Bu protokol, yoğun bakım ünitesindeki hastalarda alt solunum yolu enfeksiyonlarına yol açan 15 patojenin bir saat içinde hasta başında tespit edilmesini sağlayan, tamamen entegre mikroakışkan çip tabanlı bir LAMP yöntemini açıklamaktadır.
Yöntem makalesi
YBÜ Hastalarında Alt Solunum Yolu Enfeksiyonlarına Yol Açan Patojenlerin Hasta Başı Hızlı Tespiti
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Alt solunum yolu enfeksiyonları (ASYE), kritik durumdaki hastalarda klinik kötüleşme ve ölümün önde gelen nedenleri arasındadır. Yoğun bakım ünitesinde (YBÜ), etken patojenin zamanında tanımlanması uygun antimikrobiyal tedavi için esastır; ancak geleneksel kültür yöntemleri 3 ila 5 gün sürer ve özellikle mantarlar için optimal olmayan pozitiflik oranlarına sahiptir. PCR gibi moleküler yaklaşımlar işlem süresini kısaltır ancak hala manuel nükleik asit ekstraksiyonuna ve termodöngüye bağımlıdır, bu da yatak başı kullanıma uygunluklarını sınırlar. Bu protokol, manyetik boncuk tabanlı nükleik asit saflaştırmasını loop-mediated isothermal amplification (LAMP) ile birleştiren, tam entegre, disk şeklinde bir mikroakışkan çip (CD çip) etrafında oluşturulmuş bir hasta başı (point-of-care) iş akışını tanımlamaktadır. Basitleştirilmiş bir manuel sıvılaştırma ve lizis adımının ardından, işlenmiş örnek iki önceden paketlenmiş reaktif şişesiyle birlikte çipe yüklenir. Cihaz daha sonra ekstraksiyonu, 65 °C'de amplifikasyonu ve gerçek zamanlı floresan okumasını otonom olarak gerçekleştirerek; 1 bakteri, 3 mantar ve 1 atipik patojen olmak üzere 15 hedef için kalitatif sonuçları, cihaz çalışma süresinin 45 dakikası içinde (manuel ön işleme adımı dahil, toplam örnekten cevaba iş akışı için yaklaşık 1 saat) verir. Tek bir çip üzerinde 7 organizmaya kadar ulaşan tek patojenli ve polimikrobiyal ko-enfeksiyonları kapsayan; balgam, bronşiyal aspiratlar ve bronkoalveoler lavaj sıvısı dahil 10 YBÜ örneğinden elde edilen tespit verilerini sunuyoruz. Kapalı kartuş tasarımı aerosol kontaminasyonu riskini en aza indirir ve tek adımda yükleme işlemi özel bir eğitim gerektirmez, bu da sistemi YBÜ ekipleri için pratik bir yatak başı tanı aracı olarak konumlandırır.
Giriş
YBÜ'deki kritik durumdaki hastalar arasında, başında ventilatörle ilişkili pnömoninin (VAP) bulunduğu alt solunum yolu enfeksiyonları; morbidite, uzamış mekanik ventilasyon ve aşırı mortalitenin kalıcı bir nedeni olmaya devam etmektedir1,2. YBÜ kaynaklı alt solunum yolu enfeksiyonlarının (LRTIs) mikrobiyolojik görünümü, toplum kaynaklı hastalıklardan belirgin şekilde farklıdır. Çoklu ilaç dirençli Gram-negatifler (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii), genellikle ampirik rejimleri karmaşıklaştıran polimikrobiyal oluşumlar şeklinde baskındır3,4. Oportünistik funguslar ise sürece ek bir karmaşıklık katmanı ekler. Bir zamanlar derin immünsupresyonun bir belirtisi olarak kabul edilen invaziv pulmoner aspergillozis, günümüzde non-nötropenik YBÜ hastalarında, özellikle şiddetli influenza ve COVID-19 sonrası giderek daha sık görülmektedir5. Aspergillozis için mevcut tanı algoritmaları, düşük verimli kültürü galaktomannan (GM) antijen testi ile birleştirir; ancak GM testi, iyi belgelenmiş tanı pencereleri ve non-nötropenik konakçılardaki değişken duyarlılığı nedeniyle kısıtlıdır6. Sepsis için uygun antimikrobiyal tedavinin başlatılmasındaki her bir saatlik gecikme, mortalitede ölçülebilir bir artışla ilişkilidir7. Topluca bakıldığında, YBÜ enfeksiyonlarının hızı ve karmaşıklığı, klinik aciliyetle eşleşebilecek tanı araçlarını zorunlu kılmaktadır.
Duyarlılık testleri için vazgeçilmez olsa da standart mikrobiyolojik kültür, temel olarak hız sınırlamasına sahiptir: sonuçlanma süresi 3 ila 5 gün sürer, titiz organizmalar gözden kaçar ve fungal kültür pozitifliği düşük kalır8. Metagenomik yeni nesil dizileme (mNGS) tarafsız bir alternatif sunar, ancak klinik adaptasyonu maliyet, 24 ila 48 saatlik işlem süreleri, biyoinformatik boru hatlarına olan bağımlılık ve sınırlı hasta başı uygulanabilirlik nedeniyle kısıtlanmıştır9. PCR tabanlı paneller zaman farkını daraltmıştır, ancak bunlar hala çok aşamalı nükleik asit ekstraksiyonu, termal döngü enstrümantasyonu ve geleneksel formatlar için amplifikasyon sonrası elektroforez gerektirmektedir10. Bu platformların hiçbiri Yoğun Bakım Ünitesi'nin (YBÜ) birleşen taleplerini tam olarak karşılamamaktadır: bir saatten kısa süre, minimum uygulama süresi, mantarlar dahil çoklu patojen kapsamı ve laboratuvar dışı personelin kullanabileceği yeterlilikte operasyonel basitlik.
Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP), bu kısıtlamaların birçoğunu giderir. İlk kez Notomi ve arkadaşları tarafından tanımlanan bu yöntem, zincir yer değiştiren bir polimeraz aracılığıyla, altı farklı bölgeyi tanıyan dört ila altı primerden oluşan bir set kullanarak hedef DNA'yı sabit 65 °C'de amplifiye eder1. Reaksiyon, gerçek zamanlı floresan ile tespit edilebilen karakteristik sap-döngü ve karnabahar benzeri amplikon yapıları oluşturur ve eşik değerinin aşılmasından sonra dakikalar içinde S şeklinde eğriler üretir. Düşük kalıp konsantrasyonlarındaki hassasiyet yüksektir ve çoklu primer tasarımı, yalancı pozitifleri sınırlayan bir seçicilik sağlar12,13. Mikroakışkan çip platformlarıyla birleştirildiğinde LAMP, tek bir numune yüklemesinden çok sayıda hedef için paralelleştirilebilir14. Önceki çalışmalar, LAMP çip sistemlerinin solunum yolu patojenlerini üç saatin çok altında bir işlem süresiyle tespit edebildiğini göstermiştir15. Ancak, bu sistemlerin temel bir kısıtlaması, süre, operasyonel karmaşıklık ve kontaminasyon riski ekleyen ayrı ve manuel DNA ekstraksiyonuna bağımlı olmalarıdır.
