Kronik Travmatik Beyin Yaralanması için Fare Modeli Oluşturmak İçin Tekrarlayan Kilo Bırakma Prosedürü

Özet

Kronik depresif benzeri davranışın altında yatan mekanizmaları incelemek için, kaba yapısal beyin lezyonları yokluğunda tekrarlayan kapalı başlı hafif travmatik beyin hasarı fare modeli oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Travmatik beyin hasarı (TBI), kalıcı nöropatolojik değişikliklere ve uzun vadeli nöropsikiyatrik sonuçlara yol açabilir. İyileşme sırasında, hastaların önemli bir kısmı, rutin bilgisayar tomografisi veya manyetik rezonans görüntüleme yapıldığı belirgin yapısal anormallik göstermese bile, depresif semptomlar ve uyku kaynaklı şikayetler dahil olmak üzere duygusal bozukluklar geliştirir. Bu özellikleri tekrarlayan deneysel modeller, kronik travma sonrası nöropsikiyatrik semptomların altında yatan mekanizmaları araştırmak için gereklidir. Burada, makroskopik muayene ve T2 ağırlıklı MRI ile tespit edilebilen açık yapısal beyin lezyonlarının olmaması durumunda, kronik depresif benzeri davranışın altında yatan mekanizmaları incelemek için tekrarlayan kapalı başlı hafif travmatik beyin hasarı fare modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntemde, sağlam kafatası beş gün ardışık olarak tanımlanmış ağırlık düşüş parametreleri kullanılarak tekrar tekrar darbelere maruz bırakılır. Burada açıklanan koşullarda, prosedür kaba kafatası kırığı veya makroskopik fokal kontüzyon olmadan kapalı kafa yaralanması sağlar. Yaralanma sonrası bir aralıktan sonra, fareler depresif benzeri davranışlar sergilerken, bu çalışmada kullanılan koşullarda genel muayene veya T2 ağırlıklı manyetik rezonans görüntülemede belirgin odak yapısal anormallik göstermemektedir. Bu protokol, tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarı sonrası kronik depresif benzeri davranışların incelenmesi ve potansiyel terapötik müdahalelerin değerlendirilmesi için deneysel bir yaklaşım sunar.

Giriş

Ancak, mevcut paradigma öncelikle başı sabit bir fareye doğrusal etki sağladığı için, spor kaynaklı beyin sarsıntısı veya hafif trafik yaralanmasının doğrudan biyomekanik takliti olarak değil, kronik duygusal sonuçları incelemek için optimize edilmiş kapalı başlı bir rmTBI modeli olarak yorumlanmalıdır." Travmatik beyin hasarı (TBI), şu anda travmaya bağlı morbidite ve ölüm nedenlerinden başlıca olarak yer almakta olup, aileler ve toplum üzerinde önemli tıbbi ve ekonomik yük^{oluşturmaktadır 1,2}. Özellikle, TBI sonrası merkezi sinir sistemi hasarı geçici değildir; genellikle kronik ve ilerleyici bir şekilde evrimleşir. TBI üzerine yapılan bir çalışma, yaralanmadan 18 yıl sonra bile mikroglial aktivasyonun devam ettiğini ve uzun süren kronik nöroinflamasyonun şiddetli sinirsel bozulmaya yol açmaya devam^{ettiğini ortaya koymuştur 3}. Epidemiyolojik veriler, uzun süreli^{iyileşme aşaması 4} sırasında hastaların %28–%32'sine kadar şiddetli affektif bozukluklar geliştirdiğini göstermektedir. Bu makalede rmTBI, tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarı indüksiyon paradigmasını ifade ederken, kalıcı davranışsal değişikliklerle karakterize edilen kronik yaralanma sonrası evre, burada kronik travmatik beyin hasarı (c-TBI) olarak adlandırılır. Burada c-TBI terimi, ayrı bir yaralanma paradigması yerine rmTBI sonrası kalıcı davranışsal değişikliklerle karakterize edilen kronik yaralanma sonrası durumu tanımlamak için kullanılır. Bu kullanım, deneysel TBI'nın uzun vadeli histopatolojik ve davranışsal anormalliklerle ilişkili ilerleyici bir kronik süreç olarak evrülebileceğini gösteren önceki çalışmalarımızla kavramsal olarak tutarlıdır.

