Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare Kaynaklı Pankreas Kanseri Hücrelerinde Otofagozomal Dinamikleri İzlemek İçin Mikrotübül İlişkili Protein Hafif Zincir 3'ün Western Blot Analizi

130 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71604

⸱

3 Eylül 2026

 ,  , 
1Traslational Medicine Research Unit, Center for Medical Education and Clinical Research (CEMIC), 2Programa de Estudios Pancreaticos, Hospital de Clinicas “Jose de San Martin”, Universidad de Buenos Aires, 3The Massachusetts General Hospital Cancer Center, Harvard Medical School

Bu makalede

Özet

LC3 immünobloting, otofajiyi izlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ancak dikkatli optimizasyon gerektirir. Bu protokol, Fiji kullanılarak yapılan densitometrik analiz için standartlaştırılmış bir iş akışı ve temel teknik hususları içeren, KPC kaynaklı pankreas kanseri hücrelerinde LC3-II saptaması ve kantifikasyonu için sağlam bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Özet

Otofaji, tümör ilerlemesine, stres adaptasyonuna ve tedaviye karşı direnç gelişimine katkıda bulunarak pankreatik duktal adenokarsinomda (PDAC) karmaşık bir rol oynar. Bu nedenle, otofagozomal dinamiklerin doğru değerlendirilmesi, kanser biyolojisi çalışmaları için esastır. Mevcut yöntemler arasında, mikrotübül ilişkili protein hafif zincir 3'ün (LC3) immünoblotlanması,le sitozolik (LC3-I) ve lipitlenmiş, otofagozomla ilişkili (LC3-II) formlar arasında ayrım yaparak otofagozomal dinamikleri izlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, LC3'ün düşük moleküler ağırlığı ve bu izoformlar arasındaki elektroforetik mobilite farkının çok az olması, dikkatli optimizasyon gerektiren teknik zorluklar teşkil etmektedir. Burada, KPC kaynaklı fare pankreas kanseri hücrelerinde LC3-II seviyelerinin Western blot ile yarı nicel analizi için tekrarlanabilir bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, LC3 izoformlarının güvenilir şekilde ayrılmasını ve tespitini sağlamak için hücre lizisi, elektroforez, protein transferi ve antikor tabanlı tespit için optimize edilmiş koşulları içermektedir. Ek olarak, Fiji (ImageJ) kullanılarak LC3-II bantlarının densitometrik analizi için standartlaştırılmış bir iş akışı sağlanmıştır. Yöntemin hassasiyeti, otofaji indüksiyonu (gemcitabine tedavisi) ve bozulmuş otofajik akış (VMP1 knockdown) koşulları altında artan LC3-II seviyelerinin tespiti ile gösterilmiştir. Lizis tamponu bileşimi ve antikor özgüllüğü dahil olmak üzere veri yorumlamasını etkileyen kritik teknik parametreler, yaygın deneysel hatalarla birlikte incelenmiştir. LC3 immünoblotlaması tek başına otofajik akışı tam olarak tanımlamak için yetersiz olsa da, tamamlayıcı analizlerle birleştirildiğinde otofajik aktiviteyi izlemek için sağlam ve erişilebilir bir yaklaşım sunar. Protokol, diğer deneysel bağlamlara uyarlanabilir ve böylece kanser modellerinde otofajinin mekanistik çalışmalarını kolaylaştırabilir.

Giriş

Makrooto faji (bundan böyle otofaji olarak anılacaktır), hücrelerin proteinler ve disfonksiyonel organeller dahil olmak üzere sitoplazmik materyalleri parçaladığı düzenlenmiş bir yıkım yoludur. Otofajinin karakteristik özelliği, hücresel kargoyu içine alan ve ardından yıkım için lizozomlara ileten, otofagozom olarak bilinen çift membranlı bir yapının oluşmasıdır1,2,3. Normal hücrelerde otofaji, proteinlerin ve organellerin kontrollü döngüsüne katkıda bulunarak oksidatif stresi sınırlar ve tümör gelişimi riskini azaltır. Ancak kanser hücrelerinde bu süreç, yüksek metabolik talep, besin eksikliği ve hipoksi koşulları altında sağkalımı desteklemek için kullanılabilir. Otofaji, düşman bir mikroortama adaptasyonu kolaylaştırarak, kısmen tedavi kaynaklı hücresel hasarı hafifleterek kemoterapi direncine de katkıda bulunur4,5.

Pankreas kanseri, Amerika Birleşik Devletleri'nde kansere bağlı ölümlerin üçüncü önde gelen nedeni olarak sıralanmaktadır. Pankreas kanserlerinin yaklaşık %90'ı pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) olarak sınıflandırılır. Erken teşhis ve terapötik gelişmelerin hasta sağkalımını artırdığı diğer birçok malignite ile 달리, PDAC vakaların %80'inden fazlasında ileri evrede teşhis edilir. Agresif tümör biyolojisi ve tedaviye karşı belirgin direnç ile birleşen bu geç evre sunumu, yaklaşık %11'lik bir 5 yıllık genel sağkalım oranı ile sonuçlanmaktadır6.