Burada açıklanan sistem bu darboğazı ortadan kaldırmaktadır. Tek kullanımlık, disk şeklinde bir mikroakışkan çip (86 mm çapında) üzerine kurulu olan sistem; numune yüklemeyi, manyetik boncuk tabanlı nükleik asit saflaştırmayı ve 16-plex LAMP amplifikasyonunu tek bir sızdırmaz kartuşta entegre eder (Şekil 1). Operatör, özel olarak tasarlanmış bir işlem tüpü kullanarak yalnızca kısa bir manuel sıvılaştırma-lizis adımı gerçekleştirir, ardından lizatı ve iki reaktif şişesini çipe yükler (Şekil 2). Bu noktadan itibaren cihaz; ekstraksiyonu, 65 °C'de izotermal amplifikasyonu ve floresans kazanımını otonom olarak yöneterek 1 bakteri, 3 mantar (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) ve 1 atipik patojen (Mycoplasma pneumoniae) olmak üzere klinik olarak ilgili 15 hedef için 45 dakika içinde kalitatif sonuçlar sunar. Dahili kontrol olarak kullanılan bir nöroblastoma kırılma noktası ailesi (NBPF) geni, her analizde örneğin yeterliliğini ve reaksiyon bütünlüğünü doğrular. Bu protokol; klinik laboratuvar personeli ve YBÜ yatak başı ekiplerinin her ikisi için tasarlanmış olup, YBÜ örnek toplama aşamasından ön işleme, çip yüklemeye, otomatik deteksiyona ve sonuç yorumlamaya kadar tüm iş akışı için adım talimatlar sağlamaktadır.
Protokol
Tüm örnekler, Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Peking Union Medical College Hastanesi Etik İnceleme Komitesi tarafından onaylanmış bir protokol kapsamında toplanmıştır (Onay No. I-24PJ178). Örnek toplama işleminden önce her katılımcıdan veya yasal olarak yetkilendirilmiş temsilcilerinden yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Hedef patojen paneli ve reaksiyon kuyucuğu atamaları Tablo 1'de, örnek ön işleme sırasında kullanılan sarf malzemeleri ise Tablo 2'de listelenmiştir.
1. YBYÜ'de alt solunum yollarından klinik örneklerin toplanması
- Sputum toplanması
- Yiyecek kalıntılarını ve komensal oral florayı temizlemek için ağız boşluğunu temiz su veya steril fizyolojik salin ile üç kez çalkalayın.
- Hastaya iki ila üç kez derin nefes almasını, ardından derin solunum yollarındaki sputumu doğrudan steril bir toplama kabına çıkarmak için kuvvetlice öksürmesini söyleyin.
NOT: Kabul edilebilir bir örnek, trakeanın altından gelen viskoz, pürülan veya kan çizgili materyallerden oluşur; şeffaf tükürük veya geniz akıntısı yetersizdir ve sonraki aşamalardaki tespiti tehlikeye atabilir.
- Bronşiyal aspirat (BAS) toplanması
- Entübe edilmemiş hastalar için, steril bir aspirasyon kateterini (aspirasyon kaynağı −0.0267 MPa, yani −20 mmHg basınca ayarlanmış 10–12 Fr kateter) nazal veya oral yolla yaklaşık 30 cm derinliğe kadar yerleştirin.
- Kateteri döndürken aspirasyon uygulayın ve kateteri yavaşça geri çekin. Aspire edilen sekresyonları steril bir örnek tuzağında toplayın.
NOT: Sekresyonlar az ise, aspirasyondan önce kateter aracılığıyla yaklaşık 5 mL steril salin instile edin. - Mekanik ventilasyon altındaki hastalar için, aspirasyon kateterini endotrakeal tüp boyutuna göre seçin: 7.0–7.5 mm tüp için 10 Fr kateter ve 8.0 mm tüp için 12 Fr kateter kullanın.
- Aspirasyondan önce hastaya 30–60 s boyunca %10 oksijenle pre-oksijenasyon uygulayın. Ventilatör devresini ayırın ve seçilen kateteri, dirençle karşılaşana kadar yapay hava yolu boyunca ilerletin.
- −0.0267 MPa (–20 mmHg'ye eşdeğer) negatif basınç uygulayın; derekrütman ve hipoksemiyi minimize etmek için her bir aspirasyon geçişini ve dolayısıyla ventilatörden ayrılma süresini 15 s ile sınırlandırın ve aspirasyon sonrası hastayı 30–60 s boyunca %10 oksijenle yeniden oksijenlendirin.
- Kateter aracılığıyla 1–2 mL steril salin instile edin ve 3 s bekleyin.
- Aspirasyon uygulayın ve kateteri geri çekin. Aspire edilen sekresyonları steril bir örnek tuzağında toplayın. Örnek toplama işleminin hemen ardından ventilatör devresini yeniden bağlayın.
NOT: Örneğin nozokomiyal kontaminasyonunu önlemek için süreç boyunca katı aseptik teknik uygulamak esastır.
- Bronkoalveolar lavaj sıvısı (BALF) toplanması
- Göğüs görüntülemesinde hedef segmenti belirleyin. Bronkoskobu ilerletin ve uygun segmental veya subsegmental bronşun içine yerleştirin.
- Steril salinden 20–50 mL'lik porsiyonları hızlıca, 3–5 porsiyon boyunca (toplam 60–120 mL) instile edin. Her porsiyondan sonra hafif aspirasyon uygulayın, ardından geri alınan sıvıyı steril, kapalı bir kapta toplayın.
DİKKAT: YBÜ hastalarında BAL sırasında sürekli hemodinamik ve ventilatuar izleme zorunludur. Mekanik ventilasyon altındaki denekler için ventilatör ayarlarını gerektiği gibi düzenleyin.
NOT: Tipik geri kazanım, instile edilen hacmin %40–60'ıdır. Düşük geri dönüş, bronkoskop ucunun yeniden konumlandırılmasını gerektirebilir.
2. Sıvılaştırma ve patojen lizisi
- #2 tek kullanımlık pipet kullanarak, örneği işaretli çizgiye kadar (yaklaşık 1 mL) aspire edin ve sıvılaştırma tüpüne aktarın. Tüm vizkoz materyali transfer etmek için pipet ucunu tekrar sıkın, ardından tüpü kapatın.
