Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Arterialize Olmayan Fare Karaciğer Nakli Modelinde Uzun Süreli Hayatta Kalma Deneyimi Paylaşılması

113 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/71650

⸱

22 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Organ Transplantation Center, the Affiliated Hospital of Qingdao University, 2Institute of Organ Donation and Transplantation, Medical College of Qingdao University, 3Organ Transplant Center, Fujian Medical University Union Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu sunulan protokolün amacı, arterializasyonsuz bir fare karaciğer nakli modeli oluşturmak için optimize edilmiş cerrahi deneyimi paylaşmaktır; özellikle 100 günden sonra uzun vadeli hayvan hayatta kalmasını sağlayan teknik iyileştirmelere odaklanmaktadır.

Özet

Deneysel karaciğer naklinde, fare modeli nakil immünolojisi ve metabolik süreçlerin araştırılmasında altın standarttır; Ancak, son derece ince karaciğer arterinin (~0,5 mm) yeniden inşası büyük bir teknik zorluk teşkil eder. Bunu aşmak için, basitleştirilmiş arterializasyonsuz fare karaciğer nakli (NArLT) modeli yaygın olarak kullanılmaktadır. Ne yazık ki, arteriyel yoksunluktan kaynaklanan safra kaçağı ve iskemik kolanjit gibi ciddi safra komplikasyonları, alıcıların uzun vadeli hayatta kalmalarını sıklıkla kısıtlamaktadır. Bu engel, uzun vadeli konak-greft immünuyumluluğu ve kronik reddetme gibi önemli konularda araştırmaları önemli ölçüde sınırlar. Burada, bu iskemik safra yaralanmalarını başarıyla aşmak için kritik teknik iyileştirmeleri içeren NArLT modeli için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Önemli iyileştirmeler arasında önemli ölçüde kısaltılmış bir anhepatik faz, "dokunmasız" safra diseksiyon tekniği, kapsamlı safra yolu yıkaması ve optimize edilmiş iç safra stentleme yöntemi yer almaktadır. Bu geliştirilmiş prosedür uygulandıktan sonra, alıcının sağ kalma oranı 100 günlük gözlem döneminde %94'ü aşmıştır. Sonuç olarak, bu optimize edilmiş protokol, uzun vadeli nakil toleransının altında yatan mekanizmaları araştırmak için son derece tekrarlanabilir ve sağlam bir platform sağlar ve böylece nakil tıbbında yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini destekler.

Giriş

Fare karaciğer nakli modeli, temel nakil araştırmaları için en yaygın kullanılan deneysel platform olarak hizmet vermektedir. Ancak, daha geniş kullanımı genellikle kötü şöhretli derecede dik bir öğrenme eğrisi nedeniyle engellenmektedir; bu da sonraki deneysel çalışmaların ilerlemesini önemli ölçüdeengelleyebilir 1,2. Ayrıca, geleneksel fare karaciğer nakli modelleri genellikle cerrahi başarının altında ve düşük uzun vadeli sağkalım oranlarından muzdariptir. Cerrahi işlemleri kritik bir şekilde kolaylaştırarak, operatif detayları titizlikle inceleyerek ve damar ile safra rekonstrüksiyonları doğrudan görselleştirme altında yapılarak bu karmaşık mikrocerrahi modelle ilişkili öğrenme eğrisi önemli ölçüdekısaltılabilir 3,4. Karaciğer nakli, son evre karaciğer hastalığı için tek tedavi tedavisi olmaya devam etmektedir; bu da fare karaciğer nakli modellerinin kurulmasını bilimsel araştırmalar için son derece önemlikılmaktadır 5,6.

Arterializasyonsuz fare karaciğer nakli (NArLT) modeli, deneysel cerrahide önemli avantajlar sunar: mikrovasküler arteriyal anastomozun zorlu zorluğunu aşır, genel ameliyat süresini kısaltır ve farelerin anestezi süresini azaltır. Arteriyel kan akışının azalmasına rağmen, bu modelde ortaya çıkan safra tepkisi, iskemik safra yaralanmalarının araştırılması için benzersiz bir bakış açısı sunmaktadır. Ancak, geleneksel NArLT modelleri ameliyat sonrası safra komplikasyon oranının %30'a kadar çıkmasıyla ilişkilidir ve bu da uzun vadeli sağkalmayı ciddi şekilde tehlikeye atar. Geleneksel klasik fare karaciğer nakli modelinde, alıcının uzun vadeli hayatta kalma oranı %70–%85'ten azdır. Bunu çözmek için, bu çalışma heparinle işlenmiş yumuşak safra stent kullanılarak optimize edilmiş bir protokol tanıtmaktadır. Peribiliyer mikrovasküler ağın korunmasını maksimize etmek için "dokunmasız" safra diseksiyon tekniği ve soğuk perfüzyon yoluyla kapsamlı safra yıkama ile bu yaklaşım, fiziksel destek ve iskemik koruma yoluyla safra komplikasyonlarını temelde azaltmayı amaçlamaktadırve nihayetinde uzun vadeli immünolojik izleme için sağlam ve stabil bir platform sağlar.

Bu nedenle, prosedürel başarı oranlarını maksimize etmek ve alıcı hayatta kalma süresini uzatmak, fare karaciğer naklinde herhangi bir teknik yeniliğin birincil hedefleri olarak durmaktadır. Bu hedeflere ulaşmak, sonraki deneysel araştırmaların zamanında ve kesintisiz ilerlemesini sağlamak için kritik bir önkoşuldur 10.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm hayvan deneyleri ve ameliyatları, Qingdao Üniversitesi Deneysel Hayvan Etik Komitesi (No. 20260301SD5020260401065) tarafından onaylandı. Hayvanların acısını en aza indirmek için tüm çabaları gösterin.