Bu kronik nöropsikiyatrik sonuçlar, hastaların yaşam kalitesini ve fonksiyonel sonuçlarını ciddi şekilde olumsuz etkiler⁵. Ancak, bu ikincil affektif bozuklukların altında yatan tam patogenezi hâlâ belirsizdir ve klinik tedavi seçenekleri ciddi şekilde sınırlıdır. Bu nedenle, c-TBI kaynaklı depresif benzeri davranışların mekanizmalarını araştırmak ve kesin terapötik hedefleri belirlemek acil klinik ihtiyaç ve önemli pratik öneme sahiptir.

TBI'nın patolojik mekanizmalarını açıklamak için araştırmacılar, çeşitli hayvan modelleri geliştirmiştir; bunlar arasında kontrollü kortikal etki (CCI) modeli şu anda en yaygın kullanılan^{modellerden biridir 6,7}. CCI, çarpma parametrelerinin hassas kontrolünü sağlayarak yüksek tekrarlanabilir odak lezyonlar üretir. Ancak, hem CCI hem de geleneksel sıvı-vurma yaralanması (FPI) modelleri genellikle kraniotomi gerektirir. Bu yaklaşımlar özellikle odak kontüzyon, doku kaybı ve şiddetli lezyon kaynaklı nöroinflamatuar yanıtların incelenmesinde faydalıdır, ancak genellikle hafif kapalı baş yaralanmalarının en yaygın klinik sunumlarından, örneğin sporla ilgili beyin sarsıntılarından önemli ölçüde farklılık gösteren ağır açık^{TBI'yı simüle ederler 8,9}. Önemli olarak, beyin dokusu nekrozu, glial skar oluşması ve kraniotomi ile çarpma nedeniyle geç evre kavitasyon iki büyük sınırlama sunar. Birincisi, ciddi yapısal eksiklikler genellikle motor disfonksiyonu tetikler ve bu da davranışsal sonuçların doğru değerlendirilmesini doğrudan şaşırtır. İkinci olarak, doku fiziksel kaybı uzun menzilli sinir projeksiyonlarını koparır. CCI kaynaklı TBI modeli kullanılarak yapılan önceki çalışmalarda gösterildiği gibi, farelerde anlamlı odak beyin kontüzileri^{görülmüştür 4}. Bu yapısal bozulma, viral izleme gibi gelişmiş nöroanatomik tekniklerin uygulanmasını ciddi şekilde engellemekte olup, psikiyatrik semptomların ve bunlara bağlı sinir devrelerinin araştırılmasını büyük ölçüde mümkün kılmamaktadır. Buna göre, bu modeller şiddetli veya odaklı TBI çalışmaları için değerli olsa da, özellikle davranışsal ve devre düzeyinde analizler için yapısal bütünlüğün korunması önemli olduğunda, tekrarlayan hafif kapalı baş yaralanmasından sonra kronik affektif anormallikleri araştırmak hedefi olduğunda, daha az uygun olabilirler.