NOT: BALF veya sulu balgam için, yeterli patojen girişi sağlamak amacıyla iki pipet hacmi yükleyin. - Sıvılaştırma tüpünü 1 dk boyunca elle kuvvetlice çalkalayın. Örneği görsel olarak inceleyin ve görünür mukus topakları kalmayana ve örnek #1 tek kullanımlık pipet aracılığıyla herhangi bir dirençle karşılaşmadan serbestçe akana kadar (homojen, su benzeri bir kıvam) çalkalamaya devam edin. En az 1 dk çalkalayın; yüksek vizkoziteli örnekler için bu kriterler karşılanana kadar süreyi gerektiği şekilde uzatın.
- Lizis tüpünün sızdırmaz kapağını açın.
- #1 tek kullanımlık pipeti kullanarak homojenize edilmiş örnekten yaklaşık 0,5 mL aspire edin ve örneği lizis tüpüne aktarın.
- Sızdırmaz kapağı kapatın ve uç kapağının sıkıca sıkıldığını doğrulayın.
- Lizis tüpünü, güvenli hale gelene kadar aşağı bastırarak Örnek Ön İşleme cihazına (SP cihazı) yerleştirin. Start düğmesine basın.
- SP cihazının, yaklaşık 15 dk süren otomatik sıvılaştırma-lizis döngüsünü (Tablo 3'teki parametreler) tamamlamasını bekleyin.
NOT: İşlem sırasında tüpü açmayın veya çıkarmayın.
3. Çip yükleme ve otomatik tespit
- Reaktif ve örnek yükleme
- CD çipi 4 °C'lik depolama alanından çıkarın ve oda sıcaklığında (yaklaşık 25 °C) 10 dk boyunca dengeleyin.
NOT: O ve B reaktif flakonları ile ön işlemden geçirilmiş lizat oda sıcaklığında kullanılır; çip üzerindeki LAMP amplifikasyonu 65 °C'de gerçekleştirilir (bkz. adım 3.2.3 ve Tablo 3). - Folyo paketini açın ve çipi düz bir yüzeye yerleştirin.
- Çipi açmak için kapağı saat yönünün tersine döndürün.
- Sıvıyı flakonun dibinde toplamak için O flakonunu hafifçe vurun.
- O flakonunun kapağını açın, nozulu O portuna yerleştirin ve tüm içeriği porta boşaltın.
- O flakonunu atın. Aynı prosedürü B flakonu ve B portu kullanarak tekrarlayın.
- İşlenmiş lizis tüpünü SP cihazından çıkarın ve uç kapağını kaldırın.
- Tüp ucunu S portuyla hizalayın ve tüm lizat hacmini çipe boşaltın.
- Kullanılmış lizis tüpünü atın.
- Tam sızdırmazlık iki duyulabilir tıklama sesiyle onaylanana kadar çip kapağını saat yönünde çevirin.
NOT: Herhangi bir portun eksik yüklenmesi, münferit kanal başarısızlıklarına neden olabilir. Sızdırmazlık işleminden önce tam boşaltmayı onaylayın. Eksik sızdırmazlık ve kontaminasyon risklerini önlemek için kapağı kapatırken PE eldiven giymeyin; bunun yerine lateks veya nitril eldivenler önerilir.
- CD çipi 4 °C'lik depolama alanından çıkarın ve oda sıcaklığında (yaklaşık 25 °C) 10 dk boyunca dengeleyin.
- Cihaz çalıştırılması
- Otomatik nükleik asit analizörüne güç verin. Detect sekmesine dokunun, çip folyo paketindeki barkodu taratın, hasta demografik bilgilerini ve örnek kimliğini girin.
- Çipi döner mile monte edin ve bir tıklama sesi yerleşimi onaylayana kadar aşağı bastırın.
- Start sekmesine dokunun. Cihaz; santrifüj reaktif dağıtımı, manyetik boncuk ekstraksiyonu, 65 °C'de LAMP amplifikasyonu ve floresans kazanımını otonom olarak gerçekleştirir. Çalışma süresi yaklaşık 45 dk'dır (reaktif/örnek yükleme ve cihaz iş akışı Şekil 3'te özetlenmiştir).
NOT: Çalışma sırasında kapağı açmayın.
- Sonuçların yorumlanması
- Yazılım, her bir S şeklindeki amplifikasyon eğrisinin büküm noktasını ikinci türev maksimum analizi ile belirler ve karşılık gelen TP değerini (pozitifliğe kadar geçen süre) raporlar.
- Her bir TP değerini Tablo 4'te listelenen karşılık gelen eşik değerle karşılaştırın. TP değerleri eşik değerde veya altında olan kanalları pozitif, eşik değerin üzerinde olan kanalları ise negatif olarak sınıflandırın.
- İç kontrol kanalının (kuyu 16), 12 dk'nın altında bir TP değerine sahip S şeklinde bir amplifikasyon eğrisi sergilediğini doğrulayın.
- İç kontrol başarısız olursa çalışmayı reddedin. Yeni bir çip kullanarak testi tekrarlayın veya numuneyi yeniden toplayın.
Sonuçlar
Geçerli bir çalışma tamamlandığında, cihaz 16 kanalın tamamı için gerçek zamanlı floresan izlerini görüntüledi. Pozitif kanallar, otomatik olarak açıklanmış TP değerleri ile beklenen S şeklinde amplifikasyon kinetiği sergilerken, negatif kanallar baz hattında kaldı. IC kanalı (kuyu 16), tüm geçerli çalışmalarda TP < 12 min olan S şeklinde bir eğri verdi.
Protokolün pilot uygulaması ve kavram kanıtlama gösterimi olarak, YBÜ pratiğinde karşılaşılan klinik senaryoların kapsamını örneklendirmek amacıyla; 6 bronşiyal aspirat (BAS), 2 bronkoalveoler lavaj sıvısı (BALF) örneği ve 2 derin balgam (Spt) örneği olmak üzere 10 temsili örnek seçilmiştir. Bu örnekler, patojen prevalansını tahmin etmekten ziyade, monomikrobiyal ve kompleks polimikrobiyal vakaları kapsayacak şekilde bilinçli olarak seçilmiştir; 10 örneğin 8'i polimikrobiyal (her birinde 2 ila 7 hedef), 2'si ise monomikrobiyaldir. Tam TP verileri Tablo 5'te sunulmuş ve temsili amplifikasyon eğrileri Şekil 4'te gösterilmiştir.
Karmaşıklık spektrumunun bir ucunda, S1 (BAS) örneği Aspergillus spp. için tek bir pozitif sinyal (TP = 8 min) üretirken, tüm bakteriyel kanallar negatif kalmıştır. Bu örüntü, konvansiyonel kültürün sıklıkla hızlı bir şekilde tespit edemediği bir tanı olan izole invaziv aspergillosis ile tutarlıdır. Benzer şekilde S10 (Spt) örneği, Streptococcus pneumoniae için tek bir pozitif sonuç (TP = 5.5 min) vermiştir. Bu bulgular, analizin 15 patojen hedefi arka planında monomikrobiyal enfeksiyonları tanımlama yeteneğini kanıtlamıştır.
