Tünel Nanotüplerinin Standartlaştırılmış İmmünoflüoresans Görüntülemesi ve Astrositler ile Nöronlar Arasında Mitokondriyal Transferin

Xiaoyan Du; Yang Deng

doi:10.3791/71670

Yöntem makalesi

Tünel Nanotüplerinin Standartlaştırılmış İmmünoflüoresans Görüntülemesi ve Astrositler ile Nöronlar Arasında Mitokondriyal Transferin

DOI:

10.3791/71670

⸱

12 Haziran 2026

Xiaoyan Du¹ , Yang Deng¹

¹School of Public Health, Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science and Technology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, tünel nanotüplerinin görselleştirilmesi ve astrositler ile nöronlar arasında mitokondriyal transferin in vitro olarak görülmesi için fiksasyon, boyama ve konfokal görüntüleme yöntemlerini standartlaştırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriler, sinir hücrelerinde enerji üretimini, hücresel sinyal iletimi ve metabolik homeostazı düzenleyen temel organellerdir. Tünel nanotüpleri (TNT'ler), uzun mesafeli hücreler arası iletişimi sağlayan ve bağlı hücreler arasında mitokondri dahil olmak üzere hücresel bileşenlerin transferini kolaylaştıran ince membran yapılardır. TNT'lerin ve mitokondriyal transferin güvenilir görselleştirilmesi, bu yapıların fiksasyon, yıkama ve görüntüleme koşullarına karşı son derece kırılgan ve hassas olması nedeniyle dikkatli örnek kullanımı gerektirir. Bu protokol, astrositlerde ve astrosit-nöron kokültür sistemlerinde TNT'lerin fiksasyon, boyama ve konfokal görüntülemesi için standartlaştırılmış prosedürleri tanımlar. İş akışı, TNT görselleştirmesi için membran ve sitoskelet boyama, mitokondriyal lokalizasyonu takip etmek için mitokondriyal etiketleme ve Miro1 kolokalizasyon analizi için immünoflüoresans boyama içermektedir. TNT morfolojisinin korunması için nazik yıkama ve ışık korumalı taşıma gibi kritik adımlar işlem boyunca vurgulanır. Protokol ayrıca sabit hücre preparatlarında TNT'ler ve mitokondrilerin karakterizasyonu için görüntüleme yaklaşımlarını da özetlemektedir. Bu yöntemler, TNT oluşumu ve sinir hücreleri arasında mitokondriyal transferi in vitro incelemek için tekrarlanabilir bir deneysel çerçeve sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriler, hücrenin enerji fabrikaları olarak hizmet eder; adenosine trifosfat üretimi yoluyla hücresel faaliyetler için gerekli enerjiyi sağlarken, hücresel sinyal iletimi ve redoks dengesinde önemli roller^oynarlar. Sinir sisteminde, mitokondriyal metabolitler nöronal süreçlerin karmaşıklığını ve uyarılabilirliğini artırabilir, böylece nöronal büyüme ve gelişimi^desteklenir. 2. Mitokondriler statik organeller değildir; çeşitli hücre içi ve ekstrahücre streslerine ve metabolik gereksinimlere uyum sağlamak için morfolojilerini, konumlarını ve dağılımlarını sürekli^{değiştirirler 3}. Hücreler arası mitokondriyal transfer, doku homeostazının korunmasına katkıda bulunur ve fizyolojik koşullarda gelişimi destekler; patolojik koşullarda ise hasar onarımında, bağışıklık regülasyonunda ve hastalık ilerlemesinde^{yer alır} ^4,5.

Materyal ve enerjinin hücreler arası iletişimi, hücresel homeostaz, doku onarımı ve sinir ağı düzenlemesi gibi çeşitli biyolojik süreçler için gereklidir. Mevcut çalışmalar, tünel nanotüpleri (TNT'ler), hücrelerarası mitokondriyal transferle ilişkili en kapsamlı incelenmiş mekanizmalardan birini temsil eden birden fazla hücre arası iletişim^{modunu ortaya koymuştur 6}. TNT'ler, F-aktin bazlı, köprü benzeri membran yapılarıdır ve tübüler morfolojiye sahiptir; çapı 50 ila 200 nm arasında değişir ve uzunluğu birkaç hücre^{çapına kadar uzanır. 7}. Araştırmalar, TNT'lerin sinir hücreleri arasında fiziksel bağlantı olarak hizmet edebileceğini ve nörodejeneratif hastalıklar, beyin kanseri ve diğer hastalıkların başlangıcı ve ilerlemesiyle yakından ilişkili olduğunu göstermiştir. Örneğin, mikroglialardan nöronlara TNT'ler aracılığıyla mitokondriyal transferin nöronal hücreleri kurtardığı^{bildirilmiştir} ^8,9.