Bahsedilen ağır açık TBI modellerinin sınırlamalarını aşmak için, bu çalışma, kraniotomi olmadan açıkta kalmış, sağlam kafatasında ağırlık bırakma yöntemiyle tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarı (rmTBI) fare modeli oluşturmak için bir protokolü detaylandırmaktadır. Bu protokol, hassas olarak tanımlanmış çarpma parametreleri kullanır: 25 cm düşüş yüksekliği ve 20 g ağırlık. Çarpma noktası, sagittal dikişin 2 mm sol ve koronal dikişin 2 mm gerisinde hedeflenmiş, çarpma kuvvetinin doğruluğunu ve düzenliliğini sağlamak için çapı 4 mm olan kavisli metal darbe ucu kullanılmıştır. Ayrıca, beş gün ardışık tekrarlayan etkilerin spesifik sıklığı, kronik patolojik değişikliklerin stabilitesini sağlar. MR, histopatoloji ve davranışsal testleri içeren kapsamlı değerlendirmeler, bu fare modelinin belirgin fokal kontüzyonlar veya motor eksiklikler olmadan büyük yapısal beyin bütünlüğünü korurken önemli depresif benzeri davranışlar sergilediğini göstermektedir. Bu fenotipik profil, rutin nörogörüntülemede belirgin yapısal anormallikler olmamasına rağmen nöropsikiyatrik benzeri değişiklikler dahil olmak üzere tekrarlayan hafif kafa yaralanmasının seçilmiş davranışsal özelliklerini^yakalıyor 10,11,12,13. Ancak, mevcut paradigma öncelikle başı sabit bir fareye doğrusal etki sağladığı için, sporla ilgili sarsıntı veya hafif trafik yaralanmasının doğrudan biyomekanik takliti olarak değil, kronik duygusal sonuçları incelemek için optimize edilmiş kapalı başlı bir rmTBI modeli olarak yorumlanmalıdır.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Hefei Kapsamlı Ulusal Bilim Merkezi'nin Yapay Zeka Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (Onay No. IAI2024071004). Tüm işlemler, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal ve ulusal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Deneysel protokolün şematik diyagramı Şekil 1'de gösterilmiştir. Kritik performans özellikleri korunduğu sürece, örneğin 20 g darbe ağırlığı, 25 cm drop yüksekliği, 4 mm darbe ucu çapı, güvenilir izofluran teslimatı ve burada kullanılanlara benzer MRI ayarları gibi diğer tedarikçilerden eşdeğer ekipmanlar kullanılabilir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hayvan hazırlığı

1. Hayvanları hazırla.
   1. 8–10 haftalık ve 20–25 g ağırlığında erkek C57BL/6N fareleri kullanın.
   2. Fareleri, belirli bir patojensiz (SPF) hayvan tesisinde bireysel olarak havalandırılan kafeslerde (IVC) barındırır. Yiyecek ve su imkansız sağlayın ve kontrollü sıcaklık ve nem altında 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü sürdürün.
   3. Fareleri deneyden önce barınma odasına alıştırın ve kurumsal hayvan bakım prosedürlerine uygun olarak rutin sağlık taraması yapın.
2. Grupları atayın.
   1. Fareleri rastgele Naive grubuna, Sham grubuna ve c-TBI grubuna atanın. MRI yorumlama, büyük patolojik değerlendirme ve davranışsal puanlama/veri analizinden sorumlu araştırmacılar grup atamasına kör edildi.
   2. İlk yaralanma seansından önce hayvan kimlik numarasını ve grup atamasını kaydedin.

2. Ameliyat ve anestezi için hazırlık

1. Cerrahi aletleri ve anestezi sistemini hazırlayın.
   1. No. 11 bıçak, steril pamuk çubukları, steril fizyolojik salin, %10 povidon-iyot çözeltisi, 5-0 emilemeyen polipropilen monofilament dikiş, yapışkan bant ve klortetrasiklin oftalmik merhem ile donatılmış steril bir skarpel hazırlayın.
   2. Cerrahi aletleri kullanmadan önce sterilize edin, temiz bir cerrahi alana yerleştirin ve işlem boyunca aseptik tekniği koruyun. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
   3. Termostatik ısıtma pedi hazırlayın ve 37 °C ± 0,5 °C'ye ayarlayın.
   4. İndüksiyon odasını ve burun konisini laboratuvar hayvan gaz anestezi sistemine bağlayın.
   5. Oksijen akış hızını 0.5–1.0 L/da'ya ayarlayın ve izofluran buharlaştırıcıyı indüksiyon ve bakım için hazırlayın. İyi havalandırılan bir alanda anestezi yapın veya onaylı bir atık gaz temizleyici sistemi kullanın.
2. Fareyi ameliyata hazırlayın.
   1. Anestezi ve ameliyattan önce onaylanmış hayvan protokolüne uygun olarak buprenorfin HCl (0.1 mg/kg, intraperitoneal) 30 dakika sonra uygulanır.
   2. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve izofluran ile anestezi yapın. Buharlaştırıcıyı indüksiyon için %3–%5'e ayarlayın ve fareyi düzeltme refleksi kaybolana ve kendiliğinden uzuv hareketi durana kadar sürekli izleyin. İndüksiyon sırasında %5 izofluranı aşmayın.
   3. Fareyi yatan pozisyonda stereotaksik bir çerçeveye aktarın ve burun konisi aracılığıyla anestezi sürdürün. Bakım için buharlaştırıcı ayarını %1–%2'ye indirerek oksijen akışını 0,5–1,0 L/dakika olarak tutun.
      1. İşlem sırasında, yaklaşık 60–100 nefes hızı dakikada sabit bir şekilde korun. Solunum hızı dakikada 60 nefesin altına düşerse veya nefes sığ veya düzensiz hale gelirse, izofluran konsantrasyonunu hemen azaltın, destekleyici ısınma sağlanın ve stabil solunum yeniden başlayana kadar etkisi erteleyin. Bakım sırasında %2 izofluranı aşmayın.
   4. Pedal çekilme refleksi olmadan yeterli anestezi doğrulan, stereotaksik çerçevenin kulak çubuklarıyla başı timpanik zarlara zarar vermeden sabitleyin (Şekil 2A) ve fareyi yatağa yatan pozisyonda tutun. Belirtilen indüksiyon ve bakım aralıkları içinde yeterli anestezi sağlanamazsa veya aşırı solunum depresyonu oluşursa, hayvan o yaralanma seansından dışlanın.
   5. Her iki göze klortetrasiklin oftalmik merhem uygulayın, saç derisini tıraş edin ve cerrahi bölgeyi %10 povidon-iyot solüsyesiyle dezenfekte edin.

3. Tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarı modelinin oluşturulması

1. Kafatasını ortaya çıkar.
   1. Saç derisinde, yaklaşık 0,5 cm ila 1 cm uzunluğunda, No. 11 bıçaklı steril bir sneşter kullanarak boyuna orta hat kesi yapın.
   2. Kemik yüzeyini çizmeden kafatasını tamamen açığa çıkarmak için deri altı dokusu ve periostumu steril forseps veya pamuk çubuklarıyla kesin.
   3. Kafatası yüzeyini, fizyolojik tuzlu suyla nemlendirilmiş steril pamuk çubukla silin, böylece kranial işaretler, bregma ve koronal dikiş gibi görselleştirin.
2. Çarpma cihazını hazırla.
   1. Serbest düşen ağırlık bırakma cihazına 4 mm çapında kavisli metal darbe ucu takın.
   2. Düşüş yüksekliğini 25 cm olarak ayarlayın ve 20 g darbe ağırlığı kullanın (Şekil 2B).
3. Etkiyi ver.
   1. Çarpma yerini, kafatası yüzeyinde sagital dikişin 2 mm sol solunda ve koronal dikişin 2 mm gerisinde bir noktada tespit edin (Şekil 2C).
   2. Darbe ucu ucu hedef bölge üzerinde dikey hizalanın, hafifçe kafatası yüzeyine temas edecek kadar aşağı indirin ve ağırlığı bırakmadan önce ucun kafatasına dik ve ortada kaldığından emin olun.
   3. 20 g ağırlığı 25 cm yükseklikten bırakarak tek bir darbe verebilirsiniz.
   4. Naif grup için anestezi veya ameliyat yapılmaz. Sham grubu için anestezi uygulanır ve saç derisi kesiği yapılır, ancak etkiyi vermeyin.
4. Kesiyi dikiş ile ameliyat sonrası bakım sağla.
   1. Çarpışmadan hemen sonra darbe ucu çıkarılır ve cerrahi bölgeyi inceleyin.
   2. Saç derisi kesisini, kesintili 5-0 emilen polipropilen monofilament dikişiyle kapatın ve kesi yerini %10 povidon-iyot çözeltisi ile dezenfekte edin.
   3. Fareyi 37 °C ± 0,5 °C sıcaklıkta tutulan termostatik ısıtma pedine yerleştirin, tam bilinç kazanana ve serbest yürüyüşe kadar solunumu izleyin ve ardından fareyi ev kafesine geri götürün.
      NOT: İyileşme, düzenli spontan solunumun geri dönmesi, dikleşme refleksinin geri kazanılması ve spontan ambulasyonun gerçekleşmesiyle tanımlanır. Akut apne ve görünür kanama, her darbeden hemen sonra ve erken iyileşme sırasında izlenmelidir. Uzun süreli apne, görünür kanama gösteren, izofluran bıraktıktan sonra 10 dakika içinde refleksi yeniden kazanmayan veya 15 dakika içinde kendiliğinden hareket edemeyen hayvanlar, sonraki işlemlerden dışlanmalı ve onaylanmış hayvan protokolüne göre yönetilmelidir.
   4. Kullanılmış bıçak ve iğneleri onaylı bir keskin kutuda atın. Hayvan atıkları ve kirlenmiş maddeleri kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak bertaraf etmelidir.
5. Yaralanmayı tekrarlayın.
   1. 3.1–3.4 adımlarını 5 gün ardışık 5 gün boyunca her 24 saatte bir tekrarlayarak toplamda 5 darbe elde edin.
   2. Ameliyat sonrası iyileşme dönemi boyunca vücut ağırlığını ve aktiviteyi sürekli takip edin. Hayvanlarda kafatası kırığı, görünür kanama, nöbet, kalıcı daire çizme veya bağımsız beslenme veya su yiyememesi gelişirse sonraki analizlerden dışlanın.