1. Ameliyat Öncesi Hazırlık

  1. Deneysel hayvanlar
    1. Donör olarak 8–10 haftalık ve 220–250 g ağırlığındaki yetişkin erkek Sprague–Dawley (SD) farelerini kullanın. Alıcının ağırlığının bağışçının ağırlığından biraz daha yüksek olmasını ve farkın 50 g içinde olmasını sağlayın.
    2. Ev sıçanları belirli patojensiz koşullarda, kontrollü sıcaklıkta 22°C ± 2°C ve %50 ± %10 göreli nemde.
    3. Kafes başına 2–3 fare kalınlığıyla 12 saatlik ışık/karanlık döngü sürdürün.
    4. Standart bir laboratuvar kemirgen diyeti sağlayın. Cerrahi müdahaleden önce en az 1 hafta boyunca sıçanların laboratuvar ortamına alışmasına izin verin.
    5. Ameliyattan önce 12 saat hızlı hayvanlar. Suya imtiyazlı erişim izni ver.
      NOT: Ameliyattan önce oruç tutmak, anestezi sırasında aspirasyon riskini en aza indirir ve solunum fonksiyonunu bozabilecek ve cerrahi maruziyeti engelleyebilecek mide genişlemesini önler.
  2. Cerrahi aletler ve malzemeler
    1. Şekil 1'de gösterildiği gibi nakil cerrahisi için gereken aletleri kullanın. Ameliyatta kullanılan sarf malzemelerinin detaylarını Malzeme Tablosu'nda listeleyin.
    2. 5F ve 6F epidural kateter kılıflarını, kateterlerin dış çapını, hedef damarların fizyolojik iç çaplarıyla eşleştirerek seçmek için 220–250 g ağırlığındaki erkek SD sıçanlarda alın.
    3. Portal ven (PV) için yaklaşık 1,67 mm 5F kılıf kullanın. Infrahepatik inferior vena cava (IHIVC) için yaklaşık 2,00 mm 6F kılıf kullanın.
      NOT: Anatomik standartlar ve ameliyat dışı görsel tahmin kombinasyonuna dayanarak cerrahi mikroskop altında kateter boyutunu seçin. Kateterin dış çapı ile hedef damarın iç lümeni arasında gerçek zamanlı karşılaştırma yapın. Uygun uyum, kateter damar lümeninin yaklaşık %70–%80'ini kapladığında sağlanır; böylece damar duvarı fazla gerilmeden veya fazla gevşeklik bırakmadan düzgün bir yerleştirme sağlanır. Belirlenen ağırlık aralığındaki SD sıçanları için, önceden tanımlanmış anatomik damar çapları ilk boyut seçimi için kullanılabilir ve bireysel varyasyonlara göre ameliyat içi olarak ayarlanmalıdır. Operatörler, bu damar-kateter eşleştirmesini önceden mikrocerrahi eğitimle kurmalıdır.
    4. 8–10 haftalık SD sıçanlarında, PV ve IHIVC için sırasıyla 5F ve 6F epidural kateter kılıfları alın (Şekil 2A).
    5. Toplam fonksiyonel uzunluğu (tübüler gövde) 2,0–2,5 mm olan manşetler hazırlanır. Forsepsle taşıma için 3,0–4,0 mm uzantı uzunluğu kalın.
    6. Manşon duvarını, sivrisinek penslerinin çeneleriyle sıkıştarak, manşetin proksimal kenarından yaklaşık 0,5–1,0 mm mesafede bir çevresel oluk oluşturulur (ayrıntılar için Şekil 2A'ya bakınız). Güvenli düğüm bağlama ve ardından sabitlemeyi kolaylaştırmak için yaklaşık 0,1–0,2 mm arasında oluk derinliği korumak.
    7. Oluk, 7-0 sabitleme ligatürünün sert kateter yüzeyinden kaymasını önlediğinden emin olun.
    8. 22G intravenöz kateter keserek uçları eğik veya eğimli bir safra stent oluşturun. 5–7 mm uzunluğunda olmasını sağla.
    9. Stent uzunluğu 7 mm tercih ederim. Anatomik varyasyonlara göre uzunluğu, sağ mide veninin yatay seviyesini bir işaret olarak kullanarak ayarlayın. Bu simge noktadan hepatik hilum'a olan mesafeyi tahmin ederek stent uzunluğu seçimini yönlendirin.
    10. Tahmini mesafe sınırlıysa veya yerleştirme sırasında direnç yaşanırsa stenti yaklaşık 5–6 mm'ye kısaltın. Stentin yaklaşık 2–3 mm kısmının safra kanalına bükülmeden, bükülmeden veya çıkıntı olmadan yerleştirilebileceğinden emin olun.
    11. Stenti oda sıcaklığında (23°C ± 2°C) hepparinize tuzlu sunda (100 IU/mL) bekletebilirsiniz. Stenti kullanmadan önce en az 30 dakika suda tutun; böylece donörün safra lümenine yerleştirildiğinde intraluminal safra pıhtılaşmasını önleyin (Şekil 2A).
      NOT: Ameliyattan önce manşeti hazırlayın ve başarılı kanülasyondan sonra manşet duvarında oluklar oluşturmak için sivrisinek forsepsiyle katlanma ve fiksasyonu kolaylaştırın. Safra kanalının perforasyonunu önlemek için kesilen safra stentinin uçlarının aşırı keskin olmamasına dikkat edin. Cerrahi mikroskop altında (10×–16× büyütme), kesilen kenarın temiz ve keskin plastik burklardan arınmış olduğunu doğrulayın; Ucu iğne gibi görünüyorsa, mikro makasla hafifçe kütleştirin. Manipülasyon sırasında stenti tutmak için sadece ince, dişsiz mikro penseps kullanın. Stent lümeninin düzleşmesi, ovalizasyonu veya bükülmesi gibi aşırı dış kuvvet uygulamaktan kaçının; Deforme olmuş stenti atıp yerine koyun, çünkü luminal daralma ameliyat sonrası safra komplikasyonları riskini artırır.

