Yöntem makalesi

Meme Tümörü Taşıyan İmmünokompetan Farelerde Antrasiklin Kaynaklı Kardiyotoksisitenin Kardiyo-Onkolojik Fare Modeli

6 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71633

⸱

1 Ekim 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1INSERM UMR-S 942 MASCOT, Cardiovascular Biomarkers, Pathophysiology, and Therapeutic Strategies - CIRCUS, Paris Cité University, 2Medical and Surgical Intensive Care Unit, University Hospital Avicenne, AP-HP

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Antrasiklin kaynaklı kardiyotoksisitenin klinik olarak ilgili fare modelleri oldukça nadirdir. Burada, kanser hastalarının klinik protokollerini taklit eden, antikanser tedavi alan ve tümör taşıyan immünokompetan farelerin kullanıldığı bir model önerilmektedir.

Özet

Avrupa Kardiyoloji Derneği'nin kanser tedavisiyle ilişkili kardiyak disfonksiyonun preklinik modelleri üzerine yaptığı son güncelleme, daha temsili ve translasyonel in vivo modellere duyulan kritik ihtiyacı vurgulamaktadır. Klinik popülasyonlarda gözlemlenen heterojenliği daha doğru bir şekilde yeniden oluşturmak için, immünokompetan, tümör taşıyan, birden fazla suşu ve her iki cinsiyeti içeren modeller geliştirme ihtiyacına işaret etmektedir. Bu nedenle, meme tümörü taşıyan hayvanlarda antrasiklinle indüklenen kardiyotoksisitenin (AIC) klinik olarak ilgili bir modeli oluşturulmuştur. Farelerin genetik arka planına göre, Balb/c farelerine veya C57Bl/6J farelerine, erkek ve dişilerin alt meme bezine sırasıyla 4T1Luc hücreleri (200k hücre) veya PY8119 hücreleri (200k hücre) subkutan olarak enjekte edilmiştir. Tümör büyümesi biyolüminesans ve palpasyon ile kontrol edilmiştir. Tümör kütlesi palpasyonla saptanabilir hale geldiğinde, yani tümör hücresi enjeksiyonundan 2 hafta sonra, hayvanlara antikanser Doksorubisin tedavisi uygulanmıştır. Farelerin Doksorubisin toleransı suşa bağlıdır. Kardiyak fonksiyon, protokolün başlangıcından önce (bazal seviye) ve sonrasında haftalık olarak, ketamin ile anestezi altındaki farelerde kardiyak ultrason ile değerlendirilmiştir. Kardiyotoksisite, sol ventrikül fraksiyonel kısalmasında bazal seviyeye göre en az %10'luk bir azalma, %50'den küçük (<50%) bir mutlak değer ve 300 BPM'den büyük (>300 BPM) bir kalp hızı olarak tanımlanmıştır. Protokol, %99 tümör gelişimi başarısı ve >%80 fare sağkalım oranı ile tekrarlanabilirdi. Tümör ve Doksorubisin uygulanan farelerin >%90'ında kardiyotoksisite gözlemlenmiştir.

Giriş

Kardiyo-onkoloji, kanser hastalarında kemoterapi öncesinde, sırasında ve sonrasında kardiyovasküler sonuçları iyileştirmeyi amaçlar. Preklinik modeller, bu iki hastalık arasındaki etkileşimin daha iyi anlaşılmasında büyük rol oynamıştır. Yakın zamanda, paradigma değiştiren bir çalışma, spontan intestinal poliplere doğal olarak yatkın olan farelerin, miyokard enfarktüsü ve ardından gelen bir kalp yetmezliği (HF) döneminden sonra bu tümörlerin daha fazlasını geliştirdiğini gözlemleyerek, kardiyovasküler bir olayın tümör büyümesi üzerindeki doğrudan etkisini ortaya koymuştur1. O zamandan beri, çok sayıda çalışma çeşitli tümör tiplerinde ve fare suşlarında tutarlı bulgular bildirmiş, sıklıkla belirli moleküler yolakları veya proteinleri ilişkilendirmiş ve böylece kanser ilerlemesinin kardiyovasküler hastalıklar (KVD'ler) tarafından tetiklendiği kavramını pekiştirmiştir2,3,4,5.

Buna karşılık, kanserin KVS gelişme riski üzerindeki etkisi on yıllardır çalışılmaktadır. Epidemiyolojik veriler, hem bu iki hastalığın ortak risk faktörleri hem de anti-kanser tedavilerin6,7,8,9,10 bilinen çeşitli toksisiteleri nedeniyle, kanserden kurtulanların daha fazla KVS'den muzdarip olduğunu göstermektedir. Preklinik çalışmalarda, uzun vadeli kardiyovasküler sonuçları iyileştirmek amacıyla insanlarda modüle edilebilecek spesifik hedefleri belirlemek için yaygın olarak kanser kaynaklı kaşeksi modelleri kullanılmıştır11,12,13,14. Bununla birlikte, hastalar genellikle bu ileri evre kanser sendromuna ulaşmadan tedavi edildikleri için bu modellerin yaygın klinik durumu pek yansıtmadığı savunulabilir, ancak genel kaşeksinin hala toplam kanser ölümlerine büyük ölçüde katkıda bulunduğu düşünülmektedir15.

Avrupa Kardiyoloji Derneği'nin (ESC) ilk kardiyo-onkoloji kılavuzlarında, kanser ve KVS arasındaki ilişkinin daha iyi anlaşılması için daha fazla araştırmaya ihtiyaç olduğu sonucuna varılmıştır16. Daha kesin bir ifadeyle, ESC kardiyo-onkoloji çalışma grubundan gelen güncel bir bildirimde, özellikle tümör taşıyan hayvanların kullanıldığı modellerle yapılan preklinik araştırmaların, bu bilgi boşluğunun giderilmesinde büyük önem taşıdığı belirtilmiştir17. Ayrıca, günümüzdeki klinik çalışmaların çoğunun preklinik ortamlarda yeterince incelenmemiş antikanser tedavileri üzerinde yürütülmesi nedeniyle, preklinik ve klinik çalışmalar arasında daha iyi bir korelasyona ihtiyaç duyulmaktadır18.

Doksorubisin (Dox) gibi antrasiklinler (AC'ler), çok sayıda solid ve kan tümörünün kemoterapisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Günümüzde daha modern tedaviler mevcut olsa da, bu ilaçların ucuzluğu, iyi belgelenmiş yan etkileri ve belirgin etkinliği, önümüzdeki uzun yıllar boyunca kullanılmaya devam etmelerini sağlayacaktır19,20. Çok miktarda kanıt, AC'lerin temel olarak sol ventrikül disfonksiyonu şeklinde görülen ve günümüzde klinik kullanım için ana sınırlayıcı faktörlerden biri olan, ayrıca kardiyo-onkologlar için sıklıkla endişe verici bir faktör olan doz bağımlı bir kardiyotoksisiteye yol açtığını göstermektedir21,22. Bu literatür, insanlardaki yüksek insidansı nedeniyle temel olarak meme kanseri çalışmalarından gelmektedir, ancak lenfomalar, akciğer kanseri ve lökemiler üzerine yapılan klinik çalışmalar da benzer gözlemler sunmaktadır23. Bu nedenle, AC kaynaklı kardiyotoksisitenin (AIC) altında yatan patofizyolojik mekanizmaları anlamak için birkaç on yıldır preklinik araştırmalar yürütülmekte olup; bu araştırmalar oksidatif stresin, doğrudan ve dolaylı DNA hasarının, ferroptozun ve mitokondriyal hasarın yaygın olarak etkili olduğunu ortaya koymuştur23,24.

Buna rağmen, AIC'nin nasıl önleneceği veya tedavi edileceği konusunda aslında sınırlı kanıt bulunmaktadır. Yaygın HF ilaçları klinik deneylerde karmaşık sonuçlarla test edilmiştir ve birkaç potansiyel adayın kullanım zamanlamasını belirlemek zor olmuştur21,23,25,26,27,28. Demir modüle eden bir ilaç olan Dexrazoxane, AIC'yi önlemede gelecek vaat eden sonuçlar göstermiştir ancak günümüzde sistematik olarak kullanılmamaktadır21. AC'lerin kanda serbest form dışında, örneğin lipozomlar içine kapsüllenmiş formlarda iletilmesi de gelecek vaat eden sonuçlar vermiş olsa da, kısmen maliyetleri nedeniyle konvansiyonel AC'lerin yerini almada hala zorluklar yaşanmaktadır21.

Bu durumun bir açıklaması, AIC'yi incelemek için klinik olarak ilgili hayvan modellerinin eksikliğidir17. İnsanlarda Dox, tekrarlanan enjeksiyonlar yoluyla zamana yayılmış şekilde uygulanır ve AIC'nin çoğu tedaviden sonraki ilk yıl içinde gözlemlenir. Ancak, yakın zamanda yayınlanmış bir incelemede gösterildiği üzere, literatürde hayvan protokollerinde büyük bir varyasyon gözlemlenmektedir29. Akut kardiyotoksisite modelinin klasik bir örneği, tek doz 20 mg/kg Dox alan tümörsüz farelerdir30. Tipik bir kronik kardiyotoksisite modelinde, birçok çalışma, toplam kümülatif doz 20 mg/kg olacak şekilde haftada bir kez 5 mg/kg Doxorubicin enjeksiyonu alan tümörsüz fareleri tanımlamaktadır29,31. Bu kronik kardiyotoksisite modeli, aynı Dox dozunda tümör taşıyan hayvanlarda da gözlemlenebilir; ancak bu durum literatürde hala çok nadirdir29,32.