Onkogenik Kras'ın pankreasa özgü aktivasyonuna ve Cre rekombinaz tarafından yönlendirilen Trp53'ün koşullu delesyonuna dayanan KPC fare modeli, pankreatik duktal adenokarsinomun en yaygın kullanılan genetik olarak modifiye edilmiş modellerinden biridir. Bu farelerde, pankreatik intraepitelyal neoplazi (PanIN) aşamasından invaziv karsinoma ilerleyen ve insan hastalığına yakından benzeyen tümörler kendiliğinden gelişir. Önemli olan şudur ki; bu model, yoğun desmoplastik stroma ve immünosupresif bir tümör mikroçevresi dahil olmak üzere pankreas kanserinin temel özelliklerini yeniden sergilemektedir. KPC farelerinden izole edilen tümör hücreleri (KPC türevli hücreler), orijinal tümörlerin birçok genetik ve fenotipik özelliğini koruyan tamamlayıcı bir in vitro sistem sağlayarak mekanistik çalışmalara ve terapötik yanıtların kontrollü değerlendirmesine olanak tanır7,8.

VMP1, Beclin-1 ile etkileşime girerek ve PI3KC3 kompleksini çağırarak otofajiyi başlatan temel bir otofaji ilişkili proteindir9,10. Başlatma aşamasının ötesinde VMP1; otofazozom oluşumu10, kapanma11 ve mitofaji12 ile zimofaji13 gibi seçici süreçler dahil olmak üzere otofajinin birden fazla aşamasında yer alır. VMP1, otofajik akış boyunca etkili olmaya devam eder ve bir fosfolipid skramblaz olarak ek fonksiyonlar sergileyebilir14. Pankreasta VMP1 ekspresyonu tipik olarak düşüktür; ancak pankreatit ve onkogenik transformasyon gibi stres koşulları altında güçlü bir şekilde indüklenir ve burada mutant KRAS sinyalleme yolunun aşağısında otofajiyi teşvik eder15,16. VMP1, pankreas kanserinde aşırı eksprese edilir17 ve deneysel fare modelleri, VMP1'e bağımlı otofajinin tümör başlangıcını ve PanIN oluşumunu teşvik etmek için KRAS ile iş birliği yaptığını göstermiştir18. Ayrıca VMP1, gemcitabine19 gibi ajanlar tarafından yukarı regüle edilmesinin otofajiyi stimüle etmesi19 ve tümör hücresi sağkalımını desteklemesi17 nedeniyle kemoterapi direncine katkıda bulunur ve bu da pro-tümörijenik rolünü vurgular15.

Otofagozomlar, otofaji ile ilişkili protein mikrotübül ilişkili protein hafif zincir 3 (LC3) varlığı ile karakterize edilir20. Bazal koşullar altında LC3, ağırlıklı olarak sitoplazma ve çekirdek boyunca dağılmış çözünür bir formda (LC3-I) bulunur. Otofajinin aktivasyonu üzerine LC3, fosfatidiletanolamine konjugasyon yoluyla lipidasyon geçirerek membranla ilişkili form olan LC3-II'yi oluşturur1,21. LC3-II, bu modifikasyon nedeniyle LC3-I'den daha yüksek bir moleküler ağırlığa sahip olsa da, muhtemelen artan hidrofobisitesi nedeniyle SDS-PAGE sırasında daha hızlı göç eder. Sonuç olarak, LC3-I'den LC3-II'ye dönüşüm, proteolitik işlemeden ziyade lipidasyonu yansıtır; LC3-I tipik olarak yaklaşık 16 kDa'da ve LC3-II yaklaşık 14 kDa'da tespit edilir. LC3-II seviyeleri otofagozom bolluğu ile korelasyon gösterdiğinden, otofajik aktiviteyi izlemek için LC3 immunoblotting yaygın olarak kullanılmaktadır22. Bu nedenle, LC3 dinamiklerinin doğru değerlendirilmesi, otofajiyle ilişkili deneysel bulguların yorumlanması için esastır.