TNT'ler üzerine güncel araştırmalar, genellikle TNT'lerin yapısal kırılganlığı gibi çeşitli zorluklarla karşı karşıya kalmaktadır; bu da onları kırılmaya yatkın hale getirir ve deneysel sonuçları etkileyebilir; TNT'leri filopodia veya diğer zar çıkıntılarından ayırt etmekte zorlanıyor; ve hücrelerarası TNT'lerin doğru şekilde nicelendirilmesiyle ilgili zorluklar. TNT ile ilgili çalışmaların tekrarlanabilirliğini ve tutarlılığını artırmak için, TNT'lerin yıkanması, fiksasyonu, boyama ve görüntülemesi için standartlaştırılmış yöntemler, deneysel değişkenliği en aza indirirken yapı ve dağılımlarının doğru değerlendirilmesini mümkün kılmak için gereklidir. Fiksasyon öncesi hücre yoğunluğu, ışıktan koruma, yıkama yoğunluğu, fiksasyon süresi ve fiksasyon sonrası boyama koşulları gibi faktörler, TNT'lerin yapısını ve kararlılığını etkileyebilir. Bu çalışmada, astrosit ve astrosit-nöron kültür sistemlerinde TNT'ler ve mitokondri ile ilişkili TNT yapılarının ön tedavi, boyama ve konfokal görüntüleme prosedürlerini açıklıyoruz.

Bu araştırma protokolü genellikle çoğu laboratuvar ortamında uygulanabilir. Primer astrositlerde ve fare hipokampal nöron hücre hattında yapılan doğrulama, protokolün hem birincil sinir hücreleri hem de ölümsüzleştirilmiş hücre hatları için uygun olduğunu doğruladı. Ancak, bu protokolün hâlâ bazı sınırlamaları vardır. Konfokal mikroskopi, TNT görselleştirmesi için süper çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımlarına göre daha düşük uzamsal çözünürlük sağlar ve MitoTracker tabanlı mitokondriyal transferin değerlendirilmesi boya sızıntısı ve mitokondriyal olmayan sinyal girişiminden^{etkilenebilir.}

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma insan denekleri veya canlı omurgalı hayvanları içermedi; Yalnızca ticari olarak elde edilen veya yerleşik hücre hatları kullanılıyordu ve etik onay gerekmiyordu.

1. Astrositlerde TNT'ler için boyama

Hücre Tohumlama
1. Tohum, birincil fare astrositlerini 3. geçişte (P3) 35 mm cam tabanlı kültür kablarına 5 ×^10-4 hücre yoğunluğunda izole etti. 2 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı/Besin Karışımı F-12 (DMEM/F-12) tam ortamı eklenerek %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 üçlü antibiyotik karışımı (penisilin G, streptomisin ve amfoterisin B) eklenin. Hücreler, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37°C sıcaklığında kültürlen.
2. Hücreleri yaklaşık 24 saat kuluçka altına alın, ta ki bağlanma gerçekleşene kadar.
Ön İşlem ve Fiksasyon
1. Kültür çanaklarını hücre bağlandıktan sonra ışık korumalı koşullarda temiz bir tezgaha taşıyın.
  NOT: TNT bütünlüğünü korumak için kullanım sırasında gereksiz hareket ve titreşimi en aza indirin.
2. Kültür ortamını loş ışık koşullarında nazikçe çıkarın.
  NOT: Ortam çıkarımı sırasında hücre yüzeyinin tamamen kurumasından kaçının, çünkü TNT'ler çöküp kültür substratına yapışabilir.
3. Hücreleri kalsiyum ve magnezyum iyonları (pH 7.3–7.5) olmadan 500 μL fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) nazikçe yıkayın. Yıkama sırasında hücrelerarası TNT'leri bozmamak için PBS'yi kültür kabının duvarı boyunca yavaşça ekleyip çıkarın.
4. PBS'yi dikkatlice çıkarın.
5. Hücreleri, loş ışık koşullarında, oda sıcaklığında (RT; 20°C–25°C) 30 dakika boyunca paraformaldehit (pH 7.2–7.4) içeren ticari %4 doku hücresi fiksör çözeltisi ile sabitleyin.
  DIKKAT: Uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla fiksatif çözümleri kullanın ve tüm prosedürleri kurumsal kimyasal güvenlik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirin.
6. Fiksatif çözümü çıkarın.
7. Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.
Hücre Permeabilizasyonu ve Floresan Boyanma
1. Hücreleri, RT'de 20 dakika boyunca 500 μL kullanıma hazır Triton X-100 permeabilizasyon çözeltisi ile permeabilize edin.
  DIKKAT: Triton X-100, hassas TNT yapılarını bozabilir. Geçirimlilik sırasında aşırı ajitasyonu en aza indirin.
2. Geçiricilik çözümünü çıkarın.
3. Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.
4. Boyama çözeltisini hemen kullanmadan önce hazırlayın. PBS'deki F-aktin boyasını 1 μM nihai konsantrasyona kadar seyreldin ve kullanıma hazır nükleer boya olarak 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) kullanın. Kullanmadan önce iki boyama çözelyesini iyice karıştırın.
  NOT: F-aktin görselleştirmesi için alternatif olarak falloidin bazlı boyama reaktifleri kullanılabilir.
5. F-aktin ve nükleer boyama çözeltilerini ışık korumalı koşullarda 1:1 oranında (eşit hacimde) karıştırın.
6. Hazırlanmış boyama çözeltisini kültür yemeklerine ekleyin.
7. Hücreleri 37°C'de karanlıkta 30 dakika kuluçka yapın.
8. Lekeleme çözeltisini çıkarın.
9. Hücreleri PBS ile üç kez, her yıkamada 500 μL kullanarak 1 dakika boyunca yıkayın.
10. Görüntüleme hazırlığı sırasında hücrelerin kurumasını önlemek için 1 mL PBS ekleyin.
Konfokal görüntüleme
1. ×20 objektif lensle donatılmış Nikon ters konfokal mikroskobu kullanarak görüntü alın. DAPI için 405 nm uyarılma, F-aktin boyama için ise 488 nm uyarım kullanın. RT'de ışık korumalı koşullarda 1024 × 1024 piksel çözünürlükte görüntüler yakalayın.
2. Her örnek başına en az beş rastgele seçilmiş görüş alanı kullanarak nitel değerlendirme ve manuel nicelik gerçekleştirin. Her görüş alanında bir veya daha fazla TNT içeren TNT ve pozitif TNT hücrelerinin sayısını nicelikle ölçer (Şekil 1A ve 1B).
  NOT: TNT'lerin floresan kaybını ve yapısal bozulmalarını en aza indirmek için boyamadan hemen sonra görüntüler alın.

