Caenorhabditis elegans'ta embriyonik ölümcüllük oranının nicelendirilmesi

Özet

Bu protokol, Caenorhabditis elegans'ta embriyonik ölümlülük oranını nicelendirmek için basit ve düşük maliyetli bir prosedür sunar. Özel ekipman veya solucan toplama uzmanlığı olmadan popülasyonlar arasında embriyonik anormalliklerin doğrudan tespit edilmesini sağlar. Protokol, genetik mutasyonların, RNA girişimiyle yapılan gen çökerliklerinin ve diyetin etkilerini nicelendirmek için kullanılabilir.

Özet

Embriyonik ölümcüllük, Caenorhabditis elegans araştırmalarında toksik maruziyetler ve genetik mutasyonlar gibi faktörlerden kaynaklanan gelişimsel kusurları karakterize etmek için kullanılan temel fenotiplerden biridir. Bu nedenle, embriyonik ölümcüllüğün nüfuzunu doğru şekilde nicelendirmek, bu bozulmaların hayvan gelişimi üzerindeki mekanizmalarını ve etkilerini anlamak için kritik öneme sahiptir. Otomatik puanlama platformları mevcut olmasına rağmen, bu yaklaşımlar genellikle önemli finansal yatırımlar ve özel donanım veya yazılım gerektirir. Bu makale, embriyon ölümcüllüğünü başarıyla yumurtadan çıkamayan embriyoların yüzdesini ölçerek nicelikten ölçen düşük teknolojili, düşük maliyetli bir testi tanımlar. Özellikle, bu testin bu versiyonu solucan kazmasına olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve yeni başlayanlar için son derece uygundur. Bu yaklaşımın ek bir avantajı, her teknik testin birden fazla hayvandan gelen neslleri çoğaltmasıdır; böylece tek solucan testlerinin potansiyel önyargılarından kaçınır. Bu protokol, fenotip nüfuzunu doğru şekilde yakalamak için gereken minimum nesil sayısı ve metodolojinin gerekçesi gibi kritik parametrelerin tartışılmasını içerir. Son olarak, test testini RNA girişimi, farmakolojik tedaviler veya besin takviyeleri yoluyla gen knockdown'un etkilerini değerlendirmek için uyarlama konusunda rehberlik sağlıyor ve C. elegans araştırmacılarının araç setine çok yönlü ve erişilebilir bir araç ekliyor.

Giriş

Embriyonik ölümcüllük, genlerin ve çevresel faktörlerin erken gelişimdeki rollerini değerlendirmek için kritik bir fenotiptir. C. elegans, değişmez hücre soyunu, şeffaf vücudu ve hızlı yaşam döngüsü sayesinde gelişim süreçlerini incelemek için güçlü bir^modeldir. C. elegans embriyonik ölümcüllüğü, kimyasal, farmakolojik, beslenmesel ve genetik bozulmalar 2,3,4,5 altında gelişimsel bütünlüğü değerlendirmek için kullanılabilir. Bu nedenle, embriyonik ölümlülük oranını doğru şekilde niceleyen erişilebilir ve çok yönlü yöntemler araştırma topluluğuna fayda sağlayacaktır.

Embriyogenezi inceleyen gelişmiş yüksek verimli ve yüksek içerikli yöntemler, genellikle önemli finansal yatırımlar gerektiren özel görüntüleme sistemleri ve yazılımlarına^{dayanır 4,6,7}; daha basit yüksek verimli yaklaşımlar ise esas olarak niteliksel okumalar^{sağlar 8,9}. Klasik yöntemler ise, genellikle bireysel hermafroditlerin solucan kazmasıyla tekrar tekrar aktarılmasını içeren manuel ve düşük maliyetli bir yaklaşım kullanır ve tüm yavrunun embriyonik ölümcüllüğünü^{değerlendirir.} Ancak, bu yöntem yeni başlayanlar için teknik olarak zor olabilir ve sınırlı ölçeklenebilirliğe sahiptir. Ayrıca, klasik yavru boyutuna dayalı testler, tek bir annenin neslinde embriyonik yaşamıcılığı nicelikle ölçüyor ve bu da istemeden önyargı yaratabilir.

Bu yöntemin genel amacı, embriyonik canlılığı orta verimlilikte nicelikten ölçmek için alternatif, basit, maliyet etkin ve çok yönlü bir yaklaşım sunmaktır. Bu yöntem, bir çoğaltmada birden fazla hayvanın neslinde embriyonik ölümcüllük oranlarını ölçür, solucan kazma kullanılmasını gerektirmez ve herhangi bir özel ya da pahalı ekipmandan kaçınır. Çalışma ayrıca, yöntemin RNA girişimi ve ilaç veya besin testi gibi yaygın bozulmalara nasıl uygulanabileceğini gösteriyor.

