Bu protokol, termal yaralanma kaynaklı fibrotik yeniden yapılandırma ve terapötik müdahaleleri incelemek için mesane boynu fibrozunun tekrarlanabilir bir fare modeli oluşturmak amacıyla transvezikal Ho:YAG lazer ablasyonunu göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Holmium:YAG Bir Fare modelinde mesane boyun kontraktürünin lazer destekli indüksiyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Mesane boyun kontraktürü (BNC), mesane çıkışında fibrotik daralma ve prostatın transüretral rezeksiyonundan (TURP) sonra zor bir komplikasyondur. Mevcut hayvan modelleri genellikle ekstravezikal ligasyon veya kimyasal koterizasyona dayanır; bu da endoskopik cerrahi sonrası gelişen termal yaralanma kaynaklı fibrozisi yeterince çoğaltmaz ve sınırlı tekrarlanabilirlik gösterebilir. Burada, mesane boynun transvezikal Holmium:YAG lazer (Ho:YAG lazer) ablasyonu ile indüklenen mesane boynu fibrozisinin fare modelini anlatıyoruz. Küçük bir alt orta hat laparotomisi ve sistotomi işleminden sonra, doğrudan görselleştirme altında 200 μm Ho:YAG lazer lifi mesane lümenine yerleştirilir. Lazer enerjisi, mesane boynunun 3 ve 9 saat pozisyonlarında nokta başına 5 saniye boyunca 1.0 J ve 10 Hz kontakt modunda iletilir; bu da her nokta başına 50 J ve hayvan başına 100 J denktir. Dört hafta sonra, tedavi edilen hayvanlarda büyük mesane büyümesi, mesane boynu daralması, mesane duvarı kalınlaşması ve fibrotik yeniden şekillendirmenin histolojik kanıtları gelişir; bunlar arasında artan kolajen birikimi ve artan kolajen tip I ve III i. ile III ifadesi bulunur. Bu protokol, mesane çıkışında yerel termal yaralanma kaynaklı skarlığı taklit eden pratik bir model sunar. Kadın fareler kullanıldığı ve mevcut çalışmada fonksiyonel ürodinamik testler yapılmadığı için, model mesane boyun fibrozisi ve yapısal yeniden yapılandırma çalışmaları için en uygun, prostat sonrası erkek BNC tam üreme yerine kullanılıyor. Model, BNC'nin fibrotik mekanizmalarını incelemek ve anti-fibrotik veya rekonstruktif müdahalelerin preklinik değerlendirmesinde faydalı olabilir.
Giriş
Mesane boyun kontraktürü (BNC), özellikle TURP 1,2,3 olmak üzere transüretral işlemlerden sonra sıkça meydana gelen mesane boynundaki fibrotik daralmadır. Patolojik temeli, doku yaralanması sonrası aşırı yara oluşumu ve kolajen birikimi ile anormal yara iyileşmesidir 4,5,6. BNC kalıcı boşalma işlev bozukluğuna, tekrarlayan müdahalelere ve önemli hastalıklara yol açabildiğinden, patogenezi ve tedavisini incelemek için tekrarlanabilir deneysel bir modeleihtiyaç vardır 7.
Mesane çıkış tıkanıklığı veya peri-üretral fibrozu incelemek için çeşitli hayvan modelleri kullanılmıştır; bunlar arasında proksimalüretra 8'in ekstravezikal ligasyonu ve diğer açık cerrahi yaklaşımlarda bulunmaktadır. Bu modeller idrar tıkanıklığı ve detruzor hipertrofisini tetikleyebilse de, endoskopik cerrahi sonrası BNC'yi başlattığı düşünülen lokal termal hasarı özel olarak yeniden üretmezler. Ayrıca, anatomik hedef ve yaralanma derecesi genellikle standartlaştırmak zordur ve bu da hayvanlar arası değişkenliği artırabilir.
