Lazer Benek Kontrast Görüntüleme Kullanarak İnsan Deri Mikrosirkülasyonunda Sistemik Mikrovasküler Fonksiyonun Standartlaştırılmış Değerlendirmesi Protokolü

Summary

Bu protokol, klinik araştırma ortamlarında mikrovasküler reaktiviteyi değerlendirmek için lazer lek kontrast görüntüleme, farmakolojik iyotoforez ve fizyolojik uyarıcılarla birleştirilen insan deri mikrosirküler fonksiyonunun değerlendirilmesi için standartlaştırılmış, invaziv olmayan bir yöntemi tanımlar.

Abstract

Lazer benek kontrast görüntüleme (LSCI), mikrovasküler kan perfüzyonunun gerçek zamanlı, tam alan görselleştirmesini sağlayan yüksek çözünürlüklü, invaziv olmayan bir optik tekniktir. Bu protokol, LSCI kullanılarak insan deri mikrosirkülasyonunda sistemik mikrovasküler fonksiyonun değerlendirilmesi için standartlaştırılmış bir metodoloji sunmaktadır. Bu teknikle elde edilen ölçümler çevresel ve fizyolojik karıştırıcı faktörlere karşı son derece hassas olduğundan, protokol tekrarlanabilirliği ve deneysel güvenilirliği artırmak için sıkı standartlaştırma prosedürlerini vurgular. Protokol, 23°C ± 1°C arasında oda sıcaklığı stabilizasyonu, katılımcı konumlandırması, aklimatizasyon prosedürleri ve görüntü alımı sırasında dış müdahalenin en aza indirilmesi gibi temel çevresel kontrolleri detaylandırıyor. Metodoloji, LSCI'yi deri mikrovasküler reaktivitesini değerlendirmek için iki tamamlayıcı kışkırtıcı manevra ile entegre eder. Post-oklüzyon reaktif hiperemi entegre mikrovasküler reaktiviteyi değerlendirmek için kullanılırken, iyontoforez kaynaklı farmakolojik zorluklar endotel fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılır. Özellikle, endotel bağımlı vazodilatasyonu değerlendirmek için asetilkolin uygulanırken, endotelden bağımsız vazodilatasyonu değerlendirmek için sodyum nitroprussid uygulanır. Bu adım adım görselleştirilmiş protokol, standart LSCI metodolojilerinin klinik ve translasyonel araştırma ortamlarında benimsenmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Bu yaklaşım, dirençli hipertansiyon, diyabet ve koroner arter hastalığı dahil olmak üzere çeşitli klinik durumlarda mikrovasküler bozuklukları tespit etmek için başarıyla uygulanmıştır. Mikrovasküler reaktivitenin tekrarlanabilir ve invaziv olmayan değerlendirilmesini mümkün kılarak, bu metodoloji sistemik damar sağlığını araştırmak, hastalık ilerlemesini izlemek ve mikrovasküleri hedefleyen müdahalelerin etkinliğini değerlendirmek için değerli bir araç sağlar.

Introduction

Bu protokolün temel amacı, lazer lek kontrast görüntüleme (LSCI) ile fizyolojik ve farmakolojik provokatif manevralarla sistemik mikrovasküler fonksiyon ve reaktiviteyi değerlendirmek için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir metodoloji sağlamaktır. Yaklaşık 100 μm^çapından küçük terminal kan damarlarından oluşan mikrosirkülasyon, metabolik değişimin birincil noktasıdır ve periferik damar^{direncinin kritik belirleyicisidir 2}. Bu küçük damarlarda endotel disfonksiyonu genellikle makrovasküler değişikliklerden önce gelir ve hipertansiyon, diyabet ve koroner arter hastalığı gibi kardiyovasküler hastalıklar için erken bir biyobelirteç olarak^{hizmet eder 3}. Önemli olarak, mikrovasküler bozulma son organ hasarına önemli ölçüde katkıda bulunsa da, çok faktörlü hastalık sürecinde makrovasküler ateroskleroz ve sistemik kronik iltihaplanma ile birlikte etki eder. Bu nedenle, mikrovasküler reaktivitenin invaziv olmayan değerlendirmesi, translasyonel araştırmalarda hem erken tanı hem de terapötik etkinliğin izlenmesi için gereklidir⁴.

Deri mikrosirkülasyonunun sistemik damar sağlığı için bir vekil olarak kullanılmasının gerekçesi, onun erişilebilirliğinde ve küresel endotel fonksiyonuna temsil bir pencere olarak işlev^{görmesinde yatmaktadır 5,6}. Geleneksel olarak, lazer Doppler akışmetrisi (LDF), invaziv olmayan deri değerlendirmesi için altın standart olarak kabul^{edilmiştir 7}. Ancak, LDF, cilt perfüzyonunun doğuştan gelen heterojenliğine karşı noktalı ölçümler sağladığı için zayıf mekansal^{çözünürlükle sınırlıdır 8}. Buna karşılık, LSCI doku perfüzyonunun tam alan, gerçek zamanlı görselleştirmesini yüksek zamansal ve mekansal^{çözünürlükle 9}. Lazer ışığı saçılmasıyla oluşan girişim desenini analiz ederek, LSCI fiziksel temas veya dışsal boyalar gerektirmeden birden fazla damarlı bölgenin eşzamanlı değerlendirilmesini^{sağlar 10,11}.

