Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Diyabetik Nefropatide Ligustri Lucidi Fructus'un Mitokondri İlgili Aday Biyobelirteçlerinin Belirlenmesi

57 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71592

⸱

15 Eylül 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Pharmaceutical and Food Engineering, Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Shanxi Key Laboratory of Integrative Systemic Regulation for Qi-Blood Homeostasis, 2College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Diyabetik nefropati (DN), mitokondriyal disfonksiyonu içerir. Transkriptomik, ağ farmakolojisi ve makine öğrenimi kullanarak, Ligustri Lucidi Fructus için CAT, FABP1, MAOA ve MAOB'yi aday mitokondri ile ilişkili biyobelirteçler olarak belirledik. db/db farelerde LLF, CAT ve MAOA'yı yukarı regüle ederek daha ileri mekanistik araştırmaları desteklemiştir.

Özet

Mitokondriyal disfonksiyon ve mitokondrilerdeki aşırı oksidatif stres, diyabetik nefropatide (DN) renal tübüler hasarı tetikleyen temel patolojik faktörlerdir. Her ne kadar Ligustri Lucidi Fructus (LLF) geleneksel olarak DN tedavisinde kullanılmaktadır; ancak ilgili mekanizmalar, özellikle mitokondri ile ilişkili genler ve yolaklar ile ilgili olanlar, hala yeterince anlaşılamamıştır. Bu çalışmada, DN ile ilişkili farklı eksprese edilen genleri (DEG'ler) belirlemek için GSE142025 veri setinin diferansiyel ekspresyon analizi kullanılmıştır. Özellik genleri, dört makine öğrenimi modelinin çıktılarının çapraz referanslanmasıyla seçilmiştir. Her iki veri setinde de anlamlı diferansiyel ekspresyon ve tutarlı ekspresyon paternleri gösteren genler, alıcı işletim karakteristiği (ROC) eğrisi analizi ile daha ileri düzeyde değerlendirilmiştir. Eğri altı alanı (AUC) > Her iki veri setinde de 0,7 değeri aday biyobelirteçler olarak tanımlanmıştır. Fonksiyonel zenginleştirme, immün infiltrasyon, ağ oluşturma ve moleküler kenetlenme analizleri gerçekleştirilmiştir. Kan glukozu, idrar mikroalbümin, histopatoloji ve aday biyobelirteçlerin RT-qPCR ekspresyonlarını değerlendirmek için bir DN fare modeli kullanılmıştır. Katalaz ve MAOA anlamlı düzeyde artış göstermiştir in vivoAday biyobelirteçler; ribozom fonksiyonu, valin, lösin ve izölösin yıkımı, sitokin-sitokin reseptör etkileşimleri ve peroksizomlarla ilişkili yolaklarda zenginleşmişti. Bu biyobelirteçler, CD8+ T hücreleri ve aktive olmuş mast hücreleri ile negatif; aktive olmuş NK hücreleri ve naïve B hücreleri ile pozitif korelasyon gösterdi. Taksifolin, beta-sitosterol ve eriodiktiyol, aday biyobelirteçlerle -5 kcal/mol'in altında bağlanma enerjileri sergiledi. CAT ve MAOA, daha ileri mekanistik incelemeler gerektiren gelecek vaat eden adaylardır.

Giriş

Dünya genelinde son evre böbrek yetmezliğinin önde gelen nedeni olan diyabetik nefropati (DN), diabetes mellitus'un en yaygın komplikasyonlarından biridir. Patolojik olarak, hem glomerüler hem de tübüler kompartmanlarda aşırı hücre dışı matris birikiminin yanı sıra intrarenal kan damarlarının kalınlaşması ve sklerozu ile karakterizedir2. DN genellikle proteinüri ve hipertansiyon ile ilişkilendirilir3. Gelişimi; vasküler endotel hücre hasarı, şiddetlenmiş inflamatuar yanıt ve uzamış hiperglisemi sonucu artan oksidatif stres ile yakından bağlantılıdır4. DN insidansı, özellikle orta yaşlı ve yaşlı diyabetik bireyler arasında dünya genelinde artmaktadır. Hastalık ilerledikçe, son evre böbrek yetmezliğine ve hatta kardiyovasküler komplikasyonlara yol açarak hastaların yaşam kalitesini ve prognozunu önemli ölçüde bozabilir5. DN için tanısal ve terapötik yaklaşımlardaki ilerlemelere rağmen, tanı için erken ve doğru aday biyobelirteçler hala belirlenememiştir ve patolojik süreçleri geri çevirmeye yönelik etkili tedavi stratejileri hala eksiktir. Bu nedenle, yeni ve hedeflenmiş anti-DN ilaçların geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır.

Mitokondriler; hücresel ve organizmal stabiliteyi korumak için gerekli olan hücresel biyoenerjetik, metabolik öncül sentezi, kalsiyum homeostazı, reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi, immün sinyalleme ve apoptoz için kritiktir6. Hücrenin enerji santralleri olan mitokondriler; glikoliz, trikarboksilik asit döngüsü ve oksidatif fosforilasyon gibi temel süreçlerde merkezi bir rol oynar7. Obezite, Krebs döngüsünü ve mitokondriyal solunum zincirini bozarak mitokondriyal disfonksiyona ve artan ROS üretimine yol açar. Mitokondriyal solunum zincirindeki yükselmiş ROS seviyeleri, obezite ile ilişkili inflamatuar yanıtı şiddetlendiren ve apoptozu teşvik eden oksidatif stresi tetikleyebilir8. Güncel araştırmalar; enerji metabolizmasındaki bozulmalar, aşırı ROS üretimi ve artan apoptoz sinyallemesi dahil olmak üzere, mitokondriyal disfonksiyonun DN patogenezindeki ve progresyonundaki önemli rolünü vurgulamıştır9. Kronik mitokondriyal disfonksiyon, böbrek hastalığının progresyonunu hızlandırır10. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyonun iyileştirilmesi, DN'ye karşı kritik bir koruyucu strateji olabilir.