4. Manyetik rezonans görüntüleri elde etmek

NOT: Bu çalışmada, son yaralanmadan sonraki 7. gün MR yapıldı. Fareler izofluran anestezisi altında taranmış ve görüntülemeden önce feda edilmemiştir. Doku toplama, görüntüleme sonrası deneysel programa göre gerçekleştirildi.

1. Hayvanı MR'a hazırlayın.
   1. Fareyi izofluran ile anestezi yapın ve burun konusuyla donatılmış MRI uyumlu bir hayvan yatağına yerleştirin.
   2. Tarama boyunca solunumu takip edin ve vücut sıcaklığını 37 °C ± 0,5 °C arasında tutun.
2. T2 ağırlıklı görüntüler elde edin
   1. 30 cm deliği ve maksimum gradyan gücü 1000 mT/m, maksimum eğim hızı 10000 T/m/s olan bir gradyan sistemine sahip 9,4 T süperiletken mıknatıs üzerinde görüntü alın.
   2. Radyofrekans iletimi için 86 mm hacimli bir bobin ve sinyal alımı için 15 mm düzlemsel yüzey bobini kullanın.
   3. T2 ağırlıklı yüksek çözünürlüklü çok dilimli hızlı spin-echo görüntüleri aşağıdaki parametrelerle alın: tekrarlama süresi = 3000 ms, yankı süresi = 46,34 ms, yankı treni uzunluğu = 13, alıcı bant genişliği = 220 Hz/piksel, görüş alanı = 20 × 20^{mm 2}, alım matrisi = 208 × 208, dilim kalınlığı = 0,5 mm, dilim aralığı = 0 mm ve uyarılma sayısı = 2.
   4. Tüm beyni kaplayan 30 dilim alın. Toplamda 1 dakika 33 saniye edinme süresi kullanın. Mevcut çalışmada, T2 ağırlıklı MR yalnızca nitel değerlendirme için kullanılmıştır. Herhangi bir nicel MRI analizi yapılmadı.
      NOT: MRI görüntüleri, grup atamasına kör bir araştırmacı tarafından niteliksel olarak incelendi.

5. Büyük nöropatolojinin değerlendirilmesi

1. Doku toplama işlemi yapın.
   1. Onaylanmış hayvan protokolüne göre fareyi derinlemesine anestezi altına alın.
   2. Toraks boşluğunu açın, kalbi açığa çıkarın, sol ventriküle bir perfüzyon iğnesi sokun ve sağ atriumu kesin.
   3. Normal salin ile perfüze olun, ardından %4 paraformaldehit (PFA) ile perfüze olun. Tüm perfüzyon işlemini sertifikalı kimyasal bir duman davlumbazında gerçekleştirin ve PFA ile doğrudan cilt veya göz teması yapmaktan kaçının. Dokuları ve sıvı atıkları tehlikeli atık ve biyogüvenlik düzenlemelerine uygun şekilde bertaraf et.
   4. Kafatasını ve sağlam beyni toplayın ve yüksek çözünürlüklü bir kamera kullanarak iğrenç görüntüler yakalayın.
      NOT: Toplu patolojik değerlendirme, grup atamasına kör bir araştırmacı tarafından gerçekleştirildi.

