mtDNA Hasta Trombositlerinden Trans-Mitokondriyal Sidit Üretimi: Koloni Seçimi ve Fonksiyonel Doğrulamayı Optimize Eden Verimli Bir Protokol

Özet

MtDNA hasta trombositlerinden optimize edilmiş bir trans-mitokondriyal sibrid üretim protokolünü tanımlıyoruz; büyüme parametreleri ve koloni izolasyonu vurgulanıyor. Bu yaklaşım, mitokondriyal DNA varyantlarının ortak bir nükleer arka planda değişken heteroplazmi seviyelerinde incelenmesini sağlar ve elektron taşıma zinciri enzimatik aktiviteleri ve entegre solunum kapasitesi üzerindeki fonksiyonel önemlerini nicelikle ölçerir.

Özet

Trans-mitokondriyal sibrid hücre hattı üretimi, aynı mtDNA ve nükleer genom arka planı içinde, ilgilenen belirli bir mitokondriyal DNA (mtDNA) varyantının yüksek ve düşük oranlarda (heteroplazmi seviyelerinde) biyokimyasal analizlerini mümkün kılarak, patojensiteyi belirlemede altın standart yöntemi temsil eder. Tarihsel olarak, cybrid üretim süreci zahmetli ve verimsiz olmuştur. Burada, insan trombositlerini standart osteosarkom 143B hücre hattıyla birleştirerek mtDNA (Rho⁰ hücreleri) ile izojenik bir nükleer arka plan sağlayarak trans-mitokondriyal sibrid hücre hatları üretmek için son derece verimli ve etkili bir protokolü tanımlıyoruz. Hücre izolatları, farklı heteroplazmi derecelerine sahip kararlı hücre hatları oluşturmak veya farklı mitokondriyal haplogrupların farklı etkilerini karşılaştırmak için ilgi çekici bir mtDNA genomunu yakalar. Mitokondriyal hastalardan alınan sibridleri standart protokollerle belirlemek daha zor olabileceğinden, bu mevcut metodoloji, elektron taşıma zinciri aktivitesinin etkilendiği mtDNA varyantlarını izole etmeye odaklanmaktadır. Burada, koloni seçimi tekniklerinin yüksek seviyeli heteroplazmi mtDNA mutant sibrid hatları üretme süresini azalttığını ve verimini artırdığını gösteriyoruz. MT-ND1, m.3985G>A (p.E227K)'da bilinmeyen bir varyant için sibrid oluşumuna dair bir vaka çalışması sunulmaktadır. Bu protokolü kullanarak sibrid üretim sürecinin verimliliğini analiz eder ve yüksek çözünürlüklü respirometri ile yapılan fonksiyonel çalışmalar yürütürüz. Bu protokolle üretilen yüksek seviyeli heteroplazmi MT-ND1 m.3985G>A sibrid mutantlarının, vahşi tip kontrole kıyasla karmaşık I-bağımlı mitokondriyal solunumu bozduğu gösterilmiştir ve bu da m.3985G>A'nın muhtemelen patojenik olduğunu göstermektedir.