Daha geniş literatürde, LSCI'nin asetilkolin (ACh) ve sodyum nitroprussid (SNP) gibi iyotoforez kaynaklı farmakolojik provokasyonlarla entegrasyonu, endotelyuma bağımlı ve endotelden bağımsız vazodilatator yolların değerlendirilmesi için sağlam bir yaklaşım olarak^{doğrulanmıştır 12,13}. Ayrıca, post-oklüzyon reaktif hiperemi (PORH), endotel aracıları, nörojenik duyusal sinirleri ve damar düz kas fonksiyonunu içeren mikrovasküler reaktivitenin entegre bir değerlendirmesini^{sağlar 12}. Avantajlarına rağmen, LSCI'nin çevresel ve fizyolojik değişkenliğe yüksek hassasiyeti sıkı standartlaştırma prosedürlerini gerektirir. Bu protokol, 23°C ± 1°C arası oda sıcaklığı stabilizasyonu ve standart katılımcı konumlandırması gibi kritik çevresel kontrolleri detaylandırarak bu zorlukları ele alır; böylece denek içi ve konnekler arası tekrarlanabilirliği^{artırmaktadır 10}. Bu metodoloji, çeşitli hasta popülasyonlarında mikrovasküler patofizyolojiyi araştırmak için metodolojik olarak temelli, invaziv olmayan bir yaklaşım arayan klinik ve translasyonel araştırmacılar için uygundur.

Protocol

İnsan katılımcıları içeren tüm işlemler, Ulusal Kardiyoloji Enstitüsü'nün (Brezilya Sağlık Bakanlığı) etik standartlarına uygun olarak, ulusal düzenlemelere (Ulusal Etik Araştırma Komitesi – INAEP – Mayıs 2024 No. 14.874 uyarınca) ve Helsinki Bildirgesi'ne (revize 2024) uygun şekilde gerçekleştirildi.

1. Katılımcı Hazırlığı ve Çevresel Kontrol

1. Sınav ortamını istikrara kavuşturmak
   1. Muayene odası sıcaklığını (RT; 23°C ± 1°C) özel bir termostat kullanarak stabil bir termal ortam sağlamak için stabilize edin.
   2. RT'yi her 10 dakikada bir kalibre edilmiş dijital termometre ile izleyin (doğruluk ±0.1°C).
      NOT: Deri mikrovasküler fonksiyonu sıcaklık dalgalanmalarına karşı son derece hassastır.
2. Katılımcıyı değerlendirmeden önce hazırlayın
   1. Katılımcılara değerlendirmeden önce 24 saat boyunca sigara içmekten, kafein veya alkol tüketmekten ve yoğun egzersiz yapmadan kaçınmalarını söyle.
   2. Katılımcılara değerlendirmeden önce en az 2 saat oruç tutmalarını ve su içmelerine izin vermelerini öğretin.
      NOT: Kafein ve yoğun egzersiz, deri damar tonusuna dış müdahaleyi en aza indirir. Kafein, adenosine reseptör antagonisti olarak ve egzersiz, sempatik sürücü ve termoregulasyon üzerindeki etkileri sayesinde, maruziyetten sonra birkaç saat boyunca devam eden mikrovasküler reaktivite değişikliklerine yol^{açabilir 4,14}.
3. Katılımcıyı görüntü edinme için konumlandırın
   1. Katılımcının baskın olmayan kolunu kalp seviyesine yerleştirin; ön kolu yatay ve sabit bir konumda tutmak için vücut minderleri kullanın.
   2. Önkolun ventral yüzeyini değerlendirme alanı olarak kullanın.
      NOT: Baskın olmayan ön kol, günlük aktivitelerle ilişkili lateralize damar remodelasyonunun etkisini en aza indirir. Ventral ön kol, optik görüntüleme için daha düşük saç yoğunluğu ve deri kalınlığının azalması gibi uygun anatomik özellikler sağlar; böylece sinyal artefaktlarını en aza indirir ve iyotoforetik ilaç ilminatının tekrarlanabilirliğini artırır.
4. Kardiyovasküler stabilizasyona izin verin
   1. Mikrovasküler kayıtlara başlamadan önce katılımcıyı en az 20 dakika dinlenme halinde tutun.
   2. Katılımcının dinlenme süresince konuşmasını, değerlendirilen uzuvunu hareket ettirmesini veya elektronik cihaz kullanmasını kısıtlayın.
      NOT: Stabilizasyon dönemi, başlangıç alımından önceki otonom ve kardiyovasküler dalgalanmaları en aza indirir.
5. Hareket artefaktlarını en aza indirin
   1. Katılımcının baskın olmayan ön kolunu vakum yastığı sistemine yerleştirin.
   2. Görüntü alımı boyunca ventral ön kol yüzeyini sabit yatay konumda tutmak için yastığı ayarlayın.
6. Deri yüzeyini hazırlayın
   1. Tüm ölçüler için görünür saç olmayan cilt bölgelerini seçin.
   2. Gerektiğinde değerlendirmeden 24 saat önce cerrahi bir makas makinesiyle saçınızı çıkarın.
      DIKKAT: Tüy alma için jilet kullanmayın çünkü cilt tahrişi mikrovasküler ölçümlere müdahale edebilir.
7. Arteriyal kan basıncını ölç
   1. Manşet boyutunu katılımcının kol çevresine göre seçin.
   2. Kalibre edilmiş otomatik osilometrik cihaz ile ardışık üç kan basıncı ölçümü yapın, ölçümler arasında 1 dakikalık aralık var.
   3. İlk ölçümü atıp son iki ölçümün ortalamasını hesaplayarak ortalama arter basıncını (MAP) belirleyin; ESC/ESH ve AHA kardiyovasküler yönergelerine göre.