Bu bilgi boşluğunun azaltılmasına katkıda bulunmak amacıyla, AIC'yi incelemek için meme tümörlü immünokompetan farelerin pragmatik ve klinik olarak ilgili bir modeli, yani 4T1 taşıyan Balb/c fareler oluşturulmuş ve bu modelin sağlamlığı PY8119 taşıyan C57Bl/6J farelerde doğrulanmıştır; yazarların bilgisine göre ikincisi, C57Bl/6J soyunda üçlü negatif meme kanseri ile oluşturulan ilk kardiyo-onkolojik modeldir. Hayvanlar kardiyotoksisite gösteren Dox ile tedavi edilmeden önce, biyolüminesans kantifikasyonu aracılığıyla tümör büyümesinin başarılı bir şekilde takibi sağlanmış ve kardiyo-onkolojik deneyle eş zamanlı olarak tümör mikroçevresini incelemek için bir organ toplama protokolü uygulanmıştır. Ayrıca, soy ve cins duyarlılığına ilişkin literatürde tanımlananlara benzer sonuçlar gözlemlenmiştir. C57Bl/6J farelerin AIC deneylerindeki yüksek sağkalım oranları nedeniyle oldukça değerli olmaları sebebiyle, bu çalışmanın gelecekteki kardiyo-onkolojik çalışmalarda hayvan protokollerinin standartlaştırılmasına ve geliştirilmesine katkı sağlaması beklenmektedir29.

Önerilen yöntemin avantajı; genetik mühendisliği kolay olan, genomu iyi tanımlanmış, temini ucuz ve yüksek kümülatif AC dozlarına toleranslı olan C57Bl/6J suşunun kullanılmasıdır29,33,34. AC'lerle yapılan spesifik bir çalışma için bir genin nakavt edilmesi gerekiyorsa, bu model bu amaç için oldukça uygundur. Ayrıca, bu suştan türetilmiş bir üçlü negatif meme kanserinin kullanılması translasyonel açıdan önem taşımaktadır; çünkü üçlü negatif meme kanserli kadınlar, AC alma olasılığı en yüksek olan ve prognozu en kötü olan hastalardır35. Bu modelin kullanılması, özellikle bu hastalar için AIC bilgisini muhtemelen geliştirecektir.

Bu modelin gücü aynı zamanda, farelerin kardiyovasküler yeniden şekillenmeyi gerçekten etkileyebilecek bir tümör ile önceden koşullandırılmış olmasında yatmaktadır36,37. Ayrıca bu model, AIC'nin akut ve tam kronik modelleri arasında yer almakta olup, yüksek sağkalım oranları sayesinde hayvan izleme süresinin uzatılabilme imkanı sunmaktadır; bu durum, diğer AC döngüleri değerlendirildiğinde büyük bir değer taşıyabilir.

Bununla birlikte, tümör inokulasyonuna yönelik pragmatik yaklaşımı nedeniyle bu model, protokol sonunda yapılacak spesifik tümör karakterizasyonu için muhtemelen en uygun model değildir. Eğer bu durum bilimsel hipotezin merkezinde yer alıyorsa, tümör enjeksiyonunun uyarlanmış bir versiyonu uygulanmalıdır. Ayrıca, Balb/c farelere yapılan 4T1 hücre enjeksiyonu, örneğin burada açıklanmayan ve metastaz bilimsel soru için temel teşkil ediyorsa dikkate alınması gereken metastaz çalışmaları gibi daha onkolojik bir yaklaşım için iyi yapılandırılmış bir modeldir38. Bu model yetişkin farelerde uygulanmaktadır; ancak amaç AIC'yi pediyatrik bir ortamda incelemekse, bu protokol için yanıtları burada çalışılmamış olan daha genç fareler değerlendirilmelidir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, yerel hayvan etik kurulu (Lariboisière-Villemin) ile uyumlu olarak gerçekleştirilmiş ve Fransız Yükseköğretim ve Araştırma Bakanlığı (MESRI) tarafından APAFIS 46086 protokol numarası ile onaylanmıştır. Protokol tasarımı sırasında 3R kuralları dikkate alınmıştır. Balb/c ve C57Bl/6J fareleri, Janvier Labs veya Envigo gibi bir hayvan üreticisinden temin edilmiştir. Bu protokol için fareler, üçlü negatif meme kanserinden muzdarip kadınlara benzer şekilde genç yetişkin dönemiyle uyumlu olması için dahil edildikleri sırada 10 ile 18 hafta yaşları arasındaydı. Hayvanlar; 12 saatlik karanlık/aydınlık döngüleri olan, oda sıcaklığı 20 °C ile 24 °C arasında ve nemi %30 ile %70 arasında olan bir odada, 2–5 bireylik gruplar halinde tutulmuştur. Su ve yem ad libitum olarak sağlanmıştır. Protokol boyunca, Supplementary Table 1'de açıklandığı üzere, protokol başlangıcından önce önceden tanımlanmış insani sonlanma noktalarına uyulmasına özen gösterilmiştir. İzofluran kullanıcısının güvenliği için atık gazı toplamak amacıyla bir izofluran filtresi kullanıldığından emin olun. Bu protokolün her adımında eldiven ve gözlük takarak hayvanları dikkatli bir şekilde taşıyın. Tüm tehlikeli materyaller yerel kurumsal düzenlemelere uygun olarak yönetilmelidir; burada tüm kontamine örnekler (kan, iğneler, doks içeren flakonlar vb.) biyotehlikeli sağlık atık kutularına atılmıştır. Protokol genel bakışı Figure 1A'da gösterilmiştir. Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Table of Materials içinde listelenmiştir.

1. 0. Hafta: Hücre hazırlığı ve hayvana enjeksiyon

NOT: Aşağıdaki adımlar 4T1Luc hücreleri için açıklanmıştır ve PY8119 hücrelerinin kullanımı için de aynıdır. Bununla birlikte, üretici tavsiyelerine bağlı olarak bu adımlar her hücre hattı için uyarlanmalıdır. Protokolü optimize etmek için, bir kişi hücre hazırlığını gerçekleştirirken diğeri hayvan hazırlığını yapabilir.

  1. Konfluens düzeyine ulaşmış bir hücre kültürü flaskı (%80-%90 konfluens) elde edildiğinde, 5 dakika boyunca şu sıcaklıkta 3 mL tripsin uygulayın: 37 °C ve %5 CO22.
  2. Hücrelerin tamamının ayrışması için erleni hafifçe tıklatın, hücre kümelerinin oluşmasını önleyin ve hücre kültür ortamında yeniden süspanse edin.
  3. Malassez kamarası (veya mevcut imkanlara bağlı olarak başka bir teknik) kullanarak hücreleri sayın.
  4. Hücreleri 300'de santrifüj edin × g 5 dakika boyunca bekletin, ardından 200.000 hücre enjekte etmek için eşit hacimde PBS içinde yeniden süspanse edin 100 µL.
    NOT: Hücre sayısı, literatür taraması sonucunda belirlenmiştir (bakınız Ek Tablo 2).
  5. 26 G'lik bir şırınga kullanarak nazikçe aspire edin 500 µL hücre süspansiyonunun. Hücre süspansiyonunun şırınga içerisinde çok uzun süre kalmasını önlemek için, şırınganın 5 hayvan için gerekenden daha az hacimde doldurulması önerilir.
  6. Fareleri (mümkünse aynı anda) bir izofluran haznesine yerleştirin ve oda havası içerisinde 1 L/dk akış hızında %3 izofluran ile hızla anestezi indüksiyonu gerçekleştirin. Hayvan uyur uyumaz, burnu %1 izofluran içeren bir koni içerisinde olacak şekilde sırtüstü pozisyona getirin.
  7. Bir pamuklu çubuk yardımıyla hayvanın torasik bölgesine ve sol inferior abdominal duvarına 1 dakika boyunca yumuşatıcı tüy temizleme kremi uygulayın. Tüyleri ve kremi suyla temizleyin, ardından cildi bir peçete ile kurulayın.
  8. Parmak ucunu sıkarak yeterli anestezi sağlandığından emin olun.
  9. Üst karın sol meme ucunu belirleyin. Cımbızla nazikçe kavrayıp yukarı doğru kaldırın (bakınız Şekil 1B).
  10. Şırınga iğnesini deri altına yerleştirin ve iğne meme bezinin altına gelene kadar ilerletin.
  11. Enjekte edin 100 µL hücre süspansiyonunun. Meme ucunun altında deri altı bir kabarcık oluşmalıdır (bakınız Şekil 1C). Kontrol hayvanlarına PBS verilmelidir. Randomizasyon, randomizasyon yazılımı (ücretsiz bir çevrimiçi araç olan RandoMice gibi) kullanılarak veya tedavilerin farelere önceden belirlenmiş 1'e 1 veya 2'ye 2 oranında (veya daha yüksek) tahsis edilmesiyle gerçekleştirilebilir.
  12. İğneyi nazikçe çıkarın ve pensle tutulan meme ucunu serbest bırakın.
  13. Protokol için bazal ağırlığı belirlemek amacıyla hayvanı tartın.
  14. Hayvanı kafesine geri koymadan önce ortam havasında uyanmaya bırakın.