Ligustri Lucidi Fructus (LLF), karaciğer ve böbrek besleyici özelliklerinin yanı sıra saçları koyulaştırma ve görme yetisini iyileştirme kabiliyetiyle bilinen Luteaceae ailesine ait kurutulmuş, olgun bir meyvedir. LLF'den ekstrakte edilen doğal bir heteropolisakkarit tanımlanmış ve bunun böbrekleri fibrozisten koruma potansiyeli ortaya çıkarılmıştır1. Son yıllarda, LLF'nin DN tedavisindeki kullanımına artan bir ilgi gösterilmiş ve dikkate değer renoprotektif etkiler kanıtlanmıştır11,12,13. Ayrıca, LLF ile mitokondri arasındaki karmaşık ilişki kapsamlı bir şekilde araştırılmış ve doğrulanmıştır. Özellikle bir çalışma, LLF'nin AMPK sinyal yolu aktivasyonu yoluyla mitokondriyal fonksiyonu modüle ederek faydalı etkiler gösterdiğini ortaya koymuştur14. Bu mekanizma, mitokondrileri oksidatif stresin neden olduğu hasara karşı etkili bir şekilde korur. Bu bulgular, hücresel enerji metabolizmasının sürdürülmesinde ve hücrelerin oksidatif strese karşı direncini artırmada LLF'nin hayati rolünü daha da vurgulamaktadır. Ancak, özellikle mitokondriyal fonksiyonun geri kazanımıyla ilgili kesin terapötik mekanizma hala yeterince anlaşılamamıştır.

Bu çalışmanın amacı, LLF'nin DN'deki mitokondriyal fonksiyon üzerindeki terapötik etkisinin altında yatan biyolojik mekanizmaları aydınlatmaktır. LLF'nin böbrek koruyucu etkileriyle ilişkili aday biyobelirteçleri belirlemek için, transkriptomik veriler ve aktif bileşen bilgileri entegre edilerek biyoinformatik araçlar kullanılarak genel veri tabanları taranmıştır. İmmün infiltrasyon, klinik özelliklerle ilişkilendirme, m6A RNA modifikasyonu, fonksiyonel zenginleştirme, düzenleyici ağ oluşturma ve moleküler kenetlenmeyi içeren ileri analizler, bu aday biyobelirteçlerin DN tedavisi sırasında mitokondriyal fonksiyonun düzenlenmesinde merkezi bir rol oynadığını göstermiştir. In vivo doğrulama, bunların önemini daha da teyit etmiştir. Bu kapsamlı analiz, LLF'nin DN'yi tedavi etme mekanizmalarına dair anlayışımızı derinleştirmekte ve mitokondriyal disfonksiyon temelli yeni terapötik hedeflerin geliştirilmesi için sağlam bir temel sağlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Veri toplama
DN ile ilişkili olan GSE142025 ve GSE96804 veri setleri için gen ekspresyon matrisi ve ilgili klinik veriler, Gene Expression Omnibus (GEO) veri tabanından (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) alındı15. Eğitim seti (GSE142025), GPL20301 platformu kullanılarak sekanslanan 27 DN'li hasta ve dokuz kontrolden alınan böbrek dokusu örneklerini içermekteydi. Doğrulama seti (GSE96804), GPL17586 platformu kullanılarak işlenen 41 DN'li hasta ve 20 kontrole ait sekanslama verilerinden oluşmaktaydı. Her iki veri seti de böbrek dokusuna odaklanmaktadır; GSE96804 veri seti özellikle böbreğin birincil filtrasyon birimi olan glomerulü incelemektedir (Şekil 1). GSE142025 veri seti (eğitim seti), tüm böbrek dokusu örneklerinden oluşmakta ve DN'nin transkriptomik manzarasına dair kapsamlı bir genel bakış sunmaktadır. Diğer yandan GSE96804 veri seti (doğrulama seti), özellikle glomerüler filtrasyon hasarının birincil bölgesi olan glomerüler dokuya odaklanmaktadır. Platform ve doku farklılıkları nedeniyle bu iki veri seti doğrudan birleştirilmediğinden, grup etkisi (batch effect) düzeltmesi uygulanmamıştır. Bunun yerine, veri setleri arası doğrulama bağımsız olarak gerçekleştirilmiştir. Her iki veri setinde tutarlı yönlü değişimler gösteren ve eğri altında kalan alan (AUC) değeri 0,7'den büyük olan genler, farklı böbrek kompartmanları arasındaki genelleştirilebilirliği destekleyen güçlü adaylar olarak seçilmiştir.

MitoCarta3.0 veri tabanından (https://www.broadinstitute.org/mitocarta) toplam 1.136 mitokondri ile ilişkili gen (MRG) çıkarılmıştır. LLF'nin aktif bileşenleri, ≥30% oral biyoyararlanım (OB) eşiği ve ≥0.18 ilaç benzerliği (DL) eşiği temel alınarak Geleneksel Çin Tıbbı Sistem Farmakolojisi (TCMSP) veri tabanı (http://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php) kullanılarak öngörülmüştür. Ardından, aktif bileşenler için potansiyel hedef genler Swiss Target Prediction veri tabanı (http://www.swisstargetprediction.ch/) kullanılarak öngörülmüştür.

