$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu çalışma, yerleşik insan akut miyeloid lösemi hücre hatları ve bunların doksorubisine dirençli türevleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İnsan katılımcılar, hayvanlar veya birincil hasta kaynaklı örnekler dahil edilmedi. Bu nedenle, insan denek araştırmaları için kurumsal inceleme kurulu onayı ve hayvan etiği onayı gerekmiyordu. Hücre hatları, Çin'in Tianjin kentindeki Çin Tıp Bilimleri Akademisi Hematoloji Enstitüsü'nden alınmış ve Fujian Hematoloji Enstitüsü, Fujian Tıp Üniversitesi Birlik Hastanesi'nde korunmaktadır. Hücre kimliği, deneyden önce karyotip ve morfolojik değerlendirme ile doğrulandı ve tüm hücre kültürleri mikoplazma kontaminasyonu açısından test edildi. Protokolde kullanılan kimyasallar, ekipmanlar ve yazılımlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
1. Hücre kültürü ve dirençli fenotipin doğrulanması
İnsan HL60 ve K562 akut miyeloid lösemi hücreleri ile doksorubisine dirençli türevleri HL60/A ve K562/A, Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Tianjin, Çin'deki Hematoloji Enstitüsü'nden temin edilmiştir. Hücreler, %10 fetal sığır serumu ve %1 penisillin-streptomisin ile takviye edilmiş Roswell Park Memorial Institute 1640 ortamında, %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C'de kültürlendi.
HL60/A hücreleri, dirençli fenotipi korumak için 1 μg/mL doksorubisin içeren tam ortamda tutulurken, K562/A hücreleri dirençli fenotipi korumak için 5 μg/mL doksorubisin içeren tam ortamda tutuldu. Doksorubisin, tedavi testleri sırasında akut ilaç seçimi etkilerini önlemek için deneysel testlerden 1 ay önce kültür ortamından çıkarıldı.
Deneylerden önce, dirençli fenotip ebeveyn ve dirençli hücreler arasında doksorubisin yarı maksimum inhibitör konsantrasyon değerleri karşılaştırılarak yeniden doğrulandı. İlaçsız kültürün 1 ayından sonra direnç stabilitesi, doksorubisin hassasiyet testi tekrarlanarak ve bazal P-glikoprotein ile çoklu ilaç dirençle ilişkili protein 1 ekspresyonunun incelenmesiyle değerlendirildi. Kültürler, dirençli türevlerin ebeveyn muadillerine göre daha yüksek doksorubisin yarı inhibitör konsantrasyon değerleri ve daha yüksek taşıyıcı ekspresyonu koruması durumunda deneyler için kullanılmıştır.
2. İlaç hazırlama ve tedavi tasarımı
FTY720, doksorubisin ve SC79, üreticilerin talimatlarına göre stok çözelti olarak hazırlandı. FTY720 ve SC79 dimetil sülfoksitte çözündürüldü ve doksorubisin önerilen çözücüde hazırlandı ve işlem sırasında ışıktan korundu. İşleyen çözeltiler, işlemden önce tam kültür ortamında taze seyreltilmiştir. Son dimetil sülfoksit konsantrasyonu tedavi grupları arasında aynı tutuldu ve %0,1'i aşmadı.
Araç kontrol grupları, ilgili işlem gruplarıyla aynı nihai dimetil sülfoksit konsantrasyonu aldı. Kombine-tedavi deneylerinde, 5 μM FTY720 duyarlılaştırıcı konsantrasyon olarak kullanılmıştır. Doksorubisin, apoptoz ve hücre içi doksorubisin birikim testlerinde HL60/A hücreleri için 4 μM, K562/A hücreleri için 8 μM olarak kullanılmıştır; aksi belirtilmedikçe.
3. Hücre canlılık testi ve yarı maksimum inhibitör konsantrasyon hesaplaması
Hücreler, 100 μL tam ortamda her kuyu başına 1 × 10-4 hücre olan 96 kuyruklu plakalara tohumlanmıştır. FTY720 tek ilaç testi için HL60, K562, HL60/A ve K562/A hücreleri 0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 ve 100 μM FTY720 ile 48 saat işlendi. Doksorubisin hassasiyet testi için, HL60/A ve K562/A hücreleri, 5 μM FTY720 varlığı veya yokluğunda 48 saat boyunca seri dozrubisin konsantrasyonlarıyla muamele edilmiştir.
