Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Erken Senesans Dönemindeki İnsan Fibroblastlarına Telomeraz mRNA Teslimatı için Optimize Edilmiş Ters Transfeksiyon Protokolü

126 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71538

⸱

18 Ağustos 2026

 , 
1Center on the Biology of Aging, and Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu makale, nükleozid modifiyeli insan telomeraz ters transkriptazı (hTERT) mRNA'sının (hTERT mRNA) senesent insan fibroblastlarına verimli bir şekilde iletilmesi için optimize edilmiş bir ters transfeksiyon protokolü sunmaktadır. Kültür yüzeylerinin hTERT mRNA-lipid kompleksleri ile önceden kaplanması alımı artırarak telomeraz aktivasyonunu, telomer uzamasını ve kısmi gençleşmeyi sağlar. Kültürler, sonunda ölümsüzleşme gerçekleşmeden tekrar senesense veya krize girer.

Özet

Hücresel yaşlanma; azalmış membran akışkanlığı, bozulmuş endozomal trafik, azalmış endositik kapasite ve artmış hücre dışı RNaz aktivitesi dahil olmak üzere, mRNA iletimini engelleyen hücresel fizyolojideki derin değişikliklerle ilişkilidir. Bu engeller, özellikle büyük terapötik transkriptlerin iletimi söz konusu olduğunda, yaşlanmış hücrelerde RNA tabanlı yaklaşımların uygulanmasını sınırlamıştır. Bu protokol, modifiye edilmiş haberci RNA'nın (mRNA) yaşlanmış insan fibroblastlarına verimli iletimi için optimize edilmiş bir ters transfeksiyon yöntemini tanımlamaktadır. Model transkript olarak insan telomeraz ters transkriptaz (hTERT) mRNA'sı kullanılmış olsa da, iş akışı diğer mRNA'lar için de geniş ölçüde uygulanabilirdir. RNA-lipid komplekslerinin hücre yapışmasından sonra kültür ortamına eklendiği geleneksel transfeksiyon yöntemlerinin aksine, ters transfeksiyon, kompleksleri hücre ekimi öncesinde kültür yüzeyine yerleştirerek, yapışan hücreler ile transfeksiyon kompleksleri arasında doğrudan etkileşim sağlar. Transfeksiyon verimliliğini maksimize etmek için protokol; psödouridin ve 5-metilsitidin içeren nükleozid-modifiye mRNA, uzatılmış poli(A) kuyrukları, optimize edilmiş kompleks oluşum zamanlaması, RNaz inhibisyonu, klorokin ile endozomal pH'ın geçici olarak yükseltilmesi, artırılmış hücre ekim yoğunluğu ve uzatılmış inkübasyon sürelerini içermektedir. Bu yaklaşım kullanılarak, 5 kb'lık bir hTERT mRNA transkriptinin iletimini takiben yaşlanmış fibroblastlarda yaklaşık %50–80 oranında transfeksiyon verimlilikleri elde edilmiştir. Pik telomeraz aktivitesi, transfeksiyondan 24–48 saat sonra tespit edilmiştir. Tek bir transfeksiyon döngüsü ölçülebilir telomer uzaması sağlarken, üç ardışık transfeksiyon önemli ancak sınırlı bir telomer uzamasıyla sonuçlanmıştır. Azalmış yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz aktivitesi, azalmış p16 ve p21 ekspresyonu, hücre morfolojisinin restorasyonu ve replikatif ömrün uzaması dahil olmak üzere, yaşlanma ile ilişkili fenotiplerin kısmi geri dönüşü 72–96 saat içinde tespit edilebilmiştir. İletilen hTERT mRNA'sı 72–96 saat içinde degrade olmuş ve ölümsüzleşme gözlemlenmemiştir. Bu protokol, yaşlanmış hücrelere geçici mRNA iletimi için pratik bir yaklaşım sunmaktadır ve geniş bir hücre tipi ve tür yelpazesine adapte edilebilir.

Giriş

Ters transfeksiyon yaklaşımı, senesent hücrelerin standart transfeksiyon yöntemleri önünde oluşturduğu temel engelleri aşan kritik bir metodolojik adaptasyonu temsil eder. Hücrelerin önceden plaka üzerine ekildiği ve transfeksiyon kompleksleri eklenmeden önce yapışmalarına izin verildiği ileri transfeksiyonun aksine, ters transfeksiyonda süspansiyondaki hücreler, önceden oluşturulmuş hTERT mRNA-lipid komplekslerinin üzerine doğrudan eklenir. Bu teknik, membran yeniden şekillenmesinin en aktif olduğu kritik yapışma aşamasında transfeksiyon komplekslerine maruz kalmayı maksimize ederek, senesent hücrelerdeki transfeksiyon verimliliğini önemli ölçüde artırır.

Protokolün temel kavramsal değişikliği, yaşlı (senesent) hücreleri sadece genç hücrelerin transfekte edilmesi zor versiyonları olarak değil, ayrı bir iletim problemi olarak ele almaktır. Senesens sırasında fosfolipidler, sfingolipidler ve kolesterol dahil olmak üzere membran lipid kompozisyonundaki global değişiklikler; membran akışkanlığını, eğriliğini ve protein-lipid etkileşimlerini değiştirirken, senesensle ilişkili sekretuar fenotipe de katkıda bulunur1,2,3. Senesent hücreler ayrıca, kısmen amphiphysin-1'in aşağı düzenlenmesi ve caveolin ekspresyonundaki kompanzatuar değişiklikler tarafından tetiklenen, reseptör aracılı alımı ve sinyal iletimini körelten; azalmış klatrin ve caveolae aracılı reseptör endositozuna ve değişmiş endositik yönlendirmeye sahiptir4,5,6. Paralel olarak, Rab7 tarafından düzenlenen geç endozom-lizozom ekseni ve daha geniş endozomal-otofajik-lizozomal (EAL) ağ düzensizleşir; Rab7, yaşlanma ve nörodejenerasyonda bozulmuş olan endolizozomal olgunlaşma ve otofagozom-lizozom füzyonunun ana kontrolcüsü olarak görev yapar7.