2. 1. Hafta: Biyolüminesans ile tümör büyümesinin kontrolü

NOT: Bu işlem, büyümeyi kontrol etmek için enjeksiyondan sonraki herhangi bir günde yapılabilir. Ayrıca, tümör büyüme hızıyla ilgileniliyorsa bu işlem birden fazla zaman noktasında gerçekleştirilebilir. Ancak, 10–14 gün sonra, kanser büyümesi sırasındaki doğal tümör hücresi seçimi nedeniyle sinyal kaybolabilir. Ayrıca, protokol başlangıçta doğru şekilde uygulandıysa, uygun foton yakalaması için saçların yeniden çıkması bir sorun teşkil etmemelidir. Tümör enjeksiyonundan sonraki 2, 5, 8 ve 11. günlerde kantifiye edilen biyolüminesansın temsilci sonuçları için Şekil 2A,B'ye bakınız.

  1. Hayvanları bir isoflurane haznesine yerleştirin ve %3 isoflurane ile hızlıca anesteziyi başlatın.
  2. Hayvanlar uyuduktan sonra, 26-G şırınga kullanarak vücut ağırlığının gramı başına 10 µL lusiferini intraperitonal (IP) olarak enjekte edin. Birkaç gün sonra bazen palpe edilebilen tümörün varlığı nedeniyle, lusiferini sol taraftan enjekte etmekten kaçının.
  3. Tümör abdominal tarafta olduğu için, foton yakalamayı optimize etmek amacıyla fareleri foton görüntüleyiciye sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Burunu koni içerisine yerleştirin ve isoflurane oranını %1'e düşürün.
    NOT: 5 hayvanın bir foton yakalayıcıya doğru şekilde yerleştirilmesi zaman alır; yerleştirme işlemine görüntüleme başlamadan en az 2 dakika önce başlayın.
  4. Lusiferin enjeksiyonundan 10 dakika sonra lüminesans aktivite görüntülemesini başlatın ve 5 dakika boyunca sürdürün (Bkz. Şekil 2A). Burada kullanılan cihaz için görüntüleme modu, kare başına 89 ms BLI, 220 mm x 165 mm görüntü boyutu ve 153 µm BVR piksel boyutu olarak ayarlanmıştır.
  5. Görüntüleme tamamlandığında, hayvanı kafesine geri götürmeden önce ortam havasında uyanmasını bekleyin.
  6. Üreticinin önerilerini takip ederek, foton görüntüleyiciye uygun nicelendirme yazılımını kullanın.

3. 2. Hafta: Doksorubisin tedavisi

NOT: Ekokardiyografik değerlendirme, Dox enjeksiyonlarına başlanmadan önce yapılmalıdır. Bu nedenle, ilk Dox enjeksiyonundan kaynaklanan stresi en aza indirmek için, hayvan uykudayken enjeksiyonu uygulamak amacıyla ekokardiyografi sonrası uygulanan anesteziyi kullanın. Ayrıca, kümülatif doz her fare suşuna göre uyarlanmalıdır. Burada, önceki kurum içi verilere ve literatüre29 dayanarak Balb/c fareler için 16 mg/kg ve C57Bl/6J için 24 mg/kg kullanılmıştır (bkz. Şekil 3A–C).

  1. Doxorubicin tozunu salin solüsyonu ile yeniden süspande edin ve seyreltin. Seyreltme işlemi, 4 mg/kg Dox'un 240–360 µL'lik bir hacme karşılık geleceği şekilde hazırlanmalıdır. Bu nedenle, 2 mg/mL konsantrasyonunda bir solüsyon hazırlayıp ardından salin solüsyonu ile 6 kat seyreltme yapılması önerilir (final konsantrasyon 0.33 mg/mL).
  2. Tümör enjeksiyonundan iki hafta sonra, tümörün abdomenin sol alt kısmında palpe edilebilir olduğundan ancak 1 cm'den küçük olduğundan emin olun.
  3. Dox tedavisi sonrası kilo kaybını kontrol etmek için hayvanı tartın.
  4. 26 G enjektör kullanarak, abdomenin sağ alt kısmına 4 mg/kg IP dozuna ulaşacak uygun hacmi enjekte edin. Kontrol hayvanlarına salin solüsyonu uygulanmalıdır. Randomizasyon, adım 1.11'de olduğu gibi yapılabilir.
  5. 16 mg/kg toplam doza ulaşmak için bu prosedürü 4 gün boyunca günlük olarak tekrarlayın (C57Bl/6J fareleri için 24 mg/kg'a ulaşmak amacıyla 2 gün daha ekleyin).

4. 2–5. Hafta: Kardiyotoksisite izleme

NOT: Bu işlem haftalık olarak gerçekleştirilebilir. Protokolün 3. ve 4. haftalarında hayvanların genellikle en hassas durumda olması ve bazı fare suşlarının genel anesteziye duyarlılığının artmış mortaliteye yol açabileceği nedeniyle, daha sık değerlendirmeler yapılırken dikkatli olunmalıdır. İzofluran miyokardiyal depresyona neden olduğundan, kardiyak disfonksiyon kayıt şansını optimize etmek için ekokardiyografi ketamin anestezisi altında yapılır; Balb/c fareler için 40 mg/kg ve C57Bl/6J fareler için 80 mg/kg kullanılır39. Kemoterapi başlatılmadan önce, tümör büyümesinin kardiyak fonksiyon üzerindeki potansiyel etkisini nicelleştirmek için tümör enjeksiyonundan önce bir ultrason yapılması önerilir.

  1. Hayvanı tartın. Önemli bir kilo kaybı gözlemlenirse, şunları izleyin Ek Tablo 1.
  2. Hafif anestezi sağlamak için hayvanları, 26 G şırınga ile 40 mg/kg ketamin (Balb/c fareler) veya 80 mg/kg ketamin (C57Bl/6J fareler) IP enjeksiyonu yaparak anesteziye alın.
  3. Hipotermiyi önlemek için hayvanı bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin.
  4. Hayvan uyuduktan sonra, tüysüz bir toraks bölgesi elde etmek için hayvanı 1.7'de açıklandığı şekilde tıraş edin.
  5. Ketamin enjeksiyonundan on dakika sonra, maksimum 5 dakika boyunca ekokardiyografi yapın. Önceden ısıtılmış ultrason jeli kullanın. Kullanılan cihaza bağlı olarak, M-moduna odaklanın ve/veya strain kantifikasyonu yapın.
  6. Eğer M-modu kullanılıyorsa, farenin kalp fonksiyonunun temsili bir ortalamasını elde etmek için parasternal uzun eksen görünümünde, orta ventriküler kesitleri, en az 4 saniye boyunca atım yapacak şekilde, en az 3 kez kaydedin (bkz. Şekil 4A,B). Burada kare hızı 100 kare/s, iletim frekansı %100 güçte 38,4 MHz, alım frekansı 96 MHz, ses hızı 1538 m/s ve tarama hızı 1200 Hz olarak ayarlanmıştır.
  7. Yaklaşık 5 dakika sonra hayvan, ekokardiyografiye izin vermeyecek kadar uyanacaktır. Ultrason için kullanılan jeli temizledikten sonra hayvanı tekrar kafesine yerleştirin.
  8. Kardiyak fonksiyonu körleme yöntemiyle nicelendirin39,40Bu modeldeki ilgili disfonksiyon, bazal değerin %10 altı ve mutlak bir değer olarak tanımlanmıştır. <kalp hızı sabit kalırken sol ventrikül fraksiyonal kısalması (FS) %50'dir >300 BPM. Eğer ön işlem FS değeri çok düşükse, hayvanın analiz dışı bırakılmasını değerlendirin.
    NOT: 4 s'lik kesitlerden elde edilen her bir nicelleştirme için en az 3 kardiyak döngü gereklidir, ancak mümkün olduğunda daha fazla döngü kullanılabilir. Analizi körleme yöntemiyle gerçekleştirmek için mümkünse tüm ekokardiyografiler için aynı araştırmacıyı ve nicelleştirme için farklı bir kişiyi görevlendirin. Ekokardiyografinin kalite kontrolüne ilişkin öneriler başka bir yerde yayınlanmıştır.40.
  9. İstatistiksel analiz gerçekleştirin (bkz. adım 6). Protokol boyunca iki grubun analiz edilmesi için önerilen test, iki faktörün (zaman ve işlem) karşılaştırılması nedeniyle iki yönlü ANOVA'dır.
  10. Bunu haftalık olarak gerçekleştirin. Disfonksiyon, sadece 1 haftalık doksorubisin tedavisinden sonra ortaya çıkar.
    NOT: Örneğin, kardiyak biyobelirteçleri ölçmek için Dox sonrası belirli bir zaman noktasında kan örneği alınması gerekiyorsa; başka bir anestezi enjeksiyonundan kaçınmak, hayvan stresini minimize etmek ve zamanı optimize etmek için kan örneğini ekokardiyografiden hemen sonra alın.

5. 5. Hafta: Sakrifiye prosedürü

NOT: İdeal olarak, bu organ toplama protokolü iki kişi ile gerçekleştirilmelidir.