Y intensify bakı kalan örneklerde, yoğun bakım ünitesi hastalarındaki solunum yolu enfeksiyonlarının epidemiyolojisiyle uyumlu olarak polimikrobiyal enfeksiyonlar gözlemlenmiştir. S2–S5 örneklerinin her biri, bir veya daha fazla bakteriyel patojenin yanı sıra Aspergillus spp. ve iki örnekte Candida albicans içermekteydi. En karmaşık örnek olan S5 (BALF); Aspergillus spp., Burkholderia cepacia, Corynebacterium striatum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ve Stenotrophomonas maltophilia dahil olmak üzere yedi eşzamanlı pozitif sinyal üretmiştir. Bu sonuçlar, 16 kuyucuklu mikroakışkan çipin klinik test koşulları altındaki multipleks tespit yeteneğini ortaya koymuştur.
Fungal katılımı olmaksızın bakteriyel ko-enfeksiyonlar içeren S6–S9 örnekleri, çift patojen tespitinden (S6: B. cepacia ve E. coli) dörtlü patojen tespitine (S8: Acinetobacter baumannii, B. cepacia, Klebsiella pneumoniae ve S. maltophilia) kadar çeşitlilik göstermiştir. Tüm 10 numunede, pozitif kanallar için TP değerleri 3.5–9 min arasında değişmiş ve tüm iç kontrol kanalları TP < 12 min şeklindeki önceden tanımlanmış geçerlilik kriterini karşılamıştır.
Bu pilot set için, çip sonuçları aynı 10 örnek üzerinde paralel olarak gerçekleştirilen iki referans yöntemle karşılaştırılmıştır: hedeflenmiş metagenomik yeni nesil dizileme (tNGS) ve geleneksel balgam kültürü. 15 patojen kanalı için hedef başına uyum Tablo 6'da özetlenmiştir. Bu örneklerdeki tüm hedefler için analiz, tNGS'ye kıyasla %10 pozitif yüzde uyumu (PPA) ve %10 negatif yüzde uyumu (NPA) göstermiştir. Balgam kültürüne kıyasla PPA, kültür-pozitif olan her hedef için %10 iken, NPA %4,4 ile %10 arasında değişmiştir; daha düşük NPA değerleri, yanlış pozitiflikten ziyade nükleik asit amplifikasyonunun kültüre göre daha yüksek analitik hassasiyeti ile uyumlu olarak, çip (ve tNGS) tarafından tespit edilen ancak kültürde geri kazanılamayan hedefleri yansıtmaktadır. Kasıtlı olarak seçilmiş küçük örneklem göz önüne alındığında, bu rakamlar pilot kohort için tanımlayıcı uyum tahminleridir ve resmi tanısal doğruluk ölçümleri olarak amaçlanmamıştır. tNGS'nin kendisi nükleik asit tabanlı bir yöntem olduğundan, tNGS ile uyum, her bir organizmanın klinik durumunu belirlemekten ziyade nükleik asit düzeyindeki uyumu doğrular; her iki yöntem de tek başına gerçek enfeksiyonu kolonizasyondan ayırt etmez.
Şekil 1: Mikroakışkan çip mimarisi ve ilgili sarf malzemeleri. (A) Üç eş merkezli bölgeyi (yükleme bölgesi, ara manyetik boncuk saflaştırma bölgesi ve dış amplifikasyon ile deteksiyon bölgesi) gösteren 86 mm'lik disk çipin genel görünümü. (B) 16 reaksiyon kuyucuğunu barındıran dış amplifikasyon halkası (1, 4, 8, 12 ve 16. konumlar belirtilmiştir). (C) Lizis tüpü bileşenleri (uç kapağı, sızdırmazlık kapağı ve tüp gövdesi). (D) Tek dozluk "O" ve "B" reaktif flakonları. (E) "S" örnek kuyucuğunu ve "O" ile "B" reaktif kuyucuklarını gösteren yükleme bölgesi. Kısaltmalar: O = reaktif O; B = reaktif B; S = örnek. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ön işleme kiti ve numune ön işleme iş akışı. (A) Numune, sıvılaştırma tüpüne aktarılır ve manuel çalkalama ile homojenize edilir. (B) Homojenize edilen numune, sıvılaştırma tüpünden lizis tüpüne aktarılır. (C) Lizis tüpü, otomatik sıvılaştırma-lizis döngüsü için numune ön işleme (SP) cihazına yerleştirilir. (D) Ön işleme sarf malzemeleri: #1 ve #2 tek kullanımlık pipetler (kırmızı oklar numune yükleme işaretlerini gösterir), lizis tüpü ve sıvılaştırma tüpü. Kısaltma: SP = Sample preprocessing (Numune ön işleme). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Çip yükleme ve otomatik tespit iş akışı. (A) O reaktif şişesi, B reaktif şişesi ve işlenmiş numune, ilgili çip portlarına (O, B ve S) yüklenir. (B) Çip monte edilir ve mühürlenir. (C) Çip, otomatik nükleik asit analizörüne yerleştirilir ve barkod taranır. (D) Çalıştırma işlemi dokunmatik ekrandan başlatılır; ardından nükleik asit ekstraksiyonu, amplifikasyonu ve floresan tespiti otomatik olarak gerçekleşir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: YBÜ hastalarından toplanan 10 alt solunum yolu örneğinden elde edilen temsili amplifikasyon eğrileri. Her panel tek bir örneği (S1–S10) temsil etmektedir. S şeklinde amplifikasyon eğrileri, açıklanmış TP değerleri ile birlikte pozitif hedefleri; düz izler ise negatif hedefleri göstermektedir. S1 örneği sadece Aspergillus spp. içeriyordu; S2–S5 örnekleri Aspergillus spp. ile birlikte bakteriyel patojenleri ve/veya Candida albicans içeriyordu; S6–S9 örnekleri polimikrobiyal bakteriyel enfeksiyonlar içeriyordu ve S10 örneği sadece Streptococcus pneumoniae içeriyordu. İlgili TP değerleri Tablo 5'te verilmiştir. Kısaltmalar: Aba = Acinetobacter baumannii; Asp = Aspergillus spp.; Bcc = Burkholderia cepacia; Cal = Candida albicans; Cst = Corynebacterium striatum; Eco = Escherichia coli; Hin = Haemophilus influenzae; IC = iç kontrol; Kpn = Klebsiella pneumoniae; Lpn = Legionella pneumophila; Mpn = Mycoplasma pneumoniae; Pae = Pseudomonas aeruginosa; Pji = Pneumocystis jirovecii; Sau = Staphylococcus aureus; Sma = Stenotrophomonas maltophilia; Spn = Streptococcus pneumoniae. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
| Kuyu | Hedef | Kısaltma | Kategori | Tür |
| 1 | Acinetobacter baumannii | Aba | Bakteriler | Bakteri |
| 2 | Aspergillus türleri | Asp | Mantarlar | Mantar |
| 3 | Burkholderia cepacia | Bcc | Bakteriler | Bakteri |
| 4 | Candida albicans | Kalibrasyon | Mantarlar | Mantar |
| 5 | Corynebacterium striatum | Cst | Bakteriler | Bakteri |
| 6 | Escherichia coli | Ekoloji | Bakteriler | Bakteri |
| 7 | Haemophilus influenzae | Hin | Bakteriler | Bakteri |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | Kpn | Bakteriler | Bakteri |
| 9 | Legionella pneumophila | Lpn | Bakteriler | Bakteri |
| 10 | Mycoplasma pneumoniae | Mpn | Atipik | Atipik bakteri |
| 11 | Pseudomonas aeruginosa | Pae | Bakteriler | Bakteri |
| 12 | Pneumocystis jirovecii | Pji | Mantarlar | Mantar |
| 13 | Staphylococcus aureus | Sau | Bakteriler | Bakteri |
| 14 | Stenotrophomonas maltophilia | Sma | Bakteriler | Bakteri |
| 15 | Streptococcus pneumoniae | Spn | Bakteriler | Bakteri |
| 16 | NBPF (iç kontrol) | IC | iç kontrol | İç kontrol |
Tablo 1: Hedef patojen paneli ve reaksiyon kuyucuğu atamaları.