2. LSCI Sistem Kurulumu ve Yazılım Yapılandırması

1. LSCI sistemini hazırlayın
   1. LSCI sistemini görüntü alımından en az 10 dakika önce açın, böylece lazer kaynağının dengelenmesi sağlanır.
   2. Kayıt başlatmadan önce yazılım durum göstergesini kullanarak lazer stabilizasyonunu doğrulayın.
2. Lazer başlığını konumlandırın
   1. Lazer başını katılımcının ön kolunun tam üstüne konumlandırın.
   2. Lazer başını üretici tarafından sağlanan mesafe ölçüm aracı kullanarak cilt yüzeyinden tam olarak 15 cm mesafeye ayarlayın (Şekil 1A)
      NOT: Sabit bir alım mesafesi korumak, katılımcılar arasında optimal görüntü odakını ve tutarlı bir görüş alanını sağlar.
3. Satın alma yazılımını yapılandırma
   1. Görüntü edinme yazılımını başlatın ve yeni bir çalışma dosyası oluşturun.
   2. Katılımcının demografik bilgilerini ve önceden hesaplanan HARITA'yı girin.
      NOT: Yeterli olduğunda ayrıntılı yazılım çalışma talimatları ve temsil eden ekran görüntüleri ekleyerek ek materyal olarak bulunun.
4. Satın alma parametrelerini yapılandırma
   1. Alım örnekleme hızını 1 görüntü/s (1 Hz) olarak ayarlayın.
   2. Hedef edinme alanı için mekânsal çözünürlüğü yaklaşık 0.1 mm/piksel olarak ayarlayın.
      NOT: 1 Hz'lik örnekleme hızı, zamansal çözünürlük ile sinyal-gürültü oranı arasında uygun bir denge sağlarken, hiperemik ve farmakolojik yanıt kinetiklerini yeterince yakalar.
5. Ortam ışığı parazitini en aza indirin
   1. Görüntü alınmadan önce sistem gereksinimlerine göre arka plan gürültüsü kontrolü veya karanlık çerçeve çıkarma işlemi yapılabilir.
   2. Tüm kayıtlar sırasında oda ışıklarını kısın ve karanlık çerçeve çıkarma mümkün olmadığında karanlık perdelerle dış güneş ışığını engelleyin.
      NOT: Standart ortam aydınlatması optik paraziti en aza indirir ve sinyal tekrarlanabilirliğini artırır.
6. İlgi alanlarını (ROI'lar) tanımlayın
   1. Satın alma yazılımında canlı önizleme ekranında yaklaşık 80 mm² boyutlarında en az üç dairesel yatırım getirisi oluşturun.
   2. İyontoforez elektrot noktalarının üzerine iki ROI, PORH değerlendirme alanının üzerine ise bir ROI konumlandırın.
   3. Tüm ROI'ları antekubital fossa'nın yaklaşık 5 cm distalında ventral ön kola yerleştirin, görünür yüzeysel damarlardan kaçının.
      NOT: ROI alanının standartlaştırılması, deri perfüzyonunda mekânsal heterojenliğin etkisini en aza indirir ve ilaç dağıtım odalarıyla ilişkili kenar artefaktlarını azaltır.
7. Temel perfüzyon kaydını elde edin
   1. Damar uyarısından önce 5 dakika boyunca dinlenme deri kan perfüzyonu kaydedin.
   2. Gerçek zamanlı perfüzyon sinyalini izleyin ve temel alım sırasında hareketle tetiklenen spikelerin olmadığını doğrulayın.
   3. Temel stabilite, sürekli 2 dakikalık aralıkta %<10 perfüzyon sinyal varyasyonu olarak tanımlayın.
8. Deri damar iletkenliği (CVC) analizini etkinleştirin
   1. Katılımcının MAP'sini satın alma yazılımına girin.
   2. Yazılım ayarlarında CVC'nin otomatik hesaplanmasını etkinleştirin.
9. Perfüzyon ve iletkenlik verilerini kaydet
   1. Yazılımı, gerçek zamanlı perfüzyon değerlerini (APU) MAP'e bölerek CVC'yi otomatik olarak hesaplamak üzere yapılandırın.
   2. Hem ham perfüzyon birimleri (PU) hem de hesaplanan CVC değerlerini protokol boyunca aynı anda kaydedin.
      
      NOT: Mikrovasküler perfüzyonun CVC olarak ifade edilmesi, sistemik kan basıncı dalgalanmalarının karıştırıcı etkisini en aza indirir ve farklı hemodinamik profillere sahip katılımcılar arasında daha güvenilir karşılaştırmalar yapılmasını sağlar.