Diferansiyel ekspresyon analizi
GSE142025'in (DN ile kontrol grubu) diferansiyel ekspresyon analizi, anlamlılık kriterleri P.adj < 0.05 ve |log2FoldChange| > 0.5 olarak belirlenerek limma paketi (v3.54.1) kullanılarak gerçekleştirilmiştir16. Volcano grafikleri ve ısı haritaları, sırasıyla ggplot2 (v 3.3.6) ve ComplexHeatmap (v 2.14.0) paketleri kullanılarak görselleştirilmiştir17,18. DEG'ler, MRG'ler ve aktif bileşenlerin potansiyel hedef genleri kesiştirilmiş ve örtüşen genler aday genler olarak tanımlanmıştır. Aktif bileşenleri ve aday genleri birbirine bağlayan ağ, Cytoscape yazılımı (v 3.9.0) kullanılarak oluşturulmuştur19.

Fonksiyonel zenginleştirme analizi ve protein-protein etkileşim (PPI) ağı oluşturma
Aday genlerin biyolojik fonksiyonlarını ve ilişkili sinyal yollarını araştırmak amacıyla, clusterProfiler paketi (v 4.6.2) kullanılarak Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri gerçekleştirilmiştir (P.adjust < 0.05). Ardından, PPI ilişkilerini belirlemek için aday genler STRING veri tabanına (https://cn.string-db.org/) girilmiş (güven düzeyi ≥ 0.4) ve Cytoscape (v 3.9.0) kullanılarak bir PPI ağı oluşturulmuştur20.

Makine öğrenimi
GSE142025 veri setine dayalı olarak; rastgele orman (RF), k-en yakın komşu (KNN), kısmi en küçük kareler (PLS) ve radyal tabanlı çekirdekli destek vektör makinesi (SVM) dahil olmak üzere dört makine öğrenimi algoritması, caret paketi (v6.0-93) kullanılarak uygulanmıştır. Önceki analizde tanımlanan aday genler tahmin değişkenleri olarak, hastalık durumu (DN veya kontrol) ise sonuç değişkeni olarak kullanılmıştır. KNN modeli için, tuneLength = 10 olacak şekilde trainControl fonksiyonu kullanılarak 10 katlı çapraz doğrulama uygulanmıştır. RF modeli 20 ağaçla (ntree = 20) kurulmuştur; PLS ve SVM modelleri ise orijinal caret iş akışında uygulanan ayarlar kullanılarak kurulmuştur.

Model artık dağılımları DALEX paketi (v2.4.3) kullanılarak değerlendirildi. Ardından, kayıp fonksiyonu olarak ortalama karekök hata (RMSE) belirlenerek DALEX variable_importance fonksiyonu ile permütasyon tabanlı değişken değerlendirmesi gerçekleştirildi. Elde edilen dropout_loss, ilgili değişkenin permütasyonundan sonra elde edilen RMSE değerini temsil eder21,2. Orijinal analitik iş akışında, tüm modellerde dropout kaybı < 0.281 olan değişkenler tutuldu ve dört modelin tamamında ortak olan genler, sonraki doğrulama aşamaları için konsensüs özellik genleri olarak tanımlandı.

Dört makine öğrenimi modeli, nihai bir klinik sınıflandırıcı oluşturmaktan ziyade öncelikle özellik önceliklendirmesi için kullanılmıştır. Buna bağlı olarak, tanısal ayrım daha sonra hem keşif hem de doğrulama veri setlerinde ROC analizi kullanılarak bireysel gen düzeyinde değerlendirilmiştir.

Aday biyobelirteçlerin belirlenmesi
GSE142025 ve GSE96804'te, DN ve kontrol örnekleri arasındaki özellik genlerinin ekspresyon farkları Wilcoxon testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Sadece anlamlı diferansiyel ekspresyona (P < 0.05) sahip olan ve her iki veri setinde uyumlu ekspresyon trendleri gösteren genler, alıcı işletim karakteristiği (ROC) eğrisi analizi için seçilmiştir. ROC eğrilerinin oluşturulması ve eğri altındaki alanın (AUC) hesaplanması için pROC paketi (v1.18.0) kullanılmış olup, her iki veri setinde AUC > 0.7 değerini gösteren genler aday biyobelirteçler olarak sınıflandırılmıştır23.

Gen seti zenginleştirme analizi (GSEA)
Aday biyobelirteçlerle ilişkili biyolojik fonksiyonlar ve sinyal yolları, GSE142025 veri seti üzerinde GSEA kullanılarak daha ayrıntılı şekilde incelenmiştir. İlk olarak, aday biyobelirteçlerin diğer tüm genlerle olan Spearman korelasyon analizi psych paketi (v2.2.9) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.24Korelasyon katsayıları hesaplanmış ve (yüksekten düşüğe doğru) sıralanmıştır. Referans gen seti olarak Molecular Signatures Database (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/) üzerinden c2.cp.kegg.v2023.1.Hs.symbols.gmt kullanılmıştır. Ardından, clusterProfiler paketinin (v4.6.2) kullanımıyla, sıralanan genlerin arka plan gen setindeki zenginleşmesini değerlendirmek amacıyla GSEA gerçekleştirilmiştir. Çoklu test düzeltmesi uygulanmıştır. aracılığıyla FDR yöntemi ve düzeltilmiş P-değerler (şöyle belirtilmiştir: P.adjust) değerleri, şu durumda anlamlı kabul edildi: < 0.05.