| Sarf Malzemesi | Spesifikasyon / hacim | İşlev |
| Sıvılaştırma tüpü | 2 mL/tüp | Numunenin alındığı tüp; manuel homojenizasyon |
| Lizis tüpü | 0.5 mL/tüp | 20 µm filtre membranlı sıkıştırılabilir silikon gövde; önceden doldurulmuş lizis reaktifleri |
| #1 tek kullanımlık pipet | 0.5 mL | Homojenize edilmiş numuneyi lizis tüpüne aktarır |
| #2 tek kullanımlık pipet | 2 mL | Numuneyi sıvılaştırma tüpündeki işaretli çizgiye kadar aspire eder |
Tablo 2: Örnek ön işleme sırasında kullanılan sarf malzemelerinin özellikleri.
| Adım | Sıcaklık | Süre |
| Sıvılaşma | 50 °C | 10 dk |
| Patojen lizisi | 95 °C | 5 dk |
| Toplam döngü | — | ~15 dk |
Tablo 3: Numune ön işleme (SP) cihazı döngüsünün çalışma parametreleri.
| Hedef | TP eşiği (dak) | Sınıflandırma kuralı |
| Acinetobacter baumannii | 13 | TP ≤ eşik değer = pozitif |
| Aspergillus spp. | 15.5 | TP ≤ eşik değer = pozitif |
| Burkholderia cepacia | 12.5 | TP ≤ eşik değer = pozitif |
| Candida albicans | 13.5 | TP ≤ eşik değer = pozitif |
| Corynebacterium striatum | 13 | TP ≤ eşik değer = pozitif |
| Escherichia coli | 12 | TP ≤ eşik değer = pozitif |
| Haemophilus influenzae | 13.5 | TP ≤ eşik değer = pozitif |
| Klebsiella pneumoniae | 15.5 | TP ≤ eşik değer = pozitif |
| Legionella pneumophila | 14.5 | TP ≤ eşik değer = pozitif |
| Mycoplasma pneumoniae | 14 | TP ≤ eşik değer = pozitif |
| Pseudomonas aeruginosa | 12 | TP ≤ eşik değer = pozitif |
| Pneumocystis jirovecii | 14.5 | TP ≤ eşik değer = pozitif |
| Staphylococcus aureus | 15.5 | TP ≤ eşik değer = pozitif |
| Stenotrophomonas maltophilia | 12 | TP ≤ eşik değer = pozitif |
| Streptococcus pneumoniae | 14.5 | TP ≤ eşik değer = pozitif |
| NBPF (iç kontrol) | 12 | TP ise çalışma geçerlidir < 12 dk |
Tablo 4: Hedef sınıflandırması için kullanılan TP eşik değerleri.
| Numune | Tip | Saptanan hedef | TP (dk) | Kültür / tNGS (okuma) |
| S1 | BAS | Aspergillus spp. | 8 | + / 1,253 |
| S2 | BAS | Aspergillus spp. | 7.5 | – / 3,877 |
| Pseudomonas aeruginosa | 4 | + / 5,039 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6.5 | – / 3,087 | ||
| S3 | BAS | Aspergillus spp. | 5.5 | + / 6,145 |
| Burkholderia cepacia | 6 | – / 3,21 | ||
| Candida albicans | 7.5 | – / 3,280 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | + / 13,189 | ||
| S4 | BALF | Acinetobacter baumannii | 6.5 | + / 10,485 |
| Aspergillus spp. | 7.5 | – / 4,432 | ||
| Burkholderia cepacia | 5.5 | – / 1,676 | ||
| Candida albicans | 8.5 | – / 576 | ||
| S5 | BALF | Aspergillus spp. | 7.5 | + / 2,869 |
| Burkholderia cepacia | 4 | – / 6,532 | ||
| Corynebacterium striatum | 5.5 | – / 71,839 | ||
| Escherichia coli | 7 | – / 1,891 | ||
| Pseudomonas aeruginosa | 4 | + / 31,386 | ||
| Staphylococcus aureus | 6.5 | – / 26,683 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 4 | + / 21,467 | ||
| S6 | BAS | Burkholderia cepacia | 5.5 | – / 1,984 |
| Escherichia coli | 5.5 | + / 8,05 | ||
| S7 | BAS | Acinetobacter baumannii | 5.5 | + / 28,07 |
| Burkholderia cepacia | 4 | + / 3,585 | ||
| Haemophilus influenzae | 6.5 | – / 8,912 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | – / 8,865 | ||
| S8 | BAS | Acinetobacter baumannii | 5.5 | – / 43,721 |
| Burkholderia cepacia | 4 | – / 53,796 | ||
| Klebsiella pneumoniae | 3.5 | + / 23,757 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 4 | – / 26,898 | ||
| S9 | Spt | Haemophilus influenzae | 9 | – / 3,636 |
| Staphylococcus aureus | 8.5 | + / 1,918 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 8.5 | – / 872 | ||
| S10 | Spt | Streptococcus pneumoniae | 5.5 | – / 29,893 |
Tablo 5: Yoğun bakım ünitesi hastalarından toplanan 10 temsili alt solunum yolu örneği için tespit sonuçları ve TP değerleri.
