Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kemogenetik ve spektral yaklaşımlarla gündüz sirkadiyen faz kaymalarını indüklemek

294 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71594

⸱

12 Haziran 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section on Light and Circadian Rhythms, National Institute of Mental Health (NIMH), National Institutes of Health (NIH)

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, gündüz sirkadiyen faz kaymasını güvenilir şekilde mümkün kılmak için kemogenetik ve mor ışığı temelli stratejiler sunmaktadır.

Özet

Memelilerde, gündüz saatlerinde sirkadiyen faz kayması, suprakiazmatik çekirdeğin (SCN) fotik yanıt verebilirliğinin azalmasıyla sınırlıdır ve bu aşamada sirkadiyen saati deneysel olarak manipüle etme yeteneğini kısıtlar. Bu nedenle, gündüz faz kaymalarını tetikleyen güvenilir yöntemler, sirkadiyen plastisite ve fotik tutulma mekanizmalarını araştırmak için gereklidir. Gün boyunca sirkadiyen saatin sağlam ve zamansal olarak hassas şekilde manipülasyonu mümkün kılan tamamlayıcı genetik ve spektral stratejiler tanımlanır. İlk yaklaşım, şu anda sadece farelerle sınırlı olup, Designer Drugs (DREADD'ler) tarafından Yalnızca Aktif Olan Tasarımcı Reseptörlerin intravitreal olarak taşınmasını içeren kemogenetik bir strateji uygular; böylece içsel olarak fotosensitif retinal ganglion hücreleri (ipRGC) aktive edilir. Bu yaklaşım, retinohipotalamik yolun kontrollü aktivasyonuna izin verir ve çevresel aydınlatma koşullarından bağımsız olarak tekrarlanabilir gündüz faz kaymalarını indük eder. İkinci yaklaşım, invaziv olmayan bir alternatif olarak dalga boyuna özgü optik uyarımı kullanır. Mor ışığa maruz kalmak, ipRGC'lerin spektral hassasiyetinden yararlanarak depolarizasyon blokunu azaltır ve sürekli aktivasyonu teşvik eder; böylece öznel gün boyunca güvenilir faz sıfırlaması mümkün olur. Bu yöntem memeli sistemleri arasında geniş çapta uygulanabilir ve genetik manipülasyon veya farmakolojik müdahale gerektirmez. Deneysel hazırlık, uyarılma zamanlaması, lokomotor aktivite kullanılarak faz kaymalarının doğrulanması ve c-Fos immünohistokimyası ile nöronal aktivasyonun değerlendirilmesi için ayrıntılı protokoller sağlanmaktadır. Tekrarlanabilirliği kolaylaştırmak için sirkadiyen zamanlama, uyarıcı parametreler ve deneysel kontroller gibi temel hususlar belirtilmiştir. Bu yaklaşımlar birlikte, gündüz sirkadiyen faz kaymalarını tetiklemek için çok yönlü ve deneysel olarak yönetilebilir araçlar sunar ve gündüz sirkadiyen yanıt vermenin altında yatan mekanizmaların doğrudan incelenmesini mümkün kılar.

Giriş

Memeli beyninin ana sirkadiyen saati olan suprachiasmatik çekirdek (SCN), uyku-uyanık döngüleri ve beslenme düzenleri dahil olmak üzere fizyoloji ve davranışta temel günlük ritimleri koordine eder. Dış çevreyle hizalanmayı korumak için, SCN doğrudan fotosensitif retinal ganglion hücrelerinden (ipRGC) doğrudan fotik girdi alır; bu hücreler, retina ışığı bilgisini ileten ve iç sirkadiyen ritimleri güneşgünü 1,2 ile senkronize eder.

Organizmalar arasındaki sirkadiyen sistemlerin tanımlayıcı özelliği, faza bağlı yanıtlanmadır: farklı sirkadiyen zamanlarda verilen aynı uyarıcın belirgin şekilde farklı etkiler yaratabileceğidir. Memelilerde gece ışığı SCN saatinin faz kaymalarını güvenilir şekilde indüklerken, öznel gün boyunca maruz kalma neredeyse hiç sıfırlanmayaratmaz. Bu gündüz hassasiyetsizliği, hem in vivo hem de in vitro preparatlarda tutarlı şekilde gözlemlenmiştir; burada fotik girdileri taklit etmeye çalışmalar önemli fazkaymaları yaratamıyor 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 .

