Sodyum Hidroksit ve Sodyum Deoksikolat Kullanılarak Deselülarize İnsan Periferik Sinir Greftlerinin Hazırlanması

Özet

Bu protokol, etkili hücresel uzaklaştırma ve doğal hücre dışı matris mimarisinin korunmasıyla deselülarize insan periferik sinir greftleri üretmek için sodyum hidroksit işlemini peristaltik pompa güdümlü bir solüsyon değişim sistemiyle birleştiren standartlaştırılmış bir alkali destekli deselülarizasyon yöntemini açıklamaktadır.

Özet

Periferik sinir yaralanmaları genellikle aksonal rejenerasyon için yapısal rehberlik sağlayan greft materyaller gerektirir. Otolog sinir grefti kullanımı klinik altın standart olmaya devam etse de, kullanımı donör bölge morbiditesi ve sınırlı doku mevcudiyeti nedeniyle kısıtlıdır. Bu kısıtlamalar, sinir rejenerasyonu için alternatif bir biyomateryal olarak deselülerize insan periferik sinir greftlerine olan ilginin artmasına yol açmıştır. Ancak, yaygın olarak kullanılan deterjan bazlı deselülerizasyon protokolleri, hücre dışı matris (ECM) mimarisini bozabilir ve greft kalitesini tehlikeye atabilecek sitotoksik kalıntılar bırakabilir. Bu makalede, alkali destekli bir deselülerizasyon yaklaşımı kullanılarak deselülerize insan periferik sinir greftlerinin hazırlanması için standartlaştırılmış bir protokol açıklanmaktadır. Prosedür, etkili hücresel yıkımı teşvik etmek için sodyum hidroksit (NaOH) işlemi ile başlar ve ardından, doğal ECM organizasyonunu korurken geri kalan hücresel ve immünojenik bileşenleri uzaklaştıran hafif bir sodyum deoksikolat (SDC) adımı ile devam eder. Bu strateji, doğal ECM mimarisinin korunmasını desteklerken deterjan maruziyetini sınırlandırır. İş akışı; donör sinir hazırlığı, kontrollü NaOH işlemi, ardından gelen hafif SDC işlemi ve kalıntı işlem maddelerinin uzaklaştırılmasını kolaylaştırmak için peristaltik pompa güdümlü bir sistem kullanılarak sürekli çözelti değişimi altında kapsamlı yıkama aşamalarını içerir. Yapısal bütünlüğü korumak ve greftleri nihai paketleme ile sterilizasyona hazırlamak için ek son işlem adımları uygulanır. Deselülerizasyon verimliliği, histolojik analiz ve kalıntı DNA kantifikasyonu ile değerlendirilir ve ECM yapısının korunması taramalı elektron mikroskobu kullanılarak incelenir. Kalıntı SDC yokluğu ve işlenmiş greftlerin biyouyumluluğu sitotoksisite testleri ile onaylanmıştır. Bu protokol, periferik sinir rejenerasyonu araştırmaları ve translasyonel uygulamalar için deselülerize insan periferik sinir greftleri üretmek amacıyla pratik bir yaklaşım sunmaktadır.

Giriş

Periferik sinir yaralanmaları ciddi fonksiyonel bozukluklara yol açabilir ve rejeneratif tıp ile rekonstrüktif cerrahide önemli bir klinik zorluk olmaya devam etmektedir. Segmental sinir defektlerinin rejenerasyonu, sadece yaralanma boşluğunu köprülemekle kalmayıp aynı zamanda aksonal rejenerasyonu ve reinnervasyonu desteklemek için yapısal rehberlik ve biyokimyasal ipuçları sağlayan greft materyalleri gerektirir. Otolog sinir greftleme, doğal hücre dışı matris (ECM) mimarisini koruduğu ve sinir rejenerasyonu için destekleyici bir mikroçevre sağladığı için yaygın olarak klinik altın standart olarak kabul edilmektedir^1,2. Ancak, klinik kullanımı donör doku mevcudiyetinin kısıtlılığı, ek cerrahi prosedürlere duyulan ihtiyaç ve donör bölge morbiditesi ile sınırlıdır^3,4. Bu sınırlamalar, özellikle immunojenik hücresel bileşenleri minimize ederken doğal ECM mimarisini koruyan deselülerize periferik sinir greftleri başta olmak üzere alternatif greft materyallerinin geliştirilmesini tetiklemiştir^5,6,7,8.

