Mendel Randomizasyonu, Kololokalizasyon, Özet Veri Temelli Mendel Randomizasyonu ve İlaç Tahmini Kullanarak Kalp Yetmezliği Hedeflerinin Araştırılması

Özet

Bu çalışma, genetik analiz yoluyla kalp yetmezliği için sekiz potansiyel ilaç hedefi belirlemiş ve bu belirlenen hedeflerle ilişkili aday terapötik bileşikleri incelemiştir.

Özet

Kalp yetmezliği (HF), ileri aşamalarında yaşam kalitesini önemli ölçüde düşüren yaygın bir kardiyovasküler hastalıktır. Mevcut çeşitli tedavi stratejilerine rağmen, HF'nin hastalık yükü önemli olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, yeni terapötik hedeflerin keşfedilmesi acil bir şekilde gereklidir. Bu çalışma, ilaç kullanılabilir genler ile HF arasındaki nedensel ilişkileri değerlendirmek için Mendel randomizasyonu (MR) kullandı. Kolokalizasyon analizi ve özet veri tabanlı Mendel randomizasyonu (SMR) ile bu ilişkileri daha da doğrulamak için yapıldı. Son olarak, HF için 8 potansiyel terapötik hedef belirlendi; bunlar arasında 4 risk faktörü (CYP11A1, GALT, KCNH2 ve METRN) ve 4 koruyucu faktör (APOM, CHD4, IL11RA ve LPAR5) yer aldı. GO zenginleştirme, KEGG zenginleştirme ve protein-protein etkileşimi (PPI) ağ analizi, bu genlerin esas olarak metabolik düzenleme ve kardiyak elektrofizyolojik süreçlerde yer aldığını göstermiştir. Ayrıca, bu hedefleri hedef alan potansiyel ilaçlar, ilaç tahmini ve moleküler ikiştirme ile belirlendi; bunlar arasında mitotane, adehl, benzofuranlar, 1,3-Di-o-tolilguanidin, 96-69-5 ve bromoenol lakton bulundu. Ayrıca, PCR sonuçları mitotanın CYP11A1 ve KCNH2 ile ilişkili olabileceğini göstermiştir. Bu potansiyel terapötik hedeflere dayanarak tasarlanan ilaçlar, daha yüksek başarı oranları sunabilir ve klinik sonuçları iyileştirebilir.

Giriş

Kalp yetmezliği (HF), ventriküler dolgunun bozulması veya miyokard kasılmalarıyla tanımlanan yaygın bir kardiyovasküler sendromdur ve metabolik ihtiyaçları karşılamak için yetersiz kalp^{çıkışına yol açar 1,2,3}. Klinik olarak, HF akciğer ve sistemik tıkanıklık, doku hipoperfüzyonu ve nefes nefesi, yorgunluk ve periferik ödem gibi^{semptomlarla karakterize edilir 1,4,5}. Terapötik gelişmelere rağmen, HF dünya genelinde hastalık ve ölüm nedenlerinin önde gelen nedenlerinden biri olmaya devam ediyor ve Global Burden of Disease (GBD)^{çalışması} 6,7,8'e göre 64 milyondan fazla kişiyi etkili. Önemli hastalık yükü, yeni terapötik stratejilere acil ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır.

HF için mevcut farmakolojik ve cihaz tabanlı müdahaleler, optimal olmayan etkinlik ve yan etkiler nedeniyle sınırlıdır; bu da sürekli yüksek yeniden hastaneye yatış oranlarına ve yaşam kalitesinin düşmesine katkıda^bulunur 9,10,11,12. Bu nedenle, HF patogeneziyle nedensel bağlantıları olan yeni moleküler hedeflerin tespit edilmesi, klinik sonuçların iyileştirilmesi açısından kritiktir. Genomiklerin ilaç keşfine entegre edilmesi, verimliliği artırmak için son derece etkili bir strateji temsil eder; çünkü genetik olarak doğrulanmış tedaviler klinik denemelerde önemli ölçüde daha yüksek başarı oranı^{göstermektedir} 13,14,15. Ayrıca, bu uygulanabilir genler tarafından kodlanan proteinler hem küçük moleküller hem de monoklonal antikorlar için başlıca terapötik hedefler^{olarak hizmet eder 16,17}.