m6A modifikasyon analizi
Aday biyobelirteçlerin RNA metilasyon modifikasyonlarını incelemek için, m'yi öngörmek amacıyla SRAMP veri tabanı (http://www.cuilab.cn/sramp/) kullanılmıştır.6Aday biyobelirteçlerin ikincil yapıları içindeki yüksek güvenilirlikli pozisyonlara odaklanılarak modifikasyon bölgeleri belirlenmiştir. Ardından, |HepG2 (shRNA)| kullanılarak aday biyobelirteçlerle etkileşime giren m6A-modifiye proteinlerin tanımlanması için ENCORI veri tabanından (https://starbase.sysu.edu.cn/) yararlanılmıştır. > Kilit proteinleri taramak için 1 parametre kullanıldı. Ardından, kilit proteinler ile aday biyobelirteçler arasındaki etkileşim olasılığını tahmin etmek için RPISeq veri tabanı (http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/) kullanıldı. RF ve SVM sınıflandırıcı tahmin skorlarını oluşturmak için her ikisinin RNA dizileri düz metin formatında yüklendi. Skor 0,5'i geçtiğinde etkileşim anlamlı kabul edildi.25SRAMP analizi, m6A bölgesi tahmini için ‘High’ eşiği, ‘Transcript’ modu ve varsayılan parametreler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. ENCORI analizi, ‘HepG2 (shRNA)’ parametresi ile ‘miRNA-mRNA’ etkileşim fonksiyonu kullanılarak yapılmıştır. > 1. RPISeq analizi, varsayılan parametrelere sahip RF sınıflandırıcı kullanılarak gerçekleştirilmiştir; skorlar > 0,5 pozitif etkileşime işaret etmektedir. Bunlar hesaplamalı öngörülerdir; böbrek dokusundaki m6A modifikasyonunun veya RNA-protein etkileşimlerinin deneysel kanıtları değildir. HepG2 shRNA kriteri, ENCORI'nin önceden hesaplanmış veri setlerinden türetilmiştir ve böbreğe özgü düzenlemeyi yansıtmayabilir.

İmmün infiltrasyon analizi
GSE142025'teki hem kontrol hem de DN örneklerinde 2 immün hücre tipinin oranlarını tahmin etmek için CIBERSORT algoritması uygulanmış ve sonuçlar ggplot2 paketi (v3.3.6) kullanılarak oluşturulan bir ısı haritası ile görselleştirilmiştir26. CIBERSORT, LM2 imza matrisi kullanılarak, 1.0 permutasyon ile ve (mikrodiziler için önerildiği üzere) kuantil normalizasyonu devre dışı bırakılarak çalıştırılmıştır. CIBERSORT p < 0.05 olan örnekler ileri analizler için saklanmıştır. CIBERSORT, immün hücre fraksiyonlarını dökme (bulk) böbrek dokusu ekspresyonundan tahmin eder; bu yöntem kompartman spesifik infiltrasyonu (örneğin, glomerüler ile tubulointerstisyel arası) çözemez ve infiltre olan lökositleri resident immün hücrelerden ayıramaz. Bu nedenle, bildirilen korelasyonlar doku düzeyindedir ve uzamsal yöntemlerle doğrulanmalıdır. Diferansiyel bolluğa sahip immün hücreler ile aday biyobelirteçler arasındaki Spearman korelasyon analizi psych paketi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Ağların oluşturulması ve moleküler kenetlenme
Aday biyobelirteçlerle etkileşime giren mikroRNA'lar (miRNA'lar), miRNet veri tabanı (https://www.mirnet.ca) kullanılarak öngörülmüştür. Ardından, belirlenen miRNA'ları hedefleyen uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar), TarBase (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/tarbase) ve starbase (http://starbase.sysu.edu.cn/) veri tabanları aracılığıyla öngörülmüştür. Ağ oluşturma için her iki veri tabanında ortak olan lncRNA'lar seçilmiştir. Daha sonra Cytoscape yazılımı kullanılarak bir lncRNA-miRNA-mRNA düzenleyici ağı kurulmuştur. Aday biyobelirteçleri hedefleyen potansiyel aktif bileşenler, bir aktif bileşen-biyobelirteç ağı oluşturmak üzere seçilmiştir. Ek olarak, aktif bileşenler, aday biyobelirteçler ve GSEA'da belirlenen yolaklar, bir aktif bileşen-biyobelirteç-yolak ağı oluşturmak amacıyla Cytoscape'e dahil edilmiştir.

Potansiyel aktif bileşenler ile aday biyobelirteçler arasındaki bağlanma afinitesini değerlendirmek için moleküler docking analizi gerçekleştirilmiştir. Biyobelirteç proteinlerinin 3D yapıları, PDB dosya formatında Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB, https://www.rscb.org/pdb) üzerinden temin edilmiştir. Potansiyel aktif bileşenlerin 2D yapıları, PubChem veri tabanından (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) SDF formatında alınmıştır. Moleküler docking, CB-Dock platformu (http://clab.labshare.cn/cb-dock/php/blinddock.php) kullanılarak yürütülmüştür. -5 kcal/mol'den düşük bir bağlanma enerjisi, güçlü bir bağlanma afinitesine işaret etmiştir27.

Ligustri Lucidi Fructus hazırlama ve kimliklendirme
Burada, Ligustri Lucidi Fructus (LLF), Ligustrum lucidum W. T. Aiton (Oleaceae) bitkisinin kurutulmuş olgun meyvelerini ifade etmektedir. Botanik materyal, Çin Farmakopesine göre kimliklendirilmiş olup, 20240506, 20240911, 20241103 numaralı voucher örnekleri Shanxi Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'ne teslim edilmiştir.