Giriş

Mitokondriyal DNA (mtDNA) mutasyonlarının patojenikliğini belirlemek, nadir olmaları, farklı dokularda değişen seviyelerde mutasyona uğramış ve vahşi tip mtDNA genomlarını içeren heteroplazmi, çeşitli patofizyolojik mekanizmalar ve nükleer genom arka planlarıyla karmaşık etkileşimler^{nedeniyle zordur} 1,2,3,4 . Bu nedenlerle, trans-mitoxondriyal sibrid hücre hatları, mtDNA varyantlarının patojenliğini belirlemek için altın standart yöntem olmaya devam ediyor; burada "sibridler" bir hücrenin çekirdeğinin diğer hücrenin mitokondrileri ^5,6,7,8,9,10 birleşmesini temsil eder (Şekil 1). Cybrid hücre hatları, izojenik bir nükleer arka plan ve mitokondriler içerir; üzerinde incelenen mtDNA varyantı^11,12 için belirli bir heteroplazmi yüzdesi bulunur. Bu şekilde, respirometri (polarografi ile) veya elektron taşıma enzim aktivitesi (spektrofometri ile) gibi fonksiyonel testler, %0 ile %100 heteroplazmi seviyeleri arasında değişen sibrid hatlarında yapılabilir; böylece belirli bir mtDNA varyantının potansiyel patojenik etkileri ve sibrid^{hatları 1} arasında farklılık gösterebilecek mitokondriyal haplogrupların göreceli etkisi belirlenebilir. Diğer hücre tipleri patojenliği incelemek için kullanılabilir ve her hücre tipinin kendine özgü avantaj ve dezavantajları olduğundan, sibrid oluşumu ve fonksiyonel analizi tamamlamak için en iyi şekilde kullanılır. Hasta fibroblastları doğrudan hastadan kaynaklanır ancak kalıtsal heteroplazmi ile sınırlı kalır ve nükleer gen etkilerini ortadan kaldıracak izojenik nükleer kontrolden yoksundur. mtDNA düzenleme giderek daha popüler hale geliyor ancak mtDNA^13'te hedef dışı düzenleme ve sınırlı düzenlenebilir alanlar nedeniyle sorun yaşıyor. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler), bir mutasyonun nöronlar ve retinal ganglion hücreleri gibi farklı hücre tipleri üzerindeki etkisini incelemek için farklılaştırılabilir, ancak pluripotensi indüksiyonu ilgi duyulan mtDNA varyantının kaybına veya ek de novo ^{varyantlara yol açabilir 14}. Cybrid çalışması, kanser hücre hattı (klasik olarak 143B osteosarkom) nükleer arka planına dayanan, ancak klasik olarak iyi büyüyen daha yapay bir sistemin oluşturulmasını içerir; bu da aday müdahalelerin yüksek verimli tarama çalışmalarında kullanılmasını sağlar. Yüksek heteroplazmi seviyesindeki sibrid üretiminin sınırlamaları arasında trombosit kalitesi, başlangıç heteroplazmi ve mutant mitokondrilerin seçici dezavantajları yer alır; bunlar bu protokolde ayrıntılı olarak tartışılır.

Sibrid üretimi mtDNA varyantının patojenisitesinin fonksiyonel belirlenmesinde altın standart olmasına rağmen, çok az laboratuvar mitokondriyal hastalıkların^{incelenmesi için sibridler üretir} 9,10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Bunun yerine, kanser ve yaşlanma incelemek için daha fazla sibrid^{üretiliyor 28,29}. Burada, mtDNA hasta trombositlerinden sibrid üretimini kolaylaştırmak için geliştirilen optimizasyon stratejilerini göstermek için, hedef mtDNA varyantı için yüksek ve düşük heteroplazmi seviyelerine sahip sibrid hücre hatları oluşturmak için gereken seçim süreçleri ve hücre hazırlıklarını göstermek üzere şüpheli bir mitokondriyal hastalık hasta vaka çalışması kullanıyoruz. Özellikle, karmaşık I (CI) alt birimi MT-ND1 varyantı m.3985G>A için sibrid hücre hatları oluşturma metodolojisini gösteriyoruz ve bu varyantın patojenik doğasını gösteren biyokimyasal çalışmalar gerçekleştiriyoruz. Şekil 2, sibrid oluşumu için zaman çizelgesini göstermektedir; burada ana metodolojik adımlar arasında füzyon, seçilim ve izolasyon yöntemleri bulunur ve böylece farklı koloniler elde edilir.

Protokol

Philadelphia Çocuk Hastanesi'nin (CHOP) 08-6177 IRB çalışmasına göre kan trombositleri alındı.