Şekil 1: Astrositlerde tünel nanotüplerinin (TNT) floresans boyaması. (A) Cam tabanlı kültür çabaklarında kültürlenen astrositlerde nükleer ve F-aktin boyamalarını gösteren temsilci konfokal mikroskopik görüntüler. (B) A panelinde kutulu bölgenin genişletilmiş görünümü. Beyaz oklar, bitişik hücreler arasındaki TNT benzeri yapıları gösterir. (C) Yanlış örnek kullanımı sonucu TNT benzeri yapıların bozulduğunu gösteren temsil görüntüleri. (D) C panelindeki kutulu bölgenin genişletilmiş görünümü. Sarı oklar, bozulmuş TNT benzeri yapıları gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. TNT'ler aracılığıyla astrositlerden nöronlara mitokondriyal transferde boyama

Astrosit Tohumlanması ve Mitokondriyal Etiketleme
1. Tohum, birincil fare astrositlerini 3 (P3) geçişinde 35 mm cam tabanlı kültür kablarına 3 ×^10-4 hücre yoğunluğunda izole etti. 2 mL DMEM/F-12 tam ortamı %10 FBS ve %1 üçlü antibiyotik karışımı (penisilin G, streptomisin ve amfoterisin B) ile takviye edilmiş. Hücreler, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37°C sıcaklığında kültürlen.
2. Hücreleri yaklaşık 24 saat kuluçka altına alın, ta ki bağlanma gerçekleşene kadar.
3. Kültür kaplarını hücre tutumundan sonra loş ışık koşullarında temiz bir tezgaha taşıyın.
  NOT: TNT bütünlüğünü korumak için kullanım sırasında gereksiz hareket ve titreşimi en aza indirin.
4. Kültür ortamını ışık korumalı koşullarda nazikçe çıkarın. Orta ölçülü çıkarma sırasında TNT'leri bozmaktan kaçının.
  NOT: Ortam çıkarımı sırasında hücre yüzeyinin tamamen kurumasından kaçının, çünkü TNT'ler çöküp kültür substratına yapışabilir.
5. 50 μg liyofilize MitoTracker boyasını dimetil sülfüsit (DMSO) içinde yeniden oluşturarak 1 mM stok çözeltisi hazırlanır ve stok çözeltisi −20°C'de saklanır. Kullanımdan önce, stok çözeltiyi %10 FBS ve %1 üçlü antibiyotik karışımıyla desteklenmiş 400 μL tam DMEM/F-12 ortamında seyreltirerek nihai MitoTracker konsantrasyonu 50 μM elde edilir.
  DIKKAT: Floresan boyaları hazırlık ve kuluçka işlemleri sırasında doğrudan ışığa maruz bırakmaktan koruyun.
6. Kültür tabaklarına mitokondriyal boyama çalışma çözümünü ekleyin.
7. Hücreleri, ışık korumalı koşullarda %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde, 37°C'de kuluçka yapın.
8. Mitokondriyal boyama çözeltisini ışık korumalı koşullarda çıkarın.
9. Hücreleri kalsiyum ve magnezyum iyonları (pH 7.3–7.5) olmadan 500 μL PBS ile nazikçe yıkayın. Yıkama sırasında hücrelerarası TNT'leri bozmamak için PBS'yi kültür kabının duvarı boyunca yavaşça ekleyip çıkarın.
10. PBS'yi dikkatlice çıkarın.
Astrosit-Nöron Ortak Kültürü
1. Tohum, fare hipokampal nöron hücrelerini astrosit içeren kültür kablarına 3 geçişte (P3) 3 ×^10-4 hücre yoğunluğunda ölümsüzleştirdi. Hücreler, %10 FBS ve %1 üçlü antibiyotik karışımı ile desteklenen 1:1 oranında DMEM ve DMEM/F-12 tam ortamından oluşan toplam 2 mL hacimde hücreler ekleyin. Transwell inserti olmadan doğrudan temas yöntemiyle birlikte kültürü kurun. Hücreler, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37°C sıcaklığında kültürlen.
  NOT: Mevcut TNT yapılarının bozulmasını en aza indirmek için nöronal hücreleri nazikçe ekleyin.
2. Standart kuluçka koşullarında 24 saat boyunca kokültürü sürdürürken, işlem işlemleri sırasında gereksiz ışığa maruz kalmadan örnekleri koruyun.
Sabitleme ve Permeabilizasyon
1. Kültür ortamını ışık korumalı koşullarda çıkarın.
2. Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.
3. Hücreleri, paraformaldehit içeren %4 doku hücresi fiksatif çözeltisi ile RT'de loş ışık koşullarında 30 dakika boyunca sabitleyin.
  DIKKAT: Uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla fiksatif çözümleri kullanın ve tüm prosedürleri kurumsal kimyasal güvenlik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirin.
4. Fiksatif çözümü çıkarın.
5. Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.
6. Hücreleri, loş ışık koşullarında RT'de 20 dakika boyunca 500 μL kullanıma hazır Triton X-100 permeabilizasyon çözeltisi ile permeabilize edin.
  DIKKAT: Triton X-100, hassas TNT yapılarını bozabilir. Geçirimlilik sırasında aşırı ajitasyonu en aza indirin.
7. Geçiricilik çözümünü çıkarın.
8. Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.
Floresan Boyanma ve Görüntüleme
1. Boyama çözeltisini hemen kullanmadan önce hazırlayın. PBS'deki F-aktin boyasını 1 μM nihai konsantrasyona kadar seyreldin ve DAPI'yi kullanıma hazır nükleer boya olarak kullanın. Kullanmadan önce boyama çözeltilerini iyice karıştırın.
  NOT: F-aktin görselleştirmesi için alternatif olarak falloidin bazlı boyama reaktifleri kullanılabilir.
2. F-aktin ve nükleer boyama çözeltilerini 1:1 oranında (eşit hacimde) ışık korumalı koşullarda hemen kullanmadan önce karıştırın.
3. Hazırlanmış boyama çözeltisini kültür yemeklerine ekleyin.
4. Hücreleri 37°C'de karanlıkta 30 dakika kuluçka yapın.
5. Lekeleme çözeltisini çıkarın.
6. Hücreleri PBS ile üç kez, her yıkamada 500 μL kullanarak 1 dakika boyunca yıkayın.
7. Görüntüleme hazırlığı sırasında hücrelerin kurumasını önlemek için 1 mL PBS ekleyin.
8. ×20 objektif lensle donatılmış Nikon ters konfokal mikroskobu kullanarak görüntü alın. DAPI için 405 nm uyarılma, F-aktin boyama için 488 nm uyarılma ve MitoTracker boyama için 665 nm uyarı kullanın. RT'de ışık korumalı koşullarda 1024 × 1024 piksel çözünürlükte görüntüler yakalayın.
9. Her örnek başına en az beş rastgele seçilmiş görüş alanı kullanarak nitel değerlendirme yapın. Hücre arası membran bağlantılarında TNT benzeri yapıların ve mitokondri ile ilişkili floresan sinyallerinin varlığını değerlendirin (Şekil 2A ve 2B).
  NOT: TNT'lerin floresan kaybını ve yapısal bozulmalarını en aza indirmek için boyamadan hemen sonra görüntüler alın.