Şekil 1. Lazer lek kontrast görüntüleme (LSCI) ile iyotoforez kombinasyonu kullanılarak deri mikrovasküler perfüzyonun değerlendirilmesi için deneysel kurulum. (A) Lazer lek kontrast görüntüleme ve vazodilatör ajanların iyotoforezi kullanılarak deri mikrovasküler değerlendirmesi için kullanılan temsilli deneysel düzen. (B) Asetilkolinin (ACh) kümülatif dozlarının transdermal iyotoforetik ilimi sırasında temsil eden mikrovasküler perfüzyon yanıtı. (C) ACh iyotoforezinin temsil görüntüsü. (D) Araç içeren kontrol elektrodunun temsil görüntüsü. Etiketler aşağıdaki bileşenleri belirtir: (1) görüntüleyici başlığı; (2) iyotoforez ilaç iletim elektrotları; ve (3) dispersif elektrot. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. İyontoforez ve Farmakolojik Provokasyon

1. Deriyi iontoforeze hazırlayın
   1. Seçilen ventral ön kol deri bölgelerini alkolsüz salin solüsyolu veya hafif bir cilt temizleyici ile temizleyin.
   2. Elektrot yerleştirmeden önce cildi nazikçe kuru okşa.
      NOT: Cilt hazırlığı sırasında aşırı mekanik uyarımdan kaçının çünkü mekanik olarak indüklenen vazodilatasyon temel ölçümleri etkileyebilir.
2. İlaç dağıtım elektrotlarını konumlandırın
   1. İki ilaç dağıtım elektrodunu hazırlanan deri bölgelerine çift taraflı yapışkan diskler kullanarak takın (Şekil 1A).
   2. Elektrik akımı parazitini önlemek için elektrotlar arası mesafeyi yaklaşık 5 cm tutun.
3. ACh çözümünü hazırlayın
   1. İlk elektrot odasını %0,9 tuzlu^14,15 içinde hazırlanmış 200 μL %2 ACh çözeltisi ile doldurun.
   2. Endotel bağımlı vazodilatasyonu değerlendirmek için ACh elektrotunu kullanın.
      NOT: Seçilen ilaç konsantrasyonu, spesifik olmayan tahriş ve galvanik artefaktları en aza indirirken güçlü doz bağımlı mikrovasküler yanıt oluşturmak için optimize edilmiştir.
4. SNP çözümünü hazırla
   1. İkinci elektrot odasını %0,9 tuzlu sunda hazırlanmış 200 μL SNP çözeltisi ile doldurun.
   2. Endotelyumdan bağımsız vazodilatasyonu değerlendirmek için SNP elektrotunu kullanın.
      UYARI: SNP ışığa hassastır. Çözeltiyi ışığa karşı alüminyum folyo kullanarak koruyun ve farmakolojik stabiliteyi korumak için hazırlıktan 4 saat içinde çözeltiyi kullanın.
      NOT: Seçilen SNP konsantrasyonu, stabil plato vazodilatasyonunu kolaylaştırırken özgün olmayan elektriksel etkileri en aza indirir.
5. Hapsolmuş hava kabarcıklarını çıkarın
   1. Cilt tutumundan önce elektrot odalarında hapsolmuş hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin.
   2. Görünür hava kabarcıklarını elektrot odasına hafifçe dokunarak veya steril plastik bir şırınga ucu kullanarak çıkarabilirsiniz.
      NOT: Hava kabarcıkları akım akışını engelleyebilir ve homojen olmayan ilaç teslimatı üretebilir.
6. Referans elektrodu konumlandırın
   1. Referans (nötr) elektrotu, iletken jel veya yapıştırıcı kullanarak ilaç dağıtım elektrotlarına yaklaşık 15 cm yakında bağlayın (Şekil 1A).
   2. İyontoforez başlatmadan önce stabil elektrot teması doğrulan.
      NOT: Farmakolojik ve PORH değerlendirme bölgeleri arasındaki mekânsal ayrım, karıştırıcı etkileşimleri en aza indirir ve ACh kaynaklı akson refleks alevlenmesinin PORH ölçüm alanı ile örtüşmesini önler.
7. İyontoforez sistemini bağla
   1. Tüm elektrotları mevcut uygulamadan önce iyotoforez iletim ünitesine bağlayın.
   2. Protokole başlamadan önce elektrot polaritesini doğrulayın (ACh için anodal; SNP için katodal).
      DIKKAT: Yanlış elektrot polaritesi, ilaç teslimat verimliliğini bozabilir ve damar yanıtlarını değiştirebilir.
8. İyontoforez akım protokolünü uygulayın
   1. Her iki farmakolojik ajan için 30, 60, 90, 120, 150 ve 180 μA altı adet artımlı akım dozu verin.
   2. Her mevcut dozu 10 saniye uygula.
      NOT: Artan akım protokolü, doz-yanıt eğrisi oluşturulmasını sağlar ve mikrovasküler duyarlılık ile plato yanıtlarının değerlendirilmesini^{kolaylaştırır 11}. Düşük akım genlikleri ve kısa uyarılma aralıklarının birleşimi, özgül olmayan galvanik vazodilatasyonu en aza indirir.
9. Uyarımlar arasındaki aralığı koruyun
   1. Ardışık akım uygulamaları arasında 60 saniyelik bir aralık kalın.
   2. Dozlar arasındaki stabilizasyon döneminde perfüzyon sinyalini izleyin.
      NOT: Seçilen aralık, mikrovasküler yanıtın stabilizasyonunu sağlarken yerel ilaç teslimatını sistemik etkiler olmadan sürdürür.
10. Mikrovasküler yanıtı kaydedin
    1. Tüm iyotoforez uyarıları boyunca mikrovasküler perfüzyon sinyalini kesintisiz olarak kaydedin.
    2. Son uygulamadan sonra en az 10 dakika kayda devam ederek maksimum plato yanıtını yakalayın. Temsil eden doza bağlı bir yanıt Şekil 2A'da gösterilmiştir.