1. Trombositlerin hazırlanması

1. 1. Gün: Kan alınırken asit-sitrat-dekstroz tüplerine alın.
   NOT: Kan rotatora hemen konmalıdır. Trombositler ideal olarak kan aldıktan sonra en fazla 4 saat içinde toplanır.
2. Kanın hacmini kaydet. 5–6 mL kan hacmi önerilir.
3. Kanı 200 × g'de 20 dakika boyunca 12 °C'de santrifüj yapın.
   NOT: 12 °C'de santrifüjleme, örnek bütünlüğünü korur ve trombosit aktivasyonunu engeller.
4. Süpernatantı (plazma) yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
5. Plazmanın hacmini kaydet.
6. Plazmayı 1500 × g sıcaklığında 20 dakika boyunca 12 °C'de santrifüj yapın.
7. Tahmini trombosit pellet hacmini kaydedin.
   NOT: Bu protokolde çok fazla trombosit zahmetli olabilir. Birleşmeden sonra, Rho⁰ hücreleri ve trombositler kaplama yapılırken, fazla trombosit termosunun altına yapışabilir ve Rho⁰ hücresinin yapışmasını engelleyebilir. Füzyon için trombosit pellet hacminin 50 μl'den az kullanılması önerilir. Fazla trombositler, trombositler aşağıdaki adımlarda bölünerek dondurulabilir.
8. Üst yüzeyi çıkarın.
   NOT: Eğer pellet büyükse, pellet çıkarılması aspirasyon yoluyla gerçekleştirilebilir. Hasta trombositleri bazen çok azalır ve çok yapışkan değildir. Eğer durum buysa, plazmayı yavaşça çıkarmak için pipet kullanın.
9. Taze trombositlerle devam ederseniz, pelleti Minimum Temel Kartal ortamının (SMEM) Spinner modifikasyonu ile 1 mL içinde yeniden askıya alın ve mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
10. Donarsa, pellet (trombositler) 1,05 mL SMEM ve 450 μL trombosit dondurma çözeltisi (350 μL fetal sığır serumu [FBS] + 100 μL dimetil sülfoksit [DMSO]) içinde yeniden askıya alın.
    NOT: Bazı hasta trombositleri dondurma işlemi sırasında stabil değildir ve dondurulduktan sonra yüksek mutant bir sibrid elde edilemez. Taze preparatın kullanılması önerilir.
11. Rho⁰ hücreleri zamanında hazır olmazsa, trombositleri 37 °C'ye yerleştirin ve 60 rpm'de hafif sallama yapın.
    NOT: Sonuç olarak, trombositlerin ve Rho⁰ hücrelerinin aynı anda hazır olması için zamanlaması en iyisidir. 2 saatten fazla beklemeniz önerilmez.

2. Rho⁰ hücrelerinin hazırlanması

1. Ya yeni çözülmüş 143B osteosarkom Rho⁰ hücrelerini ya da birleşmeye yakın büyüyen Rho⁰ hücrelerini kullanın.
   NOT: Kuluçka içinde büyüyen Rho⁰ hücrelerinin birleşmeye yakın bir noktaya kadar kullanılması önerilir. Taze çözülmüş Rho⁰ hücreleri kullanılabilir ve yüksek hücre yoğunluğuna sahip dondurulmuş bir Rho⁰ hücre şişesi kullanılması önerilir. Hücrelerin birleşmeden önce iki veya daha fazla saat boyunca bağlanmasına izin verin.
2. T75 termosunu 5 mL PBS ile yıkayın.
3. Rho⁰ hücrelerini kapatmak için %1 mL Tripsin-EDTA 0,25% ekleyin.
4. 37 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
5. Termosunu salladıktan sonra, matonun altını 5 mL SMEM ile yıkayın.
6. Rho⁰ hücrelerini 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
7. 200 × g seviyesinde 5 dakika boyunca santrifüj yapın, hücre sayısı ölçümü için konsantre olun.
8. Süpernatantı çıkarın ve 1 mL SMEM'e yeniden süzülün.
9. Hücreleri say.
   NOT: İdeal olarak, her füzyon için 1,5 milyon hücre olmalıdır; ancak başarılı füzyonlar sadece 30.000 hücreyle gerçekleştirilmiştir.
10. Aliquot 1,5 milyon hücreyi 1,5 mikrosantrifüj tüpüne yerleştirerek hacmi 1 mL'ye çıkarır.
    NOT: Ekstra bir "sahte füzyon" tüpü bulundurduğunuzdan emin olun. Bu tüp sadece Rho⁰ hücreleri içerecek ve seçim sürecini yönlendirmek için kullanılacaktır.
11. Trombositleri oda sıcaklığında 1700 × g sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüjleyin.
    NOT: Rho⁰ hücreleri soğuk sıcaklığa hassastır.
12. Trombositlerden süpernatantı çıkarın.
13. Trombosit pelletinin üzerine 1 mL Rho⁰ hücresi ekleyin.
14. Rho⁰ hücrelerini ve trombositleri oda sıcaklığında 200 × g 5 dakika boyunca santrifüjlen.