Şekil 2: Astrosit-nöron kokültür sisteminde mitokondri ve TNT'lerin floresans boyaması. (A) Cam tabanlı kültür çabaklarında kültürlenen astrositler ve nöronlarda nükleer, mitokondriyal ve F-aktin boyamalarını gösteren temsil konfokal mikroskopik görüntüler. Astrositler, uzanmış hücresel süreçlerle düzensiz yıldız benzeri veya çokgen morfolojiler sergilerken, nöronal hücreler yuvarlak veya oval ve ince nörite benzeri uzantılara sahipti. (B) A panelinde kutulu bölgenin genişletilmiş görünümü. Beyaz oklar, hücreler arasındaki mitokondri ile ilişkili TNT benzeri yapıları gösterir. İki hücre popülasyonu, öncelikle karakteristik hücresel morfolojilerine göre ayrıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Mitokondri ve TNT'lerde Miro1 için İmmünofluoresans kolokalizasyon boyama

Astrosit Tohumlanması ve Mitokondriyal Etiketleme
1. Tohum, birincil fare astrositlerini 3 (P3) geçişinde 35 mm cam tabanlı kültür kablarına 3 ×^10-4 hücre yoğunluğunda izole etti. 2 mL DMEM/F-12 tam ortamı %10 FBS ve %1 üçlü antibiyotik karışımı (penisilin G, streptomisin ve amfoterisin B) ile takviye edilmiş. Hücreler, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37°C sıcaklığında kültürlen.
2. Hücreleri yaklaşık 24 saat kuluçka altına alın, ta ki bağlanma gerçekleşene kadar.
3. Kültür kaplarını hücre tutumundan sonra loş ışık koşullarında temiz bir tezgaha taşıyın.
  NOT: TNT bütünlüğünü korumak için kullanım sırasında gereksiz hareket ve titreşimi en aza indirin.
4. Kültür ortamını ışık korumalı koşullarda nazikçe çıkarın. Orta ölçülü çıkarma sırasında TNT'leri bozmaktan kaçının.
  NOT: Ortam çıkarımı sırasında hücre yüzeyinin tamamen kurumasından kaçının, çünkü TNT'ler çöküp kültür substratına yapışabilir.
5. DMSO'da 50 μg liyofilize MitoTracker boyasını yeniden oluşturmak için 1 mM stok çözeltisi hazırlanır ve stok çözeltisi −20°C'de saklanır. Kullanımdan önce, stok çözeltiyi %10 FBS ve %1 üçlü antibiyotik karışımıyla desteklenmiş 400 μL tam DMEM/F-12 ortamında seyreltirerek nihai MitoTracker konsantrasyonu 50 μM elde edilir.
  DIKKAT: Floresan boyaları hazırlık ve kuluçka işlemleri sırasında doğrudan ışığa maruz bırakmaktan koruyun.
6. Kültür tabaklarına mitokondriyal boyama çalışma çözümünü ekleyin.
7. Hücreleri, ışık korumalı koşullarda %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde, 37°C'de kuluçka yapın.
8. Mitokondriyal boyama çözeltisini ışık korumalı koşullarda çıkarın.
9. Hücreleri kalsiyum ve magnezyum iyonları (pH 7.3–7.5) olmadan 500 μL PBS ile nazikçe yıkayın. Yıkama sırasında hücrelerarası TNT'leri bozmamak için PBS'yi kültür kabının duvarı boyunca yavaşça ekleyip çıkarın.
10. PBS'yi dikkatlice çıkarın.
Astrosit-Nöron Ortak Kültürü
1. Tohum, fare hipokampal nöron hücrelerini astrosit içeren kültür kablarına 3 geçişte (P3) 3 ×^10-4 hücre yoğunluğunda ölümsüzleştirdi. Hücreler, %10 FBS ve %1 üçlü antibiyotik karışımı ile desteklenen 1:1 oranında DMEM ve DMEM/F-12 tam ortamından oluşan toplam 2 mL hacimde hücreler ekleyin. Transwell inserti olmadan doğrudan temas yöntemiyle birlikte kültürü kurun. Hücreler, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37°C sıcaklığında kültürlen.
  NOT: Mevcut TNT yapılarının bozulmasını en aza indirmek için nöronal hücreleri nazikçe ekleyin.
2. Standart kuluçka koşullarında 24 saat boyunca kokültürü sürdürürken, işlem işlemleri sırasında gereksiz ışığa maruz kalmadan örnekleri koruyun.
Sabitleme ve Permeabilizasyon
1. Kültür ortamını ışık korumalı koşullarda çıkarın.
2. Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.