Bu çalışma, KPC türevli bir pankreas kanseri hücre hattında klasik bir LC3 immunoblot protokolünün standardizasyonunu ve teknik optimizasyonunu detaylandırmaktadır. LC3 düşük molekül ağırlıklı bir protein olduğu, LC3-I ve LC3-II formları elektroforetik mobilite açısından yalnızca ~2 kDa kadar farklılık gösterdiği ve LC3-II lipitlenmiş bir tür olduğu için optimizasyon özellikle önemlidir21,22. Sonuç olarak, prosedürdeki küçük varyasyonlar LC3 tespitini tehlikeye atabilir ve suboptimal sonuçlara yol açabilir. Ayrıca, örneklerin tür kökeni, optimal immünoreaktivite elde etmek için önemli bir husustur. Optimize edilen protokol, sırasıyla otofajiyi stimüle ettiği ve otofajik akışı bozduğu bilinen kemoterapötik ajan gemcitabine tedavisi ve VMP1 nakavt sonrası artan LC3-II seviyelerini tespit edebilecek kadar hassastır. Son olarak, veri kalitesi ve sonuç yorumlama üzerindeki etkilerini göstermek için iki potansiyel teknik hata vurgulanmıştır. Bu deneysel iş akışının genel bir özeti Şekil 1'de gösterilmiştir.

figure-introduction-1
Şekil 1: KPC kaynaklı hücrelerde LC3 immunoblot protokolünün şematik gösterimi.Immunoblotting ile LC3-II seviyelerinin tespit edilmesi ve miktarının belirlenmesi için kullanılan protokolün şematik özeti. KPC kaynaklı pankreas kanseri hücreleri kültüre edilir ve deneysel işlemlere tabi tutulur; ardından hücre lizisi, protein kantifikasyonu, SDS–PAGE, membran transferi, antikor temelli LC3 tespiti, kemilüminesans sinyal alımı ve bir yükleme kontrolüne göre normalize edilmiş LC3-II bantlarının densitometrik analizi gerçekleştirilir. İş akışı, LC3 dinamiklerinin güvenilir değerlendirmesi için gerekli olan temel prosedürel adımları ve kritik aşamaları vurgulamaktadır. BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanları içeren tüm prosedürler, kurum kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Massachusetts General Hospital'ın Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından #2019N000111 numaralı protokol kapsamında onaylanmıştır. Bu çalışmada kullanılan KPC kaynaklı pankreas kanseri hücre hattı, daha önce bu onaylı protokol altında Mostoslavsky laboratuvarında oluşturulmuştur. Reaktiflerin, kimyasalların ve ekipman bilgilerinin listesi Materyaller Tablosu'nda sunulmuştur.

1. Hücre hazırlığı

  1. Düşük pasajlı KrasG12D; Trp53f/+; p48-Cre (bundan sonra KPC olarak anılacaktır) kaynaklı pankreas tümör hücrelerini, %10 fetal bovine serum, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin içeren Roswell Park Memorial Institute ortamında (RPMI 1640) 6 kuyucuklu bir plakada ekleyin. Liz gününde %70-90 konfluans elde etmek için ekim yoğunluğunu ayarlayın.
    NOT: Kuyucuk başına 3,5 × 105 hücrelik bir ekim yoğunluğu, 72 saat sonra yaklaşık %80 konfluans ile sonuçlanmıştır. Büyüme oranları laboratuvarlar ve KPC modelleri arasında farklılık gösterebileceğinden, deneyi gerçekleştirmeden önce optimal ekim yoğunluğunu ampirik olarak belirleyin.
    NOT: Stabil VMP1-knockdown hücre hatları oluşturmak için, HEK293T hücrelerini paketleme plazmidleri ve ilgili lentiviral vektör ile polyethylenimine (PEI) kullanarak ko-transfekte edin ve lentiviral partiküller üretin. Lentiviral süpernatantları transfeksiyondan 72 saat sonra hasat edin, hücresel döküntüleri uzaklaştırmak için 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 × g hızında santrifüjleyin ve 0,45 µm şırınga filtresinden süzün. KPC hücrelerini, hasat edilen viral süpernatantlarla tek tur transdüksiyona tabi tutun. Stabil olarak transdükte edilmiş hücreleri 72 saat boyunca 2,5 µg/mL puromisin (10 mg/mL stok çözeltiden 1:4.000 seyreltme) ile tedavi ederek seçin.
  2. Hücreleri, %5 karbondioksit (CO₂) içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de kültüre edin.
  3. Ortamı taze ortamla değiştirin ve aynı koşullar altında inkübasyona devam edin.

2. 20 µM gemcitabine ile işlem yapılması

  1. Lizden bir gün önce RPMI ortamında 10 mM gemcitabine çözeltisi hazırlayın. 20 µM son konsantrasyona ulaşmak için her kuyucuğa 10 mM çözeltiden 4 µL uygulayın.
  2. Hücreleri %5 karbondioksit (CO₂) içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde, 37 °C'de 24 sa boyunca inkübe edin.