Hücre canlılığı, üreticinin talimatlarına göre Cell Counting Kit-8 testiyle ölçüldü. Tedaviden sonra, her kuyuya Cell Counting Kit-8 reaktifi eklendi ve plaka 37 °C'de 2 saat kuluçka edildi. Absorbans 450 nm olarak mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü.
Göreli hücre yaşamı şu şekilde hesaplandı: göreli hücre canlılığı = [(işlenmiş kuyuların emilimi - boş kuyuların emiri) / (araç kontrol kuyularının emilimi - boş kuyuların emiri)] × %100
Yarı-maksimum inhibitör konsantrasyon değerleri, GraphPad Prism, sürüm 9.5'te dört parametreli lojistik doz-yanıt modeliyle doğrusal olmayan regresyon kullanılarak hesaplandı. Her deney, her işlem koşulu için üç teknik kuyu bulunan üç bağımsız biyolojik replikayı içeriyordu.
4. İlaç kombinasyonu analizi
FTY720'nin doksorubisin hassasiyeti üzerindeki etkileri, FTY720'nin varlığı veya yokluğunda doksorubisin doz-yanıt ilişkileri karşılaştırılarak değerlendirildi. HL60/A ve K562/A hücreleri, 48 saat boyunca sadece doksorubisin veya FTY720 ile birlikte doksorubisin seri konsantrasyonlarıyla tedavi edildi.
Hücre yaşamalılığı Hücre Sayma Kiti 8 testi kullanılarak değerlendirildi ve yarı-maksimum inhibitör konsantrasyon değerleri, dört parametreli lojistik doz-yanıt modeliyle doğrusal olmayan regresyon kullanılarak hesaplandı. Doksorubisin hassasiyetindeki değişiklikler, doz-yanıt eğrilerindeki kaymalar ve tedavi grupları arasındaki yarı-maksimum inhibitör konsantrasyon değerlerindeki farklılıklara dayanarak yorumlandı.
Deneyler tam bir sabit oranlı doz-matris çalışması olarak tasarlanmadığı için, resmi kombinasyon-indeks analizi yapılmadı. Bu nedenle, sonuçlar kesin farmakolojik sinerji yerine doksorubisin hassasiyetinin değiştiğine dair kanıt olarak yorumlandı.
5. Annexin V ile apoptoz analizi ve propidium iyodid akış sitometrisi
HL60/A ve K562/A hücreleri, 4 ×10 5 hücre/mL ile 6 kuyu plakalarına tohumlanarak 48 saat boyunca aracı, FTY720 tek başlıkta, doksorubisin veya FTY720 ile birleşen doksorubisin ile tedavi edildi. Kombine tedavi için, 5 μM FTY720, HL60/A hücrelerinde 4 μM doksorubisin veya K562/A hücrelerinde 8 μM doksorubisin ile birleştirildi.
Tedaviden sonra, kültür ortamında askıya alınan hücreler dahil hücreler toplandı ve soğuk fosfatla tamponlanmış salin ile iki kez yıkandı. Hücreler, apoptoz tespit kiti üreticisinin önerdiği konsantrasyonda Annexin V bağlanma tamponunda yeniden süspansiyona getirildi. Her örnek 5 μL Annexin V-floressein izotiosiyanat veya Annexin V-allofikosiyanin ve 5 μL propidium iyodid ile boyandı, ardından oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçka yapıldı.
Örnekler hemen akış sitometrisiyle analiz edildi. Lekelenmemiş kontroller, tek boyalı kontroller ve floresans-eksi bir kontroller, kompensasyon ve dörtgen kapılarını ayarlamak için kullanıldı. Enkaz ileri saçılma ve yan saçılma kapı ile dışlandı. Erken apoptotik hücreler Annexin V-pozitif ve propidium iyod-negatif hücreler olarak, geç apoptotik veya ölü hücreler ise Annexin V-pozitif ve propidium iyod-pozitif hücreler olarak tanımlandı. Toplam apoptoz, erken ve geç apoptotik hücre fraksiyonlarının toplamı olarak hesaplandı. Her örnek için en az 10.000 geçerli tek hücreli olay elde edildi.
