Mikroglial Parametreleri Haritalama Yazılımı (MMPS): Nicel Mikroglia Morfoloji Analizi için Açık Kaynaklı, Kullanıcı Dostu Bir Araç

Özet

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), kodlama uzmanlığı gerektirmeyen ve immünoflüoresans görüntülerden tek hücreli mikrogliyal morfoloji analizini yarı otomatikleştiren kullanıcı dostu bir analiz hattıdır. Kemirgenlerin lipopolisakkaridi indükleyen nöroinflamasyon modelinde doğrulanan MMPS, aktivasyonla ilişkili morfolojik değişiklikleri tekrarlanabilir şekilde tespit eder ve standart, ölçeklenebilir mikroglial fenotiplemeyi mümkün kılar.

Özet

Mikroglia, merkezi sinir sisteminin miyeloid kaynaklı bağışıklık hücreleridir ve nörolojik hasar sonrası doku bozulması ve yeniden şekillendirilmesini aracılık ederler ve birçok nörodejeneratif hastalıkta umut vadeden terapötik hedefler olarak ortaya çıkmıştır. Mikrogliyal morfolojinin nicel analizi, mikroglial alt popülasyonlar arasındaki ince farklılıkları ortaya çıkarırken önemli in situ bilgileri koruyabilir. Ancak, şu anda mevcut olan birçok mikrogliyal morfoloji analiz platformu ya kamuya açık değildir ya da özel hesaplama uzmanlığı gerektirir, bu da yaygın benimsenmelerini sınırlar. Bu sınırlamaları gidermek için, Python 3.11 kullanarak Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) adlı açık kaynaklı bir mikrogliyal morfoloji analiz platformu geliştirildi. MMPS, immünoflüoresans tabanlı iş akışlarıyla uyumludur ve kurulum veya işletme için kodlama uzmanlığı gerektirmez. Yazılım, erişilebilir grafiksel kullanıcı arayüzü aracılığıyla tek hücreli mikrogliyal morfoloji analizini yarı otomatikleştirir ve özelleştirilebilir görüntü işleme ile maske oluşturma iş akışlarını içerir. Çalışma, kemirgenlerin lipopolisakkaridi (LPS) tarafından indüklenen nöroinflamasyon modeli kullanılarak MMPS'nin doğrulanmasını içeriyor. Hayvan düzeyinde nicel analizler, LPS ile tedavi edilen hayvanlardan alınan mikrogliaların araçla tedavi edilen kontrollere kıyasla soma alanının (p < 0.01) ve hücre çevresinin azaldığını (p < 0.05) gösterdiğini, mikroglial aktivasyon ve nöroinflamasyonla ilişkili morfolojik özelliklerle uyumlu olduğunu gösterdi. Genel olarak, MMPS laboratuvarlar arasında mikrogliyal morfolojinin nicel analizi için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir platform sağlar.

Giriş

Mikroglia, merkezi sinir sisteminin (MSS) doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir ve çevrelerini sürekli olarak patojenler ve doku hasarı için^inceler. Aktivasyonda, mikroglialar süreçlerini geri çeker ve homeostatik, dallanmış bir morfolojiden amöoid^{fenotip 2,3'e} geçiş yapar. Iskemik inme gibi nörodejeneratif^{hastalıklarda 4,5} ve Alzheimer^{hastalığı 6,7}. Mikroglia genellikle sürekli sitokin üretimi, yoğun doku bozulması ve fagositoz yoluyla nöroinflamasyonu^{sürdürür 2}. Bu süreçler, nörovasküler birimin bozulmasına katkıda bulunur, mikroglial aktivasyonu ve CNS^{hasarını 8} daha da kötüleştirir ve böylece mikroglia umut vadeden tedavi amaçlı^{hedefler 9,10} haline gelir.

Nörodejeneratif hastalıklarda mikrogliyal alt popülasyonlar arasındaki ince farkları belirlemek için morfolojik analizler yoluyla yapılır. Bu genellikle Cx3CR1-GFP hayvanları kullanılarak in vivo iki foton^{mikroskopisi 11} veya ionize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekül-1 (Iba1) veya P2Y purinoseptör^{reseptörü 12} gibi yerleşik mikrogliyal belirteçlerin immünfloresans (IF) etiketlenmesi yoluyla yapılır. Mikroglia yaralanma sonrası sıklıkla homeostatik ve amöboid morfolojiler arasında geçiş yapsa da, önceki çalışmalar mikrogliaların hiper-ramified^{mikroglia 3,13}, bal peteği^{mikroglia 3,14}, reaktif mikroglia¹⁵ ve çubuk mikroglia ^3,16 gibi ek fenotipler de benimseyebildiğini göstermiştir. Ancak, mikrogliyal morfoloji çalışmaları genellikle homeostatik ve amöboid fenotiplerin manuel kategorizasyonuna dayanır. Bu yaklaşımlar, laboratuvarlar arasında standartlaşmanın sıkça eksik olduğu ve homeostatik ile hiper-ramified fenotipler gibi benzer morfolojiler arasındaki ayrımı eğitimli personel için bile zorlaştıran özel analiz hatlarını gerektirir¹⁷. Ayrıca, ince morfolojik değişikliklerin IF tabanlı analizi yüksek çözünürlüklü görüntüleme gerektirir ve bu da ek teknik zorluklar yaratabilir.

Bu sınırlamaları gidermek için, yarı otomatik^{olarak 11} veya^{otomatik olarak 18} mikrogliya algılayan ve kullanıcı tarafından tanımlanan hedef alanlarda (örneğin, 200–800^{μm 2}) hücrelerin birden fazla ikili temsilini oluşturan "maske" olarak adlandırılan birkaç analitik platform geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlar kullanıcı önyargısını azaltır, tekrarlanabilirliği artırır ve analitik verimliliği artırır. Bu gelişmelere rağmen, mevcut birçok yazılım platformunun yaygın benimsenmesini engelleyen sınırlamaları vardır; bunlar arasında açık kaynak erişilebilirlik^{eksikliği 17}, kodlama uzmanlığı^{gereksinimleri} 11,19,20, in vivo iki foton mikroskopi sistemlerine^{bağımlılık 11,19}, sezgisel grafik kullanıcı arayüzlerinin eksikliği 11,21,22, yavaş işlem^{hızları 11} veya ticari yazılım platformlarına^{bağımlılık} 12,19,21. Son çalışmalar bu sorunların birkaçını ele almaya başlamış olsa da, mevcut platformların çoğu mikroglial morfolojinin incelenmesinde yaygın olarak kullanılan IF tabanlı iş akışları için hâlâ uygun değildir.