3. Birleşme

1. Rho⁰ hücrelerinden ve trombosit pelletinden süpernatantı çıkarın.
2. 150 μL füzyon tamponu (%50 polietilen gliki [PEG]/%10 DMSO) ekleyin ve 90 saniye boyunca tritürat ederek yeniden süzülür.
   NOT: Bazı pelletler oldukça yapışkandır ve pipetle birlikte manuel karıştırıp kırılması gerekir. Pelletin yapışkan olup olmadığını kaydedin.
3. T75 şişesine 12 mL Cybrid ortamı (DMEM) + %10 FBS + 50 μg/mL uridin ekleyin.
4. Termosa 1 mL kaynamış trombosit ve Rho⁰ hücrelerini ekleyin.
5. Hücreler, yüksek nemde %5_CO2 ile 37 °C'de kuluçka altına alınır.
   NOT: Tüm hücre büyüme adımları bu koşullar altındadır.

4. Büyüme

1. 2. Gün: Cybrid ortamını çıkarın ve taze 12 mL Cybrid ortamı + %10 FBS + 50 μg/mL uridin ekleyin.
   NOT: Rho⁰ hücrelerinin mtDNA'yı dahil etmesi yaklaşık bir hafta sürer.
2. 5. Gün: Cybrid ortamını çıkarın ve taze 12 mL Cybrid ortamı + %10 FBS + 50 μg/mL uridin ekleyin.
   NOT: Eğer Rho⁰ hücreleri %80 birleşimdeyse, hücreleri iki şişeye ayırın.

5. Seçim

1. 8. Gün: Medya maddelerini çıkarın ve hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın.
2. PBS'yi çıkarın ve 1 mL tripsin ekleyin.
3. Matonun altını tripsinle kaplayın ve 37 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
4. 5 mL Cybrid media + %10 FBS + 50 μg/mL uridin ekleyin.
5. Hücreleri say.
   NOT: Seçim %10 birleşmeden başlamalıdır; bu da T75 veya doku kültüründe işlenmiş petri kabında 125.000 hücre demektir. Koloni toplama yöntemi tercih ediliyorsa petri kaplarının kullanılması önerilir. Sulandırma yöntemini kullanıyorsanız T75 kullanın.
6. Uygun kaba 125.000 hücre ekleyin ve hacimin geri kalanını Seçim ortamı (DMEM) ile 12 mL'ye kadar ekleyin.
   NOT: Seçim ortamı, mitokondrili birleşmiş 143B hücrelerini Rho⁰ hücrelerinden ayırmak için tasarlanmıştır. Rho⁰ hücreleri hayatta kalmak için piruvat ve uridin gerektirir. Diyalyizlenmiş FBS piruvat ve uridin içermez ve sadece seçim için kullanılmalıdır. Mümkünse iki farklı seçim ortamı kullanın. Biri %10 diyaliz edilmiş FBS olmalı, diğeri ise büyümeyi daha az kısıtlamalı, örneğin %20 diyaliz FBS + 50 μg/mL uridin gibi. Şiddetli mutantlar için paralel olarak daha az kısıtlayıcı bir seçim ortamı önerilmektedir.
7. Kalan hücreleri her biri 1 mL dondurma çözeltisi olan iki kriyovialde dondurun.
   NOT: Bunlar ön seçim hücreleridir ve farklı seçimler ileride denenebilir.
8. Medyayı yaklaşık 1 hafta boyunca her iki günde bir değiştirin.
   NOT: Rho⁰ hücreleri öldüklerinde yüzer ve medya değişiminden sonra silinir. Seçimin tamamlandığını belirlemek için "sahte" füzyon hücrelerini kullanın (şişede daha fazla hücre yok). Bu şişe tamamen boş olacak çünkü tüm^{Rho 0} hücreleri yıkanmış olacak. Deneme şişesi boş olsa bile bir gün daha beklemek iyi bir fikirdir, çünkü birleşmiş hücreler, diğer Rho⁰ hücrelerinin şişede kalmasına yardımcı olacak besinleri sağlayabilir. Hücreler %20'nin üzerinde birleşmeye ulaşırsa, bölünün ve yeniden plaka yapın. Daha fazla büyüme seçimi gizleyecektir.