3. Hücreleri, paraformaldehit (pH 7.2–7.4) içeren ticari 4% doku hücresi fiksasyon çözeltisi ile RT hızında, loş ışık koşullarında 30 dakika boyunca sabitleyin.
  DIKKAT: Uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla fiksatif çözümleri kullanın ve tüm prosedürleri kurumsal kimyasal güvenlik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirin.
4. Fiksatif çözümü çıkarın.
5. Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.
6. Hücreleri, loş ışık koşullarında RT'de 20 dakika boyunca 500 μL kullanıma hazır Triton X-100 permeabilizasyon çözeltisi ile permeabilize edin.
  DIKKAT: Triton X-100, hassas TNT yapılarını bozabilir. Geçirimlilik sırasında aşırı ajitasyonu en aza indirin.
7. Geçiricilik çözümünü çıkarın.
8. Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.
Bloklama ve İmmünoflüoresans Boyanması
1. Hücreleri RT sırasında 1 saat boyunca loş ışık koşullarında %5 keçi serumu ile blokleyin. Bloklama çözümünü keçi serumunu PBS'de 1:20 seyreltileyerek hazırlayın.
2. Engelleme çözümünü çıkar.
3. PBS içinde tavşan monoklonal anti-Miro1 antikorunu 1:100 seyreltme oranında seyreltirin. Sulandırılmış birincil antikor çözeltisini kültür tabaklarına ekleyin ve gece boyunca (12–16 saat) 4°C'de kuluçka yapın.
  NOT: Floresan etiketli örnekleri boyama işlemi boyunca doğrudan ışığa maruz kalmaktan koruyun.
4. Birincil antikor çözeltisini çıkarın.
5. Hücreleri PBS ile üç kez, her yıkamada 500 μL kullanarak 1 dakika boyunca yıkayın.
6. Floresan keçi anti-tavşan IgG ikincil antikorunu PBS içinde 1:100 seyrelme oranında seyreltirin. Her kültür kabına 500 μL seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisi eklenin ve ışık korumalı koşullarda 1 saat kuluçka yapın.
  NOT: Birincil antikor kontrolü olmayan bir kontrol mevcut çalışmaya dahil edilmemiştir. Gelecekteki deneylerde, boyama özelliğini daha da doğrulamak için uygun immünofloresans kontrolleri kullanılmalıdır.
7. Flüoresan ikincil antikor çözeltisini çıkarın.
Floresan Karşı Boyama ve Görüntüleme
1. Boyama çözeltisini hemen kullanmadan önce hazırlayın. PBS'deki F-aktin boyasını 1 μM nihai konsantrasyona kadar seyreldin ve DAPI'yi kullanıma hazır nükleer boya olarak kullanın. Kullanmadan önce boyama çözeltilerini iyice karıştırın.
  NOT: F-aktin görselleştirmesi için alternatif olarak falloidin bazlı boyama reaktifleri kullanılabilir.
2. Kültür tabaklarına boyama çözeltisi ekleyin.
3. Hücreleri 37°C'de karanlıkta 30 dakika kuluçka yapın.
4. Lekeleme çözeltisini çıkarın.
5. Hücreleri PBS ile üç kez, her yıkamada 500 μL kullanarak 1 dakika boyunca yıkayın.
6. Görüntüleme hazırlığı sırasında hücrelerin kurumasını önlemek için 1 mL PBS ekleyin.
7. ×20 objektif lensle donatılmış Nikon ters konfokal mikroskobu kullanarak görüntü alın. Z-yığını görüntülerini 5 μm adım boyutuyla toplamda 40 μm (8 optik kesit) görüntüleme aralığında toplayın. DAPI için 405 nm uyarılma, F-aktin boyama için 488 nm uyarılma, Miro1 immünboyama için 594 nm uyarılma ve MitoTracker boyama için 665 nm uyarılma kullanın. RT'de ışık korumalı koşullarda 1024 × 1024 piksel çözünürlükte görüntüler yakalayın.
8. Her örnek başına en az beş rastgele seçilmiş görüş alanı kullanarak nitel değerlendirme yapın. TNT benzeri yapıları, mitokondri ile ilişkili floresan sinyallerini ve Miro1 ile mitokondri ilişkili boyama arasındaki hücrelerarası membran bağlantılarında görünen kolokalizasyonu değerlendirin (Şekil 3A–3C).
  NOT: TNT'lerin floresan kaybını ve yapısal bozulmalarını en aza indirmek için boyamadan hemen sonra görüntüler alın.