6. Vücut ağırlığını takip edin

1. Vücut ağırlığını kaydet.
   1. İlk yaralanma seansından önce ve yaralanmadan sonraki 1, 3, 7, 14, 21 ve 30. günlerde her fareyi tartın ve genel sağlık durumunu zamanla değerlendirmek için değerleri kaydedin.

7. Tışın yürüyüşü testini gerçekleştirin

1. Cihazı hazırlayın.
   1. 1 m uzunluğunda ve 1 cm genişliğinde yatay ahşap kiriş kullanın ve yerden 30 cm yüksekliğe asın.
2. Motor koordinasyonunu test edin.
   1. Fareyi ışının başlangıç ucuna yerleştirin, uç noktaya kadar ilerlemesini izin verin ve ışını geçmesi için gereken süreyi kaydedin.
   2. Testi sakatlık öncesi ve sakatlıktan sonraki 1, 3, 7, 14, 21 ve 30. günlerde yapın.
      NOT: Davranışsal testler, testler arasında aktarım etkilerini en aza indirmek için planlandı. Kuyruk süspansiyon testi (TST) ve zorunlu yüzme testi (FST), açık alan testinden (OFT) daha fazla stres yarattığı için, önce yapıldı, ardından OFT ve Barnes labirenti daha sonraki zaman noktalarında gerçekleştirildi. Bu dizi, sonraki davranışsal değerlendirmelerde önceki alışkanlık veya tekrar tekrar keşif maruziyetinden kaynaklanan potansiyel karışıklığı azaltmak için seçilmiştir.

8. Kuyruk süspansiyon testinin yapılması

1. Cihazı hazırlayın.
   1. Testi sakatlıktan sonraki 7. gün yapın ve kuyruğun üzerine bir Plexiglas silindiri yerleştirerek kuyruğun tırmanmasını önleyin. 4 cm uzunluğunda, dış çapı 1,6 cm, iç çapı 1,2 cm ve ağırlığı 1,6 g olan bir silindir kullanın.
2. Davranışı kaydet.
   1. Kuyruğu asma kutusuna yapışkan bantla sabitleyin, farenin kutunun altına ulaşmadığından emin olun ve fareyi 3 dakika boyunca askıya alın.
   2. Tüm oturumu yüksek çözünürlüklü bir kamerayla kaydedin ve kayıtlı videodan hareketlilik süresi ile hareketsizlik süresini kör bir gözlemci tarafından manuel olarak analiz edin.

9. Zorunlu yüzme testini yapmak

1. Cihazı hazırlayın.
   1. Testi yaralanmadan sonraki 10. gün yapın ve 25 cm yüksekliğinde, 15 cm çapında şeffaf bir silindiri 23–25 °C sıcaklığında tutulan suyla doldurun. Kuyruk ve arka uzuvların diple temas etmesini engelleyen bir su derinliği kullanın.
2. Davranışı kaydet.
   1. Fareyi suya 6 dakika boyunca yerleştirin ve tüm oturumu yüksek çözünürlüklü bir kamerayla kaydedin.
   2. Kayıtın son 4 dakikasını kör bir gözlemci tarafından manuel olarak analiz edin ve hareketlilik süresi ile hareketsizlik süresini nicelikle ölçün.
   3. Hareketsizliği sadece başı suyun üstünde tutmak için gereken minimum hareketler olarak tanımlayın.