6. Koloni seçimi büyüme yöntemi

1. Kolonileri göze görünecek şekilde büyütün; Cybrid media + %20 FBS + 50 μg/mL uridin ile kullanın.
   NOT: Tabağı eğin ve ışığa doğru tutun. Koloniler bulutlu daireler şeklinde görünür. Mikroskop altında, koloniler arasında çok fazla arka plan hücresi olmamalı.
2. Bağımsız, örtüşmeyen kolonileri matlanın altına işaret koyarak ışığa tutarak daire çizin.
3. Bir P20 kullanarak hem kazımak (mekanik olarak şişenin altına bağlı hücreleri bozmak) hem de aynı anda çizilmiş daire içinde 20 μL aspirasyon yapmak için seçilen koloniden hücreleri P20'nin ucuna yerleştirin.
   NOT: Elle kazıma hücreleri ayırır ve 20 μL çıkarmak hücreleri pipet ucundaki toplar.
4. Her koloniyi kendi kuyusuna 96 kuyuyla plakalayın.
   NOT: Bu yöntemin avantajı, 143B hücrelerinin birlikte iyi büyüme eğiliminde olmasıdır, bu yüzden büyüme sorunu yaşamamalı ve daha hızlı sonuçlar elde edilmelidir. Dezavantajı ise karışık bir nüfusa sahip olabilmesi.

7. Sulandırma büyüme yöntemi

1. Hücreler %75 Cybrid ortamında birleştiğinde + %20 FBS + 50 μg/mL uridin ile hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın.
2. PBS'yi çıkarın ve 1 mL tripsin ekleyin.
3. Matonun altını tripsinle kaplayın ve 37 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
4. 5 mL Cybrid media + %20 FBS + 50 μg/mL uridin ekleyin.
5. Hücreleri say.
6. 1 × 10⁵ hücreyi 20 mL Cybrid ortamında + %20 FBS + 50 μg/mL uridin 50 mL konik tüp 1'e ekleyin.
   NOT: Bu 5000 hücre/mL olup, 96 kuyu bir plakada kaplama edildiğinde 100 μL'de 500 hücre olur.
7. 50 mL konik bir tüp hazırlayın ve 100 kat seyreltme ile (200 μL Tüp 1'den 20 mL Cybrid ortamı + %20 FBS + 50 μg/mL üridin).
   NOT: Bu, her kuyuda yaklaşık 5 hücre demek.
8. 50 mL konik bir tüp 3 hazırlayın ve 1:1 seyreltme ile (10 mL Tube 2'den 10 mL Cybrid ortamında + %20 FBS + 50 μg/mL uridin).
   NOT: Bu, her kuyu başına yaklaşık 2,5 hücre demek.
9. 50 mL konik bir tüp 4 hazırlayın ve 1:1 seyreltme ile (10 mL Tüp 3, 10 mL Cybrid ortamı + %20 FBS + 50 μg/mL üridin).
   NOT: Bu, her kuyu başına yaklaşık 1 hücre demek.
10. Plaka Tüpleri 2, 3 ve 4, 96 kuyuklu plakalarda her biri 100 μL içerir.
    NOT: Kaplamadan önce hücreleri karıştırdığınızdan emin olun. Her kuyunun içinde bir hücre olup olmadığını kontrol etmek zordur çünkü hücreler dibine batıp tutunmalıdır. Bu yöntemin avantajı, tek bir hücrenin koloniye dönüşmesi ve karışık bir arka planın olmamasıdır. Dezavantajı ise, şiddetli mutantların izole edilirse hayatta kalamayacağıdır.
11. Ertesi gün, her kuyuda birden fazla hücre olduğu açıkça kuyrukları çizin.
12. Birkaç gün sonra kuyuları tekrar kontrol edin.
    NOT: Şimdi koloniler olmalı ve kuyunun kenarlarına yakın tek hücreler varsa bu daha belirgin hale gelir. Birden fazla koloni varsa, o kuyuları kaldırın. Hücre yoksa, kuyunu çıkarın.