| Hedef | tNGS + | POCT + | tNGS − | POCT − | PPA | NPA | (SC) PPA/NPA |
| Acinetobacter baumannii | 3 | 3 | 7 | 7 | 10% | 10% | 10% / 87.5% |
| Aspergillus spp. | 5 | 5 | 5 | 5 | 100% | 10% | 100% / 71.4% |
| Burkholderia cepacia | 6 | 6 | 4 | 4 | 10% | 100% | 10% / 4.4% |
| Candida albicans | 2 | 2 | 8 | 8 | 10% | 10% | – / 80.0% |
| Corynebacterium striatum | 1 | 1 | 9 | 9 | 10% | 10% | 100% / 10% |
| Escherichia coli | 2 | 2 | 8 | 8 | 10% | 10% | 10% / 8.9% |
| Haemophilus influenzae | 2 | 2 | 8 | 8 | 10% | 10% | – / 80.0% |
| Klebsiella pneumoniae | 1 | 1 | 9 | 9 | 10% | 10% | 100% / 10% |
| Legionella pneumophila | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 10% | – / 10% |
| Mycoplasma pneumoniae | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 10% |
| Pseudomonas aeruginosa | 2 | 2 | 8 | 8 | 10% | 10% | 10% / 10% |
| Pneumocystis jirovecii | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 10% | – / 10% |
| Staphylococcus aureus | 2 | 2 | 8 | 8 | 10% | 10% | 10% / 8.9% |
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | 6 | 4 | 4 | 100% | 10% | 100% / 50.0% |
| Streptococcus pneumoniae | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 10% | – / 90.0% |
Tablo 6: 10 temsili örnek için analiz ile hedeflenmiş metagenomik yeni nesil dizileme (tNGS) ve konvansiyonel balgam kültürü arasındaki hedef başına uyum. 15 patojen hedefinin her biri için, her yöntemle elde edilen pozitif ve negatif sonuçların sayısı ile buna bağlı olarak pozitif yüzde uyumu (PPA) ve negatif yüzde uyumu (NPA) gösterilmiştir. Kısaltmalar: PPA = pozitif yüzde uyumu; NPA = negatif yüzde uyumu; tNGS = hedeflenmiş metagenomik yeni nesil dizileme; pozitif (veya negatif) referans sonuçların mevcut olmadığı durumlarda PPA/NPA ""/" şeklinde gösterilmiştir.
| Hayır. | Patojen | LoD (kopya/mL) |
| 1 | Acinetobacter baumannii | 1,000 |
| 2 | Aspergillus spp. | 2,000 |
| 3 | Burkholderia cepacia | 2,000 |
| 4 | Candida albicans | 1,000 |
| 5 | Corynebacterium striatum | 1,000 |
| 6 | Escherichia coli | 4,000 |
| 7 | Haemophilus influenzae | 2,000 |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | 4,000 |
| 9 | Legionella pneumophila | 2,000 |
| 10 | Mycoplasma pneumoniae | 1,000 |
| 11 | Pseudomonas aeruginosa | 2,000 |
| 12 | Pneumocystis jirovecii | 1,000 |
| 13 | Staphylococcus aureus | 2,000 |
| 14 | Stenotrophomonas maltophilia | 2,000 |
| 15 | Streptococcus pneumoniae | 4,000 |
| 16 | İç kontrol (NBPF) | Uygulanamaz (iç kontrol) |
Tablo 7: Her bir panel hedefi için analitik saptama sınırı (LoD). LoD, negatif bronkoalveoler lavaj sıvısı matrisine eklenen, seri olarak seyreltilen ve üç tekrarlı olarak test edilen dijital-PCR ile miktar tayini yapılmış genomik nükleik asit kullanılarak belirlenmiş ve tekrarların en az %95'inde saptanan en düşük konsantrasyon olarak tanımlanmıştır. Değerler kopya/mL cinsinden ifade edilmiştir. Kısaltma: LoD = saptama sınırı.
| Boyut | POCT (bu analiz) | Balgam kültürü | Konvansiyonel PCR | mNGS |
| Çevrim süresi | ~1 sa | 2–5 gün | 4–8 sa | > 24 sa |
| Operatör becerisi gereklidir | Düşük | Yüksek | Yüksek | Yüksek |
| Laboratuvar gereksinimleri | Düşük; yatak başı | Yüksek; bakteriyoloji laboratuvarı | Yüksek; PCR laboratuvarı | Yüksek; özelleşmiş tesis |
| Ekipman yatırımı | Düşük-orta | Düşük | Orta derece | Yüksek |
| Test başına maliyet | Orta düzeyde | Düşük | Orta düzeyde | Yüksek |
| Analitik duyarlılık | Yüksek | Düşük | Yüksek | Yüksek |
| Temel avantaj | Tam entegre, numune girişli/sonuç çıkışlı, uzmanlık gerektirmeyen işletim | Referans standart; duyarlılığı sağlar | Yüksek hassasiyet; kantitatif | Tarafsız; nadir/beklenmedik patojenleri tespit eder; zor vakaları çözer |
Tablo 8: Mevcut hasta başı testin balgam kültürü, konvansiyonel PCR ve metagenomik sekanslama ile kalitatif karşılaştırması.Yöntemler; sonuçlanma süresi, operatör becerisi gereksinimi, laboratuvar altyapısı gereksinimi, ekipman yatırımı, test başına maliyet, analitik hassasiyet ve temel avantajlar açısından karşılaştırılmıştır. Kısaltmalar: POCT = hasta başı test; PCR = polimeraz zincir reaksiyonu; mNGS = metagenomik yeni nesil sekanslama.
Tartışma
Hızlı patojen tanımlama, yoğun bakım ünitesi (YBÜ) enfeksiyon yönetiminde kritik öneme sahiptir. Burada açıklanan sistem, patojen tanımlama süresini, kültür için tipik olarak gereken 3 ila 5 günden, ilk basamak antimikrobiyal kararlarının genellikle verildiği 1 saatten daha kısa bir süreye indirir7. Nükleik asit ekstraksiyonu, saflaştırma ve 16-plex LAMP amplifikasyonunu tek bir sızdırmaz çip içinde entegre eden bu iş akışı, önceki LAMP çip platformlarının temel operasyonel darboğazı olan manuel DNA ekstraksiyon adımını ortadan kaldırır15. Sonuç olarak, uzmanlaşmış moleküler biyoloji eğitimi olmayan personel tarafından gerçekleştirilebilen tek bir yükleme prosedürü elde edilmiştir.