Senesent hücreler, TFEB/TFE3 tarafından yönlendirilen lizozomal biyogenez ve şaperon aracılı otofaji dahil olmak üzere lizozomal işleme ve adaptasyon sisteminin (LYPAS) birçok bileşenini yaygın olarak yukarı düzenleyerek lizozomal kütleyi artırırlar. Bununla birlikte, münferit lizozomlar sıklıkla yükselmiş lüminal pH, membran hasarı ve değişmiş proteolitik kapasite sergileyerek, sayıca artmalarına rağmen lizozomal disfonksiyona katkıda bulunurlar8,9,10,11. Toplu olarak bu değişiklikler, internalize edilen materyalin degradatif endolizozomal kompartmanlara daha verimli bir şekilde yönlendirilmesine yol açarak, iletilen RNA veya proteinin üretken sitozolik salınım gerçekleşmeden önce degrade edilme olasılığını artırabilir9,10,11. Ters transfeksiyon, membranların yeniden şekillendiği en erken pencereyi, yani adezyon sırasında doğrudan hedefleyerek, hücreler ile mRNA-lipid kompleksleri arasında sürdürülen, yüksek aviditeli bir teması zorlar ve tam adezif senesent hücrelerdeki bozulmuş kararlı durum endositozunu en azından kısmen baypas eder4,5,6,12.

RNA tasarımı tarafında protokol, yaşlanma bağlamında basit bir kapak + kuyruk temel hattının yetersiz olduğunu varsayar: translasyonu endozomal Toll benzeri reseptör algılamasından ve tip I interferon indüksiyonundan ayırmak için tam nükleozid modifikasyonu (örneğin, psödouridin veya N1‑metilpsödouridin artı 5‑metilsitidin) pazarlık edilemez bir gereklilik olarak ele alınır. Temel çalışmalar, modifiye nükleozidlerin RNA'ya dahil edilmesinin TLR3, TLR7 ve TLR8 aktivasyonunu baskıladığını ve dendritik hücre sitokin üretimini belirgin şekilde azalttığını göstermiş olup, güncel nükleozid modifiyeli mRNA platformlarının azalmış doğuştan gelen immünojenitesi için mekanistik bir temel sağlamıştır13. mRNA–LNP aşıları ve mRNA ilaçları üzerine yapılan daha güncel incelemeler, doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonunu minimize ederken in vivo stabiliteyi ve translasyonu artırmak için 5′ kapağının, UTR'lerin, kodlama dizisinin ve poli(A) kuyruğunun koordineli mühendisliğinin önemini vurgulamaktadır14. Özellikle, poli(A) kuyruk uzunluğu ve mimarisi, in vitro transkribe edilen mRNA stabilitesinin ve translasyonel çıktısının temel belirleyicileri olarak ortaya çıkmış ve terapötik mRNA'larda genişletilmiş veya mühendislik ürünü poli(A) tasarımlarını teşvik etmiştir15.

Buna ek olarak, protokol; kompleks oluşumu ve hücreye alım sırasında hücre dışı ve endozomal RNazlara karşı korumayı ve klorokin16,17 gibi geçici bir lizozomotropik ajan kullanılarak tanımlanmış bir endozomal kaçış penceresini açıkça yapılandırmaktadır. Klorokin, uzun süredir endozomal bariyerlerin fonksiyonel bir probu olarak kullanılmaktadır ve endozomal membran yıkımını ve nükleik asit kargosunun sitozole kaçışını teşvik ederek, siRNA veya antisense oligonükleotidlerin hedef etkileşimini ve susturma kapasitesini belirgin şekilde artırabilmektedir18. Aynı zamanda, LNP ile iletilen mRNA'nın canlı hücre ve süper-çözünürlük görüntülemeleri; üretken iletimin, başlangıçtaki hücreye alımdan ziyade, erken/geri dönüşümlü endozomlardan gerçekleşen nadir kaçış olayları nedeniyle ciddi şekilde kısıtlandığını göstermiş ve bu durum mRNA terapötikleri için bilinçli bir endozomal kaçış basamağı tasarlamanın önemini vurgulamıştır19.