Burada sunulan bir kullanıcı odaklı mikrogliyal morfoloji analiz platformu olan Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) bulunmaktadır. MMPS kodlama uzmanlığı gerektirmez, yerleşik ImageJ tabanlı iş akışlarıyla entegre olur ve özellikle IF görüntüleri için tasarlanmıştır. Yazılım, Python 3.11 ile geliştirildi ve daha önce yayımlanmış açık kaynak morfoloji platformlarından^{kavramları içeriyor 11}. MMPS, kullanıcıların birden fazla özelleştirilebilir görüntü işleme seçeneği kullanarak büyük IF görüntü partilerini içe aktarıp işlemelerini sağlayan sezgisel bir grafiksel kullanıcı arayüzüne sahiptir. Platform ayrıca, IF görüntüleme sırasında ortaya çıkan aşırı örnekleme artefaktlarını en aza indirmek için manuel hücre seçimi ve hücresel süreçlerin soma ölçümlerine dahil edilmesini önlemek için manuel soma taslağını da içeriyor. Buna ek olarak, MMPS özelleştirilebilir maske üretim parametreleri ve maske doğruluğunu artırmak için birden fazla kalite güvencesi özelliği içerir. Yazılım, çevre, ortalama centroid mesafesi, maske alanı, eksantriklik, yuvarlaklık ve soma alanı gibi yaygın kullanılan birkaç morfolojik parametreyi hesaplar. Daha ileri çalışmalar için, MMPS tarafından üretilen çıktılar birden fazla ImageJ eklentisiyle uyumludur ve fraktal, iskelet ve gövde analizleri için eşlik eden eklentilerle daha fazla analiz edilebilir.

MMPS, kortikal tabaka IV içindeki mikrogliyal değişiklikler incelenerek kemirgenlerin lipopolisakkaridi (LPS) tarafından indüklenen nöroinflamasyon modeli kullanılarak doğrulandı. Kantitatif analiz, LPS uygulamasının, araçta tedavi edilen kontrollere kıyasla hücre çevresini azaltırken mikroglial soma alanını önemli ölçüde artırdığını ve MMPS'nin mikroglial aktivasyonla ilişkili ince morfolojik değişiklikleri doğru şekilde tespit ettiğini göstermiştir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, West Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (protokol #2109047180) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu yöntemde kullanılan ekipman, reaktifler ve yazılımlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Deneysel hayvanlar

1. 10 erkek Sprague-Dawley sıçanı (2-3 aylık yaşında) temin edin. Fareler hayvan tesisine vardığında, 12 saatlik ışık/karanlık döngü altında grup olarak yerleştirilmeli, yiyecek ve suya imkansız erişim sağlanmalıdır. Fareler varıştan sonra 3 gün boyunca uyum sağlanır.
2. Fareleri rastgele araç veya LPS ile tedavi edilen gruplara (n = 5 fare/grup) atandırın.
   NOT: Kullanılacak sıçan sayısı az olduğundan, bilgisayar tarafından oluşturulan rastgele sayılarla sıçanları tedavi grubuna atanarak basit bir rastgeleleştirme stratejisi uygulanabilir.
3. "Hastalık davranışı" tedavisini takip eden fareleri izleyin: kilo kaybı (>15%), porfirin salgılanması, solunum anormallikleri veya azalmış aktivite.
   NOT: Hastalık davranışı belirtileri genellikle uygulamadan sonraki ilk 12 saat içinde ortaya çıkar, bu yüzden ilaçları sabah erken saatlerde (6-8 sabah) enjekte edin, gün boyunca davranışları izleyin ve fareleri günün geç saatlerinde (17-19:00) tesise geri getirin.

2. Nöroinflamasyon modeli

1. 50 mg LPS'yi 5 mL fosfatla tamponlanmış tuzlu salinte çözerek LPS (O111:B4) stok çözeltisi (10 mg/mL) hazırlayın.
   NOT: LPS bir endotoksindir. Araştırmacılar, işleme ve bertaraf etme konusunda kurumlarının SOP'sine uymalıdır.
2. Fareleri tartın ve ardından intraperitoneal olarak LPS (10 mg/kg) veya PBS (araç dozu) enjekte edin.
3. Farelerin ağırlığına göre, enjeksiyon hacmi 150–300 μL arasında beklenmektedir.
4. Sıçanları enjeksiyondan 24 saat sonra kalp perfüzyonu ile ötanazi yapın ve ardından kafa kesilin.
5. Fareleri 5–10 dakika boyunca solulan izofluran (%5_O2) ile anestezi edin. Pedal çekilme refleksinin olmaması nedeniyle anestezi doğrulan.
6. Anestezi altındayken diyafram ve göğüs sümüğü ortaya çıkarmak için orta hat torasik kesi oluşturun. Xiphoid sürecini hemostatlarla kelepçe ederek torakal boşluğu ortaya çıkarın.
7. Diyafram ve kaburga kafesini ön uzuvlara doğru keserek kalbi açığa çıkar.
8. İnen aort ve alt vena kava hemostatlarla kelepçelenin. Sol ventriküle 25 kalibre kanatlı bir iğne soku.
9. Fareleri peristaltik pompa kullanarak buz gibi soğuk PBS (25 mL, 30 mL/dakika) ile perfüze edin. Perfüzyon başlatıldıktan sonra birkaç saniye içinde sol atriumu keserek perfüzyon drenajına izin verin.
10. Farelerde %4 paraformaldehit (25 mL, 30 mL/dakika içinde) perfüze edin.
    DIKKAT: Paraformaldehiti uygun kişisel koruyucu ekipmanla iyi havalandırılan bir ortamda kullanın. Paraformaldehit atıklarını kurumsal ve yerel düzenlemelere göre bertaraf etmelidir.
11. Perfüzyon sonrası giyotinle farelerin kafasını kesmek.
    NOT: Kurumunuzun kafa kesinti ve bıçak bilemeleriyle ilgili yönergelerine uyun.
12. Kafatasını kafatasını burun kıvılcımına doğru çekerek açığa çıkarın.
13. Frontal kemiği, orbital yuvalara yerleştirilen hemostatlar veya rongeurlarla kırın.
14. Foramen magnum'a forseps yerleştirin ve parietal kemikleri soyun.
15. İnce forseps kullanarak beyni çıkarın ve %4 paraformaldehit içinde gece boyunca kuluçka yapın.
16. Beyinleri gece boyunca sıralı olarak %20 sakaroz ve %30 sukroza aktararak kriyokoruma için.