  1. 5. haftadaki son ekokardiyografiden sonra, hayvanlara 100 mg/kg IP ketamin yeniden enjekte edin. Kan alma işlemi için kullanılacak göze bir damla %1 Tetrakain ile lokal anestezi uygulayın.
  2. Heparinli bir kapiler kullanarak, mümkün olduğunca fazla kanı heparinli bir tüpe (veya EDTA kapiler ile EDTA tüpüne) toplamak için retro-orbital kan alma işlemi gerçekleştirin.
  3. Daha fazla kan alınamadığında, kurum tarafından onaylanmış protokoller doğrultusunda servikal dislokasyon uygulayın. Toplanan kanı, adım 5.5'te belirtilen sakrifikasyon protokolü uygulanırken, sonraki işlemlerle kullanılana kadar hemen buz üzerinde tutun.
  4. Kan hücrelerini ve plazmayı ayırmak için kanı 4 °C'de 10 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüjleyin. Plazma tüpünü sıvı azot ile şok dondurun ve ileri analizlere kadar -80 °C'de saklayın.
  5. Hayvanı, emici kağıtla kaplanmış bir polistiren köpük kapak üzerine yerleştirin ve 4 bacağını iğnelerle sabitleyin.
  6. Tümör önemli bir boyutta (en az 2 cm) olmalıdır. Tümörü ayırmak için çevresinde geniş bir marj bırakarak kesin. Diğer organ toplama işlemleri adım 5.15'te açıklandıktan sonra daha detaylı diseksiyon yapılabilir.
  7. Ayrı bir alanda, tümörü cımbızla tutarken küçük, keskin makaslarla nazikçe diseke edin. Tümöre zarar vermeden gerginliği artırmak için fazla deriyi kapağa iğneleyin. Bu, diseksiyonu kolaylaştıracaktır.
  8. Tümör iyice diseke edildikten sonra kanı, tüyü ve diğer yapışık olmayan kalıntıları temizlemek için PBS ile nazikçe yıkayın. Tümörü tartın.
  9. 5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 22 µm naylon ağ yerleştirin, tümörü üzerine nazikçe koyun ve santrifüj işlemine kadar buz üzerinde tutun.
  10. İnterstisiyel sıvıyı toplamak için tüpü 4 °C'de 10 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyin (bkz. Şekil 5A). Elde edilen hacim 1 ile 20 µL arasında değişir ve rengi genellikle kırmızımsıdır (Şekil 5B). Sıvıyı 200 µL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve ileri analizlere kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Tümörün geri kalanı daha küçük parçalara bölünüp saklama tüplerine yerleştirilebilir, sıvı azot ile şok dondurulabilir ve ileri analizlere kadar –80 °C'de saklanabilir.
  11. Kemik iliği toplamak için sağ bacağı makasla kesin; femur ve tibiayı, tüm kas, bağ dokusu ve yağlar uzaklaştırılacak şekilde skalpel ve cımbızla diseke edin. Her iki kemiğin her iki ucundaki epifizleri skalpel ile kesin. Farelerin organ toplama işlemini adım 5.15'te açıklandığı şekilde tamamlarken, temizlenmiş kemikleri 12 kuyucuklu kültür plakalarındaki PBS'e yerleştirin.
    NOT: Kemik iliği izolasyonunun daha ayrıntılı detayları başka bir yerde yayınlanmıştır41.
  12. 500 µL'lik mikrosantrifüj tüplerinin altını 18 G iğne ile delin, iki kemiği içine yerleştirin ve tüpü 400 µL PBS ile doldurulmuş 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünün içine koyun.
  13. Tüpleri 4 °C'de 1 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin. 1.5 mL'lik tüpün dibinde bir hücre peleti görülür; bunların tamamı kemik iliği hücreleridir, kemik iliği stroması ise PBS ile karışmış haldedir. Tüm süpernatantı (kemik iliği stroması) ayrı bir saklama tüpüne aspire edin, materyali sıvı azot ile şok dondurun ve -80 °C'de saklayın.
  14. Makasla, toraksın altında diyafram seviyesinde transvers bir insizyon yapın ve akciğerler ile kalbi açığa çıkarmak için sternumu boylamsal ekseni boyunca kesin.
    NOT: İleri analizler için gerekliyse, burada salin solüsyonu ile tam kan alma işlemi gerçekleştirilebilir.
  15. Biyomoleküler ve histolojik analiz için gerekli tüm organları toplayın. Bunları tartın ve gelecekteki biyomoleküler analizleri kolaylaştırmak için daha küçük parçalara bölün. Organlar küçük parçalara ayrılır ayrılmaz tüm tüpleri sıvı azot ile şok dondurun, ardından -80 °C'de saklayın.
  16. Kalp için, apeks kısmını kalbin üst kısmından ayırın ve OCT ile doldurulmuş plastik kalıplara yerleştirin. OCT içerisine yerleştirdikten sonra, sıvı azot ile şok dondurup -80 °C'de saklamadan önce soğuk izopentana yerleştirin.

6. İstatistiksel analiz

NOT: Tüm istatistiksel analizler ve grafikler, istatistiksel ve grafik yazılımları kullanılarak gerçekleştirilmiş olup istatistik kılavuzu önerilerini42 takip etmektedir.

  1. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur.
  2. Fraksiyonel kısalmaya ilişkin tüm grafikler için aynı ölçeği kullanın.
  3. Her grafikte her bir bireysel deneysel birimi (fare) gösterin.
  4. Anlamlılık düzeyi alfa p = 0.05 olarak belirlenerek, her bir deneysel grubun dağılımlarının normalliğini değerlendirmek için Shapiro-Wilk testi uygulayın.
  5. İki grup arasındaki karşılaştırma için, dağılımın normalliğine bağlı olarak Welch veya Mann-Whitney testlerini kullanın (her iki grupta normal dağılımlar için Welch testi, gruplardan birinde veya her ikisinde normal olmayan dağılımlar varsa Mann-Whitney testi). %95 güven düzeyi ile çift kuyruklu seçenekleri belirleyin.
  6. Belirli bir zaman noktasında ikiden fazla grup arasındaki karşılaştırma için, yine adım 6.4'te olduğu gibi grupların dağılımlarının normal olup olmadığını belirleyin. Dağılım normalse, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından çoklu karşılaştırmalar için Holm-Sidak düzeltmesi uygulayın.
    NOT: Dağılım normal değilse, bunun yerine çoklu karşılaştırmalar için Dunn düzeltmeli Kruskal-Wallis testi uygulanmalıdır. Anlamlılığı belirlemek için aile bazlı alfa eşiği 0.05 olarak belirlenmiştir.
  7. Boylamsal veriler için, belirli bir zaman noktasındaki grup farklarını incelemek amacıyla tekrarlanan ölçümlü iki yönlü ANOVA ve ardından çoklu karşılaştırmalar için Sidak düzeltmesi kullanılmıştır. Anlamlılığı belirlemek için aile bazlı alfa eşiği 0.05 olarak belirlenmiştir.

Sonuçlar

Bu protokol, gösterildiği üzere Şekil 1A, şu deneysel grupların oluşturulduğu 5 haftalık bir protokoldür: tümör taşımayan doks-free fareler, tümör taşımayan doks-tedavi edilen fareler, tümör taşıyan doks-free fareler ve tümör taşıyan doks-tedavi edilen fareler. Her iki cinsiyetin kullanılmasına bağlı olarak bu grupların sayısı iki katına çıkabilir. Doks tedavisine başlanmadan önceki tümör büyümesinin ilk 2 haftası, 4 bölgelerine 200.000 hücre enjekte edildikten sonra tümörün büyümesi için yeterlidirth hayvanların sol meme bezi (Şekil 1B). Tümör hücresi süspansiyonu nazikçe enjekte edilirken, meme ucu altında bir kabarcık oluşmasıyla deri altı enjeksiyonun gerçekleştiği onaylanmalıdır (Şekil 1C). Tablo 1 her bir fare suşu için protokolün temel parametrelerini ve aşağıda tartışılacak olan ana sonuçları kısaca özetler.

Şekil 2A tümörsüz bir fareye (sol) ve tümörlü bir fareye (sağ) lusiferin enjekte edilip 5 dakika boyunca fotonların toplandığı durumda elde edilen biyolüminesans sinyalinin temsilî görüntüsüdür. Bu analiz, lusiferin enjeksiyonu sonrası foton üretmek için tümörlerin lusiferaz genini eksprese etmesini gerektirir. Toplamda, 4T1Luc hücre enjeksiyonu yapılan 33 Balb/c fare 11 gün boyunca biyolüminesans ile izlenmiş, 9 kontrol grubu kullanılmıştır. Şekil 2B tümörün hızla büyüdüğünü ancak sinyal yoğunluğunun 8. günden sonra plato çizmeye başladığını ve [şekil/grafik]'te gösterildiği üzere, dişi Balb/c farelerde tümörün başlangıçta erkeklere kıyasla daha hızlı büyüdüğünü doğrulamaktadır Şekil 2C. 45 Balb/c faresinden sadece 1 tanesinde 5 hafta sonra tümör oluşmamışken, tüm C57Bl/6J farelerinde 5 hafta sonra tümör görülmüştür (Şekil 2D).

