammation-related plasma biomarkers for aging and cardio-metabolic disorders. Clin Proteomics. 2024;21(1):30.
  28. Xie Z, et al. Identification and verification of biomarkers and immune infiltration in obesity-related atrial fibrillation. Biology (Basel). 2023;12(1):121.
  29. Huo TM, Wang ZW. Comprehensive analysis to identify key genes involved in advanced atherosclerosis. Dis Markers. 2021;2021:4026604.
  30. Chen M, et al. Weighted gene co-expression network analysis identifies crucial genes mediating progression of carotid plaque. Front Physiol. 2021;12:601952.
  31. Wang S, et al. S100A8/A9 in inflammation. Front Immunol. 2018;9:1298.
  32. Wang Q, et al. Myeloid-specific S100A8/A9 deficiency attenuates atrial fibrillation through prevention of TLR4/NF-κB-mediated immune cell recruitment and inflammation. Front Immunol. 2025;16:1623486.
  33. Wu CL, Yin R, Wang SN, Ying R. A review of CXCL1 in cardiac fibrosis. Front Cardiovasc Med. 2021;8:674498.
  34. Zhang YF, et al. CXCR4 and TYROBP mediate the development of atrial fibrillation via inflammation. J Cell Mol Med. 2022;26(12):3557-67.
  35. Hulsmans M, et al. Recruited macrophages elicit atrial fibrillation. Science. 2023;381(6654):231-9.
  36. van der Net JB, et al. Arachidonate 5-lipoxygenase-activating protein gene and coronary heart disease risk in familial hypercholesterolemia. Atherosclerosis. 2009;203(2):472-8.
  37. Ye X, et al. ALOX5AP predicts poor prognosis by enhancing M2 macrophage polarization and immunosuppression in serous ovarian cancer microenvironment. Front Oncol. 2021;11:675104.
  38. Song P, Deng H, Liu Y, Zhang M. Integrated bioinformatics analysis and experimental validation reveal the relationship between ALOX5AP and the prognosis and immune microenvironment in glioma. BMC Med Genomics. 2024;17(1):218.
  39. Chen S, Tang L, Guillot A, Liu H. Bariatric surgery associates with nonalcoholic steatohepatitis/hepatocellular carcinoma amelioration via SPP1 suppression. Metabolites. 2023;13(1):11.
  40. Ji H, et al. Integrated genomic, transcriptomic, and epigenetic analyses identify a leukotriene synthesis-related M2 macrophage gene signature that predicts prognosis and treatment vulnerability in gliomas. Front Immunol. 2022;13:970702.
  41. Sirish P, et al. The critical roles of proteostasis and endoplasmic reticulum stress in atrial fibrillation. Front Physiol. 2021;12:793171.
  42. Sun Z, et al. Cross-talk between macrophages and atrial myocytes in atrial fibrillation. Basic Res Cardiol. 2016;111(6):63.
  43. Schall TJ, Proudfoot AEI. Overcoming hurdles in developing successful drugs targeting chemokine receptors. Nat Rev Immunol. 2011;11(5):355-63.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

TıpSayı 234Sayı 234Boş DeğerSayıTek Hücre AnaliziSHAP analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.