Dekoksiyon hazırlığı için, nitelikli LLF dilimlerinin 20 g'ı, oda sıcaklığında 30 dk boyunca 1.0 mL distile suda bekletildi. Karışım şiddetli bir şekilde kaynatıldı ve ardından 60 dk boyunca kısık ateşte kaynatılmaya devam edildi. Filtrat toplandı ve geride kalan bitki materyalleri, başka bir 1.0 mL distile su ile 60 dk boyunca tekrar dekoksiyona tabi tutuldu. İki filtrat birleştirildi, filtrelendi, santrifüj edildi ve indirgenmiş basınç altında konsantre edilerek 1 g ham ilaç/mL nihai stok konsantrasyonu (toplam hacim 10 mL) elde edildi. Hazırlanan dekoksiyon, kısa süreli kullanım için 4 °C'de veya uzun süreli saklama için −20 °C'de muhafaza edildi. Deneysel güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği sağlamak amacıyla, LLF'nin ve dekoksiyonunun kalitesi Çin Farmakopesi standartlarına göre titizlikle tanımlandı ve doğrulandı.

Kalitatif tanımlama için ince tabaka kromatografisi uygulanmıştır. Kısaca, hazırlanan dekoksiyonun uygun bir hacmi santrifüjlenmiş ve süpernatan metanol ile ekstrakte edilmiştir. Filtrasyonun ardından, numune çözeltisi ve specnuezhenide referans standart çözeltisi aynı silika jel G plakasına damlatılmıştır. Geliştirme, kurutma ve ultraviyole ışık altında inceleme işlemlerinden sonra, numune çözeltisinin lekesi referans bileşik ile tutarlı renk ve konum göstermiş, böylece LLF'nin karakteristik biyoaktif bileşeninin varlığı doğrulanmıştır.

Kantitatif kalite kontrolü için yüksek performanslı sıvı kromatografisi deteksiyonu gerçekleştirilmiştir. Analiz, mobil faz olarak metanol–su kullanılan bir C18 kolonu ile yapılmıştır. Deteksiyon dalga boyu 24 nm olarak ayarlanmıştır. Dekoksiyondaki specnuezhenide içeriği, standart eğriye dayanarak belirlenmiştir. Sonuçlar, hazırlanan dekoksiyonun kimyasal bileşiminin stabil ve homojen olduğunu göstermiş ve hayvan müdahale deneyi boyunca tutarlı ilaç kalitesi sağlamıştır.

Hayvan deneyleri
On iki adet SPF sınıfı erkek db/db fare (8-9 haftalık) ve yaşla uyumlu altı adet db/m fare, Shanxi Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'nin SPF hayvan tesisinde tutulmuştur. Deneylerden önce hayvanlar, 12 saat ışık/12 saat karanlık döngüsü altında 7 gün boyunca adapte edilmiştir. ad libitum gıda ve suya erişim. Çalışma, Shanxi Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Onay No. 2022DW167). Belirtiler gösteren hayvanlar >Vücut ağırlığının %20'sini kaybeden, moribund duruma gelen veya yiyecek ve suya erişemeyen fareler, planlanan çalışma bitiş noktasından önce insani yöntemlerle ötanize edilmiştir. Çalışmanın sonunda, geri kalan tüm fareler, kurum protokollerine uygun olarak intraperitonal pentobarbital sodyum enjeksiyonu ve ardından servikal dislokasyon ile ötanize edilmiştir.

Alıştırma dönemini takiben, db/db farelerde DN modelinin oluşturulduğu, kuyruk veni kan glikoz seviyesinin ≥ 16 mmol/L olması ve pozitif idrar mikroalbumin test şeridi ile belirtilen mikroalbüminüri ile doğrulanmıştır. DN modelinin başarıyla oluşturulmasının ardından, db/db fareler rastgele iki gruba (grup başına n = 6) ayrılmıştır: DN model grubu (DN) ve LLF tedavi grubu (Treatment). Ayrıca, kontrol grubu (Control) olarak db/m fareler (n = 6) kullanılmıştır. Dozaj, diyabetik sıçanlarda LLF ile yapılan önceki farmakodinamik çalışmalara dayanarak seçilmiş ve vücut yüzey alanı normalizasyonu kullanılarak insan eşdeğer dozuna dönüştürülmüştür28. Kontrol ve DN gruplarına distile su verilirken, tedavi grubu 8 hafta boyunca 3.5 g/kg LLF almıştır. 8 haftalık uygulamadan sonra, sonraki testler için serum, idrar ve böbrek dokusu toplamak amacıyla tüm fareler ötanize edilmiştir.

Kan ve idrar göstergeleri
Serum glukoz seviyeleri tam otomatik bir Kan Biyokimya Analizörü kullanılarak analiz edildi. İdrardaki mikroalbümin konsantrasyonu kit talimatlarına göre ölçüldü (Ek Dosya 1).

Fare böbrek dokularının patolojik gözlemi
Böbrek dokuları histopatolojik inceleme için işlendi. %4 paraformaldehit ile fikse edildikten sonra dokular yıkandı,yıkandı,dehidre edildi,parafine gömüldü ve kesitleri alındı. Ardından hematoksilen ve eozin (HE) boyaması yapıldı ve patolojik değişiklikleri değerlendirmek için boyalı kesitler optik mikroskop altında incelendi.

Ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR)
Fare böbrek dokusundaki aday biyobelirteçlerin ekspresyonunu belirlemek için RT-qPCR kullanılmıştır. Toplam RNA, üretici talimatlarına göre ekstrakte edilmiş, ardından RNA konsantrasyonu ve kalitesi değerlendirilmiştir (Tablo 1). Ekstrakt RNA'dan, cDNA Sentez Kiti kullanılarak cDNA sentezlenmiştir. Amplifikasyon, şurada listelenen primer çiftleri ile gerçekleştirilmiştir: Tablo 1, kullanarak GAPDH referans gen olarak kullanılmıştır. Göreceli ekspresyon seviyeleri 2 ile hesaplanmıştır−ΔΔCt yöntem13,26.