Protokol

1. C. elegans bakımı

NOT: C. elegan'ın yetiştiriciliğiyle ilgili ayrıntılı rehberlik WormBook^11'de bulunabilir.

1. Bakım Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakalarını hazırlayın.
   1. 1 L NGM yapmak için, 3 g NaCl, 2,5 g bakteriyolojik pepton ve 17 g agar 2 L şişede birleştirin. 975 mL damıtılmış su ve bir karıştırma çubuğu ekleyin, ardından 121 °C'de 20 dakika otoklav yapın.
   2. Ortamı su banyonunda 55 °C'ye kadar soğutun. Şişeyi bir karıştırma tabağına yerleştirin ve aseptik teknikle 25 mL 1 M potasyum fosfat tamponu ve 1 mL her biri 1 mL ekleyin: 1 M_{MgSO 4}, 1 M CaCl₂ ve 5 mg/mL kolesterol. Her 100 mm plakaya yaklaşık 25 mL döküm.
2. Gece boyunca E. coli OP50 kültürleri hazırlayın.
   1. Aseptik teknikle, 1 L Erlenmeyer şişesini haciminin beşte birine (200 mL) LB ortamıyla doldurun. Ortamı, steril aşılama döngüsü kullanarak tek bir E. coli OP50 kolonisiyle aşılayın. Gece boyunca 37 °C'de yörünge sallayıcısında 200 rpm'de kuluçka yapın.
3. Tohum NGM bakım plakaları E. coli OP50 (Şekil 1A).
   1. E. coli OP50 kültürünü otoklavlı santrifüj şişelerine aktarın ve oda sıcaklığında 3.500 x g ile 30 dakika boyunca santrifüj yapın. Bakteriyel pelleti orijinal hacmin yirmide birinde yeniden askıya alın. Her 100 mm NGM plaka tohumlamak için 1–1,5 mL konsantre kültür kullanın.
   2. Bakterilerin büyümesi için plakaları gece boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya geçirin.
      NOT: Bu bakım plakaları, plaka başına 4.000 solucana kadar destek olacak yüksek bakteri yoğunluğuna sahiptir; bu, çok sayıda test yapılırken veya yavaş büyüyen C. elegans suşuyla çalışırken arzu edilir. Tohumlanmış bakım plakaları, buzdolabında 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.
4. Birincil C. elegans kültürü oluşturun (Şekil 1A).
   1. Steril bir pipet ucu kullanarak aç bakım plakasından ~1.000 solucan içeren küçük bir agar parçasını kesin. Agar parçasını tohumlu bir NGM tabağına yerleştirin.
   2. Yeni tabağı plastik bir kaba koyup 20 °C'de 3 gün boyunca kuluçka yapın, solucanlar somurtup yumurta bırakana kadar. Bakteriyel çimenlerin yeterli olduğundan ve solucan popülasyonunun aç kalmadığından emin olun. Bu noktada, solucan popülasyonu deneye hazırdır.

2. Deneysel ortam ve bakteriyel kültürlerin hazırlanması

NOT: Bu adımda, RNAi aracılı gen etkisini test etmek için Yöntem 1'i veya diyet takviyelerini incelemek için Yöntem 2'yi uygulayın.