Toplamda, membran dinamikleri, endositik trafik, lizozomal işlemleme ve doğal bağışıklık aktivasyonundaki bu yaşlanma ile ilişkili değişiklikler, etkili mRNA iletiminin önünde önemli engeller oluşturur. Burada açıklanan ters-transfeksiyon stratejisi; optimize edilmiş mRNA mühendisliği, RNase koruması, geliştirilmiş endozomal kaçış ve tutunan hücrelerin önceden oluşturulmuş mRNA-lipid komplekslerine doğrudan maruz bırakılmasını birleştirerek bu kısıtlamaları gidermek amacıyla geliştirilmiştir. Model kargo olarak hTERT mRNA kullanılmış olsa da, bu iş akışı diğer büyük terapötik mRNA transkriptlerinin yaşlı ve transfeksiyona dirençli hücre popülasyonlarına iletimi için geniş ölçüde uygulanabilir20,21,22.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. hTERT mRNA'nın In vitro Transkripsiyonu

  1. In vitro Transkripsiyon (IVT) (ARCA ve ΨUTP ile)
    1. Tablo 1'e göre 20 µL'lik bir IVT reaksiyonu hazırlayın. Daha yüksek verim gerekiyorsa reaksiyonu lineer olarak ölçeklendirin.
    2. T7 RNA polimeraz hariç tüm reaksiyon bileşenlerini RNaz içermeyen bir tüpte birleştirin. T7 RNA polimerazı en son ekleyin, nazikçe karıştırın ve tüpü kısaca santrifüjleyin.
    3. Reaksiyonu 37 °C'de 0,5–4 sa boyunca inkübe edin.
      NOT: İnkübasyon süresini kalıp uzunluğuna göre ayarlayın. Daha kısa kalıplar (yaklaşık 500 bp) içeren reaksiyonları yaklaşık 30 dk ve daha büyük kalıplar (yaklaşık 4 kb) içeren reaksiyonları 3–4 sa inkübe edin.
  2. DNaz işlemi
    1. 1 µL RNaz içermeyen DNaz I'i doğrudan IVT reaksiyon karışımına ekleyin.
    2. Reaksiyonu 37 °C'de 15 dk inkübe edin.
      NOT: DNaz işlemi, sentezlenen mRNA'nın ön purifikasyonu yapılmadan doğrudan IVT reaksiyonu içerisinde gerçekleştirilmelidir.
  3. mRNA purifikasyonu
    1. Reaksiyon karışımını seyreltmek için 115 µL nükleaz içermeyen H₂O ekleyin.
    2. Üretici talimatlarına uygun olarak bir RNA temizleme kiti kullanarak mRNA'yı purifiye edin.
    3. Purifiye edilen mRNA'yı 20–30 µL nükleaz içermeyen H₂O ile elüe edin.
    4. mRNA saflığını spektrofotometri ile ölçün ve RNA bütünlüğünü %1,0–1,5'lik denatüre agaroz jel veya düşük yüzdeli poliakrilamid jel üzerinde elektroforez ile doğrulayın.
  4. Poly(A) kuyruk ekleme
    1. Tablo 2'ye göre 50 µL'lik bir poly(A)-kuyruk ekleme reaksiyonu hazırlayın. Reaksiyon bileşenlerini nazikçe karıştırın ve 37 °C'de 30–60 dk inkübe edin.
      NOT: İnkübasyon süresini kullanılan RNA miktarına göre ayarlayın.
    2. 2 µL 0,5 M EDTA (pH 8,0) ekleyerek reaksiyonu sonlandırın.
  5. Final purifikasyon ve kalite kontrol
    1. Üretici talimatlarına uygun olarak bir RNA temizleme kiti kullanarak poly(A) kuyruklu mRNA'yı purifiye edin.
    2. Purifiye edilen mRNA'yı 20–30 µL nükleaz içermeyen H₂O ile elüe edin.
    3. Transfeksiyona geçmeden önce mRNA kalitesini değerlendirin
      1. mRNA konsantrasyonunu 260 nm'de ölçün ve A260/A280 ve A260/A230 oranlarını kullanarak saflığı belirleyin. A260/A280 değerleri yaklaşık 2,0 ve A260/A230 değerleri 2,0'dan büyük olan mRNA preparatlarını kullanın.
      2. Üretici talimatlarına uygun olarak jel elektroforezi veya bir RNA analiz sistemi kullanarak mRNA bütünlüğünü değerlendirin.
      3. Poly(A) kuyruk uzunluğunu RT-PCR veya Bioanalyzer analizi ile konfirme edin. Poly(A) kuyruk uzunluğunun 120 ile 200 nükleotit arasında olduğunu doğrulayın.
      4. Dondurma-çözme döngülerini minimize etmek için purifiye edilen mRNA'yı alikotlara ayırın ve alikotları −80 °C'de saklayın.