Birkaç prosedürel husus özel dikkat gerektirir. Numune kalitesi esastır. Orofaringeal kontaminasyonun gerçek patojen sinyalini maskeleyebileceği ventile hastalar için, bronşiyal aspirat veya bronkoalveolar lavaj sıvısı gibi derin solunum örnekleri, ekspektorasyonla elde edilen balgama tercih edilmelidir. Eksik sıvılaştırma, suboptimal lizisin en yaygın nedenidir ve bu nedenle manuel çalkalama, numune açıkça sulu bir kıvama ulaşana kadar devam etmelidir. Çip yüklemesi sırasında, reaktif şişesinin veya lizis tüpünün tamamen boşaltılmaması, sonraki kuyucukların gerekli girdi materyalinden yoksun kalmasına neden olarak negatif sonuçlar şeklinde yanlış yorumlanabilecek kanala özgü başarısızlıklara yol açabilir. Ayrıca, çip kapağının iki kez tıklatılarak kapatılması yalnızca mekanik bir özellik değildir; izotermal amplifikasyon için gereken sızdırmaz baş boşluğunu korumak ve evaporatif kaybı önlemek için gereklidir.
Sorun giderme nispeten kolaydır. Çok yüksek viskoziteli Yoğun Bakım Ünitesi (YBÜ) balgamı, önerilen 1 dk'dan daha uzun süre manuel çalkalama gerektirebilir. Özellikle bronkoalveoler lavaj sıvısı gibi seyreltik örnekler, düşük patojen yoğunluğunu telafi etmek için standart pipetleme hacminin iki katı miktarında yükleme gerektirebilir. S şeklinde bir amplifikasyon eğrisinin yokluğu veya 12 dk'dan büyük bir TP değeri olarak tanımlanan internal kontrol hatası, ya yetersiz örnek hücreselliğine ya da çip içindeki bir sıvı akış hatasına işaret eder. Bu gibi durumlarda uygun yaklaşım, tekil kanalları yeniden yorumlamak yerine yeni bir örnek toplamak veya taze bir çip kullanarak testi tekrarlamaktır.
Bu yöntemin ayrıca önemli sınırlamaları vardır. Panel, önceden tanımlanmış 15 hedefle sınırlıdır ve birçok antimikrobiyal direnç determinantı dahil olmak üzere bu listenin dışındaki organizmalar tespit edilemez. Cins düzeyindeki Aspergillus analizi hariç, her primer seti hedeflenen organizmanın korunmuş, türe özgü bir bölgesini hedefler; bu nedenle panelde temsil edilmeyen türler veya suşlar tespit edilemez ve panel tür içi suş düzeyindeki varyasyonları yakalayamaz. 16 kuyucuğun her biri özel bir liyofilize primer seti içerdiğinden, panel modülerdir ve gelecekteki versiyonlarda hedef eklemek için yeniden yapılandırılabilir.
Analiz çıktısı kalitatifdir. TP değerleri patojen yükü ile gevşek bir ilişki gösterse de, kantitatif kültür sonuçlarının veya döngü eşik değerlerinden türetilen PCR tabanlı tahminlerin yerini tutamaz. Solunum örnekleri üzerinde gerçekleştirilen tüm nükleik asit amplifikasyon testlerinde olduğu gibi, analiz tek başına kolonizasyonu gerçek enfeksiyondan ayıramaz. Bu nedenle klinik yorumlama; çip sonuçlarını, C-reaktif protein ve prokalsitonin gibi inflamatuar belirteçler, görüntüleme bulguları, galaktomannan ve (1,3)-β-D-glukan dahil olmak üzere fungal biyobelirteçler ve genel klinik seyir ile entegre etmelidir. Ayrıca, sistem antimikrobiyal duyarlılık verileri sağlamaz ve bu amaç için konvansiyonel kültür vazgeçilmez olmaya devam etmektedir.
Son olarak, bu çalışmaya dahil edilen tüm örnekler tek bir üçüncü basamak YBYÜ'den alınmıştır ve patojen prevalansı ile ko-enfeksiyon paternleri kurumlar ve hasta popülasyonları arasında farklılık gösterebilir. Bu nedenle, mevcut çalışma, protokolün kasıtlı olarak seçilmiş küçük bir temsilci örnek seti üzerindeki pilot bir kavram kanıtlama gösterimi olarak değerlendirilmelidir; çalışma, tanısal doğruluğu tahmin etmek için tasarlanmamıştır. Hedef başına klinik sensitivite ve spesifite ile geleneksel kültür ve metagenomik yeni nesil dizileme (mNGS) ile sistematik uyum, planlanan prospektif, ardışık olarak kaydedilen, çok merkezli bir çalışmada belirlenecektir.
Analitik performansın bir ön ölçümü olarak, her bir hedef için saptama sınırı (LoD), negatif bir bronkoalveoler lavaj sıvısı matrisine eklenmiş ve dijital-PCR ile miktarı belirlenmiş genomik nükleik asit kullanılarak tahmin edilmiştir. Örnekler seri olarak dilüe edilmiş ve üç tekrarlı olarak test edilmiştir. LoD, tekrarların en az %95'inde saptanan en düşük konsantrasyon olarak tanımlanmıştır. Ortaya çıkan LoD değerleri, panel genelinde 1,0 ile 4,0 kopya/mL arasında değişmiştir (Tablo 7). Bu pilot çalışmada her bir organizmanın koloni sayımına dayalı miktar tayini yapılamadığı için, bu LoD tahminleri gelecek çalışmalarda resmi olarak sayılmış referans suşlar kullanılarak geliştirilecektir.
Mevcut tanı yaklaşımlarıyla yapılan karşılaştırmalar, bu platformun konumunu daha da netleştirmektedir. Konvansiyonel kültür, yavaş olmasına rağmen referans standart olmayı sürdürmekte ve duyarlılık bilgisi sağlamaktadır. Metagenomik yeni nesil sekanslama çok daha geniş bir organizma kapsamı sunar, ancak bu durum önemli ölçüde daha yüksek maliyetler, daha uzun sonuçlanma süreleri (tipik olarak 24–48 h) ve birçok YBÜ'nün yerinde destekleyemeyeceği biyoinformatik gereksinimleri ile beraber gelir9. Standart multipleks PCR panelleri sonuçlanma süresini kısaltır, ancak bunlar genellikle hâlâ ayrı bir nükleik asit ekstraksiyonu ve platforma bağlı olarak ek gecikmelere yol açabilen grup işlemleme gerektirir10.
Maliyet perspektifinden bakıldığında, resmi bir maliyet-etkililik analizi bu pilot çalışmanın kapsamı dışında olsa da platform, kültür ile konvansiyonel veya multipleks PCR dahil olmak üzere YBÜ'deki temel gerçek dünya maliyet belirleyicilerini ele almaktadır (yöntemler arası kalitatif bir karşılaştırma Tablo 8'de sunulmuştur). Sputum kültürü için 2–5 gün, konvansiyonel PCR (genellikle toplu işlem gerektirir) için 4–8 saat ve metagenomik sekanslama için >24 saat ile karşılaştırıldığında, yaklaşık 1 saat içinde sonuç vermektedir. İş akışı tamamen entegre olduğu için (numune girişi, sonuç çıkışı), ayrı bir nükleik asit ekstraksiyonu gerektirmeksizin yalnızca tek bir manuel yükleme adımı gerektirir; özel bir bakteriyoloji veya moleküler laboratuvarı ya da uzman moleküler biyoloji personeli olmadan hasta başında uygulanabilir ve kontaminasyon kaynaklı tekrarlı testleri azaltan kapalı, tek kullanımlık bir kartuş kullanır. Ekipman maliyetleri de mütevazıdır ve gerçek zamanlı kantitatif PCR cihazı veya bir sekanslama platformu ihtiyacını ortadan kaldırır. Kritik durumdaki YBÜ hastaları için bu hızlı sonuçlanma süresi, uygunsuz ampirik tedavi süresini kısaltabilir ve hastanede yatış süresini azaltarak dolaylı ancak potansiyel olarak önemli bir maliyet avantajı sağlayabilir.