1. Yöntem 1: RNAi için deneysel NGM plakalarını besleyerek hazırlayın.
   1. 1.1. adımda tarif edildiği gibi 1 L NGM hazırlayın, ardından aseptik teknikle 1 mL 1 M IPTG ve 1 mL 50 mg/mL ampisilin ekleyin. Her 35 mm plakaya yaklaşık 5 mL döküm.
   2. İlgilenen C. elegans genlerini hedefleyen L4440 plazmidlerini taşıyan istenen E. coli HT115 RNAi besleyici klonları ve boş vektör kontrolünü aşılayın. Aşılama döngüsü olan tek bir koloni seçin ve 50 μg/mL ampisilin içeren 1,5 mL LB'ye aktarın. 200 rpm'de yörünge sallayıcısında 37 °C'de 18 saat kuluçka yapın.
   3. Ampisilin ve IPTG içeren 35 mm NGM plakalar, 100 μL gece boyunca E. coli HT115 kültürü ile tohumlanarak, her koşul başına iki teknik replika hazırlanır. Plakaları oda sıcaklığında gece boyunca kuluçka altına alın, böylece bakteri büyümesi ve çift zincirli RNA üretimi sağlanır. Yumurta transferinde daha sonra kullanılmak üzere 4 °C'de eşit sayıda tohumlanmamış plaka saklayın.
2. Yöntem 2: Deneysel NGM plakalarını besin veya ilaç takviyesi ile hazırlayın.
   1. 1.1. adımdaki talimatları takip ederek 1.5x konsantre NGM hazırlayın, ancak 975 mL yerine 642 mL damıtılmış su ekleyin. Hazırlanan ortamı 55 °C su banyosunda sakla.
   2. İlgilendiğiniz takviyenin su bazlı stokunu hedef konsantrasyonun 3 katı olarak hazırlayın (örneğin, 40 mM sodyum formatı içeren plakalar hazırlamak için 120 mM stok yapın). Deneysel plaka sayısını 1.666 mL (plaka hacmünin üçte biri) çarparak gerekli stok hacmini hesaplayın. Stoku filtre-sterilize etmek için bir şırınga filtresi kullanın, ardından su banyosunda 55 °C'ye ısıtın.
   3. 50 mL'lik konik bir tüpte, 2 parça 1.5x NGM ile 1 parça takviye stokunu karıştırın. Takviye kontrolü olmadan, 2 parça 1.5x NGM ile 1 parça sıcak steril su karıştırın. Tüpü 10 kez ters çevirerek nazikçe karıştırın, ardından aseptik teknikle her 35 mm plakaya yaklaşık 5 mL ortam hızlıca dökün.
      NOT: 1,5x NGM, büyük miktarda takviye eklendiğinde orta derecede seyreltmeyi telafi etmek için kullanılır. Ancak, ilaç veya metabolit stoku nihai konsantrasyonun 100× veya daha fazlasına yoğunlaştırılırsa, 1,5× NGM yerine normal NGM kullanılabilir. Organik bir asit takviyesi yaparken, sodyum tuzu formunu kullanmak orta pH'ın düşmesini önlemeye yardımcı olur.
   4. Aseptik teknikle, 50 mL'lik Erlenmeyer şişesini haciminin beşte birine (10 mL) LB ortamı ile doldurun. E. coli OP50 kolonisiyle aşılanın ve gece boyunca 37 °C'de yörüngesel bir sallayıcıda 200 rpm'de kuluçka yapın.
   5. 35 mm NGM plakalar, gece boyunca 100 μL E. coli OP50 kültürü ile tohumlanarak, her koşulda iki teknik replika hazırlanır. Tabakları oda sıcaklığında gece boyunca kuluçka yapın. Yumurta transferinde daha sonra kullanılmak üzere 4 °C'de eşit sayıda tohumlanmamış plaka saklayın.

3. L1 larvalarının senkronize bir popülasyonunun elde edilmesi

1. 7 mL steril su, 2 mL %5 sodyum hipoklorit çözeltisi ve 1 mL 5 N NaOH birleştirerek alkalin çamaşır suyu çözeltisi hazırlayın.
2. M9 tamponunu 3 g KH₂PO₄, 6 g Na_{2HPO 4} ve 5 g NaCl ile 1 L damıtılmış suda çözerek hazırlayın, ardından pH 6.5'e ayarlanır. 121 °C'de 20 dakika otoklav yapın, çözeltinin soğumasına izin verin ve ardından aseptik olarak 1 mL 1 M MgSO4 ekleyin.
3. Gravid yetişkin solucanları (adım 1.4.2) M9 tamponu ile plakadan yıkayın ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. 350 x g sıcaklıkta 2 dakika santrifüj yapın, süpernatantı aspire edin ve tüpü taze M9 tampon ile doldurun. Yıkamayı iki kez tekrarlayın.
4. Solucan pelletine 2 mL M9 tampon ve 2 mL alkali çamaşır suyu çözeltisi ekleyin. Girdablar ve sallamalar şiddetle, mikroskop altında periyodik olarak kontrol edilerek neredeyse tüm solucanlar çözülene kadar.
5. Tüpü M9 tamponu ile doldurun ve 350 x g sıcaklıkta 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Tüpü ters çevirerek süpernatantı çıkarın, ardından M9 tamponu ile dört kez yıkayın. Aşırı ağartmayı önlemek için solucanlar lizizlendikten hemen sonra ilk yıkamayı yapıldığından emin olun. Son yıkamadan sonra, tüpü 8 mL M9 tampon ile doldurun ve yumurtalar çatlayana kadar 18–20 saat boyunca bir rocker üzerinde kuluçka yapın.