2. Ters transfeksiyon

  1. Gün −1: Transfeksiyon öncesi hazırlık
    1. Senesent fenotipini doğrulayın
      1. Temsili bir hücre örneği üzerinde senesansla ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal) boyaması gerçekleştirin. Hücrelerin %70'inden fazlasının pozitif olduğunu doğrulayın.
      2. Senesans markerlarının (p16 ve p21) ekspresyonunu qRT-PCR veya immunofloresans ile konfirme edin.
      3. Hücre canlılığını belirleyin ve canlılığın %90'ın üzerinde olduğunu doğrulayın.
    2. Reaktifleri hazırlayın
      1. Tam kültür besiyerini 37 °C'ye önceden ısıtın.
      2. Fosfat tamponlu salini (PBS) 37 °C'ye önceden ısıtın.
      3. Taze Opti-MEM I besiyeri hazırlayın.
        NOT: Kullanımdan önce Opti-MEM I içerisine RNaz inhibitörü eklemeyin.
  2. Gün 0: Transfeksiyon günü
    NOT: Reaktif hazırlığından transfekte edilen hücrelerin inkübasyonuna kadar yaklaşık 3 saat süre tanıyın.
    1. hTERT mRNA hazırlığı
      1. hTERT mRNA'sını buz üzerinde çözdürün. mRNA konsantrasyonunu ölçün ve 0,5 ile 1,0 µg/µL arasındaki konsantrasyonlara sahip preparatları kullanın.
      2. İstenen miktardaki hTERT mRNA'sını, kullanılan kültür formatına göre (Tablo 3) Opti-MEM I içerisinde dilüe edin. 0,5–1,0 U/µL son konsantrasyona ulaşacak şekilde RNaz inhibitörü ekleyin ve nazikçe karıştırın.
      3. Dilüe edilmiş mRNA'yı kompleks oluşumuna kadar buz üzerinde tutun.
        NOT: RNaz inhibitörünü kullanımdan hemen önce ekleyin. mRNA'yı RNaz inhibitörü ile birlikte saklamayın, çünkü dondurulduktan sonra aktivitesi azalır.
    2. Transfeksiyon reaktifi hazırlığı
      1. Steril RNaz-free bir tüpte 6,0 µL transfeksiyon reaktifini 100 µL Opti-MEM I ile birleştirin. Pipetleme yaparak nazikçe karıştırın.
      2. Karışımı oda sıcaklığında 5 dk inkübe edin.
        NOT: Büyük hTERT mRNA konstrüktları (~5 kb) için reaktif-mRNA oranlarını, 100 ng mRNA başına 0,4 ile 0,6 µL reaktif arasında optimize edin.
    3. mRNA-Lipid kompleks oluşumu
      1. Dilüe edilmiş hTERT mRNA çözeltisini (100 µL), dilüe edilmiş transfeksiyon reaktifi çözeltisine (106 µL) ekleyin. 5–6 kez pipetleyerek nazikçe karıştırın.
      2. Karışımı oda sıcaklığında 15–20 dk inkübe edin.
      3. Kompleksleşme süresini 30 dakikadan fazla uzatmayın.
      4. Hafif bulanık bir çözelti oluşumuyla başarılı kompleks oluşumunu doğrulayın.
        NOT: Hücre hazırlığını kompleksleşme süresi boyunca gerçekleştirin.
    4. Ters transfeksiyon için hücre hazırlığı
      1. Senesent hücre kültürlerinden kültür besiyerini aspire edin.
      2. Hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile bir kez yıkayın (6 kuyucuklu plakanın her kuyucuğu için 2 mL).
      3. Kuyucuk başına 500 µL %0,05 trypsin-EDTA ekleyin.
      4. Hücreleri 37 °C'de 3–5 dk inkübe edin.
      5. Trypsin'i, serum içeren 3 mL tam besiyeri ile nötralize edin.
      6. Tek hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri nazikçe triture edin.
      7. Hemositometre veya otomatik hücre sayıcı kullanarak hücre sayısını belirleyin.
      8. Tam besiyeri içerisinde, kuyucuk başına 2,0–2,5 × 105 hücre içeren bir süspansiyon hazırlayın.
        NOT: Senesent hücreler mekanik strese karşı oldukça hassas olduğundan uzun süreli tripsinizasyondan kaçının. Hücreleri süspansiyonda tutun; ters transfeksiyondan önce ön ekleme (pre-plating) yapmayın.
    5. Ters transfeksiyon
      1. Kültür plakası hazırlığı
        1. 6 kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna 500 µL %0,01 poly-L-lysine ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dk inkübe edin.
        2. Kaplama çözeltisini kullanımdan hemen önce aspire edin.
        3. Her kuyucuğun merkezine 200 µL hTERT mRNA-lipid kompleksi ekleyin.
        4. Plakayı 37 °C ve %5 CO₂ altında 30 dk inkübe edin.
          NOT: Plaka kaplamasını kompleks oluşumu ve hücre hazırlığı ile paralel olarak gerçekleştirin.
      2. Hücre süspansiyonu hazırlığı
        1. 2,0–2,5 × 105 hücreyi 1800 µL antibiyotiksiz tam besiyeri içinde süspanse edin.
        2. Homojen bir tek hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri nazikçe yeniden süspanse edin.
          NOT: Transfeksiyon sırasında antibiyotiksiz besiyeri kullanın.
      3. Hücrelerin kompleksler üzerine ekilmesi
        1. 1800 µL hücre süspansiyonunu doğrudan önceden oluşturulmuş hTERT mRNA-lipid komplekslerinin üzerine ekleyin.
        2. Hücrelerin eşit dağılması için plakayı her yöne 2–3 kez nazikçe eğin.
          NOT: Hücre eklemesinden sonra süspansiyonu pipetlemeyin, çünkü bu durum mRNA-lipid komplekslerini bozabilir.
      4. Hücre inkübasyonu
        1. Hücreleri %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 6–8 saat inkübe edin.
        2. Transfeksiyondan 2–3 saat sonra hücre tutunmasını ışık mikroskobu ile izleyin.
        3. Hücrelerin eşit dağıldığını ve kültür yüzeyine tutunmaya başladığını doğrulayın.
          NOT: Aşırı sayıda yüzen hücre veya hücresel debris, transfeksiyonla ilişkili sitotoksisiteye işaret edebilir.