Şekil 3A  ve Şekil 3B Dox'un kümülatif doz azalmasının, Dox başlangıcından 3 hafta sonra sağkalımı artırdığını kanıtlayın: 24 mg/kg dozda tümör taşıyan hiçbir Balb/c fare hayatta kalamazken, 16 mg/kg dozda %50'si hayatta kalmıştır. Ancak, tümör taşıyan C57Bl/6J fareler, 24 mg/kg Dox dozunda bile daha dirençlidir, çünkü >Kemoterapi başlangıcından 3 hafta sonra bunların %80'i hayatta kalır (Şekil 3D). Cinsiyetin sonuç üzerinde önemli bir etkisi vardı: Balb/c farelerde dişiler, erkeklere göre çok daha iyi bir sağkalım sergiledi (16 dişi farenin 29'u hayatta kalırken, erkeklerin ise yalnızca 16'da 3'ü hayatta kaldı). Şekil 3C 16 mg/kg Dox alan Balb/c farelerdeki cinsiyet farklılıklarını göstermektedir (erkek sayısı az olduğu için istatistiksel test yapılmamıştır). C57Bl/6J farelerde, iki cinsiyet arasında sağkalım açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır (bkz. Şekil 3E).

Dox tedavisi öncesinde ekokardiyografi ile değerlendirilen sağlıklı fare kalp fonksiyonlarını temsil eden bir görüntü şurada gösterilmiştir: Şekil 4Ave Dox sonrası kardiyak disfonksiyon gelişmiş bir fareye ait olanı ise şurada gösterilmiştir Şekil 4B24 mg/kg Dox uygulanan tümör taşıyıcılı 17 C57Bl/6J farede M-modunda kantifiye edilen FS, iki hafta sonra belirgin bir azalma göstermektedir (Dox öncesi %59,3 karşı Dox sonrası %44,3, p < 0.0001, Şekil 4C). Hayatta kalan 12 fareden sadece 1 tanesi (%8), kardiyotoksisite için önceden belirlenmiş kriterleri karşılamamıştır. Kalp hızı, Dox öncesi 623 BPM'den Dox sonrası 569 BPM'ye hafif ancak anlamlı bir şekilde azalmaktadır (p < 0.05, Şekil 4D). M-modu ile kantifiye edilen tüm parametreler şurada bulunabilir Ek Tablo 3.

Doksorubisinin kardiyotoksik etkisi makro- ve mikroskobik analizlerle doğrulanır. Şekil 6A,B, hayatta kalan az sayıdaki tümör taşıyan dişi Balb/c farelerde Dox tedavisinden sonra mutlak kalp ağırlığının anlamlı düzeyde azaldığını, ancak kalp ağırlığının toplam vücut ağırlığına normalize edilmesinin yalnızca bir eğilim gösterdiğini kanıtlamaktadır. Tümör taşımayan C57Bl/6 fareler üzerinde yapılan bir deneyde, Dox başlangıcından bir hafta sonra 24 mg/kg Dox, aşağıdaki genlerin kardiyak mRNA düzeylerinde beklenen değişiklikleri tetiklemiştir: atrofi lehine Atrogin ve Murf1 artmış, oksidatif stres lehine NQO1 artmış ve pro-apoptotik bir durum lehine Bax artmıştır (Şekil 6C–F).

Şekil 5A, tümör interstisyel sıvı protokolünün şematik bir gösterimidir. Toplanan sıvının temsili bir görüntüsü Şekil 5B'de gösterilmiştir: elde edilen hacim küçüktür.

figure-results-1
Şekil 1: Deneysel protokolün temsilci illüstrasyonları. (A) Deneysel protokolün şematik genel görünümü. BioRender ile oluşturulmuştur (lisans no. JE29USE7LU). (B) Subkütan tümör inokülasyonunun şematik gösterimi. BioRender ile oluşturulmuştur (lisans no. SO29JHW7R6). (C) Başarılı subkütan tümör implantasyonunun şematik gösterimi. BioRender ile oluşturulmuştur (lisans no. SO29JHW7R6). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Biyolüminesans görüntüleme ve tümör implantasyon oranı. (A) Kontrol faresinin (solda) ve tümör taşıyan bir farenin (sağda) temsili biyolüminesans görüntüleri. (B) Zaman içindeki biyolüminesans sinyali (ortalama ± SEM; tekrarlanan ölçümlü iki yönlü varyans analizi [ANOVA]; *P < 0.05). (C) Erkek ve dişi Balb/c fareleri arasındaki biyolüminesans sinyallerinin karşılaştırılması (ortalama ± SEM). (D) Her iki fare suşundaki tümör implantasyon başarı oranları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Tümör taşıyan farelerin sağkalım analizi. (A) 24 mg/kg doksorubisin (Dox) ile tedavi edilen Balb/c farelerin Kaplan–Meier sağkalım eğrisi. (B) 16 mg/kg Dox ile tedavi edilen Balb/c farelerin Kaplan–Meier sağkalım eğrisi. (C) 16 mg/kg Dox ile tedavi edilen erkek ve dişi Balb/c fareleri karşılaştıran Kaplan–Meier sağkalım eğrisi. Erkek fare sayısının sınırlı olması nedeniyle istatistiksel analiz yapılmamıştır. (D) 24 mg/kg Dox ile tedavi edilen C57BL/6J farelerin Kaplan–Meier sağkalım eğrisi. (E) 24 mg/kg Dox ile tedavi edilen erkek ve dişi C57BL/6J fareleri karşılaştıran Kaplan–Meier sağkalım eğrisi (log-rank testi, P = 0.86). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Doksorubisin kaynaklı kardiyotoksisitenin ekokardiyografik değerlendirmesi. (A) Sağlıklı bir fareden alınan temsilci M-mod ekokardiyogram. (B) Doksorubisin kaynaklı kardiyotoksisiteye sahip bir fareden alınan temsilci M-mod ekokardiyogram. (C) Doksorubisin tedavisi öncesinde ve 14 gün sonrasında C57BL/6J farelerde fraksiyonel kısalma (FS). (D) Doksorubisin tedavisi öncesinde ve 14 gün sonrasında C57BL/6J farelerde kalp hızı (HR). Veriler n = 17 fare için sunulmuştur. İstatistiksel karşılaştırmalar Welch's t-testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *P < 0.05; ****P ≤ 0.0001. Kısaltmalar: FS, fraksiyonel kısalma; HR, kalp hızı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Organ örnekleme protokolü. (A) Tümör interstisyel sıvısı toplama protokolünün şematik gösterimi. BioRender ile oluşturulmuştur (lisans no. HV29USD91R). (B) Organ örneklemesi sırasında tümör interstisyel sıvısının toplandığını gösteren temsili görüntü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Doksorubisin kaynaklı kardiyotoksisite. (A) Tümör taşıyan Balb/c farelerde 16 mg/kg doksorubisin tedavisi başlangıcından 3 hafta sonra ölçülen kalp ağırlığı. (B) Tümör taşıyan Balb/c farelerde 16 mg/kg doksorubisin tedavisi başlangıcından 3 hafta sonra ölçülen ve toplam vücut ağırlığına normalize edilen kalp ağırlığı. (C) C57BL/6J farelerinin miyokardiumunda 24 mg/kg doksorubisin tedavisi başlangıcından 1 hafta sonraki Atrogin mRNA ekspresyonu. (D) C57BL/6J farelerinin miyokardiumunda 24 mg/kg doksorubisin tedavisi başlangıcından 1 hafta sonraki Murf1 mRNA ekspresyonu. (E) C57BL/6J farelerinin miyokardiumunda 24 mg/kg doksorubisin tedavisi başlangıcından 1 hafta sonraki NQO1 mRNA ekspresyonu. (F) C57BL/6J farelerinin miyokardiumunda 24 mg/kg doksorubisin tedavisi başlangıcından 1 hafta sonraki BAX mRNA ekspresyonu. İstatistiksel analizler, veri dağılımına bağlı olarak uygun şekilde Welch t-testi veya Mann–Whitney U testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. ns, P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Fare suşuBalb/cC57Bl/6J
Kullanılan hücre hattı4T1LucPY8119
Enjekte edilen hücre miktarı200 000200 000
Kullanılan cinsiyetErkek ve dişiErkek ve dişi
Enjeksiyon gün sayısı46
Günlük doz4 mg/kg4 mg/kg
Kümülatif Doksorubisin dozu16 mg/kg24 mg/kg
Ketamin dozu40 mg/kg80 mg/kg
Kardiyotoksisite insidansı>90%>90%
Sağkalım oranı19/4516/19

Tablo 1: Her bir fare suşu için temel protokol parametreleri. Balb/c ve C57BL/6J fare protokollerinde kullanılan temel deneysel değişkenlerin ve reaktif konsantrasyonlarının karşılaştırılması.

Ek Tablo 1: Hayvan refahı bitiş noktaları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: 4T1 deneysel protokollerinin literatür özeti. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 3: 24 mg/kg doksorubisin ile tedavi edilen tümör taşıyan 17 C57BL/6J farede M-modu ile ölçülen ekokardiyografik parametreler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada, meme tümörü taşıyan farelerde doksorubisinle indüklenen kardiyotoksisite modeli geliştirilmiştir ve bunun kardiyo-onkoloji alanındaki gelecekteki çalışmalar için güçlü bir klinik öneme sahip olduğu düşünülmektedir. Amaç, bir hastanın tanı konulmuş bir kanserle hastaneye gelişinden, potansiyel olarak kardiyotoksik bir kemoterapi ile tedavi edilmesine kadar geçen klinik sürecini taklit etmektir. Protokol, pragmatik bir tasarım izlemekte ve dünya çapında erişilebilen immünokompetan fareler kullanmaktadır; böylece diğer ekiplerin bu çalışmayı farklı laboratuvarlarda tekrarlamasına olanak tanımaktadır. Yüksek tümör implantasyon başarı oranı, bu modeli gelecekteki kardiyo-onkolojik toksisite çalışmaları için güçlü bir aday yapmaktadır.