İnsan genetiğindeki son gelişmeler, genom çapında ilişki çalışmalarının (GWAS) ve ifade nicel özellik lokuslarının (eQTL) verilerinin entegre analiziyle ilaç hedeflerinin önceliklendirilmesini kolaylaştırmıştır. Mendel randomizasyonu (MR), genetik varyantları nedensel etkileri tahmin etmek için araçsal değişkenler olarak kullanır ve gözlemsel çalışmalarda bulunan karıştırıcı ve ters nedenselliği en aza^{indirir 13,14}. Kolokalizasyon ve özet tabanlı MR (SMR) ile birleştiğinde, bu yaklaşım, modülasyonu hastalık riskini etkileyebilecek genlerin sağlam önceliklendirilmesini sağlar ve hedef keşif için genetik olarak dayandırılmış^{bir strateji sunar} 18,19,20. Geleneksel ilişki çalışmalarına kıyasla, MR, SMR ve kololokalizasyonun entegrasyonu, karışık ve ters nedenselliği aşarak sağlam nedensel çıkarımlar oluşturur. Ayrıca, bu çerçeve, gen ekspresyonu ve kalp yetmezliği riskinin aynı temel nedensel varyantı paylaşmasını sağlayarak bağlantı dengesizliğinden kaynaklanan yanlış pozitif sinyalleri filtreleyerek hedef önceliklendirmeyi optimize eder. Kardiyovasküler dokular yüksek özgüllük sergilese de, bu çalışmanın öncelikle istatistiksel gücü en üst düzeye çıkarmak için büyük ölçekli kan cis-eQTL verilerini kullandığı belirtilmelidir. Bu yaklaşım, HF'nin dokuya özgü mekanizmalarını tam olarak yakalamasa da, kan kaynaklı varyantlar erişilebilir biyobelirteçler olarak hizmet verir ve hastalığın sistemik genetik sürücüleri hakkında sağlam bilgiler sağlar.

Bu çalışmada, ilaçlanabilir genlerin HF riski üzerindeki nedensel etkilerini değerlendirmek için büyük ölçekli GWAS ve eQTL veri setleri kullanıldı. Önemli ilişkiler, kolokalizasyon ve SMR analizleriyle daha da doğrulandı. Önceliklendirilen hedeflerin biyolojik işlevlerini aydınlatmak için Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri ile birlikte protein-protein etkileşimi (PPI) ağ analizleri gerçekleştirildi. Terapötik potansiyel daha sonra ilaç tahmini ve moleküler ikişlenme yoluyla değerlendirildi. Son olarak, seçilen ilaçlanabilir genler ile aday ilaçlar arasındaki ilişkiler in vitro deneylerle doğrulandı.

Sonuç olarak, bu çalışma HF için yeni terapötik hedeflerin keşfi için önemli içgörüler sunmaktadır. MR, SMR, kololokalizasyon analizi, gen zenginleştirme analizi, PPI ağ inşası, ilaç tahmini, moleküler kenetlenme ve in vitro deneyler kullanılarak bu bulgular, HF için daha etkili terapötik stratejilerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan tüm veri setleri, daha önce yayımlanmış çalışmalardan etik onayla alınmıştır. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Çalışma tasarımı

Bu çalışmanın iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. İlk olarak, ilaç kullanılabilir genlerin cis-eQTL'lerinden maruziyet verileri elde edildi. İkinci olarak, ilaç uygulanabilir genler ile HF arasındaki nedensel ilişkiyi incelemek için MR analizi yapıldı. HF için aday terapötik hedefler daha sonra kolokalizasyon ve SMR analizleriyle belirlendi. Daha sonra gen zenginleştirme analizi ve PPI ağ inşası yapıldı. Son olarak, ilaçların genlere olan yakınlığını incelemek için ilaç tahmini ve moleküler kesim yapıldı.

2. Veri kaynağı

Toplamda iki kaynaktan 6.888 ilaçlanabilir gen tanımlandı. Bir veri setinde, daha önce yayımlanmış ve birden fazla veri kaynağını entegre eden 4.463 gen yer^{alıyordu 17}. Diğer veri seti ise İlaç-Gen Etkileşim Veritabanı'ndan (DGIdb)^21'den 5.012 gen içeriyordu. Detaylı bilgiler web sitesinde (https://www.dgidb.org/) yer almıştır. Kopyalar birleştirilip çıkarıldıktan sonra, analiz için 6.888 benzersiz ilaç kullanılabilir gen tutuldu.