Şekil 3: Astrosit-nöron kokültür sisteminde TNT'lerde mitokondri ve Miro1'in kolokalizasyon boyaması. (A) Cam tabanlı kültür çabaklarında kültürlenen astrositlerde ve nöronlarla nükleer, mitokondriyal, Miro1 ve F-aktin boyamalarını gösteren temsil konfokal mikroskopik görüntüler. Beyaz oklar, TNT benzeri yapılar içinde mitokondri ile ilişkili sinyaller ile Miro1 arasında belirgin kolokalizasyon bölgelerini gösterir. (B) Bitişik hücreler arasında oluşan TNT benzeri yapıları gösteren üç boyutlu yeniden oluşturulmuş Z-yığını görüntüsü. (C) Aynı Z-yığını görüntüsünün yan görünümlü rekonstrüksiyonu, bitişik hücreler arasında uzanan TNT benzeri yapıları gösteriyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrosit monokültür preparatlarında, bitişik hücreleri birbirine bağlayan ince zar çıkıntıları F-aktin ve nükleer boyama sonrası gözlemlenmiştir (Şekil 1A ve 1B). Komşu astrositler arasında uzanan birden fazla TNT benzeri yapı tespit edildi ve bireysel astrositler sık sık çevredeki birkaç hücreyle bağlantı kurdu. TNT benzeri yapıların başarılı korunması, yıkama ve fiksasyon işlemleri sırasında nazik bir şekilde ele alınmasıyla ilişkilendirilmiştir. Ortamın çıkarılması veya yıkaması sırasında aşırı mekanik bozulmalar, bu membran bağlantılarının algılanabilirliğini azaltmasına ve yapısal bozulmalarına yol açtı; bu, yanlış örnek işlenmesi sonucu bozulmuş TNT benzeri yapılarda gösterilmiştir (Şekil 1C ve 1D).

Astrosit-nöron kokültür preparatlarında, MitoTracker boyama ve konfokal görüntüleme sonrası, komşu hücreleri birbirine bağlayan TNT benzeri yapılarda mitokondri ile ilişkili floresan sinyalleri gözlemlenmiştir (Şekil 2A ve 2B). Bu yapılar, TNT benzeri bağlantıların morfolojik değerlendirmesini desteklemek için F-aktin ve nükleer boyama ile birlikte görselleştirildi. Doğru ışık koruması ve en aza yıkama yoğunluğu, görüntüleme hazırlığı sırasında floresans sinyalinin ve TNT morfolojisinin korunmasını sağladı.