6. Hücre içi doksorubisin birikimi testi
HL60/A ve K562/A hücreleri, 4 ×10 5 hücre/mL oranında 6 delikli plakalara tohumlanarak gece boyunca kültürlendi. Hücreler daha sonra araç kontrolü, sadece doksorubisin veya 5 μM FTY720 ile birleşen doksorubisin ile tedavi edildi. HL60/A hücreleri 4 μM doksorubisin ile, K562/A hücreleri ise 8 μM doksorubisin ile işlendi. Hücreler 37 °C'de 4 saat kuluçka altına alındı ve ışıktan korundu.
Tedaviden sonra hücreler toplanıp soğuk fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla iki kez yıkanarak ekstraselüler doksorubisin çıkarıldı. Hücreler, fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla yeniden süspansiyona getirildi ve doksorubisin içsel floresansı kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edildi. Arka plan otofloresansını tanımlamak için işlememiş hücreler kullanıldı ve doksorubisinle işlenmiş hücreler floresans-pozitif referans olarak kullanıldı. Hücre içi doksorubisin birikimi, döküntü ve agregat dışlanmasından sonra medyan floresan yoğunluğu olarak nicelendirilmiştir. Medyan floresans yoğunluk değerleri, her bağımsız deneyde doksorubisin tek başına olan grubin grubuna normalize edildi.
7. P-glikoprotein ve çoklu ilaç dirençle ilişkili protein 1 ekspresyonunun akış sitometrik analizi
HL60/A ve K562/A hücreleri, 2 × 106 hücre/mL ile 6 kuyu plakalarına yerleştirildi ve 24 saat boyunca 5 μM FTY720 veya araç kontrolüyle işlendi. İşlemden sonra, hücreler buz gibi soğuk fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla iki kez yıkanmış ve 100 μL hücre boyama tamponunda yeniden süspansiyona getirilmiştir.
Hücreler, üretici tarafından önerilen seyreltme yöntemiyle fikoerithrin ile konjuge edilmiş anti-P-glikoprotein antikoru ve Alexa Fluor 647 ile konjuge edilmiş anti-çoklu ilaç dirençle ilişkili protein 1 antikoruyla boyandı. Kapı ayarı ve kompensasyon için eşleşen izotip kontroller, lekelenmemiş kontroller, tek boyalı kontroller ve floresans-eksi bir kontroller dahil edilmiştir. Örnekler karanlıkta 4 °C sıcaklıkta 30 dakika kuluçka altına alındı, hücre boyama tamponu ile iki kez yıkandı ve alınmadan önce 500 μL hücre boyama tamponunda yeniden süzüldü.
Akış sitometrisi, BD FACScan akış sitometresi kullanılarak gerçekleştirildi. Her örnek için en az 10.000 geçerli tek hücreli olay elde edildi. P-glikoprotein ve çoklu ilaç direnciyle ilişkili protein 1 ekspresyon seviyeleri, ilgili izotip-kontrol sinyalinin çıkarılmasından sonra medyan floresans yoğunluğu olarak nicelendirilmiştir. Normalleştirilmiş değerler, her bağımsız deneyde araç kontrol grubuna göre ifade edildi.
8. Western blotting ve densitometrik niceliklendirme
Belirtilen tedavilerden sonra hücreler toplanıp soğuk fosfatla tamponlanmış salin ile iki kez yıkandı. Toplam protein, proteaz ve fosfataz inhibitörleriyle desteklenen radyoimmünopresipitasyon testi tamponu kullanılarak çıkarıldı. Protein konsantrasyonu, bicinchoninic asit protein test kiti kullanılarak ölçüldü.
Her şerit başına toplam 30 μg protein, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılarak poliviniliden diflorür membranlarına aktarıldı. Zarlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca Tris tamponlu tuzlu Tween 20 içeren tuzlu bir şekilde %5 yağsız süt veya %5 sığır serum albümini ile tıkandı.
Zarlar, toplam protein kinaz B'ye karşı birincil antikorlarla, fosforile edilmiş protein kinaz B, rapamisinin toplam mekanik hedefi, rapamisinin fosforile mechanik hedefi, kesilmiş kaspaz-3, kesilmiş poli(adenosin-difosfat-riboz) polimeraz, P-glikoprotein, çoklu ilaç dirençli protein 1 ve gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaza ile 4 °C'de inkübe edildi. Yıkamadan sonra, zarlar uygun yaban turpu peroksidaz ile konjuge ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat kuluçka edildi. Protein bantları, geliştirilmiş kemilyünüminesans tespiti kullanılarak görselleştirildi.