Şekil 2. İyontoforez ve post-oklüzyon reaktif hiperemi (PORH) sırasında deri mikrovasküler perfüzyonun temsilci kayıtları. (A) LSCI ile elde edilen %2 ACh iontoforezi sırasında elde edilen deri mikrovasküler kan akışının temsil kaydı; 30, 90, 120, 150 ve 180 μA artan anodal akımlar kullanılarak 10 saniyelik aralıklarla 10 saniye aralıklarla sağlanmıştır. (B) PORH değerlendirmesi sırasında temsil kayıt elde edilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Post-Occluzive Reaktif Hiperemi (PORH)

1. Tıkanma manşetini konumlandırın
   1. LSCI kaydı için kullanılan aynı uzuvun üst koluna standart bir pnömatik manşet (yaklaşık 12 cm genişlik) yerleştirin.
   2. Manşeti seçilen mikrovasküler değerlendirme alanına yakın konumlandırın.
2. PORH değerlendirme bölgesini tanımlayın
   1. İyotoforez elektrot bölgelerine bitişik ventral ön kolda üçüncü bir yatırım getirisi oluşturun.
   2. Farmakolojik müdahaleyi önlemek için yatırım getirisi uygulanabilir bir cilt bölgesine yerleştirilin.
      NOT: Farmakolojik uyarım noktaları ile PORH değerlendirme bölgesi arasında uzamsal ayrımı koruyarak bağımsız vasküler yanıtları korumak.
3. PORH temel kaydını edinin
   1. Arterial tıkanmadan önce 5 dakika boyunca dinlenme deri perfüzyonu kaydedin.
   2. Manşet şişirilmeden önce sinyal stabilitesini doğrulamak için temel perfüzyon sinyalini izleyin.
4. Arteriyal tıkanmayı indük edin
   1. Pnömatik manşeti otomatik şişirici veya manuel şişirme ampulünü < 5 saniye içinde hızla şişirin.
   2. Manşet basıncını, katılımcının daha önce ölçülmüş sistolik kan basıncının (SBP) 50 mmHg üstüne çıkarın.
      DIKKAT: Tıkanma dönemi başlamadan önce tam arteriyel tıkanıklığı doğrulayın çünkü eksik tıkanma hiperemik yanıtı bozabilir.
5. Tıkanma dönemini sürdürmek
   1. Arteriyal tıkanıklığı tam 3 dakika boyunca sürekli olarak koruyun.
   2. LSCI sinyalinin biyolojik sıfır platosuna (10 NOT: Biyolojik sıfır sinyali, kan hücrelerinin yönlendirilmiş kan akışından bağımsız kalıntı hareketini, Brownian hareketi de dahil olmak üzere, yansıtır.
6. Tıkanma manşetini serbest bırakın
   1. Manşet basıncını hızlı egzoz valfiyle anında bırakın.
   2. Kan akışının anında yeniden kurulmasına izin verin ve reaktif hiperemik yanıt başlatın.
7. Hiperemik tepkini kaydet
   1. LSCI kaydına manşet bıraktıktan sonra en az 5 dakika devam edin.
   2. Tepe perfüzyon tepkisini ve ardından temel perfüzyon seviyelerine dönüşü yakalayın. Temsil eden bir PORH yanıtı Şekil 2B'de gösterilmiştir.
8. PORH yanıtını nicelikleştirin
   1. Görüntü alma yazılımında zirve CVC'yi hesaplayın.
   2. Hiperemik yanıt sinyalinin eğrisinin altındaki alanı (AUC) analiz yazılımı kullanarak hesaplayın.

5. Veri Çıkarımı ve İstatistiksel Analiz

1. Kaydedilen verileri açın ve doğrulayın
   1. Kaydedilmiş edinim dosyalarını görüntü analiz yazılımıyla açın.
   2. Tüm önceden tanımlanmış yatırım getiricilerinin ilgili ölçüm alanları üzerinde doğru konumda kaldığını doğrulayın.
      NOT: Yatırım getirisi yalnızca hareket artefaktları veya alım sürüşmesi orijinal yerleşimi tehlikeye attığında yeniden konumlandırın.
2. Analiz aralıklarını tanımlayın
   1. Perfüzyon ve CVC trend grafiklerinde spesifik analiz aralıklarını belirleyin.
   2. İlk damar uyarıcısından hemen önce 60 saniyelik sürekli bir başlangıç aralığı seçin.
   3. İyontoforez uyarısından sonra her 60 saniyelik aralığın son 30 saniyesini seçerek plato mikrovasküler yanıtını yakalayabilirsiniz.
      NOT: Veri analizinden önce vazomotor salınımların ve hareket artefaktlarının etkisini en aza indirmek için perfüzyon sinyalinde %5 varyasyon katsayısı (
3. PORH yanıt değişkenlerini belirleyin
   1. PORH protokolünün arteriyel tıkanma aşamasında biyolojik sıfır sinyalini tespit edin.
   2. Manşet bırakıldıktan hemen sonra zirve CVC değerini belirleyin.
4. Aralık ortalama değerlerini hesaplayın
   1. Her önceden tanımlanmış analiz aralığı için görüntü analiz yazılımını kullanarak ortalama CVC değerini hesaplayın.
   2. Son hesaplanan değerleri doğrulamadan önce hareket artefaktlarının olmadığını doğrulayın.
5. Çıkarılan verileri organize edin
   1. Ortalama ham PU ve ortalama CVC değerlerini yapılandırılmış bir tabloya dışa aktarın veya manuel olarak transkribe edin.
   2. Veri setini, asetilkolin, sodyum nitroprussid ve PORH yanıtları dahil olmak üzere çalışma gruplarına ve damar uyaranlarına göre düzenleyin.
      NOT: Aktarım hatalarını en aza indirmek için veri işleme sürecinde tutarlı dosya isimlendirmeleri ve katılımcı kimlik kodları korun.
6. İkincil vasküler sonuçları hesaplayın
   1. Damar reaktivitesini belirlemek için başlangıç perfüzyon veya CVC değerlerinden elde edilen yüzde artışı hesaplayın.
   2. İkincil uç nokta analizi için gerektiğinde AUC'yi hesaplayın.
7. İstatistiksel analiz yapın
   1. Verileri istatistiksel analiz yazılımı kullanarak analiz edin.
      NOT: Yazılım tabanlı analizler için temsil ekran görüntüleri veya iş akışı talimatları varsa ek materyal olarak ekleyin.
   2. Veri dağılımını değerlendirin
      1. Shapiro-Wilk testi kullanarak veri normalliğini değerlendirin.
      2. Normal dağılımlı verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade eder.
      3. Normal dağılmamış verileri medyan ve çeyreklerarası aralık (IQR) olarak ifade et.
   3. Mikrovasküler yanıtları karşılaştırın
      1. Normallik varsayımları sağlandığında bağımsız bir t-testi kullanarak iki grup veri setlerini karşılaştırın.
      2. Birden fazla grubu tek yönlü ANOVA ile karşılaştırın, ardından Tukey'nin post-hoc testini izleyin.
   4. İstatistiksel anlamlılık kriterlerini tanımlayın
      1. İstatistiksel anlamlılığı p < 0.05 olarak tanımlayın.
      2. Hareket artefaktlarından kaynaklanan eksik verileri çiftli silme veya etkilenen analizden dışlama yoluyla ele alın.
         NOT: Analitik bütünlüğü korumak için tüm çalışma gruplarında aynı eksik veri stratejisini tutarlı şekilde uygulayın.