figure-protocol-1
Şekil 1. Nakil işleminde kullanılan cerrahi aletler. (A) Paslanmaz çelik böbrek leğeni. (B) Mikro iğne tutucuları. (C) Mikro-makas kullan. (D) Mikro-forseps (düz ve eğri). (E) Mikrovasküler klipsler ve küçük sivrisinek tarzı bulldog kelepçeleri. (F) Standart iğne tutucu. (G) Düz hemostatik pensler (sivrisinek forsepsleri). (H) Damar kelepçesi. (I) Standart cerrahi makas. (J) Steril cerrahi eldivenin manşetinden yapılmış kauçuk bant). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-2
Şekil 2. Özel yapımı cerrahi manşetler, safra stenti ve planlı karın kesileri. (A) Damar manşetlerinin ve milimetre cetvelin yanında safra stentin hazırlanması. Soldan sağa: infrahepatik inferior vena cava (IHIVC) manşeti için kullanılan 6F epidural kateter kılıfı, portal ven (PV) manşeti için kullanılan 5F kılıf ve 22G intravenöz kateterden kesilen 5–7 mm safra stent. (B) Cerrahi maruziyeti en üst düzeye çıkarmak için donör fare karnında çapraz kesik işareti. (C) Alıcı fare karnında işaretlenmiş standart orta hat laparotomi kesisi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Bağışçı Operasyonu