Bu protokoldeki yaygın hatalar arasında, düşük kalp hızına sahip farelere ekokardiyografi yapılması yer alır; bu durum, yapay olarak düşük bir fraksiyonal kısalma (FS) sonucu doğurabilir. Ekokardiyografik değerlendirme öncesinde farelerin anesteziklerin başlangıçtaki negatif kronotropik etkilerinden kurtulmasına izin vermek, doğru FS ölçümleri yapılmasını sağlar. Balb/c farelerde, mortalite oranı yüksek kalmaya devam ederse anestezik dozunun daha da düşürülmesi gerekebilir. Gözlemciler arası değişkenlik belirgin olabileceğinden43, çalışma boyunca tüm ekokardiyografik değerlendirmeler aynı deneyci tarafından gerçekleştirilmelidir. Tümör implantasyonu sırasında, enjeksiyon esnasında şırınganın erken çekilmesi çizgi şeklinde bir tümör oluşmasına neden olabilir ve bu tümörler, uygun enjeksiyonla oluşturulan tümörlerden daha büyük büyüyebilir. Doğru meme ucuna enjeksiyon yapılması da kritiktir, çünkü üst abdominal meme ucuna yerleşim, tümör gelişiminin ilerleyen aşamalarında ekokardiyografik değerlendirmeyi engelleyebilir. Her farenin karşılaştırılabilir sayıda hücre almasını sağlamak ve böylece protokol sonunda tümör boyutundaki varyasyonu en aza indirmek için, süspansiyondaki hücrelerin manuel olarak sayılması ve enjeksiyondan önce iyice karıştırılması önerilir. Haftalık kan örneği alınması gerektiğinde, doksorubisin tedavisi sonrası fareler daha hassas hale geldiği için toplanan hacim dikkatle kontrol edilmelidir. Daha büyük hacimler protokol sırasında mortaliteyi artırabileceği için, her örnekleme zaman noktasında toplam maksimum 50 µL kan hacmi önerilir. Kan toplama sıklığı ve hacmi ayrıca yerel hayvan etiği gerekliliklerine ve kurumsal hayvan tesisi kılavuzlarına uygun olmalıdır. Örneklenen kan hacminin, subkütan olarak uygulanan eşdeğer hacimde salin ile değiştirilmesi, kan toplama sonrası sıvı kaybının telafi edilmesine yardımcı olabilir.

Bu doks-prosedürünü karşılaştırmak amacıyla, AIC hayvan modelleri üzerine yakın zamanda yayınlanmış bir inceleme, preklinik modellerin çoğunun (%88) tekrarlanan Dox enjeksiyonları kullandığını ve sonuç ölçümlerini (genellikle ekokardiyografi yoluyla) birkaç hafta sonra gerçekleştirdiğini gözlemlemiştir29. Makalelerin çoğu, muhtemelen dayanıklılığı ve düşük maliyeti nedeniyle C57Bl/6J suşunun (%73,8) kullanıldığını bildirmiştir29. Maalesef, önemli sayıda çalışma, AC'leri enjekte etmeden önce tümörün hayvan biyolojisi üzerindeki etkisini göz ardı etmiştir17,29. 736 çalışmadan sadece 46'sı tümör taşıyan modeller bildirmiş, bunlardan 12'si Balb/c farelerde 4T1 hücre hattını (triple-negatif benzeri meme kanseri) kullanmış ve sadece biri C57Bl/6J farelerde bir meme kanseri modeli (daha spesifik olarak EGFR2-pozitif benzeri meme kanseri) olmuştur29. Başka bir çalışmada EGFR-2-pozitif benzeri meme kanseri ile C57Bl/6J kullanılmış ancak kemoterapinin başlangıcından önce tümör büyümesine izin verilmemiştir; bu durum, modelin translasyonel yönünü sınırlamaktadır32.

İmmün yetmezlik fareleri kullanılarak oluşturulan xenograft modelleri, insan tümör hücre hatlarının kullanımına izin verir ancak fonksiyonel bir bağışıklık sisteminden yoksundurlar; bu durum, bağışıklık aracılı kardiyotoksisite mekanizmalarının incelenmesini kısıtlamakta ve bağışıklık kontrol noktası inhibitörlerine bağlı kardiyotoksisitenin artan önemi göz önüne alındığında büyük bir sınırlama teşkil etmektedir. Kardiyo-onkoloji alanında büyük hayvan modelleri ortaya çıkmaktadır, ancak bu modeller yüksek maliyet ve sınırlı genetik mühendisliği kapasitesi gibi dezavantajlara her zaman sahip olacaktır44. In vitro ve 2D/3D insan hücre tabanlı sistemler (örneğin, insan iPSC türevli kardiyomiyositler, kardiyak organoidler), yüksek kapasiteli mekanistik ve toksikolojik taramaya olanak tanır ancak in vivo modeller tarafından yakalanan entegre, tüm organizma fizyolojisini (hemodinamik, nörohormonal regülasyon, immün etkileşim) yeniden canlandıramazlar. Bu yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, bu syngeneic, immünokompetan, tümör taşıyan model, daha yüksek biyolojik değişkenlik, bazı suşlarda daha yüksek mortalite ve daha basit in vitro veya tümör taşımayan in vivo modellere göre daha düşük kapasite pahasına, tümör yükü ile kemoterapi kaynaklı kardiyotoksisite arasındaki etkileşimi incelemek için klinik olarak daha uygun bir bağlam sunar.

Bugüne kadar çoğunlukla kullanılan tümör taşımayan AC kardiyotoksisite modelleri; yüksek tekrarlanabilirlik, düşük maliyet ve daha kolay ekokardiyografik ile sağkalım değerlendirmeleri sunsa da, hastalarda kardiyotoksisitenin ilgili karıştırıcı faktörleri olarak giderek daha fazla kabul edilen tümör yükünün sistemik etkilerini, kanserle ilişkili inflamasyonu ve kaşeksiyi kalpte yakalayamaz17,45. Ayrıca, kalbin metabolik yeniden programlanması ve dolayısıyla kontraktil fonksiyonu, D-2-hidroksiglutarat veya süksinat gibi salgılanan onkometabolitler tarafından değiştirilebilir14. Bu nedenle, çeşitli omik yaklaşımlar (örneğin proteomik ve metabolomik) kullanılarak kardiyak biyokimyasal analiz için bir kardiyo-onkologik model oluşturulacaksa, kemoterapiden önce tümörün varlığı esastır. Literatürde tutarlı olmasa da, tümörün tek başına belirgin kardiyak disfonksiyonu tetikleyebileceğine dair bazı kanıtlar da bulunmaktadır. Bazı modeller tümör inokülasyonunun FS veya elektriksel iletim parametreleri üzerinde zararlı bir etkisi olduğunu gösterirken, diğerleri tümör varlığının fareleri transvers aortik konstriksiyon tarafından indüklenen yeniden modellemeden koruduğunu bulmuştur11,13,46. Ön hipoteze bağlı olarak, tümör taşımayan hayvanlara da ihtiyaç duyulmaktadır. Bu hayvanlar, kemoterapötik ajanın doğrudan kardiyotoksik etkisinin, tümörün kendi karıştırıcı etkisindenle ayrıştırılabileceği tek ortamı oluşturur ki bu, nedenselliğin kurulması ve ilaca özgü etki mekanizmalarının aydınlatılması için temel bir ön koşuldur. Bu hayvanlar, antikanser tedavi etkisi ve bunun tümörle kardiyotoksisite üzerindeki etkileşimi için kontroller olarak hizmet edecektir. Bu karşılaştırıcı olmadan, gözlenen kardiyak fenotipin hangi bileşeninin ilaca, tümöre veya bunların etkileşimine atfedilebileceğini ayırt etmek imkansız olacaktır. Bu ayrım sadece mekanistik anlayış için değil, aynı zamanda kardiyoprotektif stratejilerin rasyonel tasarımı için de kritiktir. Bu nedenle, bu modellerin her birinin farklı ve tamamlayıcı bilimsel sorulara yanıt verdiği ve tek başına hiçbir modelin klinik kardiyo-onkolojinin karmaşıklığını tam olarak yeniden oluşturmak için yeterli olmadığı kabul edilmelidir; sağlam mekanistik ve translasyonel sonuçlara varmak için genellikle her ikisinin kombine veya ardışık kullanımı gereklidir.