4. Anne popülasyonlarının yetiştirilmesi

1. Cam bir kaydırağa beş 3 μL damla solucan süspansiyonu yerleştirin ve mikroskop altında çatlamış L1 larva sayısını sayın. Toplam sayıyı 15'e bölerek mikrolitre başına konsantrasyonu elde edin.
2. 30 L1 larvalarını her tohumlu 35 mm plakaya yerleştirin ve 20 °C'de 72 saat kuluçka yapın. Deneysel koşullar gelişim gecikmesine neden olursa, kuluçka süresini solucanlar kök hale getirip yumurta bırakmaya başlayana kadar uzatın (Şekil 1B).

5. Embriyoların yumurtalık plakalarına aktarılması

1. Tohumlanmamış 35 mm tabakları buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.
2. Solucan plakalarını mikroskop altında inceleyin ve 100'den fazla embriyo içerdiklerini, yumurtadan çıkmış L1 larvalarının olmadığını doğrulayın.
3. Plakayı dikkatlice M9 tamponu ile doldurun. Sıvıyı aspire etmek ve anne popülasyonunu çıkarmak için vakum hattı kullanın. Tabakta yetişkin solucanların kalmadığından emin olun.
4. Mikropipet ucunu 200 μL M9 tampon ile doldurun ve pipette şiddetle yukarı aşağı uygulayarak embriyoları bakteriyel çimlerden ayırın. Mikroskopla bakarken, pipet ucunu embriyo yoğun alanlara yönlendirin.
5. Tohumlanmamış bir plaka alın ve bir damla embriyo süspansiyonunu ortadan pipetleyin. Damlayı mikroskop altında inceleyin. Eğer 100–300 embriyo içermiyorsa, bu aralık ulaşana kadar daha fazla embriyo süspansiyonu ekleyin. Ebeveyn popülasyonundan solucanların embriyolarla birlikte aktarılmasından emin olun.
6. Sıvının kurumasına izin verin, ardından transfer plakalarını en az 24 saat 20 °C'de kuluçka yapın.
   NOT: Deneysel plakada zaten L1 larvaları varsa, M9 yıkama yerine vakum hattı kullanarak tüm anne popülasyonunu teker teker çıkarın. Bu, embriyolar gibi bakteriyel çime yapışmayan L1 yavrularının yıkanmasını önler. Soy transferine devam edin; bu transfer hem embriyoları hem de L1 larvalarını içerecek. Tüm koşullara aynı yaklaşımın uygulandığından emin olun.

Şekil 1: Embriyonik ölümcüllük testindeki temel adımların deneysel zaman çizelgesi ve şeması. (A) Bakım ortamı hazırlığından hatching plakalarının puanlanmasına kadar deneysel protokolün tam süresini temsil eden akış şeması zaman çizelgesi. Deneyin ilgili günleri için temel prosedürler belirtilmiştir. (B) Embriyonik öldürücülük testinin şeması (4–6. adımlar). 4. günde, senkronize L1 larvaları deneysel RNAi veya takviye plakalarına eklenerek anne popülasyonu oluşturulur. 7. günde, 72 saat sonra, solucanlar yumurta bıraktıktan sonra, anne popülasyonu yıkanırken embriyolar bakteriyel çimelere bağlı kalır. Embriyolar daha sonra pipetle çimden yıkanır ve en az 100 embriyo içeren bir yumurta tabakasına aktarılır. 24 saatlik kuluçkadan sonra, yumurtadan çıkan larvalar ve çatlamamış embriyolar sayılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. Puan plakaları

1. 35 mm Petri kabının kapağına yaklaşık 4 mm × 4 mm boyutunda bir ızgara çizmek için kalıcı bir marker kullanın, ardından kapağı tabağın altına yerleştirin. Izgonu rehber olarak kullanın ve mikroskop altında, elde taşınan tıklama sayacı ile L1 larvalarının ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını sayın.
2. Her çoğaltının soy sayısına göre uygun ağırlıklandırılmasını sağlamak için teknik kopyalardan kombine sayımları alın. Özellikle, teknik kopyalar arasında yumurtadan çıkmamış embriyoların ve yumurtadan çıkmış larvaların sayısını toplamaktır.
3. Her biyolojik kopya başına bir embriyonik öldürme oranını hesaplayın; embriyoların (yumurtadan çıkmamış solucanlar) sayısını solucan ve embriyoların toplam sayısına bölür, ardından 100'e çarparak değeri yüzde olarak ifade edersiniz.
   NOT: Bir plakada sadece çatlamış larvalar veya sadece embriyolar varsa, bu sayma aşaması atlanabilir; çünkü embriyonik ölümcüllük oranı sırasıyla 0 (%0) veya 1 (%100) olup.