3. Hücre lizatları

  1. Plakayı buz üzerine yerleştirin ve soğuk fosfat tamponlu tuzlu solüsyon (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄ ve 2 mM KH₂PO₄) ile üç kez yıkayın.
  2. Proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 80 µL liziz tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, %1 Triton X-100 ve %0.1 SDS) ekleyin.
    NOT: Kuyucuklar arasında farklı konfluens seviyeleri gözlemlenirse, karşılaştırılabilir protein konsantrasyonları elde etmek için liziz tamponu hacmini ayarlayın. Kılavuz olarak, %10 konfluens başına ~10 µL liziz tamponu kullanın (örneğin, %70 konfluens için 70 µL ve %90 konfluens için 90 µL).
  3. Bir P200 pipet ucunun geniş (proksimal) ucunu kullanarak, hücreleri ayırmak ve liziz tamponunda toplamak için her bir kuyucuğun tüm yüzeyini iyice kazıyın.
  4. Lizatı bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın ve 15 dk boyunca buz üzerinde tutun.
  5. Numuneleri 4 °C'de, 10 dk boyunca 16,900 × g'de santrifüj edin.
  6. Süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  7. Protein miktar tayini için bir alikot alın ve analiz edilene kadar buz üzerinde tutun.
    NOT: Protein miktar tayini için, 2.5 µL lizatı 7.5 µL liziz tamponunda seyreltin ve 200 µL bisinkoninik asit reaktifi ile karıştırın. Alternatif protein miktar tayini yöntemleri de kullanılabilir.
  8. Lizatlara 4× Laemmli örnek tamponu (250 mM Tris-HCl, pH 6.8, %8 SDS, %40 gliserol, %0.04 bromofenol mavisi ve %20 β-merkaptoetanol) ekleyin ve iyice karıştırın. 77.5 µL lizat için 25.8 µL Laemmli örnek tamponu ekleyin.
  9. Numuneleri −80 °C'de saklayın.
    NOT: Protokol bu adımda duraklatılabilir. Numuneler, SDS–PAGE öncesinde iki haftaya kadar −80 °C'de saklanabilir.

4. SDS–PAGE ve Western blot

  1. Numuneleri 96 °C'de 5 dk ısıtın.
  2. Her numuneden 70 µg'ı %15'lik bir SDS-PAGE jeline (1,5 mm kalınlık) yükleyin ve boya önü ayırıcı jele girene kadar elektroforezi 90 V'da çalıştırın. %15 akrilamid/bis-akrilamid, 375 mM Tris-HCl (pH 8,8) ve %0,1 SDS içeren, kendi döküldüğü %15'lik poliakrilamid ayırıcı jel kullanın.
  3. Voltajı 120 V'a yükseltin ve boya önü jelin altına ulaşana veya jelin altından çıkana kadar elektroforeze devam edin. Moleküler ağırlık merdiveninin 10 kDa marker'ı jelden çıkmadan önce çalışmayı durdurun.
  4. Üst ve alt kısımları ayırmak için jeli yaklaşık 25 kDa'den kesin.
  5. Proteinleri, transfer tamponunda (25 mM Tris baz, 192 mM glisin ve %20 [v/v] metanol) metanol ile önceden aktive edilmiş 0,2 µm PVDF membrana; alt jel kısmı (<25 kDa) için 1 sa boyunca ve üst jel kısmı (>25 kDa) için 2,5 sa boyunca 200 mA'de aktarın.
  6. Membranı, hafif ajitasyon altında bloklama tamponunda 1 sa boyunca bloklayın.
  7. %0,1 Tween-20 içeren bloklama tamponunda 1:1.000 oranında anti-LC3 primer antikor çözeltisi hazırlayın.
    NOT: Anti-LC3 primer antikor 1:1.000 dilüsyonda, anti-aktin yükleme kontrol antikoru ise 1:4.000 dilüsyonda kullanılmıştır.
  8. Membranı, hafif ajitasyon altında anti-LC3 primer antikoru ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  9. Membranı TBS-T (TBS içinde %0,1 Tween-20; 20 mM Tris-HCl, pH 7,6 ve 150 mM NaCl) ile 5 dk boyunca dört kez yıkayın.
  10. Bloklama tamponunda 1:2.000 oranında yabanoturu peroksidaz-konjuge anti-tavşan sekonder antikor çözeltisi hazırlayın.
  11. Membranı, sekonder antikor ile oda sıcaklığında hafif ajitasyon altında 1 sa boyunca inkübe edin.
  12. Membranı TBS-T ile 5 dk boyunca dört kez yıkayın.
  13. Membranı TBS ile iki kez yıkayın.