10. Açık alan testinin yapılması

1. Cihazı hazırlayın.
   1. Testi, yaralanmadan sonraki 14. gün, sürekli aydınlatma altında sessiz bir odada yapın. Bu sonraki zaman noktası, önceki TST ve FST seanslarından ayrılık sağlamak ve böylece OFT'ye akut stresle bağlı transferi azaltmak için seçildi.
   2. 40 cm × 40 cm × 40 cm ölçüsünde açık bir alan kutusu kullanın.
2. Keşif davranışlarını kaydedin ve analiz edin.
   1. Fareyi arenanın ortasına yerleştirin ve 6 dakika boyunca özgürce keşfetmesine izin verin.
   2. Davranışı 6 dakika boyunca bir davranış takip ve analiz yazılımı kullanarak takip edin. Yazılımda arena boyutlarını 40 cm × 40 cm aralarındaki cihazlara uyduracak şekilde kalibre edin ve arenayı neredeyse 5 × 5 ızgaraya bölebilirsiniz.
   3. 16 dış kareni çevresel bölge olarak, 9 iç kareni ise merkez bölgesi olarak tanımlayın. Hayvan rengini arka plan renginden daha koyu ayarlayın. Sadece hayvanın bedenini takip edin; Kafayı veya kuyruğu takip etmeyin. Arka planı manuel olarak yakalayın.
   4. Yazılımı kullanarak ortalama hız, merkez bölgede geçirilen süre, çevresel bölgede geçirilen süre ve tam test süresi boyunca toplam kat edilen mesafeyi ölçün.
   5. Her denemeden önce ve sonra cihazı temizleyin ve koku gidererek koku işaretlerini çıkarın.

11. Barnes labirentini sahnelemek

1. Cihazı hazırlayın.
   1. Barnes labirent değerlendirmesine sakatlıktan sonraki 30. günde başlayın.
   2. Çapı 1 m olan, 20 eşit aralıklı delik içeren dairesel paslanmaz çelik platform kullanın.
   3. Kaçış kutusunu belirlenmiş bir hedef deliğinin altına yerleştirin, labirentin etrafına görsel ipuçları yerleştirin ve tüm denemeler için hedef deliği konumunu sabit tutun.
2. Eğitim aşamasının yürütülmesi
   1. Eğitim sırasında 90 dB beyaz gürültüyü olumsuz bir uyarık olarak açın.
   2. Fareyi platformun ortasında şeffaf bir silindirin altına 120 saniye koyun.
   3. Silindiri çıkarın ve farenin 180 saniyeye kadar keşfetmesine izin verin.
   4. Dört pati kaçış kutusuna girdiğinde başarılı bir deneme kaydedin.
   5. Hedefi 180 saniye içinde bulamazsa fareyi kaçış kutusuna yönlendirin ve gecikmeyi 180 saniye olarak kaydedin.
   6. Farenin kaçış kutusunda 60 saniye kalmasına izin verin.
   7. Her antrenman gününde 4–5 saat aralıktan sonra antrenman denemesini bir kez tekrarlayın ve ardışık 4 gün boyunca antrenmana devam edin.
3. Dinlenme günü ve test aşamasını yürütmek
   1. Eğitim aşamasından sonra 1 gün eğitimi askıya alın.
   2. Test gününde fareyi platformun ortasına yerleştirin ve 180 saniyeye kadar keşif yapın.
   3. Labirent çapını ölçek kalibrasyonu için 100 cm'ye ayarlayın ve takip alanının video çerçevesinde merkeze yerleştirildiğinden emin olun. Hayvan rengini arka plandan daha koyu ayarlayın. Sadece hayvanın bedenini takip edin; Kafayı veya kuyruğu takip etmeyin. Arka planı manuel olarak yakalayın.
   4. Kaçış kutusuna girerken gecikmeyi, ortalama hızı ve 180 saniyelik test oturumunda yapılan toplam mesafeyi davranışsal takip ve analiz yazılımı kullanarak kaydedin. Analizden önce belirlenen hedef deliğin konumuna göre yazılımda kaçış bölgesini tanımlayın.