Gündüz duyarsızlığı, en azından kısmen, SCN içindeki sirkadiyen kapı mekanizmalarının yanı sıra faz sıfırlama mekanizmalarını ve retina sürücüsünün yetersiz olmasına bağlanmıştır. Bu fikirle tutarlı olarak, ipRGC'ler fotopik koşullarda eşit şekilde yanıt vermez; Bir alt küme depolarizasyon bloğuna girer ve sürekli aksiyon potansiyeli17,18,19 ateşlemelerini sınırlar. Bu fizyolojik kısıtlama, gün içinde geleneksel fotik uyarımın etkinliğini azaltabilir. Bu sınırlamanın aşılması, geleneksel olarak fotik sıfırlamaya dirençli olarak kabul edilen gündüz saati plastisitesinin doğrudan sorgulanmasını mümkün kılar.

Öznel gün boyunca sirkadiyen saatin sağlam faz kaymasını mümkün kılmak için iki tamamlayıcı metodoloji tanımlanır. İlk yaklaşım, ortam aydınlatma koşullarından bağımsız olarak ipRGC'leri seçici olarak aktive etmek için kemogenetik bir strateji kullanır. Özellikle, Opn4Cre/+ fareleri, Designer Drugs (DREADD) tarafından Yalnızca Aktive Edilen Designer Receptor (DREADD) hM3Dq'yu kodlayan adeno-ilişkili virüs (AAV) injektereal enjeksiyonlarını Cre'ye bağımlı bir şekilde alır. Klozapin-N-oksitin (CNO) sirkadiyen zaman 4'te (CT4) uygulanması, ipRGC'lerin patlama benzeri ateşlenmesini tetikler ve retinohipotalamikyolun 19'un sürekli aktivasyonunu sağlar. Faz kaymaları, lokomotor aktivite kayıtları kullanılarak nicelendirilir ve SCN içindeki moleküler aktivasyon c-Fos immünohistokimyası ile değerlendirilir.

İkinci yaklaşım, daha geniş uygulama için invaziv olmayan bir strateji olarak dalgaboyuna özgü optik uyarım kullanır. Vahşi tip fareler, öznel günün ortasında sirkadiyen zamanında (CT6) mor ışığa (385 nm) maruz kalır. Mor ışık, mavi veya beyazışık 19'a kıyasla daha düşük depolarizasyon bloğu oluşturur ve sürekli ipRGC aktivasyonunu destekler. Faz kaymaları yukarıda açıklandığı gibi nicelendirilir.

Her iki yaklaşım da ipRGC odaklı sinyal göndermeyi SCN'ye artırmayı ve böylece öznel günün karakteristik azalmış fotik yanıt vermesini aşmayı amaçlar. Bu metodolojiler birlikte, geleneksel olarak fotik sıfırlamaya dirençli bir aşamada sirkadiyen saati manipüle etmek için sağlam ve deneysel olarak yönetilebilir stratejiler sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü (NIMH) Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (ASP-SLCR-01) yönergelerine uygun olarak onaylanmış ve uygulanmıştır. Tüm çabalar acıyı en aza indirmek ve kullanılan hayvan sayısını azaltmak için gösterildi. Kullanılan araştırma araçları Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Kemogenetik strateji