  1. İlk adımlar
    1. Donör sıçanını indüksiyon odasında %5 izofluran ile 1 L/dakika hava akışında anestezi edin. Anestezi derinliğini, spontan uzuv hareketi ve yoksunluk refleksinin olmadığını doğrulayarak değerlendirin.
      NOT: Anestezi derinliği, spontan uzuv hareketinin olmaması, yoksunluk refleksinin olmaması ve solunum hızı gözlemlenerek değerlendirilir. Ameliyatın sorunsuz ve güvenli ilerlemesini sağlamak için, bu parametreler tüm işlem boyunca 20 dakikalık aralıklarla titiz şekilde yeniden değerlendirilir.
    2. Sağ alt karın bölgesinde, orta hattın yaklaşık 1–2 cm lateral (linea alba) ve sağ inguinal ligamentte 1–2 cm kafatasında intraperitoneal enjeksiyon ile %1 pentobarbital (40–45 mg/kg) uygulanır. Arka patiyi sıkıştırarak ve yoksunluk refleksi olmadığından emin olarak yeterli anestezi olduğunu doğrulayın.
    3. Donör fareyi 37°C ısıtma pedinde sırtüstü pozisyona yerleştirerek ameliyat sırasında vücut sıcaklığını korursun.
    4. Karın cerrahi bölgesini tıraş edin. Bölgeyi üç kez povidon-iyot ile dezenfekte edin.
  2. Karaciğer perfüzyonu öncesi işlemler
    1. Cerrahi alanın en üst düzeyi olarak aksifoid sürecine kadar uzanan, kasık simfizine ve yanlara doğru aksiller orta hatta uzanan çapraz kesi yapın (Şekil 2B).
      NOT: Laparotomiyi iki katmanda yapın. Önce deri ve deri altı dokuyu kesin. Sonra linea alba'yı pensepsle çadırlayın ve hava girişine izin vermek için küçük bir ilk kesi yapın, böylece iç organlar dökülür. Kesiyi makasla uzatarak alt bıçağı karın duvarına paralel tutarak organ hasarını önleyin.
    2. Bağırsakları tuzlu gazlı bezle sarın. Ameliyat bölgesini açığa çıkarmak için karının sol tarafındaki steril ameliyat alanına yerleştirin.
      NOT: İskemik kurumayı ve hipotermiyi önlemek için içüstü içten çıkarılmış bağırsakların sürekli nemini korumak tüm işlem boyunca şarttır. Örtücü bezi periyodik olarak yaklaşık her 10–15 dakikada bir veya cerrahi aydınlatma altında kurumaya başladığında sıcak (37°C) normal salin damlaları uygulayarak yeniden nemlendirilin.
    3. Falciform bağı ayırın. Xiphoid sürecini kranial olarak kelepçe ve geri çekerek suprahepatik IVC (SHIVC) ve sol alt frenik ven ortaya çıkar.
    4. Sol üçgen bağı ayırın. Sol frenik veni SHIVC'ye yakın bir şekilde 7-0 veya 8-0 ile bağlayın Dikiş (Şekil 3A).
      NOT: Sol alt frenik ven ligasyonu yaparken, ligasyonu SHIVC'ye yakın konumlandırın. Dikiş iğnesinin diyaframı kolayca delip pnömotoraksa neden olabileceğini unutmayın; Kan damarına yakın dikiş yapın.
    5. Hızlı hemostaz sağlamak ve ameliyat süresini azaltmak için damar bölünmesi için elektrokoter, prosedürel tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği artırmak için önerilir.
      NOT: Elektrokoterlik hemostazı standartlaştırır, ameliyat süresini azaltır ve operatörler arasında tekrarlanabilirliği artırır.
    6. Kaudat ve papiller lobları harekete geçirin (Şekil 3B).
    7. IHIVC yüzeyinden yağ ve bağ dokusunu çıkarmak için mikroskobik forseps kullanın.
      NOT: Damar duvarı pürüzsüz ve saydam görünene kadar bağ dokusunu çıkarın. Damar kelepçeleri müdahale olmadan uygulanabildiğinde ve kelepçeleme veya dikiş için zarar verebilecek hiçbir doku kalıntısı olmadığında yeterli maruziyet sağlanır.
    8. Sağ adrenal ven IHIVC ile hizalandı. Sağ böbrek venini izole edin ve IHIVC ile hizasına yakın şekilde bağlayın.
    9. IHIVC'nin kaudal olarak sol böbrek veninin hemen üstünde bir seviyeye kadar disseksiye edilmesine devam edin (Şekil 3C).
      NOT: Diseksiyon sırasında IHIVC'nin tamamen iskeletize olduğundan emin olun (kan damarlarını yağlı bağ dokusundan mümkün olduğunca tamamen ayırın). Bu, sonrasında karaciğer eksplantasyonu ve manşet tutma işlemlerini kolaylaştırır.
    10. Karaciğeri pamuklu çubukla nazikçe yükseltin. Sağ alt hepatik lob ile retroperitoneum arasındaki bağ bağlarını disseksiye edin.
      NOT: SHIVC'yi üst karaciğer kutbunda kısa, geniş, ince duvarlı mavimsi bir damar olarak tanımlayın. Ön yüzeyi temizlendikten ve bitişik diyafram lifleri göründüğünde diseksiyonu durdurun.
    11. SHIVC'ye ulaştığınızda diseksiyonu durdurun.
      NOT: Parenximal hasarı önlemek için karaciğeri son derece dikkatli kullanın. Kranial retroperitoneal diseksiyon sırasında IVC'yi korumak için dikkatli olun.
    12. PV ile doğru HA arasındaki bağ dokusunu disseksiye. PV'yi izole edin.
    13. Sağ mide venini (pilorik damar) PV ile aynı hizada bağlayın. Dalak veninin köküne kadar diseksiyona devam edin.
    14. Porta hepatis'i açığa çıkar. PV'nin solunda yer alan kablo benzeri yağ bağ dokusunu tespit edin; bu doku ortak safra kanalı (CBD) ve HA'yı kapsüller.
    15. CBD'nin ön duvarında, karaciğer kanalı bifurkasyonundan 3–5 mm distal bir "V" şeklinde kesi yapın.
    16. Safra stentini tutmak için mikroforseps kullanın. Stenti yaklaşık 3 mm safra yoluna yerleştirin ve kanalla paralel hizalanmayı korur.
      NOT: Stenti direnç göstermeden pürüzsüz bir şekilde ilerlet. Yandan çıkıntı, iç alanlama veya kanal duvarı çadırı olmamadığından emin olun. Direnç veya deformasyon oluşursa, geri çekilin ve yeniden yerleştirmeden önce yeniden hizalanın.
    17. Stenti çevresi 7-0 ipek kravatla sabitleyin. HA'yı kesi seviyesinde bağlayın ve proksimal olarak kesin (Şekil 3D).
      NOT: Donör CBD'yi disseksiye ederken aşırı "iskeletleşme"den kesinlikle kaçının. Peribiliyer bağ dokusu, sinir pleksusları ve mikrovasküler ağları koruyarak erken yan dolaşımı ve ameliyat sonrası safra iyileşmesini teşvik edin. Donör kanalının distal ucu en iskemik bölge olduğundan, iskemik yükü en aza indirmek için anastomozik bölgeyi hepatik hiluma yakın tutun.
  3. Karaciğer perfüzyonu
    1. Karın aortasını açığa çıkarın. Yaklaşık 1 cm yüksekliğinde, 20 mL'lik bir enjektöre bağlanmış 23 gauge (23 G) saç derisi damar iğnesini soğuk (4°C) Wisconsin Üniversitesi (UW) çözeltisiyle doldurulan bir şırıngaya takın.
      NOT: İğneyi karın aortasına sığ bir açıyla (15°–20°) sokun. Arteriyal kan geri dönüşünü gözlemleyerek girişi onaylayın, ardından hafifçe ilerleyip iğneyi damara paralel hizalayarak arka duvar perforasyonunu önleyin.
    2. İnfüzyondan önce enjeksiyondan hava çıkarın. Karın aortunu ve iğneyi damar kelepçesiyle kelepçe ile sabitleyin.
      NOT: Şırıngadan tüm havayı tıklayarak kabarcıkları çıkarır ve iğne ucunda sürekli bir damla görünür hale gelene kadar sıvıyı dışarı çıkarır. Kanülasyondan önce iğne göbeğinde hava olmadığını doğrulayın.
    3. Perfüzyonu yavaşça başlatın; şırıngayı manuel olarak 3–3,5 mL/dakika sabit bir hızda bastırarak başlatın (Şekil 3E).
      NOT: Tüpteki kan geri dönüşünü gözlemleyerek doğru intravasküler yerleşimi doğrulayın.
    4. Diyaframı kesin. Toraks IVC ve torasik aortayı tamamen açığa çıkarın.
    5. Toraks IVC'sini, sağ atriumla birleştiği noktada ve torasik aortayı damar kelepçeleriyle kelepçelendirin.
    6. Toraks IVC'yi kelepçenin hemen altına aktararak perfüzyonun akışına izin verin.
      NOT: Kelepçeyi mümkün olduğunca kafatası şeklinde uygulayın ve damar uzunluğunu korumak için altından kesin yapın. Pıhtılaşmayı önlemek ve greft kalitesini korumak için hemen perfüzyona başlayın.
    7. Perfüzyonu sabit bir hızda (3–3,5 mL/dakika) yaklaşık 40 mL toplam hacme sürdürün.
    8. Karaciğer parenximesi tamamen solgun (sarımsı-kahverengi) döndüğünde perfüzyonu durdurun (Şekil 3F).
      NOT: Karaciğer uniform şekilde solgun (sarımsı-kahverengi) olduğunda ve kesilmiş IHIVC'den çıkan atık sıvı berrak aktığında, kan kalıntısı olmadan yeterli perfüzyon doğrulanır.
    9. IHIVC'yi sol böbrek veniyle aynı hizada kesin. PV'yi dalak damarı seviyesinde kesin.
      NOT: Endotel ve parenkimal hasarı önlemek için hızlı veya kuvvetli perfüzyon enjeksiyonundan kaçının.
    10. Diyafram kesisini büyütün. Karaciğer greftini bağlı diyafram ile birlikte bir blok halinde alın.
    11. Greft, soğuk UW koruma çözeltisi içeren steril bir petri kabına yerleştirin.
    12. Grefti soğuk UW çözeltisinde 4°C'de tutun. Alınımdan sonra 2 saat içinde tam nakil yapılması.