3. Sitotoksisitenin azaltılması

  1. Hücre kaybı %20'yi aşarsa, transfeksiyon maruziyet süresini 48 s saate düşürün.
  2. Hücre sağkalımını artırmak için transfeksiyon süresince kültürleri 10 µM ROCK inhibitörü Y-27632 ile destekleyin.
  3. Transfeksiyondan 6–8 s sonra, kısmen yapışmış hücreleri minimum düzeyde rahatsız ederek transfeksiyon ortamını dikkatlice aspire edin. Her kuyucukta yaklaşık 100 µL kalıntı ortam bırakın.
  4. Her kuyucuğa, %15 FBS ile desteklenmiş 1 mL taze, önceden ısıtılmış tam büyüme ortamı ekleyin.
  5. Ortam değişiminden hemen sonra klorokinle nihai konsantrasyonu 10–20 µM olacak şekilde ekleme yapın.
  6. Kültürleri, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 2 s daha inkübe edin.
  7. Klorokin içeren ortamı taze tam büyüme ortamı ile değiştirin.
  8. Kültürleri büyümenin devam etmesi için inkübatöre geri yerleştirin.
    NOT: Toparlanma dönemi boyunca hücre morfolojisini ve canlılığını izleyin. Aşırı hücre kopması veya debris oluşumu, transfeksiyonla ilişkili sitotoksisiteye işaret edebilir.

4. Transfeksiyon sonrası analiz

  1. Transfeksiyondan 24–48 saat sonra TERT protein ekspresyonunu değerlendirin.
  2. Standart laboratuvar prosedürlerine göre western blotting veya immünofloresan boyama ile TERT protein seviyelerini ölçün.
  3. Aynı zaman aralığında uygun bir telomeraz aktivite testi kullanarak telomeraz aktivitesini ölçün.
    NOT: Geçici olarak iletilen hTERT mRNA'nın yıkımı nedeniyle telomeraz aktivitesi tipik olarak 48 saatten sonra azalır.
  4. Transfeksiyondan 48–72 saat sonra monokrom multipleks kantitatif PCR (MMqPCR) veya eş değer bir telomer uzunluğu analiz yöntemi kullanarak telomer uzunluğunu değerlendirin.
    NOT: Başarılı hTERT mRNA iletimini takiben saptanabilir telomer uzaması gözlemlenebilir.
  5. Transfeksiyondan 7 gün sonra senesansla ilişkili ve gençleşmeyle ilişkili fenotipleri değerlendirin
    1. Senesansla ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesini ölçün.
    2. p16 ve p21 ekspresyon seviyelerini ölçün.
    3. Ki67 ekspresyonunu değerlendirin.
    4. Hücresel morfolojiyi ışık mikroskobu ile inceleyin.
      NOT: Senesansla ilişkili fenotiplerdeki ve proliferatif özelliklerdeki değişiklikleri değerlendirmek için işlem görmüş kültürleri, işlem görmemiş veya yalancı transfekte edilmiş senesent kontrollerle karşılaştırın.

5. Tekrarlanan dozlama protokolü (Opsiyonel)

  1. Bölüm 2–4'te açıklandığı şekilde ilk transfeksiyonu gerçekleştirin.
  2. Transfeksiyonları şu takvime göre tekrarlayın: 0. Gün: İlk transfeksiyon; 5. Gün: İkinci transfeksiyon; 10–12. Gün: Üçüncü transfeksiyon.
  3. Hücreleri adherent kültürler olarak sürdürün ve sonraki transfeksiyonlardan önce tripsinizasyon yapmayın.
  4. Bölüm 2.2.1–2.2.3'te açıklandığı şekilde taze hTERT mRNA–lipid kompleksleri hazırlayın.
  5. Her kuyucuktaki kültür ortamını aspire edin.
  6. Her kuyucuğa doğrudan 200 µL hTERT mRNA–lipid kompleksi ekleyin.
  7. Kompleks eklemesinin hemen ardından 800 µL taze komplet F-10 medyumu ekleyin.
  8. Hücreleri %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 4–6 sa boyunca inkübe edin.
  9. Transfeksiyon medyumunu taze komplet medyum ile değiştirin.
    NOT: Kümülatif transfeksiyona bağlı sitotoksisiteyi minimize etmek için işlemi en fazla üç transfeksiyon döngüsü ile sınırlandırın.

6. Forward transfeksiyon protokolü (2 µg/mL, 6 kuyucuklu format)

  1. Gün −1: Hücre ekimi
    1. %0,05 trypsin-EDTA kullanarak senesen veya erken senesen fibroblastları ayırın.
    2. Trypsini tam kültür besiyeri ile nötralize edin.
    3. Hücre sayısını ve canlılığını belirleyin.
    4. Hücreleri, kuyuk başına 2,0–2,5 × 105 hücre yoğunluğunda 6 kuyucuklu plakalara ekin.
    5. Hücreleri, yaklaşık %60–80 konflüenseye ulaşana kadar %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde, 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.
  2. Gün 0: hTERT mRNA–reaktif komplekslerinin hazırlanması
    1. Nükleozid modifiyeli hTERT mRNA'nın bir alikvotunu buz üzerinde çözdürün.
    2. hTERT mRNA'yı, steril RNaz-free bir tüpte (Tüp A) Opti-MEM ile 2 µg/mL nihai konsantrasyona kadar seyreltin.
    3. Tüp A'ya 0,5–1,0 U/µL nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde RNaz inhibitörü ekleyin ve nazikçe karıştırın.
    4. Transfeksiyon reaktifini, ikinci bir RNaz-free tüpte (Tüp B) 100 ng mRNA başına 0,4–0,6 µL reaktif kullanacak şekilde Opti-MEM ile seyreltin.
    5. Tüp B'nin içeriğini, nazikçe karıştırarak damla damla Tüp A'ya ekleyin.
    6. Karışımı oda sıcaklığında 15–20 dk inkübe edin.
  3. Gün 0: İleri transfeksiyon
    1. Hücrelerin %60–80 konflüenste olduğunu ve sağlıklı morfoloji sergilediğini doğrulayın.
    2. Kültür besiyerini aspire edin.
    3. Hücreleri 1–2 mL önceden ısıtılmış PBS ile bir kez yıkayın.
    4. Her kuyucuğa 0,5 mL önceden ısıtılmış tam veya serumu azaltılmış besiyeri ekleyin.
    5. İsteğe bağlı olarak, 10–20 µM nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde klorokin ekleyin.
    6. Adım 6.2.6'da hazırlanan hTERT mRNA–reaktif komplekslerinden 0,5 mL'yi her kuyucuğa ekleyin.
    7. Komplekslerin eşit dağılması için plakayı nazikçe sallayın.
    8. Hücreleri %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde, 37 °C'de 4–6 saat inkübe edin.
      ​NOT: Senesen hücreler için gerekliyse inkübasyon süresini 6–8 saate uzatın.
    9. Transfeksiyon besiyerini aspire edin.
    10. Her kuyucuğa 2,0 mL taze tam besiyeri ekleyin.
    11. Bölüm 4'te açıklandığı şekilde transfeksiyon sonrası analizleri gerçekleştirin.
      NOT: İleri ve ters transfeksiyon koşullarını karşılaştırırken aynı hTERT mRNA lotunu, transfeksiyon reaktifini ve nominal dozu kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