Bu protokolde kardiyotoksisite, orta dereceli asemptomatik kanser tedavisine bağlı kardiyak disfonksiyonu sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonunda (LVEF) meydana gelen bir azalma olarak tanımlayan 2022 ESC Kardiyo-onkoloji Kılavuzları'na göre tanımlanmıştır: >%40 ile %49 arasında LVEF'e sahip %1016Ancak, doğru LVEF kantifikasyonu için ultrason cihazında 3B modül gereklidir.39Sistolik kalp fonksiyonunun yanlış değerlendirilmesini önlemek ve daha eski ultrason cihazlarını kullanan laboratuvarlarda uygulanabilecek basit bir protokol sürdürmek amacıyla, ESC tarafından belirlenen kriterlerin aynısı ile farelerde M-modu analizi aracılığıyla doğru ve kolayca elde edilebilen FS'nin, kalp disfonksiyonu belirteci olarak kullanılması tercih edilmiştir. Bu protokol kullanıldığında, hayatta kalan farelerin %90'ı kardiyotoksisite kriterlerini karşılamaktadır; bu durum, protokolü gelecekteki translasyonel çalışmalar için güçlü bir aday haline getirmektedir. Dox'un kardiyotoksik etkisi, Balb/c farelerde makroskobik değerlendirme (azalmış kalp ağırlığı) ile doğrulanmıştır. C57Bl/6 farelerde sadece tümör içeren bir grup çalışmaya dahil edilmemiştir; bu nedenle, bu suş için henüz bir karşılaştırma mevcut değildir. Ayrıca, tümör taşımayan C57Bl/6 farelerde, Dox dozu, antrasiklin kardiyotoksisitesinin mekanizmaları üzerine önceki literatürle tutarlı olan şu değişiklikleri tetiklemiştir: artmış atrofi, oksidatif stres ve apoptoz.19,20.

Bununla birlikte, speckle-tracking global longitudinal strain (GLS) gibi hastalarda kullanılan daha modern değişkenler, teknik nedenlerle burada nicelendirilmemiştir. Eğer yerel olarak mümkünse, GLS'nin nicelendirilmesi ek bir değer sağlayacaktır; çünkü GLS, erken dönem kardiyak hasarı tespit etmede genellikle daha duyarlı kabul edilmektedir23. Kardiyotoksisite tespitinin kesinliğini artırmak için troponin gibi dolaşımdaki kardiyak biyobelirteçler de değerlendirilebilir; ancak, farelerde bu analizler için geleneksel olarak gereken plazma miktarı, bu hayvanların düşük toplam kan hacmi nedeniyle sınırlayıcı bir faktör olabilir. Ayrıca, Dox tedavisi sonrası bu hayvanların hassasiyeti, kan örneği alımı sırasında veya sonrasında mortalite oranlarını artırabilir. Son bir sınırlayıcı faktör ise, bu biyobelirteçler için kullanılan analizlerin hassasiyetidir ve bu durum genellikle yorumlamayı zorlaştırabilmektedir.

Tüm ultrason görüntülemeleri deneyimli aynı araştırmacı tarafından yapılmasına rağmen, tedavi uygulanmamış Balb/c farelerinde bile haftalar arasında yüksek varyasyon gözlemlenmiştir. Bu durum, suşun ketamin anestezisine olan hassasiyetiyle açıklanabilir47. Nitekim, başlangıçta anestezi altındaki prosedürler sırasında yüksek mortalite oranları gözlenmiş ve bu durum protokolün sonuna ulaşan hayvan sayısının azalmasına yol açmıştır; sonuç olarak Balb/c fareleri için kullanılan ketamin dozu 80 mg/kg'dan 40 mg/kg'a düşürülmüştür. Dox uygulanan Balb/c farelerinin sağkalım grafiklerine bakıldığında, bazı ölümlerin anestezi aşamasında (haftalık ekokardiyografi) meydana geldiği, ancak ölümlerin çoğunun herhangi bir aktif işlem olmaksızın hayvan barınağında gerçekleştiği görülmektedir; bu da Dox'un bu farelerdeki mortalitenin temel nedeni olduğunu vurgulamaktadır. Yine de, iki veya daha fazla suş karşılaştırılırken bu model için sağkalım grafiklerini yorumlarken anestezi kaynaklı ölümleri göz önünde bulundurmak önemlidir. Anestezi kaynaklı ölüm riskini azaltmak için ekokardiyografi uyanık farelerde de yapılabilir, ancak bu durum farelerin protokole dahil edilmeden önce eğitim ve alıştırma sürecinden geçmesini gerektirir. Dox ile ilgili olarak, azaltılmış dozlarda bile Balb/c farelerinin neredeyse yarısı protokolün sonuna ulaşamamıştır. Daha düşük Dox dozlarıyla kardiyotoksisite indüklemesi denenebilir, ancak bu durum kardiyotoksisite kriterlerini karşılayan hayvan sayısını azaltma riski taşır. Bir diğer strateji, her Dox enjeksiyonundan sonra hayvanın toparlanması için daha fazla süre tanımak olabilir; bu yöntem burada uygulanmamıştır ancak literatürde sağkalımı artırdığına dair kanıtlar bulunmaktadır29.

Bu model oluşturulurken yapılan, Balb/c farelerinin Dox'a C57Bl/6J farelerinden daha duyarlı olduğu ve dişilerin Dox'a erkeklerden daha dirençli olduğu yönündeki gözlemler, önceki literatürle29 uyumludur. Dahası, her iki fare suşunda elde edilen benzer ve tekrarlanabilir sonuçlar, önerilen bu modelin sağlamlığını daha da doğrulamaktadır. Kısa bir süre boyunca orta derecede yüksek günlük dozlar aracılığıyla yüksek kümülatif dozlara ulaşarak, yüksek sağkalım oranıyla birlikte yüksek kardiyotoksisite oranları elde edilmiştir. C57Bl/6J farelerinde bir meme kanseri modeli (PY8119, triple-negatif benzeri bir meme kanseridir) oluşturmak, bu farelerin transgenik modeller için temel genetik arka planlardan birini temsil etmeleri nedeniyle34 gelecek çalışmalar için büyük fayda sağlayacaktır. Seçilen enjeksiyon yönteminin etkinliğini destekleyen tümör inokulasyonlarının yüksek başarı oranı da bu model için gelecek vaat etmektedir. Ayrıca, bu farelerin yüksek Dox toleransı, sekonder kanser veya metastazın sık görülen klinik durumlarını taklit etmek amacıyla Dox ile yeniden uyarmaların yapıldığı daha uzun süreli çalışmalara kapı açmaktadır. Son olarak, organ örnekleme protokolü; tüm katı organların, tümörlerin ve bunların interstisyel sıvısının, ayrıca kemik iliğinin ve stromasının toplanmasını sağlayarak modelin oldukça kapsamlı bir şekilde analiz edilmesine olanak tanır.

Bu modelin bazı sınırlamaları vardır. Pragmatik tasarımı nedeniyle ve invaziv cerrahiyi önlemek amacıyla, tümörün kesin konumu (yani, deri altı yağ dokusu yerine doğru meme bezi), bilimsel soruya bağlı olarak büyük önem taşıyabilecek bir husus olmasına rağmen, deri altı enjeksiyon ile tam olarak kontrol edilememektedir48. Eğer kesin kanser bölgesi enjeksiyonuna ihtiyaç duyulursa, ortotopik enjeksiyon gerçekleştirmek için daha kapsamlı bir cerrahi daha uygun olabilir; ancak hacim, latans ve insidans enjeksiyon yönteminden bağımsız olarak benzer sonuçlar verdiğinden, bu durum esas olarak tümör biyokimyasal analizi planlandığında önem taşımaktadır48. Ayrıca, sadece AC'lerin kullanımının, hastaların sıklıkla siklofosfamid veya cisplatin gibi kombinasyon rejimleri aldığı klinik durumla mükemmel şekilde korele olmadığı savunulabilir. Bu, gerçekten de bu protokol için bir sonraki tasarım olabilir; ancak kullanılan her kemoterapi için doz adaptasyonu dikkatle yapılmalıdır. Dahası, Dox tedavisinin başlangıcından 3 hafta sonra Balb/c farelerde %50'nin üzerindeki mortalite oranı hala çok yüksektir; doz azaltımı, belki daha az belirgin bir kardiyotoksisite pahasına sağkalımı artırabilir. Ayrıca, bu modelde kullanılan dozlarla ilgili olarak, bunların günümüzde insanlarda yaygın olarak kullanılan dozlardan daha yüksek olduğu ve bunun bu modelin translasyonel potansiyelini sınırlayabileceği belirtilmelidir.

Açıklamalar

Yazarlar, makale ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedirler.