3. İmmünofluoresans

1. Kuru buz üzerinde Tissue Tek O.C.T. Bileşiminde dondurulmuş kriyokorumalı beyinler.
2. Beyinleri 30 μm'de kriyostat kullanarak kesin.
3. PBS'de bölümleri toplayıp 12 kuyuyla bir plakaya yerleştirilmiş ağ kuyulara aktarın.
4. Her sıçan için ön dorsal hipokampusu içeren en az iki bölüm seçin.
5. Bölümleri PBS'de iki kez iki kez PBS'de yıka.
6. Bölümleri %0,3 Triton X-100/PBS ile 45 dakika boyunca sallanırken geçirin.
   NOT: Başka belirtilmedikçe yıkama veya kuluçka aşamasında 3 mL çözelti kullanın.
7. Bölümleri PBS'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
8. Antijen alma çözeltisini PBS'de 1x seviyesinde seyreldin ve her kuyuya 2 mL ekleyin.
9. Bölümleri 80°C'de 20 dakika boyunca su banyosu kullanarak kuluçka yapın.
10. Devam etmeden önce bölümlerin oda sıcaklığına soğumasına izin verin.
11. Bölümleri PBS'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
12. %10 eşek serumu/%0,05 Triton X-100/PBS ile 2 saat boyunca 37°C'de 75 rpm'de sallayarak kesitleri bloklayın.
13. Bölümleri %1 eşek serumu/%0,05 Triton X-100/PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
14. Bölümleri %1 eşek serumu/%0,05 Triton X-100/PBS ile hazırlanmış 500 μL primer anti-Iba1 antikor çözeltisi içeren net kuyular içermeyen yeni 12 delikli bir plakaya aktarın.
15. Inkubasyon çözeltisinden birincil antikoru çıkararak negatif kontroller hazırlayın.
16. Tüm bölümleri gece boyunca 4°C'de yörüngesel bir sallayıcıda kuluçka yapın
17. Bölümleri ağ kuyularına geri gönderin.
18. Bölümleri 1% eşek serumu/%0.05 Triton X-100/PBS ile 10 dakika boyunca üç kez yıka.
19. Bölümleri %1 eşek serumu/%0,05 Triton X-100/PBS ile oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca anti-tavşan ikincil antikoru (1:1000 seyreltme) ile kuluçka yapın.
    NOT: Tüm sonraki işlemlerde ışık maruziyetini en aza indirin ve florofor bozulmasını önlemek için plakaları alüminyum folyoya sarın.
20. Bölümleri PBS'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
21. Bölümleri mikroskop slaytlarına monte edin.
22. Karanlıkta >2 saat hava ile kurutuldu.
23. Suda çözünebilen bileşiklerle örtülü kesitler.
24. Negatif kontrol slaytlarını montaj ortamı kullanarak hazırlayın.
25. Slaytları oda sıcaklığında, karanlık bir ortamda bir sürgü kutusunda saklayabilirsiniz.

4. Görüntüleme

1. Bir görüntüleme sisteminin piksel boyutunu 40x büyütmede belirleyin. Ölçek bulunmazsa, her görüntüye bir ölçek çubuğu ekleyin.
2. DAPI boyama kullanarak kortikal tabaka IV'e karşılık gelen düşük büyütmede yoğun bir kortikal çekirdek bandı tespit edin.
3. Görüntüyü tanımlanan kortikal bölgeye odaklayın.
4. 40x büyütmeye geçin.
5. DAPI ve Iba1 sinyalinin arka plan floresansından en iyi şekilde ayrılmasını sağlamak için kanal pozlama ayarlarını ayarlayın.
6. Mikroglia'nın tam derinliğini kapsayan Z-stack görüntüleri (> 30 adım) alın.
7. Her iki lekeden elde edilen Z-yığından bir bileşik maksimum yoğunluklu projeksiyon görüntüsü oluşturup kaydedin.
   NOT: DAPI/Iba1 ile arka plan floresansı arasındaki sinyal ayrımını maksimize etmek için her görüntü için pozlama ve Z-yığını ayarlarını optimize edin. Kötü sinyal ayrımı maske oluşturma doğruluğunu azaltır.