Results

Bu protokolün başarılı bir uygulaması, her damar uyarıcısına karşı net ve ayırt edilebilir mikrovasküler yanıtlar elde eder. Teknik olarak başarılı bir deneyde, temel kayıt, minimum dalgalanmalarla stabil bir perfüzyon sinyali gösterir; bu sinyal ortalama sinyalin %10'u < SD olarak tanımlanır. ACh ve SNP'nin iyotoforezi sırasında, doz bağımlı vazodilatasyonu yansıtan APU'da kademeli bir artış beklenir. Başarılı bir PORH yanıtı, arterial tıkanma sırasında perfüzyonun hızlı bir şekilde stabil biyolojik sıfıra düşmesiyle karakterize edilir; ardından manşet bırakıldıktan hemen sonra keskin bir hiperemik zirve yaşanır ve genellikle sağlıklı deneklerde temel seviyelerin birkaç kat üzerinde değerler yükselir. Şekil 1A, LSCI ve iyotoforez kullanılarak deri mikrovasküler değerlendirme için kullanılan deneysel düzeni göstermektedir. Şekil 1B–1D , temsilli iyontoforez yanıtlarını ve elektrot konumunu göstermektedir. Şekil 2A , ACh iyontoforezi sırasında temsil eden doza bağlı mikrovasküler yanıt sunarken, Şekil 2B temsili bir PORH yanıtı gösterir.

Optimal olmayan veya teknik olarak başarısız kayıtlar genellikle sinyal kararsızlığı veya hareketle ilgili artefaktlarla karakterize edilir. Yüksek frekanslı sıçramalar veya ani başlangıç dalgalanmaları genellikle katılımcı hareketini veya vakum yastığı destek sisteminin yeterli stabilizasyonunu göstermektedir. Sağlıklı bir katılımcıda iyotoforez sırasında azalmış veya yok olan vazodilatör yanıt, genellikle elektrot-cilt temasının ya da elektrot odasında hapsolmuş hava kabarcıklarının olduğunu gösterir; bu da elektrik akımının ilagının bozulmasına neden olur. Şekil 3 , hareketle ilgili sinyal kararsızlığıyla karakterize edilen kabul edilemez bir kaydın temsilci bir örneğini sunar.

Şekil 3. İyontoforez sırasında kabul edilemez bir mikrovasküler perfüzyon kaydının temsilci örneği. ACh iyotoforezi sırasında LSCI kullanılarak elde edilen deri mikrovasküler kan akışının temsil kaydı, sinyal kararsızlığı ve hareketle ilgili artefaktları göstererek nicel analiz için uygun değil. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

PORH oklüzyon aşamasında stabil biyolojik sıfır elde edememek, genellikle yanlış manşet pozisyonu veya yetersiz manşet şişirme basıncından kaynaklanan eksik arterial tıkanmayı gösterir. Bu koşullar altında, sonraki hiperemik yanıt zayıflamış ve güvenilir yorum için uygun hale gelmezdir.

Başarıyla yürütülen protokoller, tekrarlanabilir perfüzyon ve CVC eğrileri oluşturur. SNP iyotoforezi sırasında gözlemlenen maksimum CVC platosu, toplam vazodilatör kapasite ve damar yapısal bütünlüğünü yansıtırken, ACh aracılı yanıt öncelikle endotel bağımlı mikrovasküler fonksiyonu yansıtır. Bu vasküler yanıtların standartlaştırılmış karşılaştırması, korunmuş ve bozulmuş mikrovasküler fonksiyonla uyumlu desenler arasında ayırt edilmesini sağlar. Sağlıklı genç bireylerden ve dirençli arterial hipertansiyona sahip hastalardan elde edilen temsili nicel mikrovasküler parametreler Tablo 1'de sunulmaktadır.