8. Büyüme

1. 96 kuyruklu plakadan başlayın ve hücreleri gerektiğinde adım adım daha büyük plakalara aktarın.
   NOT: Bu hücreler en çok yüksek hücre yoğunluğunda büyümeyi sever ve yeterli hücre transferi olmaması ölüme yol açabilir. Her zaman önceki plakayı içinde birkaç hücre bulundurun ve hangi kuyunun nereden geldiğini işaretleyin ki gerekirse geri dönebilsin. Önemli olarak, 143B hücreler aşırı birleşirse ölür ve ayrılır, bu yüzden bu hücreleri her gün kontrol edin.

9. Genetik doğrulama

1. Alikotlanan hücreleri 450 ×g ile 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
2. Medyayı kaldırın.
3. 5 μL DNA Ekstraksiyon tamponu (50 mM NaOH) ekleyin.
   NOT: Bu sayı çok fazla hücre varsa değişebilir. Önemli hücre pelletleri 10 μL tampon içinde olabilir.
4. 95 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
5. Ekstraksiyon tamponuna eşdeğer bir hacim DNA Stabilizasyon tamponu (0,1 M Tris-HCl; pH 8) ekleyin.
6. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) enzimin yönergelerine göre gerçekleştirilir.
   NOT: Bazı mutantlar, kontrol ve hasta hücrelerini ayırt etmek için kısıtlayıcı enzimler kullanabilir. Diğer nokta mutasyonları ayırt edilemez ve dizileme gerektirir. Bu durumda, yüksek kaliteli sonuçlar için boyasız PCR karışımlarının kullanılması önemlidir. Sanger dizileme ve yeni nesil dizileme kullanılabilir. 2,5 μL DNA 25 μL reaksiyon için yeterlidir.
7. Sanger dizileme için bu mutasyona özgü PCR amplikonları kullanın.
   NOT: PCR amplikonları Sanger'ın dizilemesi için gönderildi. Mutasyon heteroplazmi seviyesi hem klon genişlemesinden sonra hem de fonksiyonel analizden sonra doğrulandı.

10. Yüksek çözünürlüklü respirometri kullanarak yüksek çözünürlüklü respirometri

1. Respirometre (örneğin, Oroboros Instruments) yönergelerine göre hava kalibrasyonu yapılmalıdır.
2. Cybridleri PBS ile T75 şişesinde yıka.
   NOT: Hücreler aşırı birleşmemelidir; %70–%80 birleşme ideal seçimdir.
3. 1 ml tripsin ekleyin ve 4 dakika kuluçka yapın.
4. 5 ml Cybrid ortam ekleyin ve hücreleri sayın.
5. Bir tüpe 500.000 hücre ekleyerek 450 × g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
   NOT: Respirometre için hücre numarası ve hacimleri 0.5 mL odaya aittir.
6. Hücreleri PBS ile yeniden süspansiyon ile yıkayın ve tekrar santrifüj yapın.
7. Hücreleri 510 μL MiR05 tamponunda yeniden süspansiyona alın ve boş bir odaya ekleyin.
8. Stabilizasyondan sonra 0,65 μL digitonin (50 mg/mL), 0,8 μL malat (2,5 M) ve 2 μL piruvat (2,5 M) eklenin.
   NOT: Digitonin eklenmeden önce, bazal solunum ölçümü burada yapılır. Sonraki her adım stabilizasyondan sonra yapılmalıdır.
9. 12 μL adenozin difosfat (ADP) (0,25 M) ekleyin.
10. 4 μL glutamat (2,5 M) ekleyin.
11. 12 μL suksinat (1,25 M) ekleyin.
12. 1 μL oligomisin (1 mg/mL) ekleyin.
13. 1 μL karbonil siyanür-p-trifluorometoksifenilhidrazon [FCCP] (0,2 mM) ekleyin.
    NOT: Daha fazla artış gözlemlenmeyene kadar (genellikle 3–5) birden fazla ekleme ile titrleyin.
14. 1 μL rotenon (2 mM) ekleyin.
15. 1 μL antimisin A (1 mg/mL) ekleyin.
16. 0,5 μL askorbat (0,8 M) ve 0,5 μL tetrametilfenilenidiamin [TMPD] (0,2 M) ekleyin.
17. Hazını bir ara parça ile 20 dakika açın.
18. Hazneyi kapatın ve 5 dakika stabilizasyon yapın.
19. 22,5 μL azid (4 M) ekleyin.
20. Hücreleri protein ölçüsü için bicinchoninic asit (BCA) test seti kullanarak toplayın.
21. Oksijen tüketim oranının stabilizasyonundan sonra hesaplamalar yapılacak ve proteine göre normalleştirilecek. Bazal Spirasyon, hücrelerin odaya eklenmesinden sonra stabilize edilen oksijen tüketim oranıdır.
    NOT: Diğer tüm ölçümler, belirtilen substrat veya inhibitörden sonra alınır.
22. OXPHOS_CI hesaplayın: (Glutamat-Antimisin A)/(FCCP-Antimisin A).
23. OXPHOS_CI+CII: (Suksinat-Antimisin A)/(FCCP-Antimisin A) hesaplayın.
24. ETS_CI+CII: (FCCP-Antimisin A) hesaplayın.
25. ETS_CII: (Rotenon-Antimisin A)/(FCCP-Antimisin A) hesaplayın.
26. LEAK_CI+CII hesaplayın: (Oligomisin-Antimisin A)/(FCCP-Antimisin A).
27. OXPHOS_CIV: (TMPD/ASC-Azide)/(FCCP-Antimycin A) hesaplayın.
28. Respirometri ölçümleri için en az 4–6 biyolojik kopya kullanın.