7. İstatistiksel analiz

1. Bağımsız biyolojik kopyalar elde etmek için tüm deneyi en az üç kez tekrarlayın. Her biyolojik çoğaltma için, her koşul için iki teknik çoğaltma plakası kullanın, her teknik kopyalama için en az 100 embriyo bulunsun.
2. Embriyonik ölümlülük oranlarının durumlar arasında anlamlı şekilde farklı olup olmadığını tek yönlü ANOVA kullanarak belirleyin, ardından Benjamini-Hochberg yöntemi gibi çoklu test düzeltmeleriyle yapılan sonradan çift denemeli Öğrenci t-testleri yapılır.
   NOT: İki teknik replikasyonun birleştirilmesi, biyolojik bir replikasyon başına en az 200 embriyo elde eder. Bu, R temel fonksiyon power.prop.testi tarafından tahmin edilen örneklem büyüklüğü gereksinimini (~184 embriyo/durum) karşılar; bu durum %15 öldürücülük farkı (örneğin, %20 vs. %35) %90 güç ve anlamlılık seviyesi α = 0.05 olarak tespit eder.

Sonuçlar

Embriyonik öldürücülük testi iki suşta gerçekleştirildi: vahşi tip N2 ve RNAi-aşırı duyarlı suş rrf-3(pk1426). RNAi ile beslenme kullanarak, daha önce embriyonik ölümlülüğe neden olduğu bildirilen genleri yüksek verimli^{ekranlarda indirdik 9,12}. Şekil 2, test performansının temsilci bir gösterimini sunar. T04G9.4 knockdown, hem rrf-3 (pk1426) hem de N2 hayvanlarında neredeyse tamamen nüfuz edici embriyonik ölümcüllük...

Tartışma

Testin tekrarlanabilirliği ve doğruluğu için birkaç adım kritik öneme sahiptir. İlk olarak, ağartma adımı, yetişkin solucanları embriyolara zarar vermeden çözecek şekilde dikkatlice zamanlanmalıdır. Bir diğer önemli nokta ise saymak için yeterli sayıda embriyoyu aktarmaktır: çok az embriyo hassasiyeti azaltırken, çok fazla saymayı gereksiz yere zahmetli hale getirir. Sonrasında, embriyolar yumurtadan çıkmaya başlamadan önce embriyo transferi yapılmalıdır. Aksi takdirde, yavrular yetişkin...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Bacteriological peptone	Fischer Scientific	DF0118-17-0
C. elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center	N2	wild type
C. elegans NL2099	Caenorhabditis Genetics Center	NL2099	rrf-3(pk1426) II. RNAi hypersensitive
Calcium chloride, anhydrous	Sigma-Aldrich	746495
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C3045
Conical tubes, 15 mL	VWR	60818-725
Culture tubes, 14 mL	VWR	470150-966
Diaphragm vacuum pump	Amazon	TC-100
Dissecting microscope	AmScope	SM-2
Escherichia coli HT115	Caenorhabditis Genetics Center		RNAse III-deficient, used for RNAi by feeding experiments
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Granulated agar	Fischer Scientific	BP97445
Handheld tally counter	LabDepot	HTCP01
IPTG, dioxane free (Isopropyl-b-D-thiogalactoside)	US Biological	I8500
LB Broth (Miller)	US Biological	L1520	LB ortamı yapmak için 25 g LB tozunu 1 L damıtılmış suda çözün. 121.1 °C'de 20 dakika boyunca otoklavlayın.
Luer Lok disposable syringe	BH Supplies	BH20LL
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Microscopy slides	Sail Brand	7101
Petri dishes, 100 mm	Tritech Research	T3371
Petri dishes, 35 mm	Tritech Research	T3501
Potassium Phosphate Buffer (PPB)			Potasyum fosfat tamponu (1 M) yapmak için 98 g potasyum fosfat monobazik ve 48 g potasyum fosfat dibazik'i 1 L damıtılmış suda çözün. pH'ı 6'ya ayarlayın. 121 °C'de 20 dakika boyunca otoklavlayın.
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	529568
Rocker (nutating mixer)	Corning LSE	6720
Serological pipettes, 25 mL	Corning	4489
Serological pipettes, 5 mL	Celltreat	229235
Shaking incubator Infors Multitron	INFORS HT	NA
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium hydroxide solution, 5 N	Fisher Scientific	SS256-500
Sodium hypochlorite, 5%	LabDepot	LC246302
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sorvall ST1 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	75016030
Stir plate	ONilab	ONi28-S
Syringe filters	Semmerfeld	JQP033022QE1
Water bath	FOUR E's Scientific	WB401