d2EGFP-T2A-hTERT modRNA, destabilize edilmiş bir EGFP (d2EGFP) raporunun, kendi kendini kesen bir T2A peptidi aracılığıyla insan TERT'e bağlandığı hibrit bir açık okuma çerçevesi olarak tasarlanmıştır. Tüm konstrüktların tam nükleotid ve protein dizileri Ek Dosya 1'de verilmiştir. Translasyonel verimliliği ve mRNA stabilitesini artırmak için kodlama dizisi, sentetik bir 5′ çevrilmeyen bölge (UTR) ve insan β-globinin 3′ UTR'si ile çevrelenmiştir (Şekil 1A). Ekspresyon kaseti ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, hücresel senesansı proliferatif fizyolojinin küçük bir varyasyonu yerine belirgin bir iletim problemi olarak yeniden çerçeveler ve senesent durumun biyofiziksel ve immünolojik kısıtlamalarına uygun bir telomeraz mRNA transfeksiyon stratejisi geliştirir. Senesent hücreler, katılaşmış, kolesterolce zenginleşmiş membranlar ve azalmış endositik aktivite sergileyerek nükleik asit iletiminin verimliliğinin önünde önemli bir engel oluştururlar. Ters-transfeksiyon yaklaşımını benimseyen bu protokol, senesent hücreler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

J.M.S., Transposon Therapeutics'in kurucu ortağı ve SAB başkanıdır.