  1. Opn4Cre/+ farelerde adeno-ilişkili virüsün intravitreal enjeksiyonu
    1. Stereotaksik aşamayı ve tüm cerrahi aletleri uygun sterilizasyon prosedürleriyle temizleyin ve sterilize edin. Enjeksiyon cihazını kur ve cam bir kapiller enjeksiyon iğnesi tak.
    2. Fareyi isofluran ile anestezi edin. Oksijen akışını yaklaşık 1,5 L/dakika olarak ayarlayın. İndüksiyon için izofluranı %3–%5'e ayarlayın, işlem boyunca bakım için ise %1–3'e indirin.
    3. Yeterli anestezi alın, bir parmak sıkıştırmasıyla doğrulan. Hayvanın tamamen anestezi altında olduğunu düşünün, çünkü yoksunluk veya irkilme refleksi gözlemlenmemiştir.
    4. İşlem boyunca vücut sıcaklığını korumak için fareyi bir ısıtma pedinin üzerine koyun.
    5. Cam kapiler iğneleri çekin. İğneler, penetrasyon derinliğinin tutarlı olmasını sağlamak için stereomikroskop altında ince bir işaretleyici kullanılarak uçtan ~1,5 mm uzaklıkta işaretlendi.
    6. Alt göz kapağına, kör uçlu forsepsle nazikçe baskı uygulayarak göz küresi hafifçe dışarı çıkacak ve dorsal limbusu ortaya çıkar. Dorsal yaklaşımla, iğneyi göz yüzeyine teğen olarak sokun ve limbusun 0,5–1 mm gerisinde sklerayı delerek vaskülerleşmiş bölgelerde limbusu önler.
    7. İğneyi önceden belirlenen derinlikte vitreus odasına sokuyorum. Göz içi basıncını azaltmak ve iğne ucunun doku tarafından tıkanmasını önlemek için hafifçe geri çekilin.
    8. Toplam hacim 1,5 μL AAV çözeltisi (2,4 x 1013 GC/ml) enjeksiyon yapın, her biri 300 nL olmak üzere beş ardışık enjeksiyon olarak (50nl/s hızında) verilsin. Enjeksiyonlar arasında 5 saniye duraklayın, böylece difüzyon ve reflü en aza indirilebilir. Son enjeksiyondan sonra iğneyi yavaşça çekmeden önce 30 saniye bekleyin. Aynı işlemi kontralateral gözde aynı parametrelerle tekrarlayın, travma ve reflüsü en aza indirmeye özen gösterin.
    9. Ameliyattan hemen sonra ketoprofen (10 mg/kg, deri altına uygulanır).
    10. Farelerin davranış tesisine nakledilmesinden önce yeterli viral ifadeyi sağlamak için en az 2 hafta iyileşmesine izin verin.
  2. Tekerlek koşu faaliyetleri ve CNO yönetimi (Şekil 1A)
    1. Ev fareleri bireysel olarak koşu tekerlekli kafeslerde bulunur. Tekerlek koşma aktivitesini otomatik veri toplama sistemi kullanarak kaydedin.
    2. Fareleri 4–7 gün boyunca 12:12 saat açık-karanlık döngüye teşkil etti. Kararlı tutulmayı doğrulayın ve ardından hayvanları sürekli karanlığa (DD) geçirin.
    3. Faaliyet başlangıcını analiz yazılımı ile belirleyin. Gece kemirgenlerde aktivite başlangıcını CT12 olarak tanımlayın. CT4'ü buna göre hesaplayın.
    4. DD'de 8. günde, fareler CT4'te loş kırmızı ışık altında intraperitoneal CNO (1 mg/kg) veya salin enjeksiyonu alır.
    5. Hayvanları ev kafeslerine geri getirin ve sürekli karanlık altında tutun. Lokomotor aktiviteyi 8 gün boyunca kesintisiz kaydedin.
    6. Enjeksiyon öncesi ve sonrası dönemlerde aktivite başlangıçlarını belirlemek ve regresyon analizi yapmak için kullanılır. Faz kaymalarını, öngörülen ve gözlemlenen aktivite başlangıcı arasındaki fark olarak hesaplayın.
  3. Kemogenetik aktivasyon sonrası SCN c-Fos immünohistokimyası,
    1. Fareleri 12:12 saat ışık-karanlık döngüsüne geçirip sürekli karanlığa bırakırlar. DD'deki ikinci gün, CT6'da CNO uygulayın. Enjeksiyondan 30 dakika sonra hayvanları perfüz edin.
      Not: CT4, CNO etkilerinin öznel geceye kadar uzanma olasılığını en aza indirmek için davranışsal deneylerde kullanılmıştır, çünkü CNO birkaç saat aktif kalabilir. Buna karşılık, CT6, CNO'nun sirkadiyen saat üzerindeki akut etkilerini değerlendirmek için immünboyama deneylerinde kullanıldı; hayvanlar enjeksiyondan 30 dakika sonra perfüze edildi.
    2. Beyni disek ve sonradan %4 paraformaldehit ile gece boyunca 4 °C'de sabitleme yapın. Kriyoprotektif %30 sakrozda koyun, doku batana kadar. Koronal olarak 40 μm'de kesit.
    3. Bölümleri bloklayıcı çözeltide kuluçka yapın, ardından 4 °C'de gece boyunca birincil antikor kuluçkası yapılın. İkincil antikorlarla 1 saat boyunca yıkayıp kuluçka yapın. DAPI ve montaj bölümleriyle karşı boyama.
    4. Düzenli mikroskop ayarlarıyla görüntü alın. Görüntüleri analiz yazılımı kullanarak işleyin. mCherry-pozitif hücrelerle AAV enfekte bölgeleri tanımlayın.