5. Kemilüminesans saptama

  1. Kullanımdan hemen önce, Reagent A (luminol/güçlendirici çözeltisi) ve Reagent B (peroksit çözeltisi) çözeltilerinden eşit hacimlerde karıştırarak iki bileşenli geliştirilmiş kemilüminesans substratı hazırlayın.
  2. Laboratuvar mendili kullanarak membrandaki fazla sıvıyı nazikçe kurulayın.
  3. Membranı opak bir kutuya yerleştirin.
  4. Geliştirilmiş kemilüminesans çözeltisini membranın üzerine ekleyin, kutuyu kapatın ve 5 dk boyunca inkübe edin.
  5. Fazla çözeltinin membrandan süzülmesini sağlayın ve sinyal tespiti için membranı görüntüleme sistemine yerleştirin.
  6. Görüntüleme sisteminin üretici talimatlarına göre görüntüleri elde edin.

6. Fiji kullanılarak densitometrik analiz

  1. Görüntü dosyasını açmak için dosyayı Fiji penceresine sürükleyip bırakın.
  2. Görüntüyü 8-bit gri tonlamaya dönüştürün (Image → Type → 8-bit).
  3. Gerekirse, bantları yatay olarak hizalamak için görüntüyü döndürün (Image → Transform → Rotate).
    1. Önizlemeyi (Preview) etkinleştirin ve ızgara ayarını uygun bir çizgi sayısına (örneğin, 20) getirin.
    2. Bantlar düzgün bir şekilde hizalanana kadar döndürme açısını ayarlayın.
  4. Dikdörtgen seçim aracını kullanarak, yalnızca LC3-II'ye karşılık gelen bandı kapsayacak şekilde ilk şerit etrafında bir ilgi alanı (ROI) belirleyin.
    NOT: Seçim alanı, yüksekliğinin iki katından daha geniş olmamalıdır. Analize dahil edilen tüm bantlar için aynı ROI boyutlarını kullanın.
  5. Analyze → Gels → Select First Lane seçeneğini belirleyin.
  6. Aynı ROI'yi bir sonraki şeride taşıyın ve ilgili bandın etrafına konumlandırın.
  7. Analyze → Gels → Select Next Lane seçeneğini belirleyin.
  8. Son şerit seçilene kadar adım 6.6 ve adım 6.7'yi tekrarlayın.
  9. İntensite profillerini oluşturun (Analyze → Gels → Plot Lanes).
  10. Her bir pik taban çizgisini belirlemek için düz çizgi aracını kullanın ve sihirli değnek (wand) aracını kullanarak bant intensitesini niceliklendirin.
  11. Değerleri bir yükleme kontrolüne göre normalize edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol, farklı deneysel koşullar altında KPC kaynaklı bir pankreas kanseri hücre hattında LC3 dinamiklerini izlemek için Western blotting işlemini açıklamaktadır. Protokol, LC3 ve bir yükleme kontrolünün kemilüminesans görüntülerini oluşturur. Bu çalışmada, yükleme kontrolü olarak aktin kullanılmıştır.