Sonuçlar

Metodolojik farklılıkları ve protokol optimizasyonuna giden yolu göstermek için, elektron taşıma zincirinde MT-ND1'de kompleks I (CI) içinde bilinmeyen anlamlı bir varyant (VUS) taşıyan ve mitokondriyal hastalık şüpheli bir hastadan sibrid oluşumunun sonuçlarını sunuyoruz. İki farklı CLIA onaylı klinik tanı laboratuvarında birden fazla dokuda klinik mtDNA genomu yeni nesil dizileme yapıldıktan sonra, patojenlik şüphesi olan tek varyant MT-ND1 m.3985G>A oldu. Hastanın ka...

Tartışma

Burada, mtDNA hasta trombositlerinden trans-mitokondriyal sibrid hücre hatlarının üretimi için son derece verimli bir protokol sunuyoruz. Belirsiz öneme sahip bir MT-ND1 varyantının uygulanabilirliğini, büyüme ve seçim parametrelerinin dikkatlice değerlendirilmesinin önemini gösteriyoruz. Bu büyük sorunlar optimize edildikten sonra, solunum zinciri fonksiyonunu bozabilecek mtDNA varyantları barındıran sibridlerin başarılı bir şekilde seçilmesi sağlanır. Bu protokol, mtDNA mutasy...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ADP	Sigma Aldrich	A5285-1G
Antimycin A	Sigma Aldrich	A8674-25MG
Ascorbat	Sigma Aldrich	11140-250G
Azid	Sigma Aldrich	S2002-100G
Diyalizli FBS	Fisher Scientific	35071CV
Digitonin	Sigma Aldrich	D141-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	Cybrid media
DMEM	Corning	10-017-CM	Seçici media
FBS	Cytiva	SH30910.03
FCCP	Apex Bio	B5004
Glutamat	Sigma Aldrich	G5889-100G
Graphpad Prism	Graphpad
Hybri-Max	Sigma Aldrich	P7306	füzyon tamponu
Malat	Sigma Aldrich	M1000-100G
MiR05 tamponu	Oroboros Instruments	60101-01
O2K respirometre	Oroboros Instruments	C-0050
Oligomisin	Sigma Aldrich	O4876-5MG
Pirüvat	Sigma Aldrich	P2256-100G
Rotenon	Sigma Aldrich	R8875-1G
SMEM	Sigma	M8167
Süksinat	Sigma Aldrich	S2378-100G
TMPD	Sigma Aldrich	T3134-5G
Trypsin-EDTA 0,25%	Thermo Scientific	25200056
Üridin	Sigma Aldrich	U3750-25G