2. Spektral strateji

  1. Vahşi tip fareleri davranış tesisine nakletmek ve yukarıda açıklandığı gibi tekerlekli kafeslerde tek tek barındırmak. Serbest koşan sirkadiyen aktiviteyi izlemek için hayvanları sürekli karanlık (DD) altında tutun.
  2. 8. günde, DD'de, sirkadiyen saatin 6'sında (CT6), ışık geçirmez dolaptan kafesi çıkarın ve fareyi 15 dakikalık bir ışık darbesine maruz bırakın.
  3. Fareleri mavi ışık darbesine (λmax = 470 nm; 1.8 × 1014–2.2 × 1014 foton/cm2/s) veya menekşe ışık darbesine (λmax = 385 nm; 1.45 × 1014–3.3 × 1014 foton/cm2/s) maruz bırakın; yoğunluk kafesin merkez ve dört köşesinde hayvan göz seviyesinde ölçülür.
  4. Her iki dalga boyu durumunda da, fareleri kafeslerin üst kısmı çıkarılmış şekilde ev kafeslerinde tutun. Kafesleri, ışık ışınının merkezi kafesin merkeziyle hizalanmış şekilde sabit bir ışık kaynağının altına yerleştirin; böylece eşit aydınlatma sağlanır.
  5. Işığa maruz kaldıktan sonra kafesleri sürekli karanlık altında hemen orijinal konumlarına döndürün. Faz kayması analizi için kesintisiz tekerlek çalışması aktivite kaydına devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CT4'te tuzlu bir hal alan AAV-DREADD ifade eden Opn4Cre/+ fareler, tekerlek hareketinde belirgin bir faz kayması göstermedi (n = 5; Şekil 1B). Buna karşılık, CT4'te CNO uygulaması aktivite başlangıcında anlamlı bir faz gecikmesi yarattı (ortalama ± SEM: 5,03 ± 0,48 saat; n = 5; Şekil 1C, D), bu sirkadiyen zamanda DREADD'nin aktivasyonunun lokomotor aktivite ritimlerini kaydırdığını göstermektedir. Den...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Sonuçlar, ipRGC'lerin öznel gün içinde aktivasyonunun farelerde sirkadiyen faz kaymalarını tetikleyebildiğini göstermektedir; bu zaman genellikle fotik uyarıma karşı hassasiyetin azalmasıyla karakterize edilir. Kemogenetik yaklaşım, dış ışıktan bağımsız olarak ipRGC'lerin seçici aktivasyonunu mümkün kıldı ve tekerlek koşu davranışında sağlam faz gecikmeleri üretti. Bu aktivasyon ayrıca SCN'de akut c-Fos ekspresyonunu indükleyerek merkezi sirkadiyan kalp pilinin aktivasyonunu doğruladı. B...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, NIMH SLCR üyelerine ve Johns Hopkins Biyoloji Fare Tri-Lab'a faydalı tartışmalar için teşekkür ediyor. Fonlama kaynakları: Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü Hibesi  ZIAMH002964 (S.H.)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AAV2-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherryAddgene44361Cre-dependent viral vector encoding excitatory DREADD (hM3Dq) fused to mCherry for selective ipRGC activation
Anti-c-Fos antibody (rabbit monoclonal)Cell Signaling Technology2250SPrimary antibody used to detect c-Fos as a marker of neuronal activation
Anti-tdTomato antibody (goat)LSBioLS-C340696Primary antibody used to detect mCherry/tdTomato reporter expression
Blue LED driverThorlabsLEDD1BPower supply for controlling intensity and output of blue LED
Blue LED light sourceThorlabsM470L5LED source emitting blue light (λmax ≈ 470 nm) for photic stimulation
ClockLab softwareActimetricsVersion 6.0.53Software for acquisition and analysis of circadian locomotor activity data
Clozapine-N-oxide (CNO)Sigma-AldrichC0832-5MGLigand used to activate hM3Dq DREADD receptors in vivo
DAPIInvitrogen62248Fluorescent nuclear stain for labeling cell nuclei
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555InvitrogenA21432Fluorescent secondary antibody for detection of goat primary antibodies
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA21206Fluorescent secondary antibody for detection of rabbit primary antibodies
Fluoromount-GInvitrogen00-4958-02Mounting medium used to preserve fluorescence in tissue sections
ImageJ (Fiji) softwareNIHVersion 2.16.0/1.54gOpen-source software for image processing and quantitative analysis
Opn4cre MiceThe Jackson LaboratryRRID:IMSR_JAX:035925Mice used for chemogenetic activation
Violet LED driverMightexSLA-1000-2Power supply for controlling violet LED output
Violet LED light sourceMightexBLS-LCS-0385-04-22LED source emitting violet light (λmax ≈ 385 nm) for wavelength-specific stimulation
Wild-type miceThe Jackson LaboratryJackson strain #101043Mice used for violet light experiment