Protokolün iki temsilci uygulaması gösterilmiştir. İlk olarak, kontrol KPC hücreleri ile gemcitabine uygulanmış KPC hücreleri karşılaştırılmıştır. Gemcitabine, pankreas kanseri hücrelerinde...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makale, KPC kaynaklı pankreas kanseri hücrelerinde klasik bir LC3 immünoblotlama protokolünün teknik optimizasyonunu ve standardizasyonunu açıklamaktadır. Otofajinin ve otofaji ile ilişkili proteinlerin pankreas kanseri gelişimi ve ilerlemesindeki giderek daha fazla kabul gören rolü göz önüne alındığında23, bu standartlaştırılmış iş akışı LC3 dinamiklerinin izlenmesi için güvenilir bir yaklaşım sunmaktadır. Protokol; kemoterapi, oksidatif stres, hipoksi, endoplazmik retikulum stresi ve gen aşır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) [PIP 2021–2023 GI-11220200101549CO], Agencia Nacional de Promoción de la Investigación, el Desarrollo Tecnológico y la Innovación (Agencia I+D+i) [PICT-2021-I-A-00328], Universidad de Buenos Aires [UBACyT 2023–2025, 20020220300232BA] ve Fundación Norberto Quirno, Ciudad de Buenos Aires tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Yazarlar, Disease Models & Mechanisms tarafından verilen bir Gezi Bursu aracılığıyla sağlanan finansal destek için The Company of Biologists'a şükranlarını sunar. Bu destek, fonlanan ziyaret kapsamında ortaya çıkan çalışmaya katkıda bulunmuştur. Kurum hakkında daha fazla bilgiye https://www.biologists.com/ adresinden ulaşılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
C-DiGit Blot TarayıcıLI-COR BioScience3600Adım 5.6'daki kemilüminesans deteksiyonu için kullanılır.
10x Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Corning46-013-CMAdım 1.1'deki pasajlama öncesinde hücreleri yıkamak için steril 1x PBS hazırlamak amacıyla kullanılır.
2-Merkaptoetanol (β-merkaptoetanol)Sigma-Aldrich (Merck)M31484 hazırlamak için kullanılır× Adım 3.8'de SDS-PAGE numune hazırlığı için kullanılan Laemmli numune tamponu.
3B ÇalkalayıcıDLABSK-D1807-EBloklama, primer ve sekonder antikor çözeltilerinde inkübasyonun yanı sıra yıkama basamaklarında (Adım 4.6, 4.8, 4.9, 4.11, 4.12 ve 4.13) membranların inkübasyonu için kullanılır.
6 Kuyucuklu Hücre Kültür PlakasıSORFASCP-11-006Adım 1.1'de hücre ekimi yapmak için kullanılır.
AkrilamidSigma-Aldrich (Merck)A8887Adım 4.2 için gerekli olan %15'lik SDS-PAGE jelinin hazırlanmasında kullanılır–4.5.
Anti-Gliseraldehit-3-Fosfat Dehidrogenaz, fare monoklonal, klon 6C5Merck MilliporeMAB374RRID:AB_2107445 Reaktivite:
insan, kedi, domuz, fare, tavşan, balık, köpek, sıçan. Knockdown verimliliğini değerlendirmek için yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır (Şekil 2C ve 2D).
Anti-fare IgG, HRP-bağlı AntikorHücre Sinyalizasyon Teknolojisi7076RRID: AB_330924. Adım 4.10'da sekonder antikor çözeltisini hazırlamak için kullanılmıştır.
Tavşan IgG'ye karşı, HRP bağlantılı antikorHücre Sinyalizasyon Teknolojisi7074RRID: AB_2099233. Adım 4.10'da sekonder antikor çözeltisini hazırlamak için kullanılmıştır.
Anti-β-Aktin (ACTB) Antikoru fare monoklonal, AC-15Sigma-Aldrich (Merck)A1978RRID:AB_476744 Reaktivite: koyun, sazan, kedi, tavuk, sıçan, fare, Hirudo medicinalis, tavşan, köpek, domuz, insan, sığır, guinea pig. Şekil 2A, 2B, 2E, 2F, 2G ve 2H'de yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır.
Bromofenol mavisiSigma-Aldrich (Merck)B01264'ü hazırlamak için kullanılır× Adım 3.8'deki SDS-PAGE örnek hazırlama işlemi için Laemmli örnek tamponu.
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Sigma-Aldrich (Merck)E9884Düşük deterjanlı liziz tamponunun hazırlanmasında kullanılmıştır (Şekil 2G ve 2H).
Fetal Bovin SerumNATOCOR Lintc-634Hücre kültürü için tam besiyeri hazırlamak amacıyla kullanılır (Adım 1 ve 2).
FijiAçık kaynaklı yazılımLütfen çevirmek istediğiniz metni sağlayın.Görüntü analiz yazılımı
GliserolSigma-Aldrich (Merck)G55164 hazırlamak için kullanılır× Adım 3.8'deki SDS-PAGE örnek hazırlığı için Laemmli örnek tamponu.
GlisinSigma-Aldrich (Merck)G7126Adım 4.5 için transfer tamponu hazırlamak amacıyla kullanılır.
İmmün-Blot PVDF Membran, Rulo, 0.2 µm, 26 cm x 3,3 mBio-Rad1620177Adım 4.5'teki transfer işlemi için kullanılır.
Intercept (TBS) Bloklama TamponuLI-COR BioScience927-60001Adım 4.6'da bloklama yapmak ve Adım 4.7 ile 4.10'da birincil ve ikincil antikor çözeltilerini hazırlamak için kullanılır.
LC3 A/B (D3U4C) Tavşan Monoklonal Antikoru Hücre Sinyalleme Teknolojisi12741RRID: AB_2617131 Reaktivite:
insan, fare, tavşan. Adım 4.7'de primer antikor çözeltisini hazırlamak için kullanılır.
LC3B (D11) Tavşan Monoklonal AntikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi3868SRRID: AB_2137707 Reaktivite: İnsan. Şekil 2H'de LC3 primer antikoru olarak kullanılmıştır.
MetanolAnedra6197Adım 4.5'te PVDF membranı aktive etmek ve transfer tamponu hazırlamak için kullanılır.
Millex-HV Şırınga Filtre Ünitesi, 0.45 μm PVDF Merck MilliporeSLHV033RSLentivirüs içeren ortamı filtrelemek için kullanılır (Adım 1.1).
Mini dijital kuru banyoLabnet International, Inc.D 5060075Adım 4.1'deki örnekleri ısıtmak için kullanılır.
Mini-PROTEAN Tetra elektroforez sistemiBio-Rad1658025FCAdım 4.2, 4.3 ve 4.5'teki SDS-PAGE ve transfer işlemleri için kullanılır.
Fare Vmp1'ini hedefleyen MISSION shRNA (TRCN0000279038)Sigma-Aldrich (Merck)SHCLND-NM_029478Stabil VMP1-knockdown hücre hatları oluşturmak için kullanıldı (Adım 1.1).
N,N'-Metilenbisakrilamid (Bis-akrilamid)Sigma-Aldrich (Merck)M7279Adım 4.2 için gerekli olan %15'lik SDS-PAGE jelinin hazırlanmasında kullanılır–4.5.
Nabigem 1g GemcitabinMicrosules ArgentinaLütfen çevirmek istediğiniz metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz akademik standartlara ve teknik kriterlere uygun olarak profesyonelce Türkçeye çevireceğim.Adım 2'deki gemcitabine tedavisi için kullanılır.
Penisilin-Streptomisin ÇözeltisiSartorius03-031-1BHücre kültürü için komple besiyeri hazırlamak amacıyla kullanılır (Adım 1 ve 2).
Pierce BCA Protein Analiz KitiThermo Fisher Scientific23227Protein miktar tayini için kullanılır (Adım 3.7).
Pierce Proteaz İnhibitör TabletleriThermo Fisher Scientific A32953Adım 3.2'de liziz tamponu hazırlamak için kullanılır.
Polyethylenimine HCl MAX, Lineer (PEI MAX), MW 40.000Polysciences24765-1Lentiviral plazmidlerle transfeksiyon yapmak için kullanılır (Adım 1.1).
Potasyum klorür (KCl)Sigma-Aldrich (Merck)P9333Adım 3.1'de PBS hazırlamak için kullanılır.
Potasyum fosfat monobazik (KH2PO4)2PO4)Sigma-Aldrich (Merck)P5655Adım 3.1'de PBS hazırlamak için kullanılır.
PowerPac Temel Güç KaynağıBio-Rad1645050Adım 4.2, 4.3 ve 4.5'teki SDS-PAGE ve transfer işlemleri için kullanılır.
Önceden Boyanmış Protein MarkörüGenbiotechPM201Adım 4.2 - 4.4'teki SDS-PAGE işlemi için kullanılır.
Puromisin (10 mg/mL çözelti) InvivoGenant-pr-1Stabil olarak transduksiyonu gerçekleştirilmiş hücrelerin seçimi için kullanılır (Adım 1.1).
RPMI 1640GenbiotechMC2012LHücre kültürü için tam besiyeri hazırlamak amacıyla kullanılır (Adım 1 ve 2).
Sodyum klorür (NaCl)Sigma-Aldrich (Merck)S9888Adım 3.1'deki PBS'nin, Adım 3.2'deki lizis tamponlarının ve Adım 4.9'daki TBS'nin hazırlanmasında kullanılır.
Sodyum dodekil sülfat (SDS)Sigma-Aldrich (Merck)L3771Adım 3.2'de lizis tamponunu ve Adım 4.2 için gerekli olan %15'lik SDS-PAGE jelini hazırlamak için kullanılır–4.5.
Sodyum florür (NaF)Sigma-Aldrich (Merck)S7920Düşük deterjanlı liziz tamponunun hazırlanmasında kullanıldı (Şekil 2G ve 2H).
Sodyum fosfat dibazik (Na2HPO4)Sigma-Aldrich (Merck)S9763Adım 3.1'de PBS hazırlamak için kullanılır.
Sorval ST 16R SantrifüjThermo Fisher Scientific75004380Adım 1.1'deki hücrelerin ve Adım 3.5'teki lizatların santrifüjlenmesi için kullanılır.
SuperSignal West Pico PLUS kemilüminesans substratıThermo Fisher Scientific34577Adım 5.1'deki kemilüminesans saptaması için kullanılır.
Thermo Scientific 1300 Serisi A2 Sınıf II, Tip A2 Biyogüvenlik KabiniThermo Fisher Scientific1386Adım 1.1, 1.3 ve 2.1'deki steril hücre kültürü işlemleri için kullanılır.
Thermo Scientific BB 150 CO2 İnkübatörThermo Fisher ScientificBB150-2TCS-LAdım 1.2 ve 2.2'de hücre kültürü için kullanılır.
TMEM49/VMP1 (D1Y3E) Tavşan Monoklonal Antikoru Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi12929RRID: AB_2714018 Reaktivite: insan, fare, sıçan. Şekil 2C ve 2D'de VMP1 nakavt verimliliğini doğrulamak için primer antikor olarak kullanılmıştır.
Tris bazıSigma-Aldrich (Merck)T1503Adım 4.5 için transfer tamponu hazırlamak amacıyla kullanılır.
Tris hidroklorür (Tris-HCl)Sigma-Aldrich (Merck)T3253Adım 3.2 ve 4'te lizis tamponlarının hazırlanmasında kullanılır.× Adım 3.8'deki Laemmli örnek tamponu, Adım 4.2 için gerekli olan %15'lik SDS-PAGE jeli–4.5 ve Adım 4.9'daki TBS.
Triton X-100Sigma-Aldrich (Merck)T8787Adım 3.2'de liziz tamponlarının hazırlanmasında kullanılır.
Tripsin EDTAGibco11570626Adım 1.1'de hücrelerin pasajlanması için kullanılır.