Deselülerize sinir greftlerinin performansı, deselülarizasyon sürecine büyük ölçüde bağlıdır. Geleneksel yöntemler tipik olarak, lipid membranlarını çözerek hücresel bileşenleri uzaklaştıran Triton X-100 ve sodyum deoksikolat (SDC) gibi deterjan bazlı reaktiflere dayanır^9,10,11. Ancak, bu deterjanlara uzun süre maruz kalmak ECM mikro yapısını bozabilir ve hücresel canlılığı ile rejeneratif sonuçları olumsuz etkileyen kalıntı sitotoksik maddeler bırakabilir^12,13. Sonuç olarak, ECM bütünlüğünü korurken hücrelerin verimli bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlayan alternatif deselülarizasyon stratejileri aktif olarak araştırılmaktadır¹⁴. Sodyum hidroksit (NaOH) kullanılarak yapılan alkali deselülarizasyon, ekstrem pH koşullarının hücresel bileşenleri, nükleik asitleri ve lipidleri etkili bir şekilde degrade edebilmesi nedeniyle potansiyel bir alternatif yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır^15,16,17. Buna rağmen, güçlü alkali koşullara kontrolsüz maruziyet ECM bütünlüğünü tehlikeye atabilir; bu durum, hassas bir şekilde kontrol edilen işlem koşullarının önemini vurgulamaktadır^16,18.

Burada, peristaltik pompa güdümlü sürekli bir solüsyon değişim sistemi içeren, insan periferik sinir greftleri için standardize edilmiş alkali destekli bir deselülarizasyon protokolü sunulmaktadır. Geleneksel statik daldırma yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu dinamik süreç sürekli solüsyon değişimine olanak tanıyarak hücresel döküntülerin ve kalıntı işlem ajanlarının uzaklaştırılmasını kolaylaştırır. Bu makale; donör sinir hazırlığı, kontrollü alkali destekli deselülarizasyon ve peristaltik pompa güdümlü bir sistem kullanılarak gerçekleştirilen sürekli solüsyon değişimi dahil olmak üzere tüm iş akışının adım adım görsel bir gösterimini sunmaktadır. Elde edilen greftler, etkili deselülarizasyonu ve ECM ultrastrüktürünün korunduğunu doğrulamak için histolojik analiz, kalıntı DNA miktarının belirlenmesi ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak değerlendirilmiştir. Kritik teknik adımların net bir şekilde görselleştirilmesini sağlayan bu makale, deselülarize sinir greftlerinin hazırlanması ve gelecekteki işlem ölçeklendirmeleri için net bir şekilde tanımlanmış bir çerçeve sunmaktadır.

Protokol

Donated human peripheral nerves were obtained from a U.S. tissue bank under an exclusive agreement with L&C BIO and in compliance with the regulations of the American Association of Tissue Banks (AATB) and the U.S. Food and Drug Administration (FDA). Donor information, including age and sex, medical histories, and serological test results, was provided with the tissues and reviewed and approved by a certified medical director. Upon receipt, all tissues underwent incoming inspection, including verification of donor screening, serological testing, and testing for relevant pathogens; only tissues that met the predefined acceptance criteria were used in this study. All procedures involving human specimens were conducted in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. As no human subjects were directly recruited or involved in this study, a separate Institutional Review Board (IRB) approval number was not issued.

1. Prepare the solutions (Day 1)

1. Prepare 0.25 N sodium hydroxide (NaOH) solution by dissolving 10 g of NaOH in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
2. Prepare 4% sodium deoxycholate (SDC) solution by dissolving 40 g of SDC in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
3. Transfer each prepared solution into sterile glass bottles.
   CAUTION: Handle sodium deoxycholate (SDC) inside a chemical fume hood. Wear appropriate personal protective equipment, including gloves, a laboratory coat, and eye protection, to prevent inhalation and skin contact.

2. Prepare the peripheral nerve segments for decellularization

1. Disinfect the outer surface of the packaged raw peripheral nerve and open the package aseptically.
2. Rinse the peripheral nerve several times with sterile distilled water.
3. Remove residual adipose tissue, connective tissue, unnecessary branches, and damaged nerve tissue using sterile scissors and forceps. Rinse the peripheral nerve again with sterile distilled water.
4. Cut the peripheral nerve into segments measuring 2–5 cm in length. Classify the prepared segments into three length groups: 2–3 cm, >3–4 cm, and >4–5 cm.
   NOTE: Process each length group separately because different IPA, NaOH, and SDC treatment durations are applied according to nerve segment length, as summarized in Table 1.

3. Set up the peristaltic pump system

1. Attach chemically resistant silicone tubing of sufficient length to both ends of the chromatography column.
2. Connect one end of the tubing to the peristaltic pump.
3. Connect the free ends of the tubing to a 1 L glass bottle containing isopropyl alcohol (IPA) using pump tubing to establish a closed-loop circulation system.
   NOTE: Secure all tubing connections firmly, as pressure and vibration from the peristaltic pump may cause the tubing to disconnect from the column or bottle.