Teşekkürler

Hayvan refahının günlük izlenmesi konusundaki yardımları için hayvan tesisleri ekibine teşekkür ederiz. Hayvan protokolünün oluşturulmasındaki yardımları için Léanne Borges, Elias Ait Assa ve Clémence Chabaud'ya teşekkür ederiz. PY8119 hücreleri hediyesi için INSERM Birim 932'den Dr. Julie Helft'e teşekkür ederiz. Biyolüminesans konusundaki yardımları için Dr. Sylvain Provost'a ve öğrencisi Mel Gavens'a özel teşekkürlerimizi sunarız.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4T1Luc hücreleriATCCCRL-2539
Doksorubisin tozuKlinik bilim23214-92-8
EkokardiyografVisual SonicsVEVO LT-200
LusiferinPerkin Elmer E1605
Naylon ağMerckNY2002500
PhotonImager OptimaBioSpace Lab
PY8119 hücreleriDr. Julie Helft'ten hediye

Kaynaklar

  1. Meijers WC, et al. Heart failure stimulates tumor growth by circulating factors. Circulation. 2018;138(7):678-691.
  2. de Wit S, et al. Pressure overload-induced cardiac hypertrophy stimulates tumor growth in tumor-prone Apc(Min) mice. Circ Heart Fail. 2023;16(9):e010740.
  3. Avraham S, et al. Early cardiac remodeling promotes tumor growth and metastasis. Circulation. 2020;142(7):670-683.
  4. Langier Goncalves I, et al. Heart failure promotes cancer progression in an integrin β1-dependent manner. Int J Mol Sci. 2023;24(24):17367.
  5. Koelwyn GJ, et al. Myocardial infarction accelerates breast cancer via innate immune reprogramming. Nat Med. 2020;26(9):1452-1458.
  6. Wong J, Soh CH, Wang B, Marwick T. Long-term risk of heart failure in adult cancer survivors: a systematic review and meta-analysis. Heart. 2024;110(19):1188-1195.
  7. Kuiper JG, et al. Risk of heart failure among colon and rectal cancer survivors: a population-based case-control study. ESC Heart Fail. 2022;9(4):2139-2146.
  8. Mamidanna R, Nachiappan S, Bottle A, Aylin P, Faiz O. Defining the timing and causes of death amongst patients undergoing colorectal resection in England. Colorectal Dis. 2016;18(6):586-593.
  9. Armstrong GT, et al. Aging and risk of severe, disabling, life-threatening, and fatal events in the Childhood Cancer Survivor Study. J Clin Oncol. 2014;32(12):1218-1227.
  10. Herrmann J. Adverse cardiac effects of cancer therapies: cardiotoxicity and arrhythmia. Nat Rev Cardiol. 2020;17(8):474-502.
  11. Kelm NQ, Straughn AR, Kakar SS. Withaferin A attenuates ovarian cancer-induced cardiac cachexia. PLoS One. 2020;15(7):e0236680.
  12. Graca FA, et al. Progressive development of melanoma-induced cachexia differentially impacts organ systems in mice. Cell Rep. 2023;42(1):111934.
  13. Xiong S, et al. Development of an efficient mice model of cancer-associated cardiac cachexia. Anim Models Exp Med. 2025; 8(11):1960-1970.
  14. Karlstaedt A, Moslehi J, de Boer RA. Cardio-onco-metabolism: metabolic remodelling in cardiovascular disease and cancer. Nat Rev Cardiol. 2022;19(6):414-425.
  15. Murphy KT. The pathogenesis and treatment of cardiac atrophy in cancer cachexia. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2016;310(4):H466-H477.
  16. Lyon AR, et al. 2022 ESC Guidelines on cardio-oncology developed in collaboration with the European Hematology Association (EHA), the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology (ESTRO) and the International Cardio-Oncology Society (IC-OS). Eur Heart J. 2022;43(41):4229-4361.
  17. Ghigo A, et al. Update on preclinical models of cancer therapy-related cardiac dysfunction: challenges and perspectives. A scientific statement of the Heart Failure Association (HFA) of the ESC, the ESC Council of Cardio-Oncology, and the European Association of Preventive Cardiology. Eur J Heart Fail. 2025;27(6):1028-1046.
  18. Cagnazzo R, et al. Mismatch between preclinical cardio-oncology and clinical oncology research. JACC CardioOncol. 2025;7(6):770-773.
  19. Mattioli R, et al. Doxorubicin and other anthracyclines in cancers: activity, chemoresistance and its overcoming. Mol Aspects Med. 2023;93:101205.
  20. Martins-Teixeira MB, Carvalho I. Antitumour anthracyclines: progress and perspectives. ChemMedChem. 2020;15(11):933-948.
  21. Fabiani I, Chianca M, Cipolla CM, Cardinale DM. Anthracycline-induced cardiomyopathy: risk prediction, prevention and treatment. Nat Rev Cardiol. 2025;22(8):551-563.
  22. Rivero-Santana B, et al. Anthracycline-induced cardiovascular toxicity: validation of the Heart Failure Association and International Cardio-Oncology Society risk score. Eur Heart J. 2025;46(3):273-284.
  23. Camilli M, Cipolla CM, Dent S, Minotti G, Cardinale DM. Anthracycline cardiotoxicity in adult cancer patients: JACC: CardioOncology state-of-the-art review. JACC CardioOncol. 2024;6(5):655-677.
  24. Díaz-Guerra A, et al. Anthracycline cardiotoxicity induces progressive changes in myocardial metabolism and mitochondrial quality control. JACC CardioOncol. 2024;6(2):217-232.
  25. Omland T, et al. Sacubitril-valsartan and prevention of cardiac dysfunction during adjuvant breast cancer therapy: the PRADA II randomized clinical trial. Circulation. 2025: 152(16):1136-1145.
  26. Henriksen PA, et al. Multicenter, prospective, randomized controlled trial of high-sensitivity cardiac troponin I-guided combination angiotensin receptor blockade and beta-blocker therapy to prevent anthracycline cardiotoxicity: the Cardiac CARE trial. Circulation. 2023;148(21):1680-1690.
  27. Sobiborowicz-Sadowska AM, Kamińska K, Cudnoch-Jędrzejewska A. Neprilysin inhibition in the prevention of anthracycline-induced cardiotoxicity. Cancers (Basel). 2023;15(1):312.
  28. Stansfeld A, et al. Pharmacological strategies to reduce anthracycline-associated cardiotoxicity in cancer patients. Expert Opin Pharmacother. 2022;23(14):1641-1650.
  29. Li M, et al. Optimizing dose selection for doxorubicin-induced cardiotoxicity in mice: a comprehensive analysis of single and multiple-dose regimens. Eur J Pharmacol. 2025;1003:177883.
  30. Gambardella J, et al. Infiltrating macrophages amplify doxorubicin-induced cardiac damage: role of catecholamines. Cell Mol Life Sci. 2023;80(11):323.
  31. Chen Y, et al. Cysteine imaging reveals early redox dysregulation and identifies gnetol as a ferroptosis-modulating agent in doxorubicin cardiotoxicity. Redox Biol. 2026;92:104131.
  32. Luo W, et al. Critical role of the cGAS-STING pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Circ Res. 2023;132(11):321587.
  33. Mouse Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 2002;420(6915):520-562.
  34. Mekada K, Yoshiki A. Substrains matter in phenotyping of C57BL/6 mice. Exp Anim. 2021;70(2):145-160.
  35. Yin L, Duan JJ, Bian XW, Yu SC. Triple-negative breast cancer molecular subtyping and treatment progress. Breast Cancer Res. 2020;22(1): doi.org/10.1186/s13058-020-01296-5.
  36. Akbay EA, et al. D-2-hydroxyglutarate produced by mutant IDH2 causes cardiomyopathy and neurodegeneration in mice. Genes Dev. 2014;28(5):479-490.
  37. Springer J, et al. Prevention of liver cancer cachexia-induced cardiac wasting and heart failure. Eur Heart J. 2014;35(14):932-941.
  38. Herndon ME, et al. The highly metastatic 4T1 breast carcinoma model possesses features of a hybrid epithelial/mesenchymal phenotype. Dis Model Mech. 2024;17(9):dmm050771.
  39. Lindsey ML, Kassiri Z, Virag JAI, De Castro Brás LE, Scherrer-Crosbie M. Guidelines for measuring cardiac physiology in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2018;314(4):H733-H752.
  40. Zacchigna S, et al. Towards standardization of echocardiography for the evaluation of left ventricular function in adult rodents: a position paper of the ESC Working Group on Myocardial Function. Cardiovasc Res. 2021;117(1):43-59.
  41. Assad N, et al. Crosstalk between circulating DPP3 and immune cells in the context of cardio-systemic stress. iScience. 2026;29(3):115114.
  42. Motulsky HJ. GraphPad Statistics Guide. 2016. http://www.graphpad.com/guides/prism/10/statistics/index.htm.
  43. Garcia-Elcano L, et al. Accurate estimation of interobserver variability in echocardiography segmentation measured from 35 experts and impact on derived clinical metrics. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 2025;26(Suppl 1): jeae333.044.
  44. Medina-Hernandez D, et al. SGLT2i therapy prevents anthracycline-induced cardiotoxicity in a large animal model by preserving myocardial energetics. JACC CardioOncol. 2025;7(2):171-184.
  45. Asnani A, et al. Preclinical models of cancer therapy-associated cardiovascular toxicity: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 2021;129(1):e21–e34.
  46. Awwad L, Shofti R, Haas T, Aronheim A. Tumor growth ameliorates cardiac dysfunction. Cells. 2023;12(14):1853.
  47. Levin-Arama M, et al. Subcutaneous compared with intraperitoneal ketamine-xylazine for anesthesia of mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2016;55(6):794-800.
  48. Fleming JM, Miller TC, Meyer MJ, Ginsburg E, Vonderhaar BK. Local regulation of human breast xenograft models. J Cell Physiol. 2010;224(3):795-806.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kardiyo-Onkoloji ModeliAntrasiklin KardiyotoksisitesiMeme Tümörlü FarelerDoksorubisin TedavisiKardiyak UltrasonTümör BiyolüminesansıSol Ventrikül FonksiyonuTümör Taşıyan FarelerPreklinik Kardiyotoksisite

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.