figure-protocol-3
Şekil 3. Donör karaciğer mobilizasyonu ve yerinde perfüzyon sırasında önemli cerrahi adımlar. (A) Sol alt frenik venin maruz bırakılması ve bağlanması. (B) Hepato-özofageal iletişim dallarının izolasyonu ve bölünmesi. (C) IHIVC'nin diseksiyonu, sağ adrenal ve sağ böbrek damarlarının bağlanmasını göstermektedir. (D) Özel safra stentinin ortak safra kanalına (CBD) "dokunmama" tekniğiyle yerleştirilmesi, peribiliyer bağ dokusunu korumak. (E) Karın aortasının kanülasyonu ve soğuk in situ perfüzyonu başlatılması. (F) Tam perfuze edilmiş donör karaciğer, uniform bir şekilde soluk bir görünüm sergiliyor, bu da başarılı kan yıkamasını gösteriyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Ex Vivo Greft Hazırlığı

NOT: Tüm ex vivo greft hazırlıklarını buz üzerinde gerçekleştirin (Şekil 4A). Grefti UW çözeltisinde 4°C ± 2°C arasında tutun ve yeterli soğuk koruma için periyodik olarak sıcaklığı izleyin.

figure-protocol-4
Şekil 4. Donör karaciğer greftinin ex vivo hazırlanması. (A) Toplanan karaciğer grefi, soğuk UW koruma çözeltisi içeren steril bir petri kabına yerleştirilir, hipotermiyi korumak için ezilmiş buz üzerine yerleştirilir. (B) Donör PV'nin özel bir kelepçe üzerinden çevirme ve çevresel bağ ile fiksasyonla kelepçelenmesi. (C) PV ve IHIVC için kol hazırlığı tamamlandı, safra stenti yerinde koydu. (D) Suprahepatik IVC (SHIVC) hazırlanması, her iki yan köşeye de stabilizasyon dikişleri yerleştirilerek sonraki anastomozu kolaylaştırmak. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. PV manşet hazırlığı
    1. PV manşetinin kuyruğunu sivrisinek pensiyle tutun ve kuyruk ucu aşağıya, petri kabının altına dik olacak şekilde sabitleyin.
    2. Mikroforsepsleri manşetin lümeninden geçirin. PV'yi manşetten çek.
    3. PV'nin ön duvarını ayarlayın. Damar duvarının yaklaşık 3 mm uzunluğunda, manşet kuyruğunun genişleyen ucunun üzerinde yer alır.
    4. Eğimli kabı manşetin dış duvarına çevresi 7-0 ipek bir bağ ile sabitleyin (Şekil 4B).
      NOT: Damar ve manşetin burulma veya eğilme olmadan hizalandığından emin olun. Fiksasyondan sonra, PV manşetini yaklaşık 1 mL UW çözeltisi ile yıkayın ve SHIVC'den çıkan akışı gözlemleyerek açıklığı doğrulayın.
  2. IHIVC manşet hazırlığı
    1. IHIVC'nin hazırlanması ve kelepçelenmesi, PV için Adım 3.1'de tarif edilen tam olarak aynı adımlarla gerçekleştirilir. Kısaca, bu aynı standart protokole uygun olarak gemi hareketliliği, triming ve manşet fiksasyonunu içerir; deneysel tutarlılık ve tekrarlanabilirlik sağlanır. (Şekil 4C).
      NOT: IHIVC manşetinin açıklığını doğrulayın, yıkamadan sonra SHIVC'den gelen akıntıyı gözlemleyin.
  3. Safra yolu yıkama
    1. Safra kanalını, 0,5 mL UW çözeltisi içeren 1 mL bir şırınga ile safra stentinden nazikçe yuyun.
    2. Yıkama sırasında sıvı sızıntısı olmadığından emin olun.
      NOT: Sıvı sızıntısının olmaması, safra kanalının bütünlüğünü doğrular.
  4. SHIVC hazırlığı
    1. Karaciğer greftinin SHIVC'sini kalıntı diyaframı çıkararak kesin.
    2. SHIVC'nin tamamen iskeletize olduğundan emin olun, Adım 2.2.7'de tanımlandığı gibi.
  5. Dikiş yerleşimi
    1. 7-0 veya 8-0 kullanın Dikişler operatör tercihine göre yapılır.
      NOT: Cerrahi sonuçlar açısından (anastomotik açıklık ve alıcı sağkalımı dahil), bu modelde her iki dikiş boyutu fonksiyonel olarak eşittir. İkisi arasındaki seçim, işlemin tekrarlanabilirliğini etkilemeden tamamen operatörün kişisel tercihine veya laboratuvar uygunluğuna dayanabilir.
    2. SHIVC kütüğünü nazikçe düzleştirin. Dikişleri, iğneyi içeriden dışa, kenardan yaklaşık 1 mm mesafede geçirerek sol ve sağ yan köşelere yerleştirin (Şekil 4D).