İmmünofluoresans kolokalizasyon deneylerinde, astrosit-nöron kokültür preparatlarında TNT benzeri yapılarda mitokondri ile ilişkili boyama ve Miro1 immünboyamaya karşılık gelen floresans sinyallerinin örtüşmeleri gözlemlenmiştir (Şekil 3A). Bu gözlemler, Miro1 ile TNT benzeri yapılarda lokalize olan mitokondri arasında potansiyel bir ilişki olduğunu göstermektedir. Üç boyutlu yeniden yapılandırılmış Z-yığını görüntüleme, bitişik hücreler arasında uzanan TNT benzeri yapıların varlığını daha da destekledi (Şekil 3B ve 3C). TNT koruması, floresans sinyal yoğunluğu ve görüntü kalitesi fiksasyon, geçirgenleşme ve görüntüleme koşullarından etkilendi.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan deneysel protokolün ilk kritik adımı, fiksasyondan önce ışık korumalı ön tedavidir. TNT benzeri yapılar son derece kırılgandır ve kuluçka makinesinden çıkarıldıktan sonra ışık korumalı koşulların korunması, numune hazırlığı sırasında floresan sinyal yoğunluğu ve yapısal bütünlüğün korunması için önemlidir. İkinci kritik adım, sıvı akışından kaynaklanan TNT benzeri yapıların bozulmasını en aza indirmek için nazik manipülasyonla PBS yıkaması yapmaktır. Bu temel işlem prosedürlerine uyum, TNT benzeri yapıların morfolojisini ve stabilitesini korumaya yardımcı olur ve sonraki görüntüleme sonuçlarının tutarlılığını artırır. Aşırı aspirasyon, uzun süren yıkama veya güçlü sıvı karıştırması, örnek işleme sırasında TNT benzeri yapıların çökmesine veya parçalanmasına yol açabilir. Oldukça dinamik doğaları nedeniyle TNT'ler ışığa duyarlıdır. Işığa maruz kalmanın neden olduğu fototoksisite TNT bozulmasına neden olabilir ve bu yapıların görselleştirilmesini^{zorlaştırır. 11}. Bu nedenle, TNT ile ilgili deneyler sırasında ışık korumalı koşullar korunmalıdır.

Hücre içi mitokondriyal hareket, özellikle nöronlarla hücresel enerji dağılımına katkıda bulunur. Çalışmalar, mitokondrilerin aktin filamentleri ve mikrotübüller boyunca hareket edebildiğini^{göstermiştir 12}. Son çalışmalar ayrıca TNT'lerin sinir hücreleri arasında mitokondriyal transferle ilişkili uzun mesafeli hücrelerarası iletişim yapıları olarak işlev^{görebileceğini göstermiştir 13}. Bu çalışmada tanımlanan metodolojik yaklaşım, sinir hücre kültür sistemlerinde TNT benzeri yapıların ve mitokondri ile ilişkili floresan sinyallerinin görselleştirilmesini sağlar. Önceki çalışmalar, sinir hücreleri arasında hücreler arası mitokondriyal transferin, Parkinson hastalığı ve beyin iskemik yaralanması gibi nörolojik bozukluklarda doku onarımı ve nöroprotektif süreçlere katkıda bulunabileceğini^{göstermiştir} ^14,15. Bu çalışmada açıklanan yöntemler kullanılarak, astrositler arasında ve astrositler ile nöronlar arasında TNT benzeri yapılar gözlemlenmiş, bu yapılar içinde mitokondri ile ilişkili floresan sinyalleri de tespit edilmiştir.

Önceki^{çalışmalarda belirtildiği gibi,} MitoTracker boyama boya sızıntısı ve mitokondriyal olmayan sinyal transferine maruz kalır ve bu da veri güvenilirliğini azaltabilir. Bu sınırlamayı gidermek için, gelecekteki araştırmalarda daha kesin sonuçlar elde etmek için genetik olarak kodlanmış mitokondriyal etiketleme gibi daha sağlam yöntemler kullanılmalıdır. Mevcut deneysel koşullarda, iki hücre tipi esas olarak hücresel morfolojiye göre ayrılmıştır; bu yaklaşım hücre tipi tanımlama özgüllüğünü azaltabilir. Gelecekteki çalışmalar, kokültür analizinin doğruluğunu artırmak için hücre tipine özgü floresan etiketlemeleri içermelidir. Miro1, dış mitokondriyal zarda lokalize olan bir adaptör proteindir ve nöronların mitokondriyal taşıma^{süreçlerinde rol oynadığı düşünülmüştür} ^16,17. Bu çalışmada tanımlanan immünofluoresans kolokalizasyon protokolü kullanılarak, TNT benzeri yapılarda mitokondri ile ilişkili boyama ve Miro1 immünboyamaya karşılık gelen floresans sinyalleri örtüştü. Bu gözlemler, Miro1 ile TNT benzeri yapılarda lokalize olan mitokondri arasında potansiyel bir ilişki olduğunu göstermektedir. Ancak, geleneksel konfokal mikroskopinin mekansal çözünürlüğü, ince zar çıkıntıları içindeki moleküler kolokalizasyonun kesin değerlendirmesini sınırlayabilir.

Hücreler arasında TNT benzeri yapıların varlığını doğrulamak için Z-stack görüntüleme yaptık, böylece bu membran bağlantılarının yapısal doğrulamasını destekledik. Mevcut protokol çoğu deneysel ortam için uygun olsa da, sabit hücrelerin konfokal görüntülemesi, canlı hücre görüntülemesine kıyasla örnek işleme sırasında hassas TNT benzeri yapıların kaybına yol açabilir ve böylece doğru TNT^{niceliklendirmesini sınırlayabilir 18}. Ayrıca, sabit hücrelerin görüntülemesi, mitokondriyal transfer yönünün kesin belirlenmesine izin vermez; bu da gelecekteki çalışmalarda daha fazla araştırma gerektirir. Bu protokol, sinir hücresi kültür sistemlerinde TNT benzeri yapıların, mitokondri ile ilişkili sinyallerin ve ilgili proteinlerin boyaılması için standartlaştırılmış deneysel bir iş akışı sağlar. Kontrolsüz yıkama ve fiksasyon prosedürlerine kıyasla, protokol görüntüleme hazırlığı sırasında nazik numune kullanımı ve floresan korumasına vurgu yapar. Bu yöntemler, TNT ile ilgili görüntüleme çalışmalarında deneysel tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği artırmaya yardımcı olabilir.