12. Veri analizi

1. Veri setini hazırla.
   1. Davranış, görüntüleme ve vücut ağırlığı verilerini istatistiksel ve grafik yazılımında derleyin.
   2. Veriyi ortalama ± ortalama standart hata (SEM) olarak ifade edin.
2. İstatistiksel analiz yapın.
   1. Bu çalışmada, grup, zaman ve etkileşimini sabit etkiler olarak ve hayvanı rastgele etki olarak içeren lineer karışık bir model kullanarak boylamasına vücut ağırlığı ve ışın yürüyüşü verilerini analiz edin; uygulanırsa sonradan çoklu karşılaştırma testleri yapılsın.
   2. TST, FST, OFT ve Barnes labirent sonuçlarını, normal dağılımlı ve homojen varyanslara sahip veriler için sıradan tek yönlü ANOVA kullanarak analiz edin, ardından genel ANOVA anlamlı olduğunda Tukey'nin sonradan yaptığı test uygulanır. Parametrik olmayan veriler için Kruskal-Wallis testini ve ardından Dunn'un sonradan yapılan testini kullanın.
   3. Mevcut olduğunda kesin p.-değerleri, test istatistikleri, serbestlik dereceleri ve bir etki boyutu ölçüsü (tek yönlü ANOVA için^{R 2} ) ile birlikte rapor edin. Yukarıda belirtilen istatistiksel testlerden tüm bildirilen p-değerlerini türetin ve tüm analizleri istatistiksel ve grafik yazılımında gerçekleştirin.
   4. İstatistiksel anlamlılığı s. < 0.05'e ayarlayın.

Sonuçlar

C-TBI farelerinin görüntüleme ve nöropatolojik değerlendirmesi

Hayvanların genel sağlık durumu ve bazal motor fonksiyonu değerlendirilmek için vücut ağırlıkları ve ışın yürüyüşü performansları Şekil 1'de gösterilen zaman çizelgesine göre izlendi. Boylamasına grup farkları, hayvan ile rastgele bir etki olarak lineer karışık etki modeli kullanılarak analiz edildi. Modelleme öncesinde, gruplar arasında vücut ağırlığı...

Tartışma

Bu çalışma, tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarı (rmTBI) fare modeli oluşturmak için tekrarlayan serbest düşen ağırlık bırakma yöntemiyle standart deneysel bir protokolü detaylandırmaktadır. Kafatası açık fareyi stereotaksik bir cihazla sabitleyip 25 cm yükseklikten bırakılan 20 g ağırlığı kullanarak tanımlanmış koordinatlara tekrar eden darbeler uygulanarak beş gün ardından, kronik depresif benzeri davranışla karakterize edilen davranışsal fenotip kafatası kırığı veya yoğun odaklı b...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
5-0 nonabsorbable polypropylene monofilament suture	Jinhuan Medical	I303	yara kapama
Anesthesia machine	RWD Life Science	R550	hayvan modelleri inşası
ANY-maze behavioral tracking software	Stoelting	Version 7	davranış yazılımı
Barnes maze	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XB108	davranış yazılımı
Biorender	BioRender	https://biorender.com	bilimsel araştırma çizim yazılımı
Buprenorphine	Sigma-Aldrich	Y0001108	postoperatif analjezi
Electric shaver	AUX	AUX-C5-1	ameliyat öncesi kıl alma
Forced swimming test	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	davranış yazılımı
GraphPad Prism 9.5	La Jolla	9.5	istatistik yazılımı
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	hayvan modelleri inşası
Mice	Charles river	C57/6N	deneysel hayvan
Open field test	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XZ301	davranış yazılımı
Ophthalmic ointment	BEIJING TWINLUCK PHARMACEUTICAL	H11021342	anestezi sırasında kornea kurumasını önleme
Paraformaldehyde (PFA), 4%	Biosharp	BL539A	perfüzyon ve doku fiksasyonu
Phosphate-buffered saline (PBS)	Biosharp	BL1425A	perfüzyon ve doku yıkama
Povidone-iodine solution, 10%	Beyotime	27883-25g	cerrahi öncesi cilt dezenfeksiyonu
Preclinical Magnetic Resonance Imaging System	United Imaging Life Science Instrument	uMR9.4T	görüntüleme yazılımı
Scalpel blade No. 11	Jinhuan Medical	K3-11	cerrahi sırasında cilt insizyonu
Scalpel handle	Jinhuan Medical	K6-10	No. 11 skalpel bıçağı ile kullanılır
Stereotaxis instrument	RWD Life Science	68025	hayvan modelleri inşası
Sterile gauze	HYNAUT	BK05	kanama kontrolü ve cerrahi temizlik
Tail suspension test	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	davranış yazılımı
Weight-drop impactor	RWD Life Science	68093	hayvan modelleri inşası