Cis-eQTL verileri, 31.684 kan örneğinden alınan ifade profillerini içeren ve 16.987 geni kapsayan eQTLGen Konsorsiyumu'ndan (https://eqtlgen.org/cis-eqtls.html)^{alınmıştır.}

HF özet istatistikleri, 37.653 vaka ve 462.695 kontrol tabanını içeren FinnGen^{veritabanı 23'ün} R12 sürümünden alındı. HF tanısı, ICD-10—I11.0, I13.0, I13.2, I50, ICD-9—4029B|428 ve ICD-8—42700|42710|428|7824 gibi uluslararası hastalıklar sınıflandırmasına dayanmıştır. Tüm katılımcılar Avrupa kökenliydi. Detaylı bilgiler FinnGen web sitesinde ve orijinal makalede (https://www.finngen.fi/en/access_results) mevcuttur.

3. Mendel rastgeleleştirme analizi

Enstrümantal değişkenler (IV) üç temel MR^{varsayımına göre seçilmiştir 24}. İlk olarak, damar yolu doğrudan maruziyet faktörleriyle ilişkilidir. İkincisi, IV'ler karıştırıcı faktörlerle ilişkili değildir. Son olarak, IV'ler sonucu sadece maruziyete göre etkiler. Proksimal eQTL'lerin hedef genler üzerinde daha hızlı ve sağlam bir düzenleyici kontrol uyguladığı göz önüne alındığında, MR yalnızca genlerin 100 kb bölgesinde bulunan SNP'leri kullanarak biyolojik yakınlığı en üst düzeye çıkardı. SNP seçimi için sıkı kriterler uygulandı. Seçilen tüm SNP'ler, her ilaçlanabilir genin transkripsiyon başlangıç noktasının 100 kb yukarısında ve transkripsiyon son noktasının 100 kb aşağısında bulunuyordu. Sadece genom genelinde öneme sahip SNP'ler (p < 5×^10-8)^{dahil edildi 25}. Bağlantı dengesizliğini (LD) en aza indirmek için, LD kümelenmesi 0.001^r2 eşiği ve 10.000 kb²⁶ kümelenme mesafesi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. F-istatistikli >10 olan SNP'ler şu formülle hesaplanarak korundu: F = [R²(N−k−1)]/[k(1−R²)^]27. SNP bilgileri Ek Tablo 1'de sağlanmıştır.

Birincil analitik yöntemler ters varyans ağırlıklı (IVW) ve Wald oranıydı. 0.05'in altında olan bir p-değeri istatistiksel olarak^{anlamlı olarak kabul edildi (28,29}). Yanlış Bulma Oranı (FDR) p-değerini ayarlamak için uygulandı ve yanlış pozitif sonuçları^{en aza indirildi 30}. Sadece bir SNP mevcut olduğunda, Wald oranı yöntemi kullanıldı; aksi takdirde IVW uygulandı. Analizler MR-Egger, ağırlıklı medyan, ağırlıklı mod ve yeterli SNP olduğunda basit mod içeriyordu.

Cochran's Q testi ve MR-Egger kesici analizi heterojenlik ve pleiotropiyi test etmek için kullanıldı. 0.05'ten büyük Q-p-değeri, heterojenlik^31'in yokluğunu göstermiştir. MR-Egger kesişimi için p-değeri 0.05'ten küçüktü, yönsel pleiotropi^18'in varlığını gösterdi. Son olarak, sonuçların tek bir SNP tarafından etkilenip etkilenemeyeceğini test etmek için bir dışarıda bırak testi yapıldı. MR analizleri, R'deki TwoSampleMR paketi (sürüm 0.6.11) kullanılarak (sürüm 4.4.2) gerçekleştirildi.

4. Kolokalizasyon analizi

Kolokasyon analizi, paylaşılan genetik varyantların hem gen ifadesini hem de HF^{riskini 32} etkileyip etkilemediğini belirlemek için coloc R paketi (sürüm 6.0.1) kullanılarak gerçekleştirildi. Bir SNP'nin herhangi bir özellikle ilişkili olma olasılıkları sırasıyla 1 × ^10-4 ve 1 × ^10-5 olarak ayarlanmıştı. Beş hipotezin arka olasılıkları hesaplanabilir: (1) PPH0: SNP'ler iki özellikle bağlantılı değildir. (2) PPH1/PPH2: SNP'ler gen ekspresyonu veya HF ile ilişkilidir. (3) PPH3: SNP'ler HF ve gen ifadesi ile bağlantılıdır, ancak farklı SNP'ler tarafından yönlendirilirler. (4) PPH4: SNP'ler HF ve gen ifadesi ile bağlantılıdır ve yaygın SNP'ler tarafından yönlendirilirler. PPH4 > 0.8, kolokalizasyon için kanıt olarak kabul edildi.