İstatistiksel analiz
Tüm istatistiksel analizler, ilgili deneysel prosedürler için gerekli yazılımlarla birlikte R yazılımı (versiyon 4.2.2) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Aksi belirtilmedikçe, tüm istatistiksel testler çift yönlü yapılmış ve farklar P < 0.05 değerinde istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Transkriptomik diferansiyel ekspresyon analizi limma paketi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ayarlanmış P < 0.05 ve 0.5'ten büyük mutlak log2 kat değişim değerine sahip genler, diferansiyel eksprese olmuş olarak tanımlanmıştır.

Bağımsız DN ve kontrol örnekleri arasındaki aday gen ekspresyonlarının karşılaştırılması için, orijinal analitik iş akışında belirtildiği yerlerde parametrik olmayan Wilcoxon sıra toplamı testleri kullanılmıştır. Aday biyobelirteçler ile bağışıklık hücresi fraksiyonları arasındaki korelasyonlar, Spearman sıra korelasyonu kullanılarak değerlendirilmiştir.

Deneysel veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Üç bağımsız hayvan grubu arasındaki karşılaştırmalar, parametrik analiz varsayımları karşılandığında tek yönlü varyans analizi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Post hoc karşılaştırmalar için, varyanslar homojen olduğunda en düşük anlamlı fark testi, varyanslar eşit olmadığında ise Dunnett's T3 testi kullanılmıştır. Bazal ve 8. hafta farmakodinamik ölçümleri ayrı analiz edilmiş ve sunulmuştur; grup-zaman etkileşimine ilişkin herhangi bir çıkarım yapılmamıştır. Biyoenformatik ve makine öğrenimi analizleri için kullanılan R betikleri ve kaynak veriler Ek Dosya 1'de sunulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

DN tedavisinde LLF için potansiyel mitokondri ile ilişkili aday biyobelirteçleri sistematik olarak araştırmak amacıyla dört aşamalı bir analitik iş akışı tasarladık (Şekil 1). I. Aşama'da, GSE142025 veri setinden (eğitim seti, tüm böbrek, n=36) ve GSE96804 veri setinden (doğrulama seti, glomerulus, n = 61) alınan transkriptomik verileri, MitoCarta 3.0 veri tabanındaki 1.136 mitokondri ile ilişkili gen ve TCMSP veri tabanındaki 9 aktif bileşenin 517 öngörülen hedefi ile entegre ettik. Bu üç gen setinin ke...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

LLF, öncelikle karaciğer ve böbrekleri beslemek, diyabeti ve komplikasyonlarını tedavi etmek için kullanılan yaygın bir geleneksel Çin ilacıdır. Günümüzde DN için spesifik ilaçlar veya tedaviler bulunmamakta olup, yönetimi temel olarak hipoglisemik, hipolipidemik ve antihipertansif tedavilere dayanmaktadır30,31,32. Ancak bu tedaviler, renal hasar ilerlemesini yalnızca küçük bir hasta grubunda yavaşlatabilmektedir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma boyunca bizi destekleyen ve yardımcı olan tüm kişi ve kuruluşlara içten şükranlarımızı sunarız. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğal Bilimler Vakfı (No.81973486 ve 82173974), Shanxi Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı İdaresi araştırma projeleri (No.2024ZYYA021), Shanxi Çin Tıbbı Üniversitesi Disiplin Projesi (No.2026XK24) ve Shandong Çin Tıbbı Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fonu projesi (No. KYZK2024Q13) tarafından desteklenmiştir. Botanik materyali doğrulayan Shanxi Çin Tıbbı Üniversitesi'nden Doçent Qinqing Li'ye teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%4'lük Paraformaldehit Doku Tespit ÇözeltisiSaiyin Biotechnology Co., Ltd.71033600
Mutlak EtanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10009218
Kan Glukoz Ölçüm CihazıSinocare Inc.GA-3
Kan Üre Azotu (BUN) Analiz KitiNanjing Jianwei Bioengineering InstituteC03-2-1
C57BLKS/J db/db fareleriChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-0013
C57BLKS/J db/m fareleriChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-013
SantrifüjHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.HI650
Kloral HidratShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.302-17-0
Cytoscape (v3.9.0)https://cytoscape.org
m için veri tabanı6Bir modifikasyon tahminihttp://www.cuilab.cn/sramp/
Geleneksel Çin Tıbbındaki Aktif Bileşenler Veritabanıhttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
ENCORI / Starbasehttps://starbase.sysu.edu.cn/
Gen İfade Omisi (Gene Expression Omnibus - GEO)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Hematoksilin ve eosin (HE) boyama kitiServicebio C0105S
Yüksek Hızlı SantrifüjLabnet, ABDC2500-R-230V
İmmün İnfiltrasyon Analiz Aracıhttps://cibersort.stanford.edu/
Ligustri Lucidi FructusSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20240506
Manyetik KarıştırıcıJintan Zhongtian Instrument Factory, JiangsuT8-1
MikroskopOlympusBX53
MikrotomLeica, AlmanyaRM 2016
Mikro-hacim SpektrofotometreHangzhou Aosheng Instrument Co., Ltd.Nano-30
miRNethttps://www.mirnet.ca
MitoCarta 3.0https://www.broadinstitute.org/mitocarta
Model Interpretation R Paketihttps://cran.r-project.org/package=DALEX
Moleküler Kenetleme Platformuhttp://clab.labshare.cn/cb-dock/
Fare Mikroalbüminüri ELISA KitiHassas TestEM0632
Fare Mikroalbüminüri Test ŞeridiGuangzhou Huadu Gaoerbao Biotechnology Co., Ltd.20211203
Fare Serum Kreatinin ELISA KitiAbmartAB590A
MSigDBhttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/
PCR Termal DöngüleyiciRocheRoche LightCycler 480
R yazılımı (v4.2.2) + R paketlerihttps://www.r-project.org / CRAN/Bioconductor
RCSB PDBhttps://www.rcsb.org
RNA Ekstraksiyon KitiBeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF-036-01
RPISeqhttp://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/
RT-qPCR KitiBeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF949-T
SalidrosidSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20211009
Serum Kreatinin Analiz KitiNanjing Jianwei Biyoengineering EnstitüsüC01-2-1
SPF hayvan tesisiShanxi Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi
SRAMPhttp://www.cuilab.cn/sramp/
Lütfen çevirilecek metni (STRING) sağlayın. Metni ilettiğinizde, belirttiğiniz tüm akademik ve teknik kriterlere uygun olarak profesyonel Türkçe çevirisini gerçekleştireceğim.https://cn.string-db.org/
SwissTargetPredictionhttp://www.swisstargetprediction.ch/
TCMSPhttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
Tezhi PiganSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20210602
Doku Yüzdürme HavuzuWuhan JunjieJK-6