İdeal bir BNC ile ilgili model, üç kritere uymalıdır: anatomik mesane boynunu hedeflemeli, endoskopik enerji cihazlarının yarattığına benzer kontrollü termal hasarı yeniden üretmeli ve kabul edilebilir cerrahi karmaşıklıkla güvenilir şekilde fibrotik daralma üretmelidir. Bu ihtiyaçları karşılamak için, dişi farelerde transvezikal Ho:YAG lazer tabanlı bir protokol geliştirdik. Dişi hayvanlar, cerrahi maruziyeti kolaylaştırmak ve mesane boyununa özgü termal yaralanma ile prostat dokusundan parazit olmadan fibrotik yeniden yapılanmayı izole etmek için seçildi. Doğrudan intravezial görselleştirme kullanılarak, bu yöntem lazer enerjisinin mesane boyun mukozası ve submukozaya doğru şekilde iletmesini sağlar ve mesane çıkışında tekrarlanabilir fibrotik daralma sağlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri, Pekin Geleneksel Çin Tıbbı Enstitüsü Deneysel Hayvan Refahı Etik Komitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirildi (Onay No. BJTCM-R-2025-03-02). Hayvanlar standart koşullar altında besleniyordu ve yiyecek ile suya imkansız erişim sağlanıyordu. Mevcut protokolde, ameliyatsız kontrol grubunda 8 fare ve Ho:YAG lazerle tedavi edilen grupta 8 fare dahil olmak üzere toplam 16 fare kullanıldı. Ho:YAG lazerle tedavi edilen gruptaki iki hayvan ameliyattan sonra hayatını kaybetti. Delme, şiddetli kanama veya başarısız model indüksiyonu nedeniyle ek hayvanlar hariç tutulmadı.
1. Ameliyat öncesi hazırlık
- Perioperatif analjezi için ilaç kalitesinde meloksikam hazırlamak (Şekil 1A), küçük hayvan shalasyon anestezi sistemi (Şekil 1B), 200 μm lazer lifli Ho:YAG lazer sistemi (Şekil 1C), steril mikrocerrahi aletler (Şekil 1D), 8-0 sistotomi kapanması için emilebilir örgülü dikişler (kaplı poliglikolik asit, PGA), cilt kapanması için 4-0 örgülü poliglaktin 910 dikişleri, steril tuzlu süm, steril perdeler, steril pamuk çubukları ve steril kayganlaştırıcı (Şekil 1E).
- Bir indüksiyon odasında oksijende %3–%4 isofluran ile anestezi başlatın ve ameliyat sırasında burun konisinden %1,5–%2,5 isofluran ile anestezi sürdürülür.
- Konsantrasyonu solunum hızına ve onaylanmış kurumsal hayvan protokolüne göre ayarlayın. Kesiden önce parmak sıkıştırma refleksinin olmaması nedeniyle yeterli anestezi derinliğini doğrulayın ve işlem boyunca anestezik derinliğini yeniden değerlendirin.
- Tüyleri alt karın bölgesinden geniş bir şekilde kesin, böylece perde kalan tüyleri kapatır ve aletlerle kesilmemiş saç arasında temas engeller.
- Cerrahi alanı dönüşümlü povidon-iyot ve %70 izopropil alkol peelinglerle dezenfekte edin; her çözeltiyi üç kez uygulayarak kaplamadan önce uygulayın.
- Hayvanı 37 °C sıcaklığa ayarlanmış bir ısıtma pedine sırtüstü pozisyona yerleştirin ve işlem boyunca steril koşulları koruyun.
- Mesane dolgusu veya mesane boynunun ameliyat sırasında tanımlanması gerekiyorsa, küçük steril üretral kateter veya kanülü steril kayganlaştırıcı ile yağlayın, üretral kateter aracılığıyla mesaneye nazikçe sokun ve yavaş yavaş steril salin verin. Zorla yerleştirmekten veya aşırı doldurmaktan kaçının. Kateteri planlanan cerrahi maruziyete göre çıkarın veya sabitleyin.
2. Mesaneye maruz kalması
- Steril koşullarda 3–4 cm alt orta hatta bir cilt kesisi yapın (Şekil 2A).
- İnce uçlu forseps ve mikromakas kullanarak, deri altı doku bölünür ve linea alba açılarak peritoneal boşluğa girer.
- İdrar mesanesini travmatik penseps ile nazikçe dışa çıkarın (Şekil 2B).