5. SMR analizi

SMR analizi, gen ile HF arasındaki ilişkiyi SMR yazılımı (sürüm 1.3.1) kullanılarak incelemek için yapılmıştır^. Bağımlı aletlerde heterojenlik (HEIDI) testi, gözlemlenen ilişkilerin bağlantıdan kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için gerçekleştirildi. Anlamlı bir SMR p-değeri (< 0.05) ile HEIDI p-değeri > 0.05 birleştiğinde, gerçek nedensel ilişkiyi destekleyen kanıt olarak yorumlandı, bağlantı senaryosundan kaynaklanan bir ilişki değil. Ayrıntılı operasyonel protokoller ve hesaplama ayarları resmi web sitesinden erişilebilir.

6. Zenginleştirme analizi

GO ve KEGG zenginleştirme analizi, taranan potansiyel terapötik hedef genlerin biyolojik fonksiyonlarını ve yollarını karakterize etmek^{için kullanılmıştır 34}. GO zenginleştirmesi biyolojik süreçleri (BP), moleküler fonksiyonları (MF) ve hücresel bileşenleri (CC) içeriyordu. R paket clusterProfiler (sürüm 4.14.6) ve Pathview (sürüm 1.46.0) zenginleştirme^{analizini yürütmek için kullanıldı 35,36}.

7. Aday ilaç tahmini

Potansiyel terapötik bileşikleri belirlemek için, ilaç tahmin analizi İlaç İmzaları Veritabanı (DSigDB) (http://dsigdb.tanlab.org/DSigD Bv1.0/⁾³⁷ kullanılarak gerçekleştirilmiştir. DSigDB'ye 22.527 gen seti dahil edilmiştir; bunların 17.389'u 19.531 geni kapsayan benzersiz bileşikler bulunmaktadır. Aday genler ile bileşikler arasındaki ilişkiler analiz edildi, ardından HF ile ilişkili genleri hedefleyen potansiyel olarak ilgili ilaçları belirlemek için zenginleştirme analizi yapıldı.

8. Protein etkileşim ağı inşası

Protein-protein etkileşimi (PPI) ağları GeneMANIA (https://genem ania.org/)³⁸ kullanılarak inşa edilmiştir. GeneMANIA, gen fonksiyonu hipotezleri oluşturmaya, gen listelerini analiz etmeye ve fonksiyonel testler için genleri önceliklendirmeye yardımcı olabilir.

9. Moleküler kenetlenme

Genlerin ilaçlanabilirliğini ve ilaç adaylarıyla ilişkisini doğrulamak için moleküler ikişlama yapıldı. Bağlama simülasyonları, bileşikler ile hedef proteinler arasındaki bağlanma eğilimi ve etkileşim desenlerini değerlendirmeye yardımcı olur; böylece aday önceliklendirme ve optimizasyonu sağlar. Protein yapıları Protein Veri Bankası'ndan (PDB) (http://www.rcsb.org/) alındı, bileşik yapılar ise PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)^39'dan alındı. Kenetlenme, kör kenetlenme ^40,41'i yönlendirmek için boşluk algılamasını kullanan CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php) kullanılarak gerçekleştirildi. Ayrıntılı çalışma prosedürleri ve hesaplama ayarları bilgileri resmi web sitesinden edinilebilir.

10. Hücre kültürü

İnsan ölümsüzleştirilmiş kardiyomiyosit hücreleri (AC16), steril koşullarda AC16 hücreye özgü kültür ortamında kültürlendi. Hücreler, %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C'de tutuldu. Kültür ortamı her 2–3 günde bir değiştirildi ve hücreler optimal büyüme koşullarını korumak için yaklaşık %70–%80 birleşimde geçiş yapıldı. Hücre morfolojisi ve birleşim, her deneyden önce ışık mikroskobu ile rutin olarak izlendi. Tüm hücre kültürü prosedürleri, kontaminasyon riskini en aza indirmek için bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmiştir. Aranma deneyleri için, AC16 hücreleri 6 kuyu plakalarına tohumlanarak tedavi uygulamasından önce gece boyunca yapışmasına izin verildi.