Kaynaklar

  1. Grasso D, Renna FJ, Vaccaro MI. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Front Cell Dev Biol. 2018;6:146.
  2. Galluzzi L, et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO J. 2017;36(13):1811–1836.
  3. Wang Q, Sun Y, Li TY, Auwerx J. Mitophagy in the pathogenesis and management of disease. Cell Res. 2026;36(1):11–37.
  4. Debnath J, Gammoh N, Ryan KM. Autophagy and autophagy-related pathways in cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24(8):560–575.
  5. Altalbawy FMA, et al. Deciphering autophagy signaling in cancer: A paradigm shift from molecular classifications to clinical innovations. Semin Oncol. 2025;52(5):152397.
  6. Stoffel EM, Brand RE, Goggins M. Pancreatic cancer: Changing epidemiology and new approaches to risk assessment, early detection, and prevention. Gastroenterology. 2023;164(5):752–765.
  7. Kugel S, et al. SIRT6 suppresses pancreatic cancer through control of Lin28b. Cell. 2016;165(6):1401–1415.
  8. Hingorani SR, et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 2005;7(5):469–483.
  9. Molejon MI, Ropolo A, Re AL, Boggio V, Vaccaro MI. The VMP1-Beclin 1 interaction regulates autophagy induction. Sci Rep. 2013;3:1055.
  10. Ropolo A, et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. J Biol Chem. 2007;282(51):37124–37133.
  11. Zhao YG, et al. The ER-localized transmembrane protein EPG-3/VMP1 regulates SERCA activity to control ER-isolation membrane contacts for autophagosome formation. Mol Cell. 2017;67(6):974–989.e6.
  12. Vanasco V, Ropolo A, Grasso D, Alvarez S, Vaccaro MI. VMP1-dependent selective mitophagy and mitochondrial fragmentation are protective cellular mechanisms in pancreatitis. Pancreatology. 2018;18(4 Suppl):S86–S87.
  13. Grasso D, et al. Zymophagy, a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. J Biol Chem. 2011;286(10):8308–8324.
  14. Ghanbarpour A, Valverde DP, Melia TJ, Reinisch KM. A model for a partnership of lipid transfer proteins and scramblases in membrane expansion and organelle biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(16):e2101562118.
  15. Renna FJ, Gonzalez CD, Vaccaro MI. Decoding the versatile landscape of autophagic protein VMP1 in cancer: A comprehensive review across tissue types and regulatory mechanisms. Int J Mol Sci. 2024;25(7):3758.
  16. Lo Ré AE, et al. Novel AKT1-GLI3-VMP1 pathway mediates KRAS oncogene-induced autophagy in cancer cells. J Biol Chem. 2012;287(30):25325–25334.
  17. Gilabert M, et al. Novel role of VMP1 as modifier of the pancreatic tumor cell response to chemotherapeutic drugs. J Cell Physiol. 2013;228(9):1834–1843.
  18. Loncle C, et al. The pancreatitis-associated protein VMP1, a key regulator of inducible autophagy, promotes Kras(G12D)-mediated pancreatic cancer initiation. Cell Death Dis. 2016;7(7):e2295.
  19. Ropolo A, et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Front Endocrinol (Lausanne). 2020;11:411.
  20. Tanida I, Ueno T, Kominami E. LC3 and autophagy. Methods Mol Biol. 2008;445:77–88.
  21. Kabeya Y, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 2000;19(21):5720–5728.
  22. Mizushima N, Yoshimori T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 2007;3(6):542–545.
  23. Li J, Chen X, Kang R, Zeh HJ, Klionsky DJ, Tang D. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 2021;17(11):3275–3296.
  24. Moresco P, et al. Signal peptide-independent secretion of keratin-19 by pancreatic cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2025;122(27):e2426218122.
  25. Gonzalez CD, Resnik R, Vaccaro MI. Secretory autophagy and its relevance in metabolic and degenerative disease. Front Endocrinol (Lausanne). 2020;11:266.
  26. Klionsky DJ, et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 2021;17(1):1–382.
  27. Renna FJ, Herrera Lopez M, Manifava M, Ktistakis NT, Vaccaro MI. Evaluating autophagy levels in two different pancreatic cell models using LC3 immunofluorescence. J Vis Exp. 2023;(194):e65005. doi:10.3791/65005.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

LC3 İmmunoblotlamaOtofaji İzlemeLC3-II TespitiProtein ElektroforeziDensitometrik AnalizAntikor SpesifitesiOtofajik Akış

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.