Kaynaklar

  1. Hattar S, Liao HW, Takao M, Berson DM, Yau KW. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 2002;295(5557):1065–70.
  2. Jones JR, Simon T, Lones L, Herzog ED. SCN VIP neurons are essential for normal light-mediated resetting of the circadian system. J Neurosci. 2018;38(37):7986–95.
  3. Coursey PJ. Daily light sensitivity rhythm in a rodent. Science. 1960;131:33–35.
  4. Kornhauser JM, Ginty DD, Greenberg ME, Mayo KE, Takahashi JS. Light entrainment and activation of signal transduction pathways in the SCN. Prog Brain Res. 1996;111:133–46.
  5. Ding JM, Weber ET, Faiman LE, Rea MA, Gillette MU. Resetting the biological clock: mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO. Science. 1994;266(5191):1713.
  6. Mintz EM, Gillespie CF, Price KM, Albers HE. Activation of NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus produces light-like phase shifts of the circadian clock in vivo. J Neurosci. 1999;19(12):5124–30.
  7. Shirakawa T, Moore RY. Glutamate shifts the phase of the circadian neuronal firing rhythm in the rat suprachiasmatic nucleus in vitro. Neurosci Lett. 1994;178(1):47–50.
  8. Shibata S, Watanabe A, Hamada T, Ono M, Watanabe S. N-methyl-D-aspartate induces phase shifts in circadian rhythm of neuronal activity of rat SCN in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1994;267(2):R360–R364.
  9. Asai M, Yamaguchi S, Isejima H, Jonouchi M, Moriya T, et al. Visualization of mPer1 transcription in vitro: NMDA induces a rapid phase shift of mPer1 gene in cultured SCN. Curr Biol. 2001;11(19):1524–27.
  10. Sladek M, Sumova A. Modulation of NMDA-mediated clock resetting in the suprachiasmatic nuclei of mPer2 (Luc) mouse by endocannabinoids. Front Physiol. 2019;10:361.
  11. Shibata S, Moore RY. Neuropeptide Y and optic chiasm stimulation affect suprachiasmatic nucleus circadian function in vitro. Brain Res. 1993;615(1):95–100.
  12. Jones JR, Tackenberg MC, McMahon DG. Manipulating circadian clock neuron firing rate resets molecular circadian rhythms and behavior. Nat Neurosci. 2015;18(3):373–75.
  13. Kim S, McMahon DG. Light sets the brain’s daily clock by regional quickening and slowing of the molecular clockworks at dawn and dusk. Elife. 2021;10:e70137.
  14. de Vries MJ, Treep JA, de Pauw ES, Meijer JH. The effects of electrical stimulation of the optic nerves and anterior optic chiasm on the circadian activity rhythm of the Syrian hamster: involvement of excitatory amino acids. Brain Res. 1994;642(1-2):206–12.
  15. Rusak B, Groos G. Suprachiasmatic stimulation phase shifts rodent circadian rhythms. Science. 1982;215(4538):1407–09.
  16. Duy PQ, Komal R, Richardson ME, Hahm KS, Fernandez DC, et al. Light has diverse spatiotemporal molecular changes in the mouse suprachiasmatic nucleus. J Biol Rhythms. 2020;35(6):576–87.
  17. Liu A, Milner ES, Peng YR, Blume HA, Brown MC, et al. Encoding of environmental illumination by primate melanopsin neurons. Science. 2023;379(6630):376–81.
  18. Milner ES, Do MTH. A population representation of absolute light intensity in the mammalian retina. Cell. 2017;171(4):865–876.e16.
  19. Komal R, Beier C, Nath A, et al. ipRGC properties prevent light from shifting the SCN clock during daytime. Nature. 2026;650(8103):942–50. .
  20. Jewett ME, Rimmer DW, Duffy JF, Klerman EB, Kronauer RE, et al. Human circadian pacemaker is sensitive to light throughout subjective day without evidence of transients. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1997;273(5):R1800–R1809.
  21. Revell VL, Molina TA, Eastman CI. Human phase response curve to intermittent blue light using a commercially available device. J Physiol. 2012;590(19):4859–68.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kemogenetik AktivasyonSpektral Stim lasyonRetinohipotalamik Yolakntrinsik Olarak Fotosensitif Retinal GanglionDREADD lar AktivasyonuMenek e I Stim lasyonuc Fos mm nohistokimyasLokomotor AktiviteSirkadiyen Plastisite
Kemogenetik ve spektral yaklaşımlarla gündüz sirkadiyen faz kaymalarını indüklemek
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.