Bant yoğunlukları ImageJ yazılımı, 1.53t sürümü kullanılarak nicelendirildi. Fosforile protein kinaz B, toplam protein kinaz B'ye normalize edildi ve fosforile edilmiş mekanik rapamisin hedefi rapamisinin toplam mekanistik hedefi olarak normalize edildi. P-glikoprotein, çoklu ilaç direnciyle ilişkili protein 1, kesilmiş kaspaz-3 ve bölünmüş poli(adenozin difosfat-riboz) polimeraz gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaza olarak normalize edildi. Normalleştirilmiş değerler, karşılaştırmaya bağlı olarak araç kontrol veya doksorubisin grubuna göre katlanma değişiklikleri olarak ifade edildi. Western blot analizleri üç bağımsız biyolojik kopya kullanılarak gerçekleştirildi. Kırpılmamış Western blot görüntüleri kamuya açık veri deposuna bırakılır veya ek dosya olarak yüklenirdi.
9. SC79 kurtarma deneyi
Protein kinaz B sinyalinin FTY720'nin gözlemlenen etkileriyle ilişkili olup olmadığını incelemek için, HL60/A ve K562/A hücreleri, protein kinaz B aktivatörü SC79'un varlığı veya yokluğunda FTY720 ile tedavi edildi. Hücreler 12 saat boyunca 5 μM FTY720 ile ön işlemle geçirildi ve ardından 30 μM SC79 veya araç kontrolü ile ek 12 saat işlendi.
Tedaviden sonra, fosforile protein kinaz B, fosforile edilmiş mekanik rapamisin, P-glikoprotein ve çoklu ilaç dirençle ilişkili protein 1 seviyeleri Western blotting ile değerlendirildi. Paralel olarak, apoptoz doksorubisin, FTY720 ve SC79 tedavisinden sonra Annexin V ve propidium iyodid boyama ile değerlendirildi. Kurtarma etkileri, yol bağlantılı kanıt olarak yorumlandı. Genetik aşırı ifade veya knockdown deneyi yapılmadığı için, nedensel sonuçlar temkinli şekilde ifade edildi.
10. İstatistiksel analiz ve veri raporlama
İstatistiksel analizler GraphPad Prism, sürüm 9.5 ve IBM SPSS Statistics, sürüm 23.0 kullanılarak gerçekleştirildi. Biyolojik replikasyonlar, farklı günlerde bağımsız kültürlenmiş hücrelerle yapılan bağımsız deneyler olarak tanımlanmıştır. Teknik kopyalar, aynı biyolojik deney içinde tekrarlanan kuyular veya tekrarlanan ölçümler olarak tanımlandı.
Veriler, aksi belirtilmedikçe ortalama ± standart hata olarak sunuldu. İki grup karşılaştırmaları, veriler yaklaşık olarak normal dağılımdayken eşleşmemiş iki kuyruklu Öğrenci t-testi kullanılarak analiz edildi. Üç veya daha fazla grup arasındaki karşılaştırmalar, tek yönlü varyans analizi ve ardından Tukey'nin post hoc testi kullanılarak analiz edildi. İlaç konsantrasyonu ve tedavi koşulları gibi iki bağımsız faktörü içeren deneyler, iki yönlü varyans analizi ve uygun bir çoklu karşılaştırma düzeltmesi kullanılarak analiz edildi.
Normallik varsayımları desteklenmediğinde, parametrik olmayan testler kullanıldı. Kesin p-değerleri mümkün olduğunda rapor edildi. İstatistiksel anlamlılık, birden fazla karşılaştırma için düzeltmeden sonra p < 0.05 olarak tanımlandı. Tüm şekil efsaneleri, biyolojik kopya sayısını, kullanılan istatistiksel testi, hata çubuklarının anlamını ve anlamlılık eşiğini belirtirdi. Bireysel biyolojik kopya değerleri mümkün olduğunda scatter grafiklerinde gösterilir veya çubuk grafikler üzerine bindirilirdi.