Mikrovasküler Parametre	Birim	Sağlıklı Genç Kontroller (n = 25)	Dirençli Arterial Hipertansiyonu Olan Hastalar (n = 50)	p-değeri
Temel CVC	APU/mmHg	0.37 ± 0.13	0.29 ± 0.12	0.01
ACh kaynaklı Zirve CVC	APU/mmHg	0.67 ± 0.23	0.51 ± 0.19	0.004
SNP'nin neden olduğu Zirve CVC	APU/mmHg	0.60 ± 0.21	0.41 ± 0.17	0.0003
PORH Zirvesi CVC	APU/mmHg	0.87 ± 0.18	0.60 ± 0.16	< 0.0001

Tablo 1: Sağlıklı genç bireylerde ve dirençli arteriyal hipertansiyona sahip hastalarda temsil mikrovasküler reaktivite parametreleri. Değerler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edilir. p-değerleri, gruplar arasındaki karşılaştırmalar için bağımsız bir t-testi kullanılarak hesaplandı. Kısaltmalar: ACh, asetilkolin; SNP, sodyum nitroprussid; PORH, post-oklüzyon reaktif hiperemi; CVC, deri damar iletkenliği; APU, keyfi perfüzyon üniteleri. Veriler, yazarların laboratuvarından alınan yayımlanmamış sonuçları temsil eder.

Discussion

LSCI, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlükle sistemik mikrovasküler fonksiyonun değerlendirilmesi için standartlaştırılmış ve invaziv olmayan bir yaklaşım sunar. LDF ile karşılaştırıldığında, LDF tek noktalı ölçümlerle sınırlıdır ve cilt perfüzyonun mekansal heterojenliğine karşı son derece duyarlıdır, LSCI tam alan görüntüleme ve birden fazla yatırım getirisi düzeyinin eşzamanlı değerlendirilmesini sağlar. Bu özellik, klinik mikrovasküler çalışmalarda ölçüm tekrarlanabilirliğini önemli ölçüde artırır ve varyasyon katsayısını azaltır. Ayrıca, LSCI'nin temassız yapısı, prob tabanlı tekniklerle sıkça ilişkilendirilen yerel basınç artefaktlarını en aza indirir ve translasyonel ve klinik araştırma ortamlarında tekrar yapılan değerlendirmeler için uygunluğunu artırır.

Bu protokolün kritik bir bileşeni, CVC'nin hesaplanması için perfüzyon verilerinin MAP'a normalleştirilmesidir. Deri kan perfüzyonu sistemik perfüzyon basıncından güçlü şekilde etkilendiği için, ham APU'nun yorumlanması özellikle hipertansiyon veya dislipidemi gibi hemodinamik profilleri değişmiş popülasyonlarda önemli bir kafa karıştırmaya yol açabilir. Bu nedenle, protokol mikrovasküler fonksiyonun farklı fizyolojik ve patolojik koşullarda yorumlanmasını iyileştirmek için hem ham PU hem de normalize CVC değerlerinin raporlanmasını önermektedir. Protokolün bir diğer kritik yönü ise oda sıcaklığı kontrolü, hareket artefaktlarının en aza inşatı ve standart katılımcı konumlandırması gibi sıkı çevresel ve katılımcı stabilizasyonudur; bunların hepsi tekrarlanabilir kayıtlar elde etmek için gereklidir.

LSCI'nin birkaç sınırlaması da göz önünde bulundurulmalıdır. Teknik, öncelikle yaklaşık 0,5–1 mm derinlikte yüzeysel deri mikrosirkülasyonunu değerlendirir ve bu nedenle daha derin damar yataklarını tam olarak temsil etmeyebilir. Ayrıca, cilt pigmentasyonu ve ortam ışığı paraziti, sinyal-gürültü oranını etkileyebilir ve bu protokolde tanımlanan çevresel kontrollerin önemini pekiştirir. Bir diğer sınırlama ise, prosedür boyunca CVC hesaplaması için tek bir temel MAP ölçümü kullanılmasıdır. Yaklaşık 40 dakikalık kayıt süresi boyunca sistemik kan basıncı dalgalanabiliyor olsa da, tekrarlayan kan basıncı ölçümleri sempatik aktivasyon ve hareket artefaktlarını tetikleyerek lazer lekesi sinyalini engelleyebileceği için tekrarlayan manşet şişirmeleri kasıtlı olarak önlenmiştir. Sürekli invaziv olmayan hemodinamik izlemeyi entegre eden gelecekteki çalışmalar, mikrovasküler iletkenlik ölçümlerinin fizyolojik yorumunu daha da geliştirebilir.

Kritik protokol adımları arasında çevresel stabilizasyon, hareket kontrolü, elektrot konumlandırması ve PORH sırasında tam arterial tıkanma yer alır. Kararsız başlangıç kayıtları genellikle katılımcı hareketi veya yetersiz dinlenme dönemlerinden kaynaklanır ve vakum yastık sisteminin yeniden stabilize edilip aklimatizasyon süresinin uzatılmasıyla en aza indirilebilir. Küt iyotoforetik tepkiler genellikle elektrot-deri temasının ya da doğum odasında hapsolmuş hava kabarcıklarının zayıf olduğunu gösterir; Dikkatli oda doldurma ve elektrot yeniden konumlandırma genellikle bu sorunları çözür. PORH tıkanma aşamasında biyolojik sıfıra ulaşılamama genellikle yetersiz manşet şişirmesi veya yanlış manşet konumlandırmasından kaynaklanan eksik arterial tıkanıklığı gösterir. Bu koşullar altında, ortaya çıkan hiperemik yanıt zayıflamış ve güvenilir yorum için uygun hale gelmezdir.