Teşekkürler

Bu çalışma, JS'ye verilen P01 AG051449, R01 AG016694 ve R01 AG078925 numaralı Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibeleri tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ham's F-10 Besin KarışımıThermo Fisher11550043Hücre kültürü medyumu.
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Kep Yapısı AnaloğuNew England BiolabS1411LÇoğu RNA için kep yapısı stabiliteyi artırır, ekzonükleaz yıkımına karşı duyarlılığı azaltır ve mRNA başlama komplekslerinin oluşumunu destekler.
5-Metil-Sitidin-5´-Trifosfat (5-Metil-CTP)New England BiolabN0432SModifiye NTP'ler, in vitro transkripsiyon RNA'ları için immünojeniteyi azaltmak amacıyla yaygın olarak kullanılır.
6 Kuyucuklu PlakaCorning351146Bağımsız deneysel koşullarda, orta ila büyük hacimdeki adherent veya süspansiyon hücrelerini büyütmek ve işleme tabi tutmak için.
Anti-Ki67 antikoru (SP6)abcamab16667Ki67 esas olarak proliferasyon halindeki hücrelerde eksprese edilir.
Hücresel Senesans Analiz Kiti (SA-beta-gal Boyama) cellbiolabsCBA-230 SA-β-gal boyama analizi ile senesent hücrelerin tanımlanması
DNA LoBind 0.5ml TüplerEppendorf 022431005DNA ve RNA'nın herhangi bir kayıp olmadan verimli bir şekilde geri kazanılması için
DNA LoBind 1.5ml TüplerEppendorf22431021DNA ve RNA'nın herhangi bir kayıp olmadan verimli bir şekilde geri kazanılması için
DNase I, RNase-free (1 U/μL)Thermo FisherEN0521RNase-free DNase I, tek ve çift sarmallı DNA'yı sindiren bir endonükleazdır. 
E. coli Poly(A) PolimerazNew England BiolabM0276SEscherichia coli'de, Poly(A) Polimeraz I (PAP I), öncelikle RNA moleküllerinin 3' ucuna kalıptan bağımsız olarak adenozin monofosfat (AMP) kalıntılarının eklenmesi için bir katalizör görevi görür.
Fetal Bovin SerumThermo FisherA5256701Hücre kültürü serum takviyesi 
HiScribe T7 ARCA mRNA KitiNew England BiolabE2065SHiScribe T7 ARCA mRNA Kiti (kuyruklama ile), in vitro ortamda ARCA kepli ve poly(A) kuyruklu mRNA'ların hızlı üretimi için tasarlanmıştır. Kepli mRNA'lar, T7 RNA Polimeraz kullanılarak Anti-Reverse Cap Analoğu'nun (ARCA) ko-transkripsiyonel entegrasyonu ile sentezlenir.
CleanCap Reagent AG İçeren HiScribe T7 mRNA KitiNew England BiolabE2080SCleanCap Reagent AG içeren HiScribe T7 mRNA Kitleri, reaksiyon başına tipik olarak ≥90 μg verimle bir veya birden fazla transkriptin hızlı ve kolaylaştırılmış üretimini sağlar,
LongAmp Hot Start Taq DNA PolimerazNew England BiolabM0534SLongAmp Hot Start Taq DNA Polimeraz, uzun amplikonlarla olağanüstü performans sunar.
M-MuLV Ters TranskriptazNew England BiolabM0253LM-MuLV Ters Transkriptaz, kalıp olarak ya RNA (cDNA sentezi) ya da tek sarmallı DNA kullanarak bir primerden başlayan tamamlayıcı bir DNA sarmalı sentezler.
Monarch Spin RNA Temizleme Kiti (50 μg)New England BiolabT2040LMonarch® Spin RNA Temizleme Kiti'nin (50 μg) temel işlevi, enzimatik reaksiyonlardan veya ekstraksiyon karışımlarından 50 μg'a kadar yüksek kaliteli RNA'yı saflaştırmak ve konsantre etmektir.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England BiolabE2621LNEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix, fragman uzunluğu veya uç uyumluluğuna bakılmaksızın birden fazla DNA fragmanının sorunsuz bir şekilde birleştirilmesine olanak tanır. Kullanım kolaylığı, esnekliği ve basit master-mix formatı sayesinde sentetik biyoloji topluluğunun yanı sıra birden fazla fragmanın tek adımda klonlanmasında da fayda sağlar. 
Opti-MEM - Azaltılmış Serum MedyumuThermo Fisher31985070Lipid-yük kompleks oluşumu sırasında hücre transfeksiyon verimliliğini maksimize etmek için. Memeli hücrelerini yüksek canlılıkta tutarken standart serum takviyesi ihtiyacını azaltan, optimize edilmiş ve kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam görevi görür
PBS, pH 7.4Thermo Fisher10010023pH 7.4'teki Fosfat Tamponlu Salin'in (PBS) temel fonksiyonel kullanımı, memeli hücreler ve biyolojik moleküller için stabil bir pH ve ozmotik denge sağlamaktır.
PCR ŞeritleriThermo FisherAB0776PCR şerit tüplerinin (genellikle 8'li veya 12'li şerit formatında) temel fonksiyonel kullanımı, yüksek kapasiteli termal döngüler sırasında küçük hacimli sıvı reaksiyonlarını tutmaktır.
Poly-L-Lysine HidrobromürMillipore SigmaP4707-50MLHücre yapışması için Poly-L-Lysine (PLL) Hidrobromür'ün temel fonksiyonel kullanımı, yüksek yapışkanlığa sahip, pozitif yüklü bir substrat oluşturmak için negatif yüklü katı yüzeyleri (cam veya plastik gibi) kaplamaktır.
Pseudouridine-5´-Trifosfat (Pseudo-UTP- ΨUTP)New England BiolabN0433SPseudouridine-5´-Trifosfat (Pseudo-UTP), in vitro transkripsiyon RNA'ları için immünojeniteyi azaltmak amacıyla yaygın olarak kullanılır.
Ribonükleotid Çözelti SetiNew England BiolabN0450LATP, GTP, CTP ve UTP'den oluşan dört ayrı çözelti
ROCK inhibitörü Y-27632 (Dihidroklorür)Stem cell technologies72302Y-27632, Rho-ilişkili, coiled-coil içeren protein kinazın (ROCK) hücreye nüfuz edebilen, yüksek etkili ve seçici bir inhibitörüdür. Y-27632, katalitik bölgeye bağlanma için ATP ile yarışarak hem ROCK1'i (Ki = 220 nM) hem de ROCK2'yi (Ki = 300 nM) inhibe eder 
RT-PCR Derecesinde SuThermo FisherAM9935RT-PCR Derecesinde Suyun (genellikle Nükleazdan Arındırılmış Su olarak adlandırılır) temel fonksiyonel kullanımı, herhangi bir kontaminasyonun örneği bozacağı veya amplifikasyonu inhibe edeceği hassas enzimatik analizler için ultra saf çözücü olarak hizmet etmektir.
SUPERase·In RNase İnhibitörü Thermo FisherAM2694SUPERase In RNase İnhibitörü, RNase A, B, C, 1 ve T1 dahil olmak üzere en yaygın ve sorunlu RNase'lere kovalent olmayan şekilde bağlanan ve onları inhibe eden, insan dışı kökenli protein tabanlı bir inhibitördür.
SYBR Green I Nükleik Asit Jel BoyasıThermo FisherS7563SYBR™ Green I Nükleik Asit Jel Boyası'nın temel fonksiyonel kullanımı, agaroz veya poliakrilamid jellerdeki çift sarmallı DNA'yı (dsDNA) görselleştirmek ve kantifiye etmektir.
TransIT-mRNA Transfeksiyon KitiMirusbio/ Millipore SigmaMIR 2250Büyük RNA'lar için yüksek verimli, düşük toksisiteli bir transfeksiyon reaktifi
TRAPeze Telomeraz Tespit KitiMillipore Sigma S7700 TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) analizi, memeli hücrelerinde ve doku örneklerinde telomeraz aktivitesini tespit etmek ve ölçmek için yaygın olarak kullanılan hassas, PCR tabanlı bir yöntemdir. Üç ana adımdan oluşur: telomerik tekrarların telomeraz tarafından uzatılması, bu ürünlerin PCR kullanılarak amplifikasyonu ve ardından tespiti.
Trypsin-EDTA (0.05%), fenol kırmızısıThermo Fisher25300054Rutin hücre pasajlama (subkültür) ve hasat sırasında adherent memeli hücreleri kültür kaplarından ayırmak için.