- Mesane boynunu mesane tabanı ile proksimal üretra arasındaki birleşim noktası olarak tanımlayın.
- Mesane boynunun altına yumuşak bir prob yerleştirerek nazik destek sağlayın ve hedef alanı stabilize edin (Şekil 2C).
3. Transvezikal Ho:YAG lazer ablasyonu
- Mesanesi, mesane duvarı orta derecede gergin hale gelene kadar steril salin ile ayırın. Aşırı dartılışlardan kaçının; bu durum anatomik işaretleri gizleyebilir veya sistotomi bölgesinde gerilimi artırabilir.
- Ön mesane kubbesinde ince mikromakas kullanarak 0,5 cm boyuna bir sistotomi oluşturun (Şekil 2D).
- Hazırlanan 200 μm Ho:YAG lazer lifini sistotomi üzerinden mesane lümenine yerleştirin.
- Lifi doğrudan görselleştirme altında mesane boynuna doğru ilerlet.
- Lif ucunu mesane boyun mukozasıyla doğrudan temas halinde nazikçe yerleştirin. Dokunun belirgin bir girintisi olmadan temas modunu koruyun; Enerji teslimatı boyunca uç-doku mesafesinin yaklaşık 0 mm olduğundan emin olun.
- Lazer enerjisini 1.0 J ve 10 Hz'de 5 saniye boyunca 9 saat pozisyonunda iletin (Şekil 3A) ve 3 saat pozisyonunda tekrarlayın (Şekil 3B). Bu ayar, hayvanlar arasında güç 10 W olarak sabit olarak sabit olan her bir hayvan başına 50 J ve hayvan başına 100 J sağlar.
NOT: Başarılı bir ablasyon, karbonlaşma olmadan uniform mukozal beyazlanma ve sığ mukozal bir kraterin oluşmasıyla belirtilir. - 5 saniyelik uygulama sırasında lifi sabit tutun ve lifi duvara itmekten kaçının. Derin krater oluşumundan veya tam kalınlıkta deliklerden kaçının. Lifi üreter deliklerine veya distal üretraya yönlendirmeyin.
- Lifi çıkarın ve mesane lümenini steril salinle sulayarak kalıntıları temizleyin ve hemostazı doğrulayın.
- Sistotomini 2–3 kesinti 8-0 ile kapatın emilebilir örgülü dikişler (kaplamalı PGA) su geçirmez şekilde.
- Kapatma hattından sızıntı olmadığını doğrulamak için mesaneyi 0,5–1,0 mL steril salin ile doldurun (Şekil 3C).
- Karın duvarını ve deriyi katmanlar halinde kapatın (Şekil 3D).
4. Ameliyat sonrası bakım
- Fareyi anesteziden tamamen iyileşene kadar ısıtma pedinde tutun.
- Postoperatif analjezi için 1 mg/kg deri altına meloksikam uygulanır ve onaylı hayvan protokolüne göre günde bir kez 1–3 gün boyunca devam eder.
- Hayvanı ağrı, sıkıntı, hematöriye, idrar tutma, yara açılması veya enfeksiyon belirtileri açısından en az 7 gün boyunca takip edin.
- Erken iyileşme döneminde ihtiyaç duyulduğunda su takviyesi ve yumuşatılmış yiyecekler sağlayın.
5. Mesan boyun kontraktürü değerlendirilmesi
- Ameliyattan sonra hayvanların iyileşmesine 4 hafta izin verin, böylece mesane boyunda fibrotik yeniden yapılanma mümkün olsun.
- Deneysel son noktada, hayvanları sodyum pentobarbital aşırı doz (150 mg/kg, intraperitoneal) veya kurumsal hayvan protokolü tarafından onaylanan başka bir yöntemle ötenazi yapın ve doku hasadı öncesinde ölüm doğrulansın. Mesanesi, mesane boynu ve proksimal üretrayı en block alın.
- Örneği boylamasına açın ve mesane boynunu fotoğraflayarak kaba daralmayı belgeleyin.
- Dokuyu %4 paraformaldehit ile 4 °C'de 24 saat sabitleyin, derecelendirilmiş etanolle kurutun, ksilen içinde berrak olsun, parafine gömülüp mesane boyun bölgesinden seri 4 μm kesitler alın.