Fizyolojik ve farmakolojik provokasyonların entegrasyonu, bu protokolün önemli bir gücünü temsil eder çünkü bu yaklaşımlar mikrovasküler düzenlemenin tamamlayıcı yönlerini değerlendirir. PORH, geçici iskemi ve kesme stresi tarafından tetiklenen endotelyal, nörojenik ve vasküler düz kas mekanizmalarını içeren mikrovasküler reaktivitenin entegre fizyolojik değerlendirmesini^{sağlar 16}. Buna karşılık, iyotoforez endotelial bağımlı ve endotelyal bağımsız vazodilatör yolların seçici değerlendirilmesini^{sağlar 15}. ACh, endotel bağımlı nitrik oksit aracılı vazodilatasyonu değerlendirirken, SNP (doğrudan nitrik oksit donörü) endotel sinyalinden bağımsız olarak vasküler düz kas tepkisini^{değerlendirir 15}. Bu yanıtların karşılaştırmalı yorumu, fonksiyonel endotel bozulması ile yapısal mikrovasküler yeniden yapılandırma arasında ayrım yapılmasına olanak tanır. Bu ayrım, özellikle yaşlanma, dirençli hipertansiyon, diyabet ve kronik metabolik hastalıklarda önemlidir; burada bozulmuş endotel sinyal ile mikrovasküler seyrekleşme birlikte var^{olabilir 14,17}.

Özetle, bu standartlaştırılmış LSCI protokolü, insan mikrovasküler sağlığının invaziv olmayan değerlendirilmesi için tekrarlanabilir ve çeviri açısından ilgili bir yöntem sunar. Farmakolojik iyontoforezin fizyolojik iskemi-reperfüzyon testleriyle birleşimi, endotel ve yapısal damar fonksiyonlarının ayrıntılı karakterizasyonunu sağlarken, titiz çevresel ve hemodinamik standartlaştırma yoluyla deneysel değişkenliği en aza indirir. Çeşitli kardiyovasküler ve metabolik bozukluklarda erken mikrovasküler disfonksiyonu tespit etme hassasiyeti nedeniyle, bu yaklaşım translasyonel damar tıbbında klinik araştırma, uzunlamasına izleme ve terapötik değerlendirme için değerli bir araçtır.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ekipman
Otomatik Osilometrik Basınç Monitörü	Omron Healthcare	HEM-7120	Başlangıç ortalama arteriyal basınç (MAP) değerlendirmesi için kullanılmıştır (3 ölçüm)
Dijital kalibrasyonlu termometre	Delta OHM	HD2301.0	Doğruluk ve artım; 0.1&derece; Oda sıcaklığı izleme için C
Dağıtıcı (Referans) Elektrot	Permedik AB	PF 384	Büyük yüzey alanlı nötr elektrot
İlaç Dağıtım Elektrotları	Permedik AB	PF 383 / LI 611	İnvaziv olmayan iyotoforez odaları (yaklaşık 80 mm²)
İyontoforez Güç Kontrolörü	Permedik AB	PeriIont Mikrovasküler Tanı Sistemi	Çift kanallı akım kontrolörü (200 ve mikro; A)
Lazer Benek Kontrast Görüntüleme (LSCI) Sistemi	Permedik AB	PeriCam PSI NR	Yüksek çözünürlüklü kan perfüzyon görüntüleyicisi
Tıbbi Sınıf Vakum Yastığı	AB Germa	Yok	Kalp seviyesinde stabil ön kol pozisyonu için kullanılır
Tek Elle Çalışan Vakum Pompası	AB Germa	Yok	Vakum yastıklarının tahliyesi için kullanılır
Hızlı Manşet Şişirici	D.E. Hokanson, Inc.	E20 Hızlı Manşet Şişirici	Standart 3 dakikalık arterial tıkanma için kullanılır
reaktifler ve tüketim maddeleri
Asetilkolin klorür (ACh)	Sigma-Aldrich	A6625	%2 ile hazırlanmış endotel bağımlı vazodilatör
Alkol Hazırlık Pedleri	Becton Dickinson	326895	Cilt hazırlığı için %70 izopropil alkol pedleri
Deionize Su	Sigma-Aldrich	38796	Elektrotların son durulanması için kullanılır
Sodyum klorür (%0,9 salin)	Yerel Tedarikçi	Yok	İlaç hazırlığı ve cilt temizliği için çözücü
Sodyum Nitroprussid (SNP)	Sigma-Aldrich	S0501	%2 ile hazırlanmış endotelyumdan bağımsız vazodilatör
Steril gazlı bez	Yerel Tedarikçi	Yok	Temizlikten sonra cilt yüzeyini kurutmak için kullanılır
Software
Perfüzyon Analiz Yazılımı	Permedik AB	PIMSoft	LSCI veri edinimi ve ROI analizi için yazılım
İstatistiksel Analiz Yazılımı	GraphPad Yazılımı	Prizma 10	Doz-yanıt eğrisi uyumu ve eğri altındaki alan (AUC) hesaplaması için kullanılır