5. Mikroglial parametreleri haritalama yazılımı (MMPS)

1. Tüm bileşik görüntüleri tek bir görsel dizininde sakla.
2. MMPS tarafından oluşturulan sonuçlar için ayrı bir çıktı dizini oluşturun.
3. MMPS bağımsız paketini veya GitHub deposundan MMPS.py betiklerini indirin.
4. MMPS'i MMPS.py üzerinden başlatıyorsanız, requirements.txt dosyasında listelenen tüm bağımlılıkları yükleyin.
5. MMPS paketini açın veya MMPS.py betikini çalıştırın.
6. "Resim klasörünü seç" seçeneğini seçin ve resim dizinini seçin.
7. "Çıktı klasörü seç" seçeneğini seçin ve çıktı dizinini seçin.
8. İşletim sistemi tarafından istenirse klasör-erişim izinleri verin.
   NOT: Ek kurulum talimatları, sorun giderme rehberliği ve kullanım örnekleri ek dokümantasyon ve GitHub deposunda yer almaktadır.
9. "Görsel Etiketleme" seçeneğini seçin ve her görse hayvan tanımlayıcıları ve tedavi grupları atayın.
   NOT: Eğer resim etiketleme atlanırsa, MMPS veri dışına aktarmadan önce tedavi grubu ve hayvan tanımlayıcıları için uyarılar verir.
10. "Parametreler" sekmesinin altına piksel boyutunu girin.
11. Piksel boyutu bilinmiyorsa "Ölçek çubuğundan kalibre" seçeneğini seçin. Sorulduğunda ölçek çubuğunun başlangıç ve son noktalarını seçin. Bilinen ölçek çubuğu mesafesini mikrometre cinsinden girin.
12. Mikrogliyal sinyalin bulunduğu floresans kanalını seçin.
13. İşlenmek üzere görüntüleri her görsel adının yanındaki kutuyu işaretleyerek seçin. Arka plan floresansı görüntüler arasında önemli ölçüde farklılık gösterdiğinde görüntüleri tek tek işleyin.
14. "Orijinal", "Önizleme", "İşlendi" ve "Maskeler" sekmelerini inceleyerek görüntü işleme aşamalarını karşılaştırın.
15. Görüntü işleme ayarlarını değerlendirmek için "Mevcut Görüntüyü Önizleme" seçeneğini seçin.
16. Arka plan çıkarma, gürültü azaltma ve keskinleştirme ayarlarını gerektiğinde ayarlayın.
17. Arka plan çıkarma için 5–150 piksel arasında yuvarlanan top değerleri kullanın.
18. Dengesiz aydınlatma artefaktlarını azaltmak için 3–7 piksel arasında denoizasyon değerleri kullanın.
19. Kenar tanımını artırmak için 1–2 arasında keskinleştirme değerleri kullanın.
20. Görüntü işleme ayarlarının optimize edilmesinden sonra "Seçilmiş Görüntüleri İşleme" seçeneğini seçin.
    NOT: Görüntü işleme süresi, görüntü sayısına ve seçilen parametrelere bağlı olarak değişir.
21. "Soma Seç (Tüm Resimler)" seçeneğini seç.
22. RGB kompozit görüntüleri görüntülemek için "Show Color (C)" seçeneğini seçin. "Kanallar..." seçeneğini seçin. ve görüntü renkleri bozulmuş görünürse kullanılmayan kanalları seçmeden çıkarabilir.
23. DAPI ve Iba1 kololokalizasyonunu gösteren mikroglial somaları seçin. Görüntü sınırlarıyla temas eden hücreleri seçmekten kaçının. Yanlış seçilmiş soma işaretleyicileri "Backspace" veya "Delete" tuşlarıyla kaldırın.
24. Bir sonraki görüntüye geçmek için "Enter" veya "Return" tuşlarına basın.
25. Soma seçimi tamamlandıktan sonra "Somas (Hepsi)" seçeneğini seçin.
26. Seçilen her mikroglial hücrenin soma çevresini çizin. Hücresel süreçleri soma taslağından çıkarın ve her soma için en az sekiz kontur noktası kullanın. "Son Noktayı Geri Geri Al", "Sil" veya "Geri Alan" kullanarak yanlış yerleştirilmiş kontur noktalarını kaldırın.
27. Basın "Enter", "Return" çift tıklama veya sağ tıklayarak her soma taslağını tamamlayabilirsiniz.
28. Gerekirse önceki SOMA taslağını tekrar etmek için "Son Taslakları Yeniden Yap" seçeneğini seçin.
29. Soma taslağını tamamladıktan sonra "Tüm Maskeleri Oluştur" seçeneğini seçin.
30. Maskelere düşük yoğunluklu arka plan piksellerinin dahil edilmesini kısıtlamak için minimum eşik değeri uygulanır.
    NOT: Yüksek değerler dallanma pahasına soma doğruluğunu korurken, daha düşük değerler dallanma doğruluğunu soma pahasına korur. %10–30 arasındaki eşik değerler genellikle dengeli arka plan baskısı ve dal koruması sağlar.
    NOT: Maske üretim süresi, seçilen hücre sayısına bağlı olarak değişir.
31. Maske kalite güvencesini başlatmak için "QA All Masks" seçeneğini seçin.
32. İnceleme maskeleri en büyük (800^{μm 2}) ile en küçük (200^{μm 2}) arasında sunuldu.
33. Her maske, "İşlenmiş" ve "Maske" sekmelerini kullanarak ilgili mikroglia ile karşılaştırın.
34. "A" klavye kısayolunu kullanarak maskeleri kabul edin. "R" klavye kısayolunu kullanarak maskeleri reddedin. Kabul veya reddi geri almak için "B" tuşuna basın. Klavye ok tuşlarını kullanarak maske boyutları arasında gezin.
35. Komşu hücreler, aşırı arka plan, görüntü sınırları veya ölçek çubukları içermeden mikroglial dallanmayı doğru şekilde yakalayan en büyük kabul edilebilir maske seçin.
    NOT: Doğruluğu konusunda belirsizlik varsa maskeleri reddedin.
    NOT: "Tüm Maskeleri Temizle" seçeneğini seçin, ardından çoğu doğru değilse maskeleri farklı bir eşik değeriyle yeniden oluşturun.
36. Maske kalite güvencesi tamamlandıktan sonra "Basit Özellikleri Hesapla" seçeneğini seçin.
    Kabul edilen maskeler ve SOMA taslakları kullanarak ortalama centroid mesafesi, maske alanı, çevresi, eksantrikliği, yuvarlaklığı ve soma boyutunu hesaplayın.
37. Nöroinflamasyondaki parametre tanımları ve mikrogliyal eğilimler için Tablo 1'e bakınız.
38. İndir "Sholl.py", "FractalAnalysis_ImageJ.py" ve "SkeletonAnalysisImageJ.py" ile ek analizler yapmak için kullanılır.
39. Fraktal ve gövde analizleri için Fiji eklentisi olarak "FractalAnalysis_ImageJ.py"i aç.
40. İstendiğinde çıkış dizini konumunu ve piksel boyutunu girin. Sadece en büyük kabul edilen maske analizi isteniyorsa "sadece en büyük maske" seçeneğini seçin.
41. Sholl analizi için Fiji eklentisi olarak "Sholl.py"i açın.
42. İstendiğinde çıkış dizini konumunu ve piksel boyutunu girin.
43. İstediğiniz Sholl-analiz adım boyutunu girin. Sholl analizi için MMPS'ten türetilen soma yarıçaplarını başlangıç yarıçapı olarak kullanmak üzere "Başlangıç yarıçapı olarak soma yarıçapını kullan" seçeneğini seçin. MMPS'den türetilen soma yarıçapları kullanılmıyorsa sabit bir soma yarıçapı değeri girin.
44. "SkeletonAnalysisImageJ.py"i iskelet analizi için bir Fiji eklentisi olarak açın.
45. Sorulduğunda çıkış dizini konumu, piksel boyutu ve maske-klasör konumunu girin.
46. Tamamlandığında tüm eklenti tarafından oluşturulan sonuçları CSV dosyası olarak çıkış dizinine aktarın.

6. MMPS'de mikroglia morfolojisi hesaplamaları için kullanılan formüller

NOT: Tüm hesaplamalar, "Basit Özellikleri Hesapla" tuşuna basıldığında MMPS tarafından otomatik olarak yapılır. Parametre hesaplamaları aşağıda gösterilmiştir.

1. Çevre
   1. Çevre şu denklemi kullanarak hesaplayın:
      
   2. Çevre olarak, kenar piksel sayısı ve μm cinsinden piksel boyutu olarak tanımlanır.
2. Ortalama merkez mesafesi
   NOT: Ortalama centroid mesafe aynı zamanda hücre yayılması¹¹ olarak da adlandırılır.
   1. Hücre koordinatlarına göre dört dal uç noktası belirleyin:
      Üst dal: minimum Y-koordinat,
      alt dal: maksimum y-koordinat,
      sol dal: minimum x-koordinat,
      Sağ dal: maksimum x-koordinat.
   2. Centroid koordinatlarını aşağıdaki denklemlerle hesaplayın:
      
      
   3. c_x ve c_y'yi merkez koordinatları olarak, x_i ve y i piksel koordinatları olarak ve toplam piksel sayısı olarak tanımlayın.
   4. Dal mesafesini aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplayın:
      
   5. d'yi dal mesafesi olarak, x_i ve y i'yi dal ucu koordinatları olarak, c_x ve c_y ise merkez koordinatları olarak tanımlayın.
   6. Aşağıdaki denklemi kullanarak ortalama centroid mesafesini hesaplayın:
      
   7. Ortalama centroid uzaklığı, dal mesafesi, d_i ve piksel boyutu olarak μm cinsinden tanımlanır.
3. Maske alanı
   1. Maske alanını aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplayın:
      
   2. Maske alanı olarak^{μm 2} cinsinden, maske içindeki piksel sayısı ve μm cinsinden piksel boyutu olarak tanımlanır.
4. Eksantriklik
   1. Aşağıdaki denklemlerle ikinci merkez momentleri hesaplanın:
      
      
      