Kaynaklar

  1. Millner A, Atilla-Gokcumen GE. Lipid players of cellular senescence. Metabolites. 2020;10(9):339.
  2. Hamsanathan S, Gurkar AU. Lipids as regulators of cellular senescence. Front Physiol. 2022;13:796850.
  3. Das UN. Cell membrane theory of senescence and the role of bioactive lipids in aging and aging-associated diseases and their therapeutic implications. Biomolecules. 2021;11(2):241.
  4. Shin EY, Soung NK, Schwartz MA, Kim EG. Altered endocytosis in cellular senescence. Ageing Res Rev. 2021;68:101332.
  5. Park JS, et al. Down-regulation of amphiphysin-1 is responsible for reduced receptor-mediated endocytosis in senescent cells. FASEB J. 2001;15(9):1625-1627.
  6. Park SC. Functional recovery of senescent cells through restoration of receptor-mediated endocytosis. Mech Ageing Dev. 2002;123(8):917-926.
  7. Stroupe C. This is the end: regulation of Rab7 nucleotide binding in endolysosomal trafficking and autophagy. Front Cell Dev Biol. 2018;6:129.
  8. Curnock R, et al. TFEB-dependent lysosome biogenesis is required for senescence. EMBO J. 2023;42(9):e111241.
  9. Guerrero-Navarro L, Jansen-Durr P, Cavinato M. Age-related lysosomal dysfunctions. Cells. 2022;11(12):1977.
  10. Tan JX, Finkel T. Lysosomes in senescence and aging. EMBO Rep. 2023;24(11):e57265.
  11. Rovira M, et al. The lysosomal proteome of senescent cells contributes to the senescence secretome. Aging Cell. 2022;21(10):e13707.
  12. Kilroy G, Burk DH, Floyd ZE. High-efficiency lipid-based siRNA transfection of adipocytes in suspension. PLoS One. 2009;4(9):e6940.
  13. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  14. Freund I, Eigenbrod T, Helm M, Dalpke AH. RNA modifications modulate activation of innate Toll-like receptors. Genes (Basel). 2019;10(2):92.
  15. Chen H, et al. Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA. Nat Biotechnol. 2025;43(2):194-203.
  16. Alshehri A, Grabowska A, Stolnik S. Pathways of cellular internalisation of liposome-delivered siRNA and effects on siRNA engagement with target mRNA and silencing in cancer cells. Sci Rep. 2018;8(1):3748.
  17. Paramasivam P, et al. Endosomal escape of delivered mRNA from endosomal recycling tubules visualized at the nanoscale. J Cell Biol. 2022;221(2):e202110137.
  18. Pandey E, Harris EN. Chloroquine and cytosolic galectins affect endosomal escape of antisense oligonucleotides after Stabilin-mediated endocytosis. Mol Ther Nucleic Acids. 2023;33:430-443.
  19. Bettinger T, et al. Peptide-mediated RNA delivery: a novel approach for enhanced transfection of primary and post-mitotic cells. Nucleic Acids Res. 2001;29(18):3882-3891.
  20. Granados-Riveron JT, Aquino-Jarquin G. Engineering of the current nucleoside-modified mRNA-LNP vaccines against SARS-CoV-2. Biomed Pharmacother. 2021;142:111953.
  21. Hou X, Shi J, Xiao Y. mRNA medicine: recent progresses in chemical modification, design, and engineering. Nano Res. 2024;17(10):9015-9030.
  22. Ramunas J, et al. Transient delivery of modified mRNA encoding TERT rapidly extends telomeres in human cells. FASEB J. 2015;29(5):1930-1939.
  23. Majewska J, Krizhanovsky V. Immune surveillance of senescent cells in aging and disease. Nat Aging. 2025;5(8):1415-1424.
  24. Ajoolabady A, et al. Hallmarks and mechanisms of cellular senescence in aging and disease. Cell Death Discov. 2025;11(1):364.
  25. Lin J, et al. RNA and protein degradation in the aging process. Cell Signal. 2025;136:112166.
  26. Anderson BR, et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Res. 2010;38(17):5884-5892.
  27. Sugawara S, et al. RNaseH2A downregulation drives inflammatory gene expression via genomic DNA fragmentation in senescent and cancer cells. Commun Biol. 2022;5(1):1420.
  28. Chatterjee S, Kon E, Sharma P, Peer D. Endosomal escape: a bottleneck for LNP-mediated therapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(11):e2307800120.
  29. Li YY, Tay FR. The epigenetic rejuvenation promise: partial reprogramming as a therapeutic strategy for aging and disease. Ageing Res Rev. 2026;115:103009.
  30. Zhang W, Qu J, Liu GH, Belmonte JCI. The ageing epigenome and its rejuvenation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(3):137-150.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Senesent FibroblastlarhTERT mRNANükleozit Modifiyeli mRNARNaz İnhibisyonuEndozomal pH ModülasyonuTelomer UzamasıReplikatif Yaşam Süresi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.