- Hematosilin ve eozin, Masson trikromu ve picrosirius kırmızısı ile boyanma kesitleri standart histolojik protokollere veya üreticinin lümen daralması, mesane boyun duvarı kalınlaşması ve kollajen birikimini değerlendirme talimatlarına göre boyanmaktadır.
- İmmünohistokimya için, kesitleri deparaffinize edin, antijen alımı yapın, endogen peroksidaz ve spesifik olmayan bağlanmayı bloklayın, bölümleri kolajen tip I ve kollajen tip III'e karşı antikorlarla inkübe edin, uygun ikincil antikoru uygular, kromojenle geliştirin ve hematoksilin ile karşı boyama yapın.
NOT: Antikorlar üreticinin önerilerine göre seyreltilmiştir. - Lümen alanı ve kollajen pozitif alanı ImageJ/Fiji veya eşdeğer görüntü analiz yazılımı kullanarak niceliklerini ölçemek.
- Mikroskop ölçeği çubuğu kullanarak pikselden mikrometreye ölçeği kalibre edin, mesane boyun lümenini ve ilgi duyulan doku bölgesini manuel olarak ayırın ve lümen alanını ölçün.
- Masson'ın trikrom boyaması için, ilgi alanındaki mavi kollajen pozitif pikselleri belirlemek için tutarlı bir renk eşiği uygulanır.
- Kolajen pozitif alan fraksiyonunu toplam doku alanına bölünmüş kollajen pozitif alan olarak hesaplayın.
- Her hayvanın karşılaştırılabilir kesitleri ve tarlalarında ölçümler yapın ve görüntüleri kör bir şekilde analiz edin.
NOT: Başarılı model indüksiyonu, kaba mesane çıkışının daralması ile birlikte konsantrik fibrozis ve lezyon bölgesinde artan kolajen birikimiyle desteklenir. Ho:YAG lazerle tedavi edilen grubunda operasyonel başarı oranı, beklenen brüt ve histolojik fenotipin geliştirilmesine dayanarak 6/8 idi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Ameliyattan dört hafta sonra, Ho:YAG lazeri ile tedavi edilen farelerde mesane boyun fibrotik daralmasıyla uyumlu tekrarlanabilir kaba ve histolojik değişiklikler gösterildi. Bu çalışmada, ameliyatsız kontrol grubunda 8 fare varken, Ho:YAG lazerle tedavi edilen grupta 8 fare yer aldı. 6/8 tedavi edilen hayvan beklenen fenotipi geliştirdi; kaybı, Ho:YAG lazerle tedavi edilen grupta ameliyat sonrası 2 ölümden oluşuyordu ve ek bir dışlama olmadı. Genel olarak, kontrol mesaneleri normal boyu...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada, transvezikal Ho:YAG lazer ablasyonu kullanarak mesane boyun fibrotik daralmasının bir fare modelini oluşturduk. Bu yöntemin temel gücü, anatomik mesane boyunda kontrollü termal hasar ve ardından ilerleyici fibrotik yeniden şekillendirme yapmasıdır. Bu, geleneksel ekstravezikal ligasyon modellerinden farklıdır; çünkü bu modeller genellikle dış sıkıştırma yoluyla tıkanıklık oluşturur, içsel skar oluşumuyerine 10. Klinik uygulamada ameliyat sonrası BNC,...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (H.R. için 82474255 numara) ve Hebei Eyalet İdaresi TCM Araştırma Programı'ndan (İnsan Kaynakları için B2025018) hibelerle desteklendi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Absorbable braided suture (coated PGA), 8-0 | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd., Shanghai, Çin | R831 | |
| Anti-collagen I antikoru, fare monoklonal | Proteintech Group, Inc., Wuhan, Çin | 66761-1-Ig | |
| Anti-collagen III antikoru, fare monoklonal | Proteintech Group, Inc., Wuhan, Çin | 68320-1-Ig | |
| Kaplanmış Vicryl Plus dikiş (poliglaktin 910), 4-0 | Ethicon, Inc. (Johnson & Johnson) | VCP773D | SH 26 mm ½-dairesel konik iğne; menekşe örgülü; emilebilir; Lot: RLMCJX |