11. Nicel Ters Transkripsiyon PCR (RT-PCR)

AC16 hücreleri, yaklaşık %60–%70 birleşime ulaştıktan sonra 24 saat boyunca 200 μM palmitik asit (PA) veya 20 μM mitatan ile işlendi. PA, sığır serum albümininde (BSA) çözünürken, mitotan dimetil sülfüksite (DMSO) içinde çözünmüştür. Tüm potansiyel tehlikeli reagentler, eldiven ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla standart laboratuvar güvenlik prosedürlerine uygun şekilde ele alındı.

İşlemin ardından, üreticinin talimatlarına uygun olarak RNA ekstraksiyon kiti ile RNazsız koşullarda toplam RNA çıkarma kiti alındı. RNA ayrışmasını en aza indirmek için mümkün olduğunca buz üzerinde RNA çıkarma prosedürleri yapıldı. RNA konsantrasyonu ve saflığı sonraki deneylerden önce değerlendirilmiş ve sonraki analizlerde yalnızca A260/A280 oranı 1.8 ile 2.0 arasında olan örnekler kullanılmıştır.

Tamamlayıcı DNA (cDNA), üreticinin protokolüne göre ters transkripsiyon kiti kullanılarak sentezlenmiştir. Nicel RT-PCR daha sonra gerçek zamanlı PCR tespit sisteminde SYBR Green Master Mix kullanılarak gerçekleştirildi. Her reaksiyon, 5 μL SYBR Green Master Mix, 0.4 μL ön astar, 0.4 μL ters primer, 1 μL cDNA şablonu ve 3.2 μL nukleazsız su içeren 10 μL nihai hacimde hazırlandı. Amplifikasyon aşağıdaki döngü koşullarında gerçekleştirildi: başlangıçta 95 °C'de 30 saniye denatürasyon, ardından 95 °C'de 5 saniye boyunca 40 döngü denatürasyon ve 30 saniye boyunca 60 °C'de tavlama/uzatma. Her deney üç biyolojik kopya ile gerçekleştirildi ve tüm reaksiyonlar üçlü olarak gerçekleştirildi.

GAPDH dahili referans gen olarak kullanıldı ve CYP11A1 ile KCNH2'nin göreli mRNA ifade seviyeleri 2^−ΔΔCt yöntemiyle hesaplandı. Erime eğrisi analizinde tek bir zirve, spesifik amplifikasyonun göstergesi olarak kabul edildi. RT-PCR için kullanılan primer dizileri, Ek Tablo 2'de listelenmiştir.

Sonuçlar

Mendel rastgeleleştirme
İlaç uygulanabilir gen ekspresyonu ile HF arasındaki nedensel etkileri değerlendiren MR sonuçları, Ek Tablo 3'te sunuldu. FDR'ye göre ayarlanmış P değeri 0.05'ten küçük ise istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. HF ile önemli nedensel ilişkiye sahip toplam 11 gen tanımlandı (Şekil 2). Bunlar arasında, CDKN1A (P_FDR: 0.03, OR: 1.293), CYP11A1 (P_FDR: 0.034, OR: 1.494), GALT...

Tartışma

Bu araştırma, MR kullanılarak ilaçlanabilir genlerin HF riski üzerindeki nedensel etkilerini sistematik olarak değerlendirerek sekiz potansiyel terapötik hedef belirlemiştir. Bunlar arasında dört koruyucu faktör (APOM, CHD4, IL11RA ve LPAR5) ve dört risk faktörü (CYP11A1, GALT, KCNH2 ve METRN) yer alıyordu. Bu ilişkiler, kolokalizasyon analizi ve SMR ile daha da desteklendi. GO, KEGG zenginleştirmesi ve PPI ağ analizleriyle yapılan fonksiyonel açıklamalar, bu genlerin öncelikle metaboliz...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix	Abclonal	RK21203
AC16	HyCyte	TCH-C119
AC16 hücre özelinde kültür ortamı	HyCyte	TCH-G119
cDNA ters kiti	Abclonal	RK20400
CFX96™ Gerçek Zamanlı sistem	Bio-Rad Laboratories
Mitotan	TargetMol	T1199
Palmitik asit	TargetMol	T2908
RNA ekstraksiyon kiti	Abclonal	RK30120