4. Delipidize the peripheral nerve

NOTE: Unless otherwise indicated, perform all solution-exchange steps at room temperature (20–25 °C) using a peristaltic pump set to 90–186 mL/min, depending on the tubing configuration. Maintain the selected flow rate constant throughout each processing run.

1. Open one end of the chromatography column and partially fill the column with the IPA solution to ensure that the nerve tissue remains immersed immediately after insertion.
2. Using sterile forceps, gently grasp the outer tissue at one end of a single prepared peripheral nerve segment. Avoid directly compressing or grasping the main body of the nerve. Carefully lower the nerve segment into the solution within the column.
3. Using the forceps, gently straighten the nerve segment and position it longitudinally, parallel to the direction of fluid flow. Ensure that the segment is not folded, coiled, or pressed against the inner wall of the column or the outlet filter.
4. Close the column and position it at a slight upward incline toward the outlet, with the outlet placed slightly higher than the inlet. This orientation helps prevent the nerve segment from settling against either end filter, particularly the outlet filter.
   NOTE: Process one peripheral nerve segment per column per procedure. No additional physical fixation device is required. The natural buoyancy of the nerve tissue and the relatively gentle fluid flow help maintain the segment in a suspended and extended position. Inspect the tissue position during processing and gently reposition it with sterile forceps if it adheres to the column wall, filter, or itself.
5. Connect the IPA solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 1.5 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 2 h for segments measuring >3–4 cm, or 2.5 h for segments measuring >4–5 cm.
6. Drain the solution from the column.
7. Add 40 mL of sterile distilled water to the column. Gently invert or shake the column five times to wash the peripheral nerve.
8. Repeat steps 4.6 and 4.7 for a total of five washes.
9. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
   PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 5.1.
   NOTE: Minimize air bubbles inside the column to promote efficient solution exchange. Adjust the peripheral nerve segment as needed to keep it suspended in the solution and prevent it from adhering to the inner wall of the column or filter.

5. Perform the first decellularization (Day 2)

1. Connect the 0.25 N NaOH solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
2. Drain the solution from the column.
3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
   PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 6.1.

6. Perform the second decellularization (Day 3)

1. Connect the 4% (w/v) SDC solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
2. Drain the solution from the column.
3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
   PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 7.1.

7. Sterilize the decellularized peripheral nerve (Day 4)

1. Remove a small volume of distilled water from the column. Carefully retrieve the decellularized peripheral nerve while keeping it suspended in the remaining liquid.
2. Package the peripheral nerve together with sterile distilled water.
3. Sterilize the packaged peripheral nerve by gamma irradiation at a dose of 25 kGy.
   NOTE: Do not completely drain the distilled water from the column. Keep the nerve segment suspended in a sufficient volume of the remaining liquid to prevent it from adhering to the inner wall of the column and to facilitate gentle handling without allowing the liquid to overflow.

Sonuçlar

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing ...

Tartışma

Bu çalışma, periferik sinir rejenerasyonu için deselülerize insan periferik sinir greftleri üretmek amacıyla standartlaştırılmış, alkali destekli bir deselülarizasyon protokolü sunmaktadır. Protokol; donör sinir ön işlemi, kontrollü kimyasal deselülarizasyon ve peristaltik pompa güdümlü bir solüsyon değişim sistemini net bir şekilde tanımlanmış bir iş akışında birleştirerek, yerel ECM mimarisini korurken hücresel ve immünojenik bileşenlerin verimli bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlar.

Bu yön...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BT100-1L Çok Kanallı Peristaltik Pompa	Longer Pump	BT100-1L	Delipidizasyon, deselülerizasyon ve yıkama işlemleri sırasında sürekli sirkülasyon ve solüsyon değişimi sağlamak için kullanılır.
Econo-Column Kromatografi Kolonu, 2.5 × 10 cm	Bio-Rad	737-2512	Sürekli solüsyon değişimi sırasında periferik sinir segmentlerini tutmak için kullanılır.
İzopropil alkol (IPA)	Daejeong Chemicals	5035-4410	Periferik sinir dokusunun delipidizasyonu için kullanılır.
Masterflex Tygon E-LFL Pompa Hortumu	Thermo Scientific	06440-16	Sürekli solüsyon sirkülasyonu için peristaltik pompayı, kromatografi kolonunu ve solüsyon rezervuarlarını bağlamak için kullanılır.
Sodyum deoksikolat (SDC)	Sigma-Aldrich	30970-100G	Kalıntı hücresel bileşenleri uzaklaştırmak amacıyla ikinci deselülerizasyon adımında deterjan olarak kullanılır.
Sodyum hidroksit, NaOH	Duksan	1636	Hücresel parçalanma için.