   2. μ₂₀,_{μ 02} ve μ_11'i ikinci merkezi momentler, x i ve y i piksel koordinatları, c_x ve c_y merkez koordinatları olarak, N'yi ise toplam piksel sayısı olarak tanımlayın.
   3. Aşağıdaki denklemi kullanarak kovaryans-matris özdeğerleri hesaplayın:
      
   4. λ₁ ≥ λ_2'yi tanımlayın.
   5. Aşağıdaki denklemlerle büyük ve küçük eksen uzunluklarını hesaplayın:
      
   6. A'yı ana eksen uzunluğu, b'yi ise küçük eksen uzunluğu olarak tanımlayın.
   7. Aşağıdaki denklemi kullanarak eksantrikliği hesaplayın:
      
   8. Eksantriklik olarak tanımlanır.
5. Yuvarlaklık
   1. Aşağıdaki denklemi kullanarak yuvarlaklığı hesaplayın:
      
   2. Yuvarlaklık, ana eksen uzunluğu ve küçük eksen uzunluğu olarak tanımlanır.
6. Soma boyutu
   1. Aşağıdaki denklemi kullanarak soma alanı hesaplayın:
      
   2. Sa'yı μm^2'de soma alanı, soma maskesi içindeki piksel sayısı olarak, S'yi μm cinsinden piksel boyutu olarak tanımlayın.

7. İstatistiksel analiz

1. Tüm istatistiksel analizleri R sürüm 4.3.2 kullanarak gerçekleştirin.
2. Her hücre için en büyük kabul edilen maske kullanılarak veri setlerini filtreleyin.
3. Hayvan düzeyinde ortalama hücresel parametreler, istatistiksel analiz öncesi.
4. Shapiro–Wilk ve Levene testleriyle normalliği ve varyansı değerlendirin.
5. Veri setleri parametrik varsayımları karşıladığında, Öğrencinin t-testleri veya tekrarlanan ortalama ANOVA'ları, sonradan Holm düzeltilmiş eşleştirilmiş t-testlerle gerçekleştirin.
6. Veri setleri parametrik varsayımları karşılamadığında, Holm düzeltilmiş eşleştirilmiş Wilcoxon imzalı sıralama testleriyle Wilcoxon sıra-toplamı veya Friedman testleri gerçekleştirilir.
7. İstatistiksel anlamlılığı p < 0.05 olarak tanımlayın.

Sonuçlar

IF tabanlı mikroglial morfoloji analizi için erişilebilir ve standartlaştırılmış bir iş akışı sağlamak amacıyla Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) olarak adlandırılan açık kaynaklı, bağımsız bir mikroglial morfoloji analiz platformu geliştirilmiştir. Platform, önceki morfoloji-analiz metodolojilerinin üzerine inşa ediliyor, kodlama uzmanlığı gerektirmiyor ve erişilebilir bir grafiksel kullanıcı arayüzü içeriyor. MMPS, mikroglial maskelerin aşırı tahminini en aza indirmek için birden fazla koruma unsuru içerirken ince mikrogliyal dallanmanın tespitini iyileştirmek amacıyla tasarlanmıştır.

MMPS, LPS kaynaklı kemirgen nöroinflamasyon modeli kullanılarak doğrulandı. Doku işleme ve görüntü alımı (Şekil 1) sonrasında, birincil antikor boyama eksikliği olan negatif kontrol kesitleriyle IF özelliği doğrulandı (Ek Şekil 1). MMPS işlemesi, yazılım arayüzüne IF görüntülerinin ithale getirilmesiyle başlar (Şekil 2A). Yazılım, mikroglial sinyal algılama ve arka plan ayrımını geliştirmek için birden fazla görüntü işleme seçeneği sunar. Zorunlu arka plan çıkarma, Scikit-image paketinde uygulanan yuvarlanan top algoritması kullanılarak yapılırken, isteğe bağlı denoizasyon ve keskinleştirme filtreleri SciPy tabanlı Gauss filtreleme ile sunulmaktadır. Görüntü işlemenin ardından, mikrogliyal somalar manuel olarak seçilir ve kırmızı seçim işaretleyicileriyle tanımlanır (Şekil 2B). Soma sınırları daha sonra aşağı akış morfolojik hesaplamalar için manuel olarak belirlenir (Şekil 2C).

Şekil 1: Nöroinflamasyon modeli ve işlemesinin grafiksel genel bakışı. Farelere LPS veya PBS enjekte edildi ve 24 saat boyunca kalp perfüzyonu ve ardından kafa kesilerek toplandı. Beyinler çıkarılıp 30 μm'lik kesitlere ayrıldı ve ardından mikroglial belirteç Iba1 için IF'de kullanıldı; bu işaretleyiciler MMPS ile işlendi. Biorender ile oluşturuldu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: MMPS kullanımının genel özeti. (A) MMPS'de referans verilecek kortikal mikroglia (kırmızı, Iba1) ve hücre çekirdekleri (mavi, DAPI) görüntüsüne örnek (ölçek çubuğu = 75 μm, 40x). MMPS kullanılarak görüntü işlendikten sonra arka plan küçülür ve doğru morfolojiler değerlendirilir (B) MMPS'de görüntü işlendikten sonra, somalar manuel olarak kırmızı bir daire ile seçilir ve yöntemlerde detaylandırılan sonraki adımlarda kullanılır (ölçek çubuğu = 75 μm, 40x). (C) İki temsilci mikroglia manuel olarak çizilmiş ve kaydedilen soma konturu görüntüleri aşağıda gösterilmiştir. (D) Seçilen hücrelerin maske üretimi, 800^{μm 2'ye} kadar mikroglial dalları otomatik olarak izler, ancak bu manuel kalite güvencesi gerektirir. Burada yanlışlıklı 800^{μm 2} maskesini, ardından daha doğru 700^{μm 2} maske gösteriliyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Soma çiziminden sonra, MMPS kullanıcı tarafından tanımlanan minimum yoğunluk eşikleriyle sınırlanan uyarlanabilir eşik eşik kullanarak 200–800^μm2 boyut aralığında maskeleri yinelemeli olarak üretir. Küçük maskeler kullanıcı tarafından tanımlanan eşiği daha yakından takip ederken, büyük maskeler eşik kısıtlamalarını giderek gevşeterek dal entegrasyonunu maksimize eder. Oluşturulan maskeler, komşu hücrelerin dahil edilmesini, aşırı arka plan entegrasyonunu veya görüntü sınırları veya ölçek çubuklarıyla kısaltmayı önlemek için manuel kalite güvence incelemesinden geçer. Şekil 2D'de gösterildiği gibi, temsil bir mikrogliyal hücre için 800^{μm 2} maskesi komşu hücreye uzandı. 800^{μm 2} maskenin reddedilmesi ve 700^{μm 2} maskenin seçilmesi, hedef mikroglia'nın doğru şekilde tanımlanmasını korurken segmentasyon hatasını düzeltti.