Kaynaklar

  1. Thipsawat S. Early detection of diabetic nephropathy in patient with type 2 diabetes mellitus: a review of the literature. Diabetes Vasc Dis Res. 2021;18(6):14791641211058856.
  2. Kanwar YS, Sun L, Xie P, Liu FY, Chen S. A glimpse of various pathogenetic mechanisms of diabetic nephropathy. Annu Rev Pathol. 2011;6:395-423.
  3. Santulli G, et al. Prediabetes increases the risk of frailty in prefrail older adults with hypertension: beneficial effects of metformin. Hypertension. 2024;81(7):1637-43.
  4. Jin Q, et al. Oxidative stress and inflammation in diabetic nephropathy: role of polyphenols. Front Immunol. 2023;14:1185317.
  5. Alicic RZ, Rooney MT, Tuttle KR. Diabetic kidney disease: challenges, progress, and possibilities. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(12):2032-45.
  6. Harrington JS, et al. Mitochondria in health, disease, and aging. Physiol Rev. 2023;103(4):2349-422.
  7. Peña FJ, et al. An integrated overview on the regulation of sperm metabolism (glycolysis-Krebs cycle-oxidative phosphorylation). Anim Reprod Sci. 2022;246:106805.
  8. de Mello AH, Costa AB, Engel JDG, Rezin GT. Mitochondrial dysfunction in obesity. Life Sci. 2018;192:26-32.
  9. Shen Y, et al. Notoginsenoside Fc, a novel renoprotective agent, ameliorates glomerular endothelial cells pyroptosis and mitochondrial dysfunction in diabetic nephropathy through regulating HMGCS2 pathway. Phytomedicine. 2024;126:155445.
  10. Zhang PN, et al. Mitochondrial dysfunction and diabetic nephropathy: nontraditional therapeutic opportunities. J Diabetes Res. 2021;2021:1010268.
  11. Zhang JL, et al. Structural characterization and protective effect against renal fibrosis of polysaccharide from Ligustrum lucidum Ait. J Ethnopharmacol. 2023;302(Pt A):115898.
  12. Luan R, et al. The protective effect of ethyl acetate and n-butanol fractions of wine-steamed Ligustri Lucidi Fructus on diabetic nephropathy in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:6512242.
  13. Luan R, et al. Pharmacodynamics, pharmacokinetics, and kidney distribution of raw and wine-steamed Ligustri Lucidi Fructus extracts in diabetic nephropathy rats. Molecules. 2023;28(2):791.
  14. Seo HL, et al. Liqustri lucidi Fructus inhibits hepatic injury and functions as an antioxidant by activation of AMP-activated protein kinase in vivo and in vitro. Chem Biol Interact. 2017;262:57-68.
  15. Yan M, et al. Identification of pyroptosis-related genes and potential drugs in diabetic nephropathy. J Transl Med. 2023;21(1):490.
  16. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47.
  17. Gustavsson EK, et al. ggtranscript: an R package for the visualization and interpretation of transcript isoforms using ggplot2. Bioinformatics. 2022;38(15):3844-6.
  18. Gu Z, Eils R, Schlesner M. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data. Bioinformatics. 2016;32(18):2847-9.
  19. Shannon P, et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 2003;13(11):2498-504.
  20. Wu T, et al. clusterProfiler 4.0: a universal enrichment tool for interpreting omics data. Innovation (Camb). 2021;2(3):100141.
  21. Dong H, et al. Identification through machine learning of potential immune-related gene biomarkers associated with immune cell infiltration in myocardial infarction. BMC Cardiovasc Disord. 2023;23(1):163.
  22. Pei B, et al. The development of prediction model for cuffed tracheal tube size from the middle finger in pediatrics: a concise and feasible approach. Transl Pediatr. 2023;12(12):2222-31.
  23. Robin X, et al. pROC: an open-source package for R and S+ to analyze and compare ROC curves. BMC Bioinformatics. 2011;12:77.
  24. Robles-Jimenez LE, et al. Worldwide traceability of antibiotic residues from livestock in wastewater and soil: a systematic review. Animals (Basel). 2021;12(1):60.
  25. Wang Y, et al. Bioinformatics analysis combined with clinical sample screening reveals that leptin may be a biomarker of preeclampsia. Front Physiol. 2022;13:1031950.
  26. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^−ΔΔCT method. Methods. 2001;25(4):402-8.
  27. Klejborowska G, et al. Synthesis, anticancer activity and molecular docking studies of N-deacetylthiocolchicine and 4-iodo-N-deacetylthiocolchicine derivatives. Bioorg Med Chem. 2021;32:116014.
  28. Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J. 2008;22(3):659-61.
  29. An Y, Duan H. The role of m6A RNA methylation in cancer metabolism. Mol Cancer. 2022;21(1):14.