4. Alıcı Operasyonu

  1. İlk adımlar
    1. Alıcı sıçan, donör için tanımlanan aynı protokolle anestezi yapın (Adım 2.1.1).
    2. Alıcı fareyi 37°C'de tutulan termostat kontrollü bir ısıtma pedine yerleştirin.
    3. NOT: Anestezi öncesi alıcı sıçanı tartın. Vücut ağırlığının donörün ağırlığından yaklaşık 50 g daha fazla olduğundan emin olun.
  2. Alıcı karaciğerin mobilizasyonu
    1. Orta hat laparotomisi yapın.
    2. Karın duvarını yan tarafa dört elastik retraktor kullanarak geri çekin. İki üst retraktoru iki taraflı kostal kenarlara lateral ve iki alt retraktoru iki taraf inguinal bölgeye yan konuma getirerek optimal maruziyet sağlanır.
      NOT: Ameliyat alanını açığa çıkaracak kadar geri çekme uygulayın, ancak doku ağarmasına veya solunumu bozabilecek aşırı gerginlikten kaçının.
    3. Sol inferior frenik ven (LIPV) donör prosedüründe tanımlanan şekilde bağlanın (bkz. Adım 2.2.1).
    4. Sol karaciğer lobu ile retroperitoneum arasındaki bağları disseksiye edin. Kaudat ve papiller lobları harekete geçirin.
    5. Elektrokoter ile özofagus ile sol karaciğer lobu arasındaki bağları ve iletişim dallarını ayırın.
      NOT: Elektrokoter, hızlı hemostazı sağlamak, ameliyat süresini azaltmak ve prosedürel tekrarlanabilirliği artırmak için önerilir.
    6. IHIVC'yi sağ böbrek veninin seviyesine kadar kesin ve kesin.
    7. Sol adrenal darı, IHIVC ile birleştiği noktadan yaklaşık 2 mm mesafede dikkatlice izole edin ve bağlayın.
    8. Karaciğerin sağ alt lobunu donör prosedüründe tarif edilen şekilde yönetin (bkz. Adım 2.2.4).
    9. SHIVC'nin arkasına (yaklaşık 10 cm uzunluğunda, steril cerrahi eldivenin manşetinden yapılmış) bir lastik bandı geçirin.
      NOT: SHIVC'yi açık tutmak için solunum hareketini kısıtlamadan nazik bir çekiş uygulayın.
    10. SHIVC'nin sonraki kesiminde kullanılmak üzere lastik bandı yerinde bırakın.
    11. PV'yi hepatik hilumdan pilor dalı seviyesine kadar disek ve izole et.
      NOT: PV'nin diseksiyonunu anastomozik bölgeyle sınırlayın. Cerrahi travmayı azaltmak için çevredeki kolları koruyun.
    12. HA'yı hepatik hilumda izole edin.
    13. HA'yı hilumla hiza olarak bağlayın ve proksimal olarak kesin.
    14. Sol ve sağ karaciğer kanallarının karaciğer hilumunun altında CBD'yi oluşturan birleşim noktasını belirleyin. Bu bölgedeki CBD'yi 7-0 Prolene dikişi ile bağlayın ve kesin (Şekil 5A).
      NOT: Bu bölgede cerrahi travmayı en aza indirin. HA'nın mümkün olan maksimum uzunluğunu, peribiliyer bağ dokusu, sinir pleksusları ve mikrovasküler ağı ile birlikte koruyarak kollateral dolaşımın erken kurulmasını kolaylaştırın.
  3. Alıcı hepatektomi
    1. IHIVC'yi hemen sağ böbrek venine kapatmak için mikrovasküler kelepçeler uygulayın.
    2. PV'yi pilor damarla birleşiminin hemen üstünde kapatmak için mikrovasküler bir kelepçe uygulayın.
    3. Karaciğer parenkimasında görünür kararma gözlemleyerek başarılı vasküler tıkanıklığı doğrulayın.
      NOT: Karaciğerin uniform koyulaşması (siyanoz), parenkimal turgorun kaybı ve PV'nin çökmesi ile vasküler tıkanmayı doğrulayın.
    4. PV'ye 5 mL'lik bir şırıngaya bağlı 23G saç derisi damarı iğnesini soku.
    5. Yaklaşık 30 saniye boyunca 2 ml %5 glikoz çözeltisi infüze ederek intrahepatik kanı sistemik dolaşıma ayıklayın.
      NOT: Hepatik hilum yakınındaki PV ile yavaşça enjeksiyon yapın ve intrahepatik kanı sistemik dolaşıma akın.
    6. SHIVC'yi açığa çıkarmak için kauçuk banda aşağıya doğru çekiş uygulayın.
    7. SHIVC'yi damar kelepçesi kullanarak çapraz kelepçe ile geçirin (Şekil 5B).
    8. IHIVC, PV ve SHIVC'yi karaciğer parenkimiyle hizalanarak transekt yapın.
    9. Karın boşluğundan doğal karaciğeri tamamen çıkarın.
      NOT: Anhepatik fazı 26 dakika içinde (30 dakikayı geçmeden tutun) sürdürün. Transekt damarlar, yeterli uzunluk korumak ve düz damar kütüklerini sağlamak için karaciğerle hizalanır.
  4. Karaciğer grefinin implantasyonu
    1. SHIVC yeniden inşası
      1. Karaciğer greftini ortotopik anatomik yönüne yerleştirin.
      2. Sol köşeye önceden yerleştirilmiş 7-0 dikişi kullanarak arka duvarın sağ köşeye doğru sürekli dikişini başlatın.
      3. Dikşi sağ köşedeki stay südire sabitleyin.
      4. Anastomozu tamamlamak için ön duvar boyunca koşan dikişe devam edin (Şekil 6A–6C).
      5. İğne giriş mesafesini kabın kenarından 0,5–1,0 mm arasında koruyun.
      6. Dikiş aralığı 1,0–1,5 mm arasında korun.
        NOT: Güvenli ve gerginliksiz bir anastomoz sağlamak için iğne aralığı ve dikiş atışını tutarlı koruyun.
      7. Her dikişten sonra dikişi sıkıştırarak boşluğu ortadan kaldırın ve uygun gerginliği koruyun.
        NOT: Ön duvar dikişini tamamlamadan önce, SHIVC'yi kalıcı havayı dışarı atmak ve hava embolizmini önlemek için iç iğneyle UW solüsyonuyla yuyusun.
    2. PV yeniden yapılandırması
      1. Alıcı PV direğinin sol ve sağ köşelerine 7-0 stabilizasyon dikişleri yerleştirin.
      2. Üçgen bir açıklık oluşturmak için üç noktalı çekiş uygulayın.
      3. Manşetli donör PV'yi lümen'e yerleştirin.
      4. Çevre yivin etrafına bağlanmış 7-0 bağ ile sabitlenin (Şekil 6D–6F).
    3. IHIVC yeniden inşası
      1. IHIVC'yi PV yeniden yapılandırma ile aynı teknikle yeniden inşa edin (bkz. Adım 4.4.2) (Şekil 6G–6I).
    4. Reperfüzyon
      1. SHIVC, PV ve IHIVC üzerine sıralı damar kelepçeleri serbest bırakılır.
      2. Greftin tıkanıklık, kanama veya sızıntı olmadan eşit renk restorasyonunu gözlemleyerek başarılı reperfüzyonu doğrulayın (Şekil 7A).
        NOT: Safra kanalından aktif safra üretimi, karaciğer perfüzyonun ve erken greft fonksiyonunun geri kazanılmasını gösterir.
    5. Safra yarası rekonstrüksiyonu
      1. Alıcı CBD kütüğünün ön duvarında küçük bir enine kesi (kanal çapının yarısı) açın.
      2. Donör safra stentini CBD lümenine yaklaşık 3 mm yerleştirin.
      3. Stenti 7-0 çevresel dikiş ile sabitleyin (Şekil 7B).
        NOT: Yeniden yapılandırma tamamlanmadan önce donör stentin distal ucundan aktif safra akıntısını gözlemleyin. Bu, açıklığı ve erken greft fonksiyonunu doğrular.
  5. Alıcı yeniden ısınma
    1. Karın kapanmasından önce periton boşluğunu 37°C'de 150 ml normal salinle sulayın.
      NOT: Bu adım, kalıntı kanı alır, vücut sıcaklığını geri getirir ve SHIVC, IHIVC ve PV anastomozlarında hemostazın incelenmesine olanak tanır.
  6. Karın kapanması ve ameliyat sonrası bakım
    1. Muskülofasiyal tabakayı 4-0 emilebilir iplikle sürekli akan bir dikiş kullanarak kapatın, 1 cm aralıklarla 5 mm ısırıklar alın.
    2. Deriyi 4-0 ipek iplikle sürekli akan bir dikiş ile kapatın.
    3. Buprenorfin (0,1 mg/kg) her 12 saatte bir deri altı olarak toplam 2 doz uygulanır.
    4. Alıcı sıçanı temiz, sıcaklık kontrollü bir kafese nakledin.
    5. Anesteziden tamamen iyileşene ve normal spontan harekete dönene kadar sürekli izleyin.