MMPS işleminin ardından, mikroglial aktivasyon her hücre için en büyük kabul edilen maske kullanılarak değerlendirildi; çünkü bu maskeler distal dallanmayı en doğru şekilde yakalayarak arka plan entegrasyonunu en aza indirdi. Hesaplanan morfolojik parametreler Tablo 1'de özetlenmiş ve Şekil 3'te gösterilmiştir. LPS uygulaması, araçta tedavi edilen kontrollere kıyasla ortalama centroid mesafesini ve hücre çevresini anlamlı şekilde azalttı (p < 0,05; Şekil 3A,B), aktivasyon sırasında mikrogliyal süreçlerin geri çekilmesiyle tutarlıdır. Tedavi grupları arasında maske alanı, yuvarlaklık veya eksantriklikte anlamlı farklar gözlemlenmedi (Şekil 3C–E), önceki raporlarda bu parametrelerin aktive mikroglial^{fenotipler 3,23} ile ilişkilendirildiği belirtilmiştir. Mevcut çalışma, soma şekli veya maske alanındaki ince farklılıkları istatistiksel olarak tespit edememiş ve mikrogliyal alt popülasyonlar bu eğilimleri eşit şekilde takip etmeyen heterojen inflamatuar morfolojiler^{benimseyebilmektedir 3}. Buna karşılık, LPS ile tedavi edilen hayvanlarda soma alanı araç kontrollerine kıyasla anlamlı şekilde arttı (p < 0.01; Şekil 3F), aktivasyonla ilişkili morfolojik yeniden yapılandırmayı^{destekleyen 22}.

Şekil 3: Mikrogliyal morfolojik parametrelerin karşılaştırılması. Tüm paneller için normallik testleri yapıldı (Shapiro-Wilk ve Levene) ve tüm vakalarda anlamsız değerler bulundu (s>0.05), bu da Öğrenci t-testlerinin kullanılmasına yol açtı. Noktalar bireysel hayvanları temsil eder (n=5 tedavi başına) (A) Araç grubunda ortalama centroid mesafesi, LPS tedavi grubuna kıyasla anlamlı derecede yüksekti. (B) Mikroglia hücre çevresi, araç grubunda LPS tedavi grubuna kıyasla anlamlı şekilde daha yüksekti. (C) Tedavi grupları arasında maske alanında anlamlı bir fark yoktu. (D) Gruplar arasında soma eksantrikliğinde anlamlı bir fark yoktu. (E) Tedavi grupları arasında soma yuvarlaklığında anlamlı bir fark yoktur. (F) LPS grubunda soma alanında önemli bir artış bulundu * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Parametre	Tanım	Mikrogliyal Aktivasyon ile İlişkisi
Ortalama Centroid Mesafesi	En uzak dalın üst, sağ, alt ve sol pozisyonlardaki ortalama mesafesi	Azalmalar
Çevre	Hücrenin çevresinin ölçümü	Azalmalar
Maske Alanı	Hücrenin gerçek alanı, hedef maske alanı değil	Azalmalar
Eksantriklik	Hücre somasının yaklaşık uzamasının ölçümü (0: dairesel, 1: çok uzamış)	Azalmalar
Yuvarlaklık	Hücre somasının yaklaşık dairesel ölçümü (0: uzun, 1: dairesel)	Artışlar
Soma Boyutu	Hücre soma alanı	Artışlar

Tablo 1: MMPS'den Hesaplanan Parametreler ve Mikroglia Aktivasyonuna Yanıt Olarak Tahmin Edilen Değişim. Tablo, Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) tarafından hesaplanan morfolojik parametreleri özetlemektedir; çevre, ortalama centroid mesafesi, maske alanı, eksantriklik, yuvarlaklık ve soma alanı dahildir.

Kullanıcılar arası tekrarlanabilirlik, daha sonra bağımsız analiz için kör ve daha önce eğitimsiz kullanıcılara aynı görüntü seti sağlanarak değerlendirildi (Ek Şekil 2). Kullanıcılar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklar tespit edilmedi ve tüm kullanıcılar LPS ile tedavi edilen hayvanlarda mikrogliyal aktivasyonla uyumlu morfolojik eğilimleri yeniden oluşturdu.

MMPS ayrıca ileri düzey morfolojik analizleri destekler. Şekil 3'ten oluşturulan parametrelerin korelasyon analizi, farklı morfolojik özellikler arasındaki ilişkileri göstermiştir. Araçla tedavi edilen fareler, mikroglia yuvarlaklığı ile çevre arasında yalnızca zayıf bir korelasyon gösterdi (R² = 0.17), LPS ile tedavi edilen fareler ise daha güçlü bir korelasyon gösterdi (R² = 0.64), bu da artan mikroglial aktivasyonun yuvarlaklık ve çevrede eşzamanlı azalmalarla ilişkili olduğunu gösterdi (Şekil 4A). Ayrıca, maske alanı, hem araç hem de LPS ile işlenmiş gruplarda ortalama centroid mesafeyle güçlü pozitif korelasyonlar gösterdi (sırasıyla R² = 0.71 ve 0.88), bu da mikroglial aktivasyon durumuyla ilişkili dallanma karmaşıklığındaki değişikliklerle tutarlıdır (Şekil 4B).