  30. Mazzieri A, Porcellati F, Timio F, Reboldi G. Molecular targets of novel therapeutics for diabetic kidney disease: a new era of nephroprotection. Int J Mol Sci. 2024;25(7):3969.
  31. Breyer MD, Susztak K. The next generation of therapeutics for chronic kidney disease. Nat Rev Drug Discov. 2016;15(8):568-88.
  32. Leoncini G, et al. Blood pressure reduction and RAAS inhibition in diabetic kidney disease: therapeutic potentials and limitations. J Nephrol. 2020;33(5):949-63.
  33. Pofi R, et al. Diabetic nephropathy: focus on current and future therapeutic strategies. Curr Drug Metab. 2016;17(5):497-502.
  34. Arellano Buendía AS, et al. Immunomodulatory effects of the nutraceutical garlic derivative allicin in the progression of diabetic nephropathy. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3107.
  35. Zhang X, Agborbesong E, Li X. The role of mitochondria in acute kidney injury and chronic kidney disease and its therapeutic potential. Int J Mol Sci. 2021;22(20):11253.
  36. Liu Y, et al. DsbA-L interacting with catalase in peroxisome improves tubular oxidative damage in diabetic nephropathy. Redox Biol. 2023;66:102855.
  37. Zhong Y, et al. Jujuboside A ameliorates high fat diet and streptozotocin induced diabetic nephropathy via suppressing oxidative stress, apoptosis, and enhancing autophagy. Food Chem Toxicol. 2022;159:112697.
  38. Zhong Y, et al. Dioscin relieves diabetic nephropathy via suppressing oxidative stress and apoptosis, and improving mitochondrial quality and quantity control. Food Funct. 2022;13(6):3660-73.
  39. Issac PK, et al. Protective effect of morin by targeting mitochondrial reactive oxygen species induced by hydrogen peroxide demonstrated at a molecular level in MDCK epithelial cells. Mol Biol Rep. 2022;49(6):4269-79.
  40. Abo El-Asrar M, Ismail EAR, Elnhrawy AM, Thabet RA. Fatty acid binding protein 1 (FABP1) and fatty acid binding protein 2 (FABP2) as a link between diabetic nephropathy and subclinical atherosclerosis in children and adolescents with type 1 diabetes. J Diabetes Complications. 2023;37(3):108414.
  41. Gholaminejad A, Fathalipour M, Roointan A. Comprehensive analysis of diabetic nephropathy expression profile based on weighted gene co-expression network analysis algorithm. BMC Nephrol. 2021;22(1):245.
  42. Tanaka M, et al. Urinary fatty acid-binding protein 4 is a promising biomarker for glomerular damage in patients with diabetes mellitus. J Diabetes Investig. 2025;16(4):670-9.
  43. Liu Y, et al. Gastric cancer adapts high lipid microenvironment via suppressing PPARG-FABP1 axis after arriving in the lymph node. Redox Biol. 2025;85:103759.
  44. Borús DL, et al. Fatty acid binding protein 1 (FABP1) depletion promotes an oxidative metabolic shift in Caco-2 colorectal cancer cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 2025;1870(7):159661.
  45. Chu Y, et al. Glutathione peroxidase-1 overexpression reduces oxidative stress, and improves pathology and proteome remodeling in the kidneys of old mice. Aging Cell. 2020;19(6):e13154.
  46. Zhang F, et al. Mesenchymal stem cells alleviate rat diabetic nephropathy by suppressing CD103+ DCs-mediated CD8+ T cell responses. J Cell Mol Med. 2020;24(10):5817-31.
  47. Cao Q, et al. Renal F4/80+ CD11c+ mononuclear phagocytes display phenotypic and functional characteristics of macrophages in health and in adriamycin nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2015;26(2):349-63.
  48. Zhou W, et al. The landscape of immune cell infiltration in the glomerulus of diabetic nephropathy: evidence based on bioinformatics. BMC Nephrol. 2022;23(1):303.
  49. Bloch K, Shichman E, Vorobeychik M, Bloch D, Vardi P. Catalase expression in pancreatic alpha cells of diabetic and non-diabetic mice. Histochem Cell Biol. 2007;127(2):227-32.
  50. Zhao Y, et al. Taxifolin attenuates diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats. Am J Transl Res. 2018;10(4):1205-10.
  51. Ding S, Wang W, Song X, Ma H. Based on network pharmacology and molecular docking to explore the underlying mechanism of Huangqi Gegen Decoction for treating diabetic nephropathy. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:9928282.
  52. Guo S, et al. Correction: Eriodictyol: a review of its pharmacological activities and molecular mechanisms related to ischemic stroke. Food Funct. 2023;14(10):4949.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Mitokondriyal DisfonksiyonDiferansiyel EkspresyonMakine Öğrenmesi ModelleriFonksiyonel Zenginleştirmeİmmün İnfiltrasyonMoleküler KenetlenmeRibozom Fonksiyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.