figure-protocol-5
Şekil 5. Alıcı karaciğer mobilizasyonu ve hepatektomi sırasında önemli cerrahi adımlar. (A) Alıcı CBD'nin hilar bifurkasyon yakınında tanımlanması ve bağlanması. (B) SHIVC'nin maruz kalması ve çapraz kelepçelenmesi. SHIVC'nin arkasına bir lastik bant yerleştirilir, bu da tutuş sağlar ve sıkıştırma sırasında görselleştirmeyi iyileştirir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-6
Şekil 6. Karaciğer grefti implantasyonu sırasında damar rekonstrüksiyonu için önemli cerrahi adımlar. SHIVC'nin yeniden yapılandırılması: (A) köşe saplama dikişleriyle hizalanma, (B) arka duvar sürekli dikiş ve (C) ön duvar dikişlerinin tamamlanması. Manşet tekniği kullanılarak PV rekonstrüksiyonu: (D) üç noktalı çekiş, (E) kelepçeli donör PV yerleştirilmesi ve (F) manşetin sabitlenmesi. Aynı manşet tekniği kullanılarak IHIVC rekonstrüksiyonu: (G) pozlama, (H) yerleştirme ve (I) ligasyon. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-7
Şekil 7. Greft fonksiyonunun doğrulanması, safra rekonstrüksiyonu ve ameliyat sonrası iyileşme. (A) Reperfüzyon sonrası erken greft fonksiyonunun değerlendirilmesi, donör safra stentinden görünür safra akışı ile değerlendirilmesi. PV ve IHIVC rekonstrüksiyonları görünür. (B) Donör safra stentinin alıcı CBD'ye yerleştirilmesi ve sabitlenmesi ile safra rekonstrüksiyonu tamamlandı. (C) Normal duruş ve spontan aktiviteyle tam ameliyat sonrası iyileşme gösteren temsil alıcı sıçan. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

NArLT modellerinde tutarlı cerrahi kalite ve tekrarlanabilirliği sağlamak için tüm işlemler aynı deneyimli mikrocerrah tarafından gerçekleştirildi. Çalışma döneminde toplam 50 fare karaciğer nakli gerçekleştirildi. Cerrahi işlemlerin ortalama süreleri şöyleydi: donör ameliyatı ortalama 25,3 ± 2,6 dakika, ex vivo greft hazırlığı ortalama 13,1 ± 2,1 dakika, alıcı ameliyatı ortalama 43,0 ± 1,6 dakika ve anhepatik faza ortalama 15,7 ± 1,2 dakika.