Şekil 4: Mikrogliyal parametrelerin gelişmiş analizi. Tüm paneller, belirlenme katsayısı (^{R 2}) ile gösterilen ve %95 güven aralığıyla gölgelenmiş, en iyi uyan hayvan seviyesinde çizgilerdir. (A) Mikrogliyada mikrogliyal soma yuvarlaklığı ve toplam çevre uzunluğu eğilimi zayıf olarak araç grubunu oluşturur (^{R 2} = 0.17), ancak LPS maruziyetinden sonra daha güçlü korelasyona sahiptir (^{R 2} = 0.64). (B) Ortalama centroid mesafesi, aracın mikroglia alanı (R² = 0.71) ve LPS (^{R 2} = 0.88) gruplarıyla korelasyondur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: IF protokolünün negatif kontrol yoluyla doğrulanması. Her sıçan için aynı bölgeden bir beyin dilimi, otofloresans eksikliğini doğrulamak için birincil antikor ekleme olmadan IF protokolünden geçti (ölçek çubuğu = 75 μm) (A) DAPI için araç boyalı dokunun temsil edici görüntüsü (mavi). (B) Iba1 (kırmızı) için araç lekeli dokunun temsil edici görüntüsü. (C) DAPI (mavi) ve Iba1 (kırmızı) için araç boyalı doku temsil imajı. (D) DAPI için LPS lekeli dokunun temsil resmi (mavi). (E) Iba1 (kırmızı) için LPS boyalı dokunun temsil görüntüsü. (F) DAPI (mavi) ve Iba1 (kırmızı) için LPS boyalı dokunun temsil ifadesi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: MMPS Kullanıcılararası Varyasyonun Değerlendirilmesi. Birkaç kör kullanıcı, Şekil 3'teki aynı örneklerde MMPS kullandı ve hayvan düzeyindeki sonuçlar karşılaştırıldı. Tüm durumlarda, normallik testleri (Shapiro-Wilk ve Levene) anlamsızdı (p>0.05), bu da post-hoc Holm düzeltilmiş çift t-testi ile tekrarlanan ortalama ANOVA (p>0.05) kullanılmasına yol açtı. (A) Ortalama centroid mesafesi açısından her iki grupta kullanıcılar arasında anlamlı bir fark yoktu (p>0.05). (B) Çevre için kullanıcılar arasında her grupta belirgin bir fark yoktu (p>0.05). (C) Maske alanı için kullanıcılar arasında her grupta anlamlı bir fark yoktu (p>0.05). (D) Kullanıcılar arasında eksantriklik için her grupta anlamlı bir fark yoktu (p>0.05). (E) Her iki grupta kullanıcılar arasında yuvarlaklık açısından anlamlı bir fark yoktu (p>0.05). (F) Soma alanı için kullanıcılar arasında her grupta anlamlı bir fark yoktu (p>0.05). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu metodolojinin temel amacı, yaygın teknik engelleri azaltarak ve yerleşik morfolojik değerlendirme yaklaşımlarının güçlü yönlerini koruyarak mikrogliyal morfoloji analizine erişimi genişletmektir. MMPS, fraktal, iskelet, gövde ve Sholl analizleri dahil olmak üzere gelişmiş analizlerle uyumluluğu korurken ince mikrogliyal morfolojik değişikliklerin tespit edilmesini sağlar. Daha önce yayımlanmış yaklaşımlara kıyasla, MMPS erişilebilir bir grafiksel kullanıcı arayüzü, yaygın kullanılan morfolojik parametreler için entegre hesaplamalar ve kodlama gereksinimlerinin ortadan kaldırılmasını sağlarken, daha gelişmiş analizlerle uyumluluğu korur.

Birkaç kritik metodolojik adım, analitik doğruluk ve tekrarlanabilirliği güçlü şekilde etkiler. Yüksek kaliteli immünofloresans (IF) görüntüleme, güvenilir maske üretimi ve morfoloji hesaplamaları için gereklidir. Antikor özgüllüğü, görüntü kalitesinin önemli belirleyicilerinden biridir; çünkü spesifik olmayan etiketleme, arka plan floresansını artırır ve mikroglia ile çevre dokular arasındaki sinyal ayrımını azaltır. Benzer şekilde, optimal olmayan antikor konsantrasyonları floresans yoğunluğunu azaltabilir ve görüntü çözünürlüğünü düşürebilir. Z-yığını görüntülerinin elde edilmesi de kritiktir; çünkü Z-yığını görüntülemenin atlanması yapay olarak görünür mikroglial dallanma karmaşıklığını ve süreç yayılımını değiştirerek morfolojik hesaplamaları yanlışlaştırabilir.

MMPS işleme sırasında birkaç ek hususturma önemlidir. MMPS toplu görüntü işlemeyi desteklese de, bireysel görüntü optimizasyonu genellikle tercih edilir çünkü arka plan özellikleri ve boyama kalitesi görüntüler arasında önemli ölçüde farklılık gösterebilir. Görüntü kalitesi doğrudan maske üretim doğruluğunu etkiler; Bu nedenle, görüntü ön işleme sırasında yapılan optimizasyon, sonraki analizlerin tekrarlanabilirliğini ve sağlamlığını önemli ölçüde artırır. Mikrogliyal somaların dikkatli seçimi de önemlidir; özellikle hücrelerin görüntü sınırlarıyla temas etmemesi önemlidir; çünkü kısmi hücre seçimi soma ölçümlerini yapay olarak azaltabilir ve maske oluşumunu bozabilir. Maske kalite güvence incelemesinde, komşu hücreleri, aşırı arka planı veya görüntü sınırlarını içeren maskeler reddedilmelidir. Buna karşılık, daha küçük maskeler sadece tüm distal süreçleri yakalayamadıkları için reddedilmemelidir; çünkü yinelemeli maske oluşturma algoritması, maske boyutu ve bölgesel piksel yoğunluğuna göre yerel eşik parametrelerini kasıtlı olarak ayarlar.

Bu metodoloji son derece uyarlanabilir ve belirli deneysel gereksinimlere uygun şekilde değiştirilebilir. MMPS açık kaynak olduğu için, platform bireysel Z-yığını çerçevelerini analiz etmek veya otomatik hücre algılama algoritmaları dahil etmek için genişletilebilir ve tamamen otomatik bir morfoloji-analiz boru hattı oluşturulabilir. Ayrıca, oluşturulan maskeler ve soma taslakları, fraktal, gövde, iskelet ve Sholl analizleri için ImageJ tabanlı iş akışlarıyla uyumludur. MMPS Python 3.11'de geliştirildiği için, ek analizler de harici yazılım platformlarına ihtiyaç duymadan yaygın bilimsel Python paketleriyle doğrudan yazılıma entegre edilebilir.

Bu avantajlara rağmen, birkaç sınırlama göz önünde bulundurulmalıdır. MMPS, erkek Sprague-Dawley farelerinin belirli bir beyin bölgesinde nöroinflamasyon modeli kullanılarak doğrulandı ve farklı beyin bölgeleri, hastalık modelleri, tür veya biyolojik cinsiyet morfolojik sonuçları etkileyebilir. Bu nedenle MMPS'nin alternatif deneysel paradigmalara uygulanabilirliği pilot çalışmalarla doğrulanmalı veya önceki literatür karşılaştırmalarıyla desteklenmelidir. Ayrıca, IF tabanlı görüntüleme, odak düzleminin doğrudan üstünde veya altına uzanan süreçlerin maksimum projeksiyon görüntülerinde tespit edilmeyebileceği için üç boyutlu dallanma yapılarını eksik şekilde yakalar. Analiz edilen hücre sayısının artırılması bu sınırlamayı azaltmaya yardımcı olabilir. MMPS ayrıca görüntü alım kalitesine bağımlı kalmaya devam eder ve bu nedenle bireysel görüntüleme sistemleri, boyama protokolleri ve antikor preparatları için optimizasyon gerektirir. Düşük çözünürlüklü görüntüler, soma ve sıkı paketlenmiş dalların çevresindeki sınırların bulanıklaşması nedeniyle maske boyutunu yapay olarak şişirebilir. Bu nedenle, mevcut protokol görüntü kalitesini en üst düzeye çıkarmak için serbest yüzen IF yöntemleri ve birden fazla görüntü işleme seçeneği içermektedir.