| Hematoksilin ve eozin (HE) boyama kiti | Servicebio, Wuhan, Çin | 2310005 | |
| Holmiyum-YAG Lazer Sistemi (LITHO) | Quanta System S.p.A, İtalya | https://www.quantasystem.com/laser/litho/ | 1 J, 10 Hz, 10 W, 200 μm fiber |
| HRP-konjuge keçi anti-fare IgG ikincil antikoru | Boster, Wuhan, Çin | BA1050 | |
| Izofluran | RWD | 2025010601 | |
| Masson'un trikrom boyama kiti | Zhuhai Baso Biotechnology Co., Ltd., Zhuhai, Guangdong, Çin | BA4079B | |
| Meloksikam Enjeksiyonu | Qilu Animal Health, Shandong, Çin | E135H003 | |
| Paraformaldehit (%4) | Servicebio, Wuhan, Çin | 2510H0070148 | |
| Picrosirius kırmızı boyama kiti | Nanjing Senbeijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, Jiangsu, Çin | 20250228 | |
| Güvenli intravenöz kateter, 24 G | Guangdong Lily Medical Technology Co., Ltd., Foshan, Guangdong, Çin | AD4-240827 | |
| Küçük hayvanlar için inhalasyon anestezisi sistemi | RWD Life Science, Shenzhen, Çin | https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/ | Oksijende 3%-4% izofluran ile indüksiyon |
Kaynaklar
- Wu Y, et al. Analysis of risk factors for bladder neck contracture after transurethral endoscopic surgery for benign prostatic hyperplasia. Aging Male. 2024;27(1):2429456.
- Rassweiler J, et al. Complications of transurethral resection of the prostate (TURP)--incidence, management, and prevention. Eur Urol. 2006;50(5):969-79; discussion 980.
- Simhan J, et al. Bladder neck contracture. Transl Androl Urol. 2014;3(2):214-20.
- Browne BM, Vanni AJ. Management of urethral stricture and bladder neck contracture following primary and salvage treatment of prostate cancer. Curr Urol Rep. 2017;18(10):76.
- Pakshir P, Hinz B. The big five in fibrosis: macrophages, myofibroblasts, matrix, mechanics, and miscommunication. Matrix Biol. 2018;68-69:81-93.
- Li L, Zhao Q, Kong W. Extracellular matrix remodeling and cardiac fibrosis. Matrix Biol. 2018;68-69:490-506.
- Ren Y, et al. Bladder neck contracture: incidence, mechanisms, and therapeutic advances. Ann Med Surg (Lond). 2025;87(11):7378-7389.
- Mattiasson A, Uvelius B. Changes in contractile properties in hypertrophic rat urinary bladder. J Urol. 1982;128(6):1340-2.
- Igawa Y, et al. A rat model for investigation of spinal mechanisms in detrusor instability associated with infravesical outflow obstruction. Urol Res. 1993;21(4):239-44.
- Varkarakis IM, et al. Comparison of erbium:yttrium-aluminum-garnet and holmium:yttrium-aluminum-garnet lasers for incision of urethra and bladder neck in an in vivo porcine model. Urology. 2005;65(1):191-5.
- Hu X, et al. Clinical comparison of TURP, PVP and HoLEP for small volume BPH. Sci Rep. 2025;15(1):34751.
- Kang D, et al. Morphological characterization of tissue destruction according to the distance between holmium:YAG laser tip and tissue surface. Int Neurourol J. 2024;28(3):196-206.
- Zhang SL, Wong AW. A novel technique for atraumatic transurethral catheterisation of male rats. Biol Open. 2024;13(9).
- Kendall RT, Feghali-Bostwick CA. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Front Pharmacol. 2014;5:123.
- Kitta T, et al. Benefits and limitations of animal models in partial bladder outlet obstruction for translational research. Int J Urol. 2018;25(1):36-44.
- Wang Y, et al. Urethral orifice hyaluronic acid injections: a novel animal model of bladder outlet obstruction. BMC Urol. 2015;15:8.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