Mevcut sistem; hızlı işlem süresi, operasyonel basitlik ve kapalı kartuş biyogüvenliği ile tanımlanan, bu özelliklerin toplamı sayesinde hasta başı uygulamayı mümkün kılan belirgin bir niş doldurmaktadır. Üç fungal hedefin dahil edilmesi özellikle önemli bir özelliktir. Örneklerin 10'unda 5'inde Aspergillus spp. tespit edilmiştir (TP aralığı: 5.5–8 dk). Kültürün bilinen kısıtlamaları ve Aspergillus için galaktomannan testinin sınırlı tanı penceresi göz önüne alındığında5,6, 45 dk içinde elde edilen moleküler bir sinyal, hedeflenmiş antifungal tedavinin daha erken değerlendirilmesine olanak tanıyabilir; ancak bu erken sinyalin klinik değeri prospektif çalışmalarla ortaya konulmalıdır.
Birkaç gelecek yönelim belirgindir. Panelin, en azından karbapenemaz genleri ve mecA gibi temel direnç belirleyicilerini içerecek şekilde genişletilmesi, patojen tanımlama ile ampirik antimikrobiyal seçimi arasındaki boşluğun kapatılmasına yardımcı olacaktır. Ayrıca, TP veri setleri büyüdükçe, eşleştirilmiş amplifikasyon profilleri ve klinik meta veriler üzerinden eğitilen makine öğrenimi modelleri, dikkatli bir prospektif doğrulama gerektirse de, nihayetinde kolonizasyonu gerçek enfeksiyondan ayırmaya yardımcı olabilir. Daha geniş kapsamda, bu platformun tanı performansının genel olarak uygulanabilir kabul edilebilmesi için coğrafi olarak farklı YBÜ popülasyonlarında çok merkezli değerlendirmeler yapılması gerekecektir.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Bulaşıcı Olmayan Kronik Hastalıklar-Ulusal Bilim ve Teknoloji Majör Projesi (No. 2023ZD051650), Ulusal Üst Düzey Hastane Klinik Araştırma Fonu (2026-PUMCH-A-103), CMB Açık Yarışma Programı (24-561) ve Peking Union Medical College Hospital Yetenek Yetiştirme Programı (No.UGG1571).
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Otomatik Nükleik Asit Analizörü | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-T80-01 | TurboFlow T; santrifüjlü reaktif dağıtımı, manyetik boncuk ekstraksiyonu, 65 °C'de LAMP ve gerçek zamanlı floresan deteksiyonu gerçekleştirir (~45 dk çalışma süresi) |
| #1 Tek kullanımlık Pasteur pipeti | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Tek kullanımlık sarf malzemesi; 0.5 mL; homojenize edilmiş örneği lizis tüpüne aktarır |
| #2 Tek kullanımlık Pasteur pipeti | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Tek kullanımlık sarf malzemesi; 2 mL; örneği sıvılaştırma tüpündeki işaretli çizgiye kadar aspire eder |
| CD çipi | Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., Ltd | Custom-made | Tek kullanımlık sarf malzemesi; merkezi yükleme alanı (O, B, S portları), manyetik boncuk saflaştırma bölgesi ve 16 reaksiyon kuyucuğu (15 patojen hedefi + NBPF internal kontrol) bulunan 86 mm disk |
| LAMP reaksiyon reaktifleri | Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | 16730ES80 | CD çipi içerisinde liyofilize boncuklar olarak önceden depolanmış LAMP reaksiyon reaktifleri |
| Sıvılaştırma tüpü | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Tek kullanımlık sarf malzemesi; tüp başına 2 mL; manuel homojenizasyon için örneği alır |
| Lizis tüpü | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Tek kullanımlık sarf malzemesi; tüp başına 0.5 mL; 20 µm filtre membranlı sıkıştırılabilir silikon gövde; önceden yüklenmiş lizis reaktifleri |
| Primerler | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | Custom-made | CD çipi reaksiyon odasına gömülmüş primer karışımı |
| Örnek Ön İşleme cihazı | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-R10-02 | TS-20; otomatik sıvılaştırma–lizis döngüsü (~15 dk) |
| Tek dozluk flakon “B” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Tek kullanımlık sarf malzemesi; önceden paketlenmiş çip içi reaktif; test başına bir adet; 4 °C'de saklanır ve yüklemeden önce oda sıcaklığına (~25 °C) dengelenir |
| Tek dozluk flakon “O” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Tek kullanımlık sarf malzemesi; önceden paketlenmiş çip içi reaktif; test başına bir adet; 4 °C'de saklanır ve yüklemeden önce oda sıcaklığına (~25 °C) dengelenir |
Kaynaklar
- GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990–2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Infect Dis. 2018;18(11):1191-1210.
- Niederman MS, Torres A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220150.
- Weiser JN, Ferreira DM, Paton JC. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 2018;16(6):355-367.
- Reynolds D et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: another pandemic. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220068.
- Schauwvlieghe AFAD et al. Invasive aspergillosis in patients admitted to the intensive care unit with severe influenza: a retrospective cohort study. Lancet Respir Med. 2018;6(10):782-792.
- Meersseman W et al. Galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid: a tool for diagnosing aspergillosis in intensive care unit patients. Am J Respir Crit Care Med. 2008;177(1):27-34.
- Seymour CW et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 2017;376(23):2235-2244.
- Noviello S, Huang DB. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 2019;9(2):37.
- Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 2019;20(6):341-355.
- Hanson KE et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: clinical and diagnostic recommendations from the IDSA's diagnostics committee. Clin Infect Dis. 2020;71(10):2744-2751.
- Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
- Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): the better sibling of PCR? Cells. 2021;10(8):1931.
- Parida M et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 2008;18(6):407-421.
- Ou H et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 2021;10(10):11053-11066.
- Lai JX et al. Rapid detection of bacterial pathogens causing lower respiratory tract infections via microfluidic-chip-based loop-mediated isothermal amplification. J Vis Exp. 2024;(205):e66677.
Yeniden basım ve izinler
Bu makale yayımlandı
Video yakında