Optimize edilmiş ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

NArLT modeli, karmaşık mikrovasküler arterial anastomoz11'den kaçındığı için deneysel nakil araştırmalarının temel taşlarından biridir. Ancak, geleneksel NArLT yöntemleri tarihsel olarak %30'a kadar olan yüksek safra komplikasyonları ile boğuşur ve bu da uzun vadeli hayatta kalmayı ciddi şekilde sınırlar ve kronik immünolojik çalışmalarıengeller 2. Önerilen yöntemin önemi, bu iskemik safra hastalıklarını aşabilme yeteneğinde yatmaktadır. Bu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No.82370666), Çin'in Shandong Eyaleti Ana Ar-Ge Programı (No.2025KJHZ016) ve Fujian eyalet sağlık teknolojisi projesi (No. 2023CXA014) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4-0 Emilebilir DikişEtikonW9109HMuskülofasyal tabakanın (linea alba) kapanması için kullanılır
4-0 İpek DikişEtikonVCP304HDeri kapatma için kullanılır
7-0 veya 8-0 Dikiş / İpek KravatEtikonZ1711EDamarların bağlanması için kullanılır (örneğin, sol frenik veni)
22G Damar İçi KateterB. Braun4252098B5&ntire olarak kısaltılmış; 7 mm eğimli uçlarla safra stent hazırlamak için
23G Saç Derisi Damarı İğnesiShandong Qinkai Tıp Endüstrisi Şirketi, Ltd.MDLSSVSKaraciğer perfüzyonu için abdominal aortaya yerleştirme amacıyla kullanılır
BuprenorfinTianjin İlaç Araştırma Enstitüsü İlaç Şirketi, Ltd.H12020275Ameliyat sonrası subkutan analjezi olarak uygulanır
Pamuk ÇubukAoocn216-236Diseksiyon sırasında karaciğeri nazikçe yükseltmek için kullanılır
Ezilmiş BuzYokYokEx vivo hazırlık sırasında greft sıcaklığını korumak için kullanılır
Elastik RetraktorlarYokYokLaparotomi sırasında karın duvarını geri çekmek için kullanılır
Epidural Kateter KılıflarıJiangsu Maichuang Tıbbi Cihaz Şirketi, Ltd.20173084015Bedenler 5F ve 6F; PV ve IHIVC için kelepçe olarak kullanıldı
Gazlı bezCentral Medical Technology Co., Ltd.CH-1001Tuzlu su ile ıslanmış; Bağırsakları kapatmak ve korumak için kullanılır
Glikoz Çözeltisi (%5)Sichuan Kelun İlaç Şirketi, Ltd.H20044307Alıcı hepatektomi sırasında intrahepatik kan yıkamak için kullanılır
Heparin SalinShenzhen Life Biotechnology Co., Ltd.H2012003100 IU/mL; safra stentini ıslatmak için kullanılır
İç İğneB. Braun4254074BAnastomoz tamamlanmadan önce havayı almak için SHIVC'yi yuyub temizlemek için kullanılır
İzofluranJinan Guangshengyuan Biyoteknoloji Şirketi, Ltd.153107015%5 konsantrasyon; anestezi indüksiyonu ve NBSP için kullanılır;
Mikrovasküler KelepçelerŞanghay Tıbbi Cihazlar Şirketi, Ltd.JCZ200Ameliyat sırasında damar tıkanması için kullanılır
Sivrisinek PensetleriŞanghay Tıbbi Cihazlar Şirketi, Ltd.J31010İnce manipülasyon ve manşet hazırlama için kullanılır
Normal Salin (%0,9)Sichuan Kelun İlaç Şirketi, Ltd.H20044304Sulama ve gazlı bez için kullanılır (37°C; C)
Pentobarbital (%1)Şanghay Yuansi Teknoloji A., Ltd.P050000040– 45 mg/kg; Cerrahi Anestezi için Kullanım
Çevresel Takılan Venöz Kateter (PIVC)Covidien8888145015Manşetli PV'yi yıkamak ve açıklığı doğrulamak için kullanılırdı 
Povidon-İyotShanxi Trinda Biyoteknoloji A., Ltd.41836054Cerrahi bölge dezenfeksiyonu için kullanılır
Rubber Band (Surgical Glove'dan)AnsellYokAlıcı ameliyatı sırasında SHIVC traksiyonu için kullanılır
Sprague– Dawley RatsHuafukang (Pekin) Biyoteknoloji Şirketi, Ltd.22001AYetişkin erkek fareler, 8– 10 hafta, 220– 250 g
Steril Petri Kabı (10 cm)Shandong Enyou Biyoteknoloji A., Ltd.H905001Ex vivo hazırlık sırasında UW çözeltisinde greft tutmak için kullanılır
Şırınga (20 mL)Shandong Weigao Group Tıbbi Polimer Ürünleri A., Ltd.20163141593Kontrollü karaciğer perfüzyonu için kullanılır (3&ntir; 3.5 mL/min) 
UW Koruma ÇözümüHayata KöprüBTL-UW-1L4°° olarak bakımı yapıldı; C; Donör karaciğer perfüzyonu ve greft koruma için kullanılır

Kaynaklar

  1. Hirata, M., et al. Stepwise approach for acquisition of microsurgical skills through rat orthotopic liver transplantation experiments. Eur Surg Res. , (2023).
  2. Zhao, H., et al. Revisiting orthotopic rat liver transplant. Exp Clin Transplant. , (2021).
  3. Wu, W., et al. Research progress on anatomy reconstruction of rat orthotopic liver transplantation. Transplant Rev (Orlando). , (2024).
  4. Shi, J. H., Line, P. D., Zhang, S. J., Guo, W. Z. Experimental liver surgery for liver research: update, choice and translation. J Inflamm Res. , (2025).
  5. Engel, B., et al. Molecular signatures discriminating different types of rejection in human liver transplants. J Hepatol. , (2025).
  6. Khatua, C. R., Anirvan, P., Panigrahi, M. K., Singh, S. P. Admission Albumin-Bilirubin Score Is Inferior to MELD, MELD-Na+ and Child-Turcotte-Pugh Score in Predicting Survival in Indian Patients with Alcohol-associated Liver Disease. J Transl Gastroenterol. , (2025).
  7. Yu, H., et al. Low hepatic artery blood flow mediates NET extravasation through the regulation of PIEZO1/SRC signaling to induce biliary complications after liver transplantation. Theranostics. , (2024).
  8. Yang, Z., et al. Prognosis analysis of rat liver transplantation under direct vision of single operator. Transplant Proc. , (2024).
  9. Wang, Z., et al. Liver cold storage and transplantation in the cold-adaptive Daurian ground squirrels. J Vis Exp. , (2025).
  10. Wang, X., MacParland, S. A., Perciani, C. T. Immunological determinants of liver transplant outcomes uncovered by the rat model. Transplantation. , (2021).
  11. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat: technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. , (1979).
  12. Yuan, Z., et al. The effect of microcirculation disturbance of peribiliary vascular plexus on hepatic bile duct epithelial cells in rats undergoing liver transplantation and postoperative rejection reduction by nanocarrier mediation. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). , (2022).
  13. Zhao, D., et al. Regression of bile duct damage and bile duct proliferation in the non-rearterialized transplanted rat liver is associated with spontaneous graft rearterialization. Hepatology. , (1995).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Arteriyel Olmayan ModelBiliyer KomplikasyonlarTransplant mm nolojisiKronik RedBiliyer StentlemeAnhepatik FazBiliyer DiseksiyonTransplant Tolerans
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.