MMPS ayrıca kullanıcılar hücreleri manuel olarak seçip soma taslağı gösterdiği için kullanıcıya bağlı değişkenlik potansiyelini de korur. Ancak, DAPI ve Iba1 kolokalizasyonunun kullanılması, hücre seçimi sırasında belirsizliği önemli ölçüde azaltır. Ayrıca, kör kullanıcı analizi, daha önce eğitilmemiş kullanıcılar arasında minimum değişkenlik gösterdi ve analitik iş akışının tekrarlanabilirliğini destekledi.

Daha önce yayımlanmış birkaç mikrogliyal morfoloji platformunun aksine, MMPS tamamen otomatik değildir. Ancak, bu tasarım segmentasyon doğruluğu ve kalite güvencesini önceliklendirmek için seçildi. Otomatik iş akışları, Python kaynak kodunun değiştirilmesiyle entegre edilip otomatik DAPI/Iba1 ortak lokalizasyon algılama, kontur tabanlı soma taslağı ve makine öğrenimi tabanlı maske kabul veya reddedilmesini mümkün kılabiliyordu. Ayrıca, MMPS büyük bir disk depolama kapasitesi gerektirir çünkü oluşturulan maskeler ve soma taslakları otomatik olarak .tiff dosyası olarak kaydedilir ve sonraki analizler ve kalite güvencesi için kullanılır. Depolama gereksinimleri, yazılımın hücre hücre bazında maskeleri sıralı olarak oluşturacak şekilde değiştirilmesi, ardından hemen kalite değerlendirmesi ve parametre çıkarılması ile azaltılabilir.

Sonuç olarak, MMPS, kodlama uzmanlığı veya in vivo görüntüleme yetenekleri gerektirmeyen standartlaştırılmış, açık kaynaklı bir platform sağlayarak mikrogliyal morfolojinin nicel analizine erişimi genişletir. Platform, IF tabanlı mikrogliyal morfolojinin tekrarlanabilir analizini kolaylaştırırken, gelişmiş aşağı yönlü analitik yaklaşımlarla uyumluluğu korur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
12-well plate	Fisher Scientific	07-200-82	Dokunma kesitlerinin inkübasyonu ve yıkanması için kullanılan plaka.
Alüminyum folyo	Fisher Scientific	01-213-101	Floresan numuneleri ışık maruziyetinden korumak için kullanılır.
Antijen Alma Tamponu (10×)	ThermoFisher Scientific	00-4955-58	İmmünofloresan boyama sırasında antijen erişilebilirliğini artırmak için kullanılır.
Anti-Iba1 birincil antikoru	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	019-19741	Mikroglia için immünofloresan etiketlemede kullanılan birincil antikor.
Cryostat	Fisher Scientific	95-710-0L	Dondurulmuş beyin dokusunu belirli kalınlıklarda kesmek için kullanılan alet.
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21428	Tavşan birincil antikorlarının görselleştirilmesi için kullanılan floresan ikincil antikor.
Donkey Serum	Fisher Scientific	50-413-115	Spesifik olmayan antikor bağlanmasını azaltmak için kullanılan blokaj reaktifi.
EVOS FL Auto 2 Görüntüleme Sistemi	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Görüntü alımı için kullanılan floresan mikroskobu.
Fiji (ImageJ) 2.16.0	NIH	fiji.sc	Aşağı akış morfoloji analizleri ve eklentileri için kullanılan görüntü işleme platformu.
Fluoromount-G	ThermoFisher Scientific	00-4959-52	Floresansı korumak ve kapakları sabitlemek için kullanılan montaj ortamı.
Izofluran	EntirelyPets Eczanesi	MWI502017	Hayvan prosedürleri sırasında kullanılan inhalasyon anestezisi.
Lipopolisakkarit	Millipore Sigma	L2630	Kemirgenlerde sistemik nöroinflamasyon ve mikroglial aktivasyonu indüklemek için kullanılır.
Matplotlib	https://pypi.org/project/matplotlib/		Veri görselleştirme ve şekil oluşturma için kullanılan Python çizim kütüphanesi.
MMPS (Mapping Microglial Parameters Software) v1.00	Bu çalışma	https://github.com/NeurodegenerativePharmaceuticalLab/Mapping-Microglia-Parameters-Software/releases/tag/v1.00	Mikroglial morfoloji analizi için geliştirilen açık kaynaklı yazılım platformu.
Net kuyuları	Millipore Sigma	CLS3477	Boyama prosedürleri sırasında serbest yüzen doku kesitlerini tutmak için kullanılan ekler.
Numpy	https://pypi.org/project/numpy/		MMPS içindeki sayısal hesaplamalar için kullanılan Python kütüphanesi.
Objektif lens (4×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4922	Anatomi yönlendirme ve bölge tanımlaması için kullanılan düşük büyütmeli objektif.
Objektif lens (40×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4625	Mikroglial morfoloji görüntüleme için kullanılan yüksek büyütmeli objektif.
opencv-python	https://pypi.org/project/opencv-python/		MMPS içindeki görüntü işleme işlevleri için kullanılan bilgisayarlı görü kütüphanesi.
Paraformaldehit	ThermoFisher Scientific	169650025	Bölümleme öncesi doku perfüzyonu ve korunması için kullanılan fiksatif.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Slayt korunumu için kullanılan kalıcı montaj ortamı.
Fosfat tamponlu salin	Fisher Scientific	BP3991	Doku yıkama ve reaktif hazırlanması için kullanılan tampon çözeltisi.
Pillow	https://pypi.org/project/Pillow/		Görüntü işleme işlemleri için kullanılan Python görüntü işleme kütüphanesi.
PyQt5	https://pypi.org/project/PyQt5/		MMPS grafik kullanıcı arabirimini oluşturmak için kullanılan Python GUI çerçevesi.
Python 3.11	Python Software Foundation	python.org	MMPS'yi geliştirmek ve çalıştırmak için kullanılan programlama dili ortamı.
R 4.3.2	R Foundation for Statistical Computing	r-project.org	Veri analizi ve grafik oluşturma için kullanılan istatistiksel yazılım.
Scikit-image	https://pypi.org/project/scikit-image/		Görüntü işleme ve segmentasyon için kullanılan Python görüntü analiz kütüphanesi.
Scipy	https://pypi.org/project/scipy/		Filtreleme ve görüntü işleme işlemleri için kullanılan Python bilimsel hesaplama paketi.
Sprague-Dawley Sıçanları	Evingo	002	Nöroinflamasyon modelinin doğrulanması için kullanılan deney hayvanları.
Sükroz	Fisher Scientific	S5-3	Beyin dokusunu dondurmadan önce kullanılan kriyoprotektif.
Tifffile	https://pypi.org/project/tifffile/		TIFF görüntü dosyalarını okumak ve yazmakla kullanılan Python paketi.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Dondurulmuş doku örneklerinin krioseksionu için kullanılan gömme ortamı.
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	İmmünofloresan sırasında membran permeabilizasyonu için kullanılan deterjan.