Özetle, bu çalışma TNT'lerin niteliksel değerlendirmesi ve TNT benzeri yapılar aracılığıyla mitokondriyal taşınımın incelenmesi için pratik ve geniş uygulanabilir bir laboratuvar protokolü sunmaktadır. Ancak, fiksasyon ve yıkama gibi örnek işleme adımları, canlı hücre görüntüleme yaklaşımlarına kıyasla niceliklendirme değişkenliği getirebilir. Ayrıca, konfokal mikroskopi, süper çözünürlüklü mikroskopiden daha düşük uzamsal çözünürlük sağlar ve bu da TNT'lerin ayrıntılı yapısal karakterizasyonunu sınırlar. Ayrıca, MitoTracker tabanlı mitokondriyal boyama boya sızıntısı ve spesifik olmayan sinyal transferinden etkilenir ve bu durum, gelecekteki çalışmalarda deneysel doğruluğu artırmak için ele alınmalıdır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını belirtirler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82260650) tarafından finanse edilmiştir; İç Moğolistan Özerk Bölgesi Doğa Bilimleri Vakfı Projesi (2025MS08067); Baotou Tıp Fakültesi Öğrencileri İnovasyon ve Girişimcilik Eğitim Programı (S202510130008); Baotou Tıp Fakültesi Çiçek Tomurcukları Programı Projesi (HLJH202529) ve Baotou Tıp Fakültesi Halk Sağlığı ve Koruyucu Tıp Birinci Sınıf Disiplin Geliştirme Araştırma Projeleri (GWGG-20250807).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1% üçlü antibiyotik karışımı	Biosharp	BL142A	Hücre kültürü sırasında bakteri ve mantar kontaminasyonunu önler
%4 Doku Hücre Fiksatif	Solarbio	P1110	Hücre fiksasyon reaktifi
Anti-Miro1 antikoru	Abcam	AB319154	Miro1'e karşı primer antikor
Astrositler	Laboratuvarda izole edilmiş primer hücreler	NA	Astrositler, 1 –3 günlük yaşlarındaki neonatal SD sıçan yavrularının beyin korteksinden izole edilmiştir. İzole edilen hücrelerin saflığı, GFAP boyaması ile %95'ten büyük olduğu doğrulanmıştır ve tüm deneyler için 3. pasaj (P3) hücreleri kullanılmıştır
Astrosit hücre kültürü ortamı ortamı (DMEM/F-12)	Gibco	6125011	DMEM ve F-12, 1:1 oranında (v/v) karıştırılmış, %10 fetal boğa serumu (FBS) ve %1 üçlü antibiyotik ile takviye edilmiştir
Konfokal mikroskop	Nikon AX	ECLIPSE TI2-E	Görüntüler, NIS-Elements (sürüm 5.4) ile kontrol edilen bir Nikon AX konfokal mikroskop (Nikon Corporation, Japonya) kullanılarak alınmıştır
DAPI	Servicebio	G1012-100ML	Nükleer boyama boyası
DMSO	BioFroxx	1084ML100	Floresan boya stokunun hazırlanmasında kullanılan çözücü
F-aktin boyama boyası	Thermo Fisher Scientific	A57243	Hücre iskeleti yapıları ve tünnelleyen nanotüplerin görselleştirilmesi için F-aktin boyama reaktifi
Fetal boğa serumu	ExCell Bio	FSD500	Hücre kültürü için gerekli besinleri sağlar
Floresan ikincil antikor (Keçi Anti-Tavşan IgG)	ABclonal	AS039	İmmünfloresan boyama için ikincil antikor
Cam tabanlı hücre kültürü kabı	NEST	801001	Konfokal mikroskopi için görüntüleme kabı
Keçi serumu	Solarbio	210C051	İmmünfloresan boyama için blokaj reaktifi
MitoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	M22426	Mitokondri boyama boyası
Nöronlar	CAS Hücre Bankası	HT22-GNM47	DMEM tam ortamında korunan ölümsüzleştirilmiş fare hipokampal nörön hücreleri. Pasaj 3 (P3) hücreleri toplanarak sonraki deneylerde kullanılmıştır.
Nöron hücre kültürü ortamı (DMEM)	Servicebio	G4511-500ML	GlutaPlus ve sodyum pirüvat ile takviye edilmiş, HEPES içermeyen DMEM, %10 fetal boğa serumu (FBS) ve %1 üçlü antibiyotik ile takviye edilmiştir
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Servicebio	G4203-500ML	Fiksasyon ve boyama sırasında kullanılan yıkama tamponu
Triton X-100	Solarbio	P1080	Hücre geçirgenlik reaktifi

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Astrosit N ron Kok lt r Konfokal Mikroskopi Mitokondriyal Etiketleme Membran Boyama Sitoskeletal Boyama Miro1 Kolokalizasyonu N ral H cre leti imi

Tünel Nanotüplerinin Standartlaştırılmış İmmünoflüoresans Görüntülemesi ve Astrositler ile Nöronlar Arasında Mitokondriyal Transferin

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler