Antifibrotik İlaç Taraması için Fare Kollajen Tip I Alfa 1 Promotörü tarafından Yönlendirilen Fibroblast Tabanlı bir Adenoviral Raporlayıcı Sistem

Özet

Bu protokol, fibroblast aktivasyonunun boylamsal izlemesini sağlamak ve antifibrotik bileşiklerin yüksek kapasiteli taramasını kolaylaştırmak amacıyla, fare tip I kolajen promotörü tarafından yönlendirilen fibroblast tabanlı bir adenoviral raporlayıcı sistemin geliştirilmesini açıklamaktadır.

Özet

Anormal fibroblast aktivasyonu ve aşırı hücre dışı matris birikimi ile karakterize edilen kardiyak fibrozis, büyük ölçüde boylamsal, ölçeklenebilir ve yıkıcı olmayan in vitro tarama platformlarının eksikliği nedeniyle hedef spesifik tedavilerden yoksundur. Geleneksel uç nokta analizleri ve kaynak yoğun kök hücre modelleri, doğası gereği fibrotik ilerlemenin gerçek zamanlı izlenmesini engellemektedir. Bu sınırlamaları aşmak için bu protokol, NIH/3T3 fibroblastlarında fare kolajen tip I alfa 1 (Col1a1) promotör güdümlü bir adenoviral mCherry floresan raporlayıcı sistemin (Ad-mCol1a1p-mCherry) oluşturulmasını, optimizasyonunu ve validasyonunu açıklamaktadır. Rekombinant adenovirüs paketlemesi, sitotoksisiteyi minimize etmek için transduksiyon optimizasyonu (enfeksiyon çokluğu) ve sağlam bir transforme edici büyüme faktörü beta (TGF-β)-indüklenmiş fibrozis modelinin kurulmasına yönelik kritik adımlar detaylandırılmıştır. Hücre fiksasyonu ihtiyacını ortadan kaldıran bu sistem, canlı hücrelerde kolajen transkripsiyonunun doğrudan ve boylamsal olarak izlenmesine olanak tanır. Modelin spesifisitesi ve güvenilirliği, TGF‑β tip I reseptör (ALK5) inhibitörü SB431542 kullanılarak farmakolojik olarak valide edilmiş; floresan okumaların, ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ve enzimle bağlantılı immünosorbent analiz ile kantifiye edilen endojen fibrotik markerlar ile korele olduğu görülmüştür. Nihayetinde, bu maliyet etkin platform, yeni antifibrotik ajanların yüksek kapasiteli taraması için erişilebilir bir araç sunarak translasyonel kardiyovasküler araştırmaları hızlandırmaktadır.

Giriş

Kardiyak fibrozis yönetimi önemli klinik zorluklar sunmaktadır. Dinlenmedeki fibroblastların miyofibroblastlara anormal aktivasyonu ve aşırı hücre dışı matris (ECM) birikimi ile karakterize olan bu durum; kalp yetmezliği, miyokard enfarktüsü ve diğer kardiyovasküler hastalıklar tarafından paylaşılan geri dönüşümsüz bir terminal yolunu temsil eder^1,2,3. Ancak, mevcut tedavi stratejileri önemli sınırlamalarla karşı karşıyadır. Diüretikler, β-blokerler ve renin-anjiyotensin-aldosteron sistemi inhibitörleri gibi geleneksel müdahaleler öncelikle sistemik hemodinamik stresi hafifletir ve nörohümoral aktivasyonu azaltır^4,5,6,7. Bu tedaviler, fibroblast aktivasyonunu doğrudan hedeflemede veya devam eden kolajen birikimini durdurmada yetersiz kalmaktadır. Ayrıca, transforme edici büyüme faktörü beta (TGF-β)/Smad yolu, oksidatif stres ve metabolik yeniden programlama gibi sinyal kaskadları bu patolojiyi yönlendirse de, bu bulguların doğrudan etkili antifibrotik tedavilere dönüştürülmesi, sistemik toksisite ve spesifik olmayan iletim mekanizmaları nedeniyle zorlu olmaya devam etmektedir^8,9,10. Bu nedenle, yeni ve hedefe yönelik antifibrotik tedavilere acil ihtiyaç vardır. Önemli bir translasyonel darboğaz, fibroblast aktivasyonunu hassas ve dinamik bir şekilde raporlayabilen fonksiyonel değerlendirme sistemlerinin eksikliğidir. Geleneksel deneysel modeller, verimli farmakolojik taramayı engelleyen önemli sınırlamalar sergilemektedir^11,12. in vivo hayvan modelleri küresel kardiyak yeniden şekillenmeyi yeniden oluştururken, türler arası farklar, uzun deneysel süreçler, yüksek maliyetler ve düşük verimlilik gibi sorunlar yaşamaktadır¹¹.

Bu engelleri aşmak için çeşitli in vitro tarama platformları geliştirilmiştir; ancak kritik metodolojik kusurlar devam etmektedir. Yüksek içerikli immünofloresan analizler, hücrelerin yıkıcı şekilde tespitini ve zahmetli işlemleri gerektirmekte, fibroblast aktivasyonunun gerçek zamanlı kinetiğini yakalamak yerine yalnızca statik bir anlık görüntü sunmaktadır. Benar şekilde, etiketsiz empedans izlemesini kütle spektrometrisi (MS/MS) ile entegre eden platformlar, genel hücresel toksisitenin neden olduğu empedans düşüşlerinin gerçek antifibrotik etkinlik ile kolayca karıştırılabilmesi nedeniyle özgüllük eksikliği ve düşük ölçeklenebilirlik sorunları yaşamaktadır. Ayrıca,le sitoskeletal markerları (örneğin, alfa-düz kas aktini [α-SMA]/ACTA2) takip etmek için indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) kullanan, kümelenmiş düzenli aralıklarla ayrılmış kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) ile mühendisliği yapılmış reporter sistemleri, ciddi translasyonel engeller sunmaktadır¹³. Bu iPSC tabanlı modeller aşırı derecede pahalı, teknik olarak zorlayıcıdır ve rutin yüksek kapasiteli taramalar için büyük ölçüde erişilemez durumdadır. Dahası, α-SMA gibi sitoskeletal markerlara güvenmek, bu markerların ekspresyonu ECM'nin fonksiyonel sekresyonu ve aşırı depozisyonu ile kesin bir korelasyon göstermediğinden, patolojik son noktayı doğru şekilde yansıtmayabilir¹⁴. Bu nedenle, bu sistemler farmakolojik müdahalelere karşı erken evre hücresel yanıtların boylamsal olarak haritalanması için yetersizdir.

Buna karşılık, bu protokol, fibroblast aktivasyonunu izlemek için tahribatsız ve güçlü bir platform oluşturma amacıyla, kollajen tip I alfa 1 (Col1a1) promotörü tarafından yönlendirilen boylamsal bir fonksiyonel raporlayıcı sistemi tanımlamaktadır. Tip I kollajen, kardiyak yeniden şekillenme sırasında birikmiş baskın ECM bileşeni olduğundan, onu kodlayan Col1a1 geninin transkripsiyonel aktivasyonunun yakalanması, fibroblast aktivasyonu için doğrudan ve patolojik olarak ilgili bir okuma sağlar. Bu Col1a1 promotörü tabanlı model, fibrotik süreçlerin moleküler düzeyde sürekli izlenmesine olanak tanıyarak, mekanizma tabanlı ilaç taraması için optimize edilmiş, hassas, boylamsal ve nicelenebilir bir platform sunar.

Protokol

Tüm deneylerin kurumsal ve ulusal kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirildiğini onaylarız. Bu çalışma, münhasıran yerleşik NIH Swiss fare embriyonik fibroblast hücre hattını (NIH/3T3) ve mCol1a1p-mCherry raporlayıcı sistemini kullandığı için ve herhangi bir omurgalı hayvan, embriyo veya insan denek içermediği için, bu makalede açıklanan prosedürler için bir kurumsal inceleme kurulundan etik onay alınması gerekmemiştir.

Rekombinant adenoviral vektörleri içeren tüm prosedürler, kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerine ve standart Biyogüvenlik Düzeyi 2 (BSL-2) uygulamalarına uygun olarak yürütülmüştür. Viral işlemler, transdüksiyon, saklama ve atık imhası, sertifikalı biyolojik güvenlik kabinleri ve uygun kişisel koruyucu donanımlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Adenoviral materyal içeren sıvı atıklar, imha edilmeden önce taze hazırlanmış çamaşır suyu çözeltisi ile dekontamine edilmiş ve kontamine sarf malzemeleri kurumsal biyogüvenlik protokollerine göre otoklavlanmıştır. Kazara meydana gelen dökülmeler, kurumsal dökülme müdahale prosedürleri takip edilerek onaylanmış virüsid ajanlar kullanılarak derhal dezenfekte edilmiştir.

1. Deneysel İş Akışına Genel Bakış

1. Adım 2'de açıklandığı şekilde, fare Col1a1 promotörü tarafından yönlendirilen rekombinant bir adenovirüs üretin.
2. Adım 3'te açıklandığı şekilde, NIH/3T3 fibroblastlarında viral transdüksiyon koşullarını optimize edin.
3. Adım 4'te açıklandığı şekilde, TGF-β'ye yanıt veren bir in vitro fibrozis raporlayıcı model oluşturun.
4. Adım 4'te açıklandığı şekilde, zamana ve doza bağlı TGF-β stimülasyonu kullanarak modelin stabilitesini, özgüllüğünü ve biyolojik tekrarlanabilirliğini doğrulayın.
5. Adım 5'te açıklandığı şekilde, SB431542 kullanarak farmakolojik inhibisyon gerçekleştirin.
6. Adım 5'te açıklandığı şekilde, ardışık enzimle bağlantılı immünosorbent analiz (ELISA) ve kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizlerini gerçekleştirin.
   NOT: Deneysel iş akışının şematik genel görünümü için Şekil 1A'ya bakın. Deneysel cihazlar ve reaktifler için Materyal Tablosu'na bakın.

Şekil 1. Fibroblastlarda mCol1a1p-mCherry adenoviral reporter sisteminin kurulum ve doğrulama iş akışı. (A) Adenoviral (AdV) mCol1a1p-mCherry reporter sisteminin oluşturulmasının şematik özeti ve NIH/3T3 fibroblastlarında model doğrulaması için deneysel iş akışı. İş akışı; promotör klonlama, rekombinant adenovirüs montajı, HEK293 hücrelerinde viral paketleme, enfeksiyon çokluğunun (MOI) optimizasyonu ve ardından yüksek içerikli floresan taramasını içermektedir. (B) 0, 1, 10, 100 ve 1000 MOI değerlerinde Ad-mCol1a1p-mCherry adenovirüsü ile enfekte edilmiş NIH/3T3 fibroblastlarının temsilci floresan görüntüleri. Çekirdekler Hoechst 33342 (mavi) ile boyanmıştır ve mCherry floresansı (kırmızı), Col1a1 promotör aktivitesini göstermektedir. Floresan yoğunluğu, yüksek içerikli görüntüleme kullanılarak nicelendirilmiş ve çekirdek sayılarına göre normalize edilmiştir. Minimal morfolojik değişikliklerle birlikte güçlü ve homojen reporter ekspresyonuna dayanarak, sonraki deneyler için 100 MOI seçilmiştir. Ölçek çubukları = 200 µm. Bu şekil, onaylı lisanslar ile BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

2. mCol1a1 Promotör Adenovirüsünün Oluşturulması, Paketlenmesi ve Amplifikasyonu

1. Rekombinant adenoviral vektörün oluşturulması
   1. 2354 bp'lik fare Col1a1 promotör fragmanını (genomik koordinatlar: chr11:94824779–94827132; transkripsiyon başlangıç bölgesine [TSS] göre −2271 ila +83 bp), pDC315 adenoviral shuttle vektörü içindeki mCherry reporter geninin yukarısına klonlayın.
      NOT: Col1a1 promotörünün tam dizisi ve detaylı pDC315-mCol1a1p-mCherry plazmit haritası Ek Dosya 1 ve Ek Şekil 1'de sunulmuştur.
   2. pDC315 vektörünü BamHI ve KpnI kullanarak lineerleştirin. Promotör insertini 15–25 bp homoloji kolları içeren primerler kullanarak amplifiye edin.
      NOT: in vitro rekombinasyonu kolaylaştırmak için homolog rekombinasyon tabanlı dikişsiz (seamless) klonlama stratejisi kullanın.
   3. Elde edilen plazmiti PCR taraması ve Sanger sekanslama ile doğrulayın.
      NOT: Çerçeve kayması (frameshift) veya erken stop kodonlarının bulunmadığından emin olmak için promotör-reporter bağlantı dizisini dikkatlice inceleyin.
   4. Hücre içi Cre aracılı rekombinasyon yoluyla AdMax sistemini kullanarak rekombinant adenovirüsü üretin.
      NOT: pBHGloxΔE1,3Cre backbone plazmiti, E1/E3 delesyonlarına sahip nonreplikatif bir Ad5 genomu ve shuttle vektör üzerindeki loxP bölgesiyle bölgeye özgü rekombinasyonu kolaylaştıran bir Cre rekombinaz ekspresyon kaseti içerir.
   5. HEK293 hücrelerini, doğrulanmış pDC315-mCol1a1p-mCherry shuttle vektörü ve pBHGloxΔE1,3Cre adenoviral backbone plazmiti ile ko-transfekte edin.
2. Adenovirüs paketleme ve amplifikasyon
   1. HEK293 hücrelerini %10 fetal bovin serum (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Eagle Besiyeri'nde (DMEM) muhafaza edin. Adenoviral paketleme için düşük pasajlı hücreler (<20 pasaj) kullanın.
   2. Transfeksiyon anında %50–60 konfluansa ulaşmak için HEK293 hücrelerini transfeksiyondan 24 saat önce %30–40 konfluansla ekin.
   3. HEK293 hücrelerini, Lipofectamine 2000 transfeksiyon reaktifi kullanarak 5 µg shuttle plazmit ve 5 µg pBHGloxΔE1,3Cre yardımcı plazmit ile ko-transfekte edin.
      NOT: 1:1 oranında bir DNA-reaktif oranı koruyun (toplam 10 µg DNA'ya 10 µL transfeksiyon reaktifi).
   4. Transfekte edilen hücreleri 37°C'de %5 CO₂ ile kültüre edin ve sitopatik etkileri günlük olarak izleyin.
      NOT: İlk CPE'nin ortaya çıkması 7–14 gün sürebilir. Besiyeri asidleşirse (sararırsa), hücreleri rahatsız etmeden nazik bir yarı-besiyeri değişimi gerçekleştirin.
   5. Hücrelerin yuvarlaklaşması ve büzülmesiyle karakterize edilen tipik CPE gözlemlendiğinde ve hücrelerin en az %50'si kültür yüzeyinden ayrıldığında hücreleri ve süpernatantı hasat edin.
      NOT: Bu aşamaya genellikle transfeksiyondan 10–15 gün sonra ulaşılır.
   6. Numuneleri −70°C'de 30 dk dondurup 37°C'lik su banyosunda çözerek üç dondurma-çözme döngüsü gerçekleştirin.
   7. Hücre lizisini kolaylaştırmak için her çözme adımından sonra süspansiyonu 30 s boyunca vorteksleyin.
      NOT: Viral stabiliteyi korumak için çözme sırasında 37°C'de uzun süreli inkübasyondan kaçının.
   8. Tam DMEM kullanarak viral lizatın 10 katlı seri dilüsyonlarını (10⁻¹ ila 10⁻¹³) hazırlayın. Her bir viral dilüsyondan 90 µL'yi, dilüsyondan 10 replika kuyucuk kullanarak 96 kuyucuklu plakalara ekilmiş HEK293 hücrelerine ekleyin.
      NOT: ≥1 × 10⁹ PFU/mL viral titre, sonraki saflaştırma işlemleri için yeterli amplifikasyon son noktası olarak tanımlanmıştır.
   9. Hücresel debrisleri uzaklaştırmak için 10 mL ham viral lizatı 0.45 µm'lik bir filtreden geçirin.
   10. Saflaştırılmış lizatı 37°C'de 30 dk boyunca Benzonase nükleaz (10 U/mL) ile işleyin.
   11. Rekombinant adenovirüsü, üretici talimatlarına göre Adeno-X Virus Purification Kit kullanarak saflaştırın.
       NOT: Lizatı, ön dengelenmiş saflaştırma filtresine yüklemeden önce 1× dilüsyon tamponu ile karıştırın. Filtreyi 1× Yıkama Tamponu ile yıkayın ve saflaştırılmış virüsü 3 mL 1× Elüsyon Tamponu kullanarak elüe edin.
   12. Plakaları 10 gün boyunca inkübe edin ve sitopatik etkileri (CPE) ışık mikroskobu altında değerlendirin. Karakteristik hücre yuvarlaklaşması ve ayrılmasına göre pozitif CPE skorlaması yapın. CPE skorlamasına dayalı olarak Spearman–Karber yöntemini kullanarak enfeksiyöz viral titre'yi hesaplayın.
       NOT: Son viral stokun, sonraki uygulamalar için en az 1 × 10¹¹ PFU/mL titreye ulaştığından emin olun.
   13. Saflaştırılmış adenovirüsü alikotlayın ve viral stoku −80°C'de saklayın.
       NOT: Saflaştırılmış adenoviral alikotları uzun süreli koruma için −80°C'de saklayın. Viral enfektiviteyi korumak için tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçının.

3. Hücre Kültürü ve Viral Enfeksiyon Koşullarının Optimizasyonu

1. NIH/3T3 fibroblastlarını %10 FBS ve %1 gratitude penisilin–streptomisin ile desteklenmiş DMEM/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) içerisinde kültüre edin.
   NOT: Hücre durumunun tutarlılığını sağlamak için, kaynak flaskta %70–80 konfluensa ulaşmış 3 ile 8. pasajlar arasındaki hücreleri kullanın.
2. NIH/3T3 fibroblastlarını, kuyuk başına 4 × 10³ hücre olacak şekilde, 40 µL tam kültür ortamı ile 384 kuyucuklu plakalara ekleyin.
3. Hücrelerin tutunması ve logaritmik büyüme fazına girmesi için hücreleri 37°C'de, %5 CO₂ içeren inkübatörde 12 saat boyunca inkube edin.
   NOT: Düzensiz hücre dağılımını ve kenar etkilerini minimize etmek için, inkübasyondan önce plakaları oda sıcaklığında 20–30 dakika bekletin. En dıştaki kuyucukları steril fosfat tamponlu salin (PBS) veya steril su ile doldurun.
4. Hücreleri, enfekte edilmemiş bir kontrolle birlikte, 1–1.000 arasında değişen enfeksiyon çoklukları (MOI) ile rekombinant adenovirüsle enfekte edin.
   NOT: Gerekli adenoviral hacmi aşağıdaki formülü kullanarak hesaplayın:
   
   
   Burada, V adenoviral stok hacmi (mL), N kuyucuk başına ekilen hücre sayısı (4 × 10³), MOI istenen enfeksiyon çokluğu ve T enfeksiyöz viral titre (PFU/mL)'dir. Bu çalışmada kullanılan viral stok, Adım 2.2.12'de açıklanan Spearman–Karber yöntemiyle belirlendiği üzere 1 × 10¹¹ PFU/mL enfeksiyöz titreye sahipti.
5. Eklenen viral stok hacminin, toplam kuyucuk hacminin %10'unu geçmediğinden emin olun.
   NOT: Aşırı viral stok hacimleri ortam pH'ını değiştirebilir ve spesifik olmayan sitotoksisiteye neden olabilir.
6. Enfeksiyondan 24 saat sonra, virüs içeren ortamı 40 µL taze tam kültür ortamı ile değiştirin.
   NOT: Adım 3.1 ile tutarlı olarak %10 FBS ve %1 penisilin–streptomisin ile desteklenmiş DMEM/F12 kullanın.
7. Besiyeri değişimini, düşük hızlı otomatik bir sıvı taşıyıcı kullanarak veya çok kanallı pipet uçlarını her kuyucuğun üst yan duvarına dikkatlice yaslayarak gerçekleştirin.
   NOT: Hücre kopmasını minimize etmek için 384 kuyucuklu plakalarla çalışırken standart vakum aspirasyonundan kaçının.
8. Optimal MOI'yi, hücre morfolojisini ve nükleer sayısını enfekte edilmemiş kontrol hücreleriyle karşılaştırılabilir düzeyde tutarken, görünür ve homojen mCherry floresansı üreten en düşük viral doz olarak tanımlayın.
   NOT: Reporter ekspresyonunu, Hoechst ile boyanmış nükleer sayımlar ve floresan görüntüleme kullanarak değerlendirin. Hücreler, yuvarlaklaşma veya kopma olmadan karakteristik iğ şeklinde morfolojilerini korumalıdır. Aşırı yüksek MOI değerleri, hücresel stres yanıtları yoluyla bazal mCherry aktivasyonunu tetikleyebilir. Farklı MOI değerlerindeki temsili floresan sonuçları Şekil 1B'de gösterilmiştir.
9. Tüm sonraki deneyler için optimize edilmiş MOI'yi seçin.
   NOT: Bu çalışmada, sonraki deneyler için 100 MOI seçilmiştir.

4. TGF-β Stimülasyonu Kullanılarak Model Stabilitesinin Değerlendirilmesi

1. NIH/3T3 fibroblastlarını, Adım 3.9'da belirlenen 100'lük optimize edilmiş MOI değerinde rekombinant adenovirüs ile enfekte edin.
2. TGF-β stimülasyonundan önce fibroblastları %0,2 FBS içeren DMEM/F12 içerisinde 12 saat boyunca serumdan yoksun bırakın.
   NOT: Hücreleri senkronize etmek ve bazal aktivasyonu en aza indirmek için serum açlığı uygulanmıştır. Col1a1 promotör
3. şu konsantrasyonda rekombinant insan TGF-β stok çözeltisi hazırlayın 100 µg/mL %0,1 sığır serum albümini (BSA) içeren 4 mM HCl kullanılarak.
   NOT: TGF-β stok çözeltisini küçük hacimlerde alikotlayın ve − sıcaklığında saklayın80°C tekrarlayan dondurma-çözme döngülerinden kaçınmak için.
4. Hücreleri, altı bağımsız biyolojik replikatta, 0–40 ng/mL arasında değişen bir TGF-β konsantrasyon gradyanı ile işleme tabi tutun.
   NOT: 0 ng/mL koşulu, uyarılmamış kontrol grubu olarak kullanılmıştır.
5. Stimüle edilen hücreleri şu koşullarda inkübe edin: 37°C %5 CO₂ ile 24, 48 veya 72 saat boyunca inkübe edin. Kümülatif fototoksisiteyi en aza indirmek için her görüntüleme zaman noktası için ayrı paralel plakalar kullanın.
6. Hücreleri, nihai çalışma konsantrasyonu ... olan Hoechst 33342 çözeltisi ile boyayın 2.5 µg/mL görüntüleme öncesinde 15 dakika boyunca.
   NOT: Boyama solüsyonunu, 10 mg/mL Hoechst 33342 stok solüsyonunu steril PBS içerisinde 1:4.000 oranında seyrelterek hazırlayın. Fotobeyazlamayı en aza indirmek için boyama işlemini ışık korumalı koşullar altında gerçekleştirin.
7. 10× kuru objektif lensle donatılmış yüksek içerikli bir görüntüleme sistemi kullanarak floresan görüntülerini edinin.
8. Her bir deneysel koşul için 384 kuyuklu plak formatındaki her kuyukta, birbirinin üzerine binmeyen beş alan görüntüleyin.
   NOT: Karşılaştırılabilirliği sağlamak için tüm deneysel gruplarda aynı görüntüleme ayarlarını koruyun. Otomatik lazer tabanlı otofokus kullanın ve çevresel kontrol koşullarını şu değerlerde tutun: 37°C canlı hücre görüntüleme sırasında %5 CO₂ ile.
9. Edinme mCherry 561 nm eksitasyon, 600/52 Bandpass (BP600/52) emisyon filtresi ve 200 ms pozlama süresi kullanılarak floresan görüntüler.
10. 405 nm eksitasyon, BP445/45 emisyon filtresi ve 30 ms pozlama süresi kullanarak Hoechst floresan görüntülerini elde edin.
    NOT: Lineer floresans deteksiyonunu korumak ve uzamsal çözünürlüğü maksimize etmek için kamera kazancını 1,0'a ayarlayın ve tüm görüntüleri 1 × 1 binning kullanarak tam kamera çözünürlüğünde edinin.
11. Elde edilen görüntüleri CellPathfinder görüntü analiz yazılımını kullanarak analiz edin.
12. Referans nükleer çapını kullanarak Hoechst kanalındaki çekirdekleri birincil nesneler olarak tanımlayın 20 µm ve 20– arasındalık bir alan aralığı400 µm².
13. ... içindeki sitoplazmik ilgi bölgelerini (ROI'leri) tanımlayın mCherry referans hücre çapı kullanılarak nükleer sınırdan genişletilen kanal ile 60 µm.
    NOT: Görüntü kenarlarına temas eden kısmi hücreleri çıkarmak için segmentasyon sırasında bir “Exclude Edge” (Kenarları Hariç Tut) filtresi uygulayın.
14. Tanımlanan her bir hücre için ortalama floresan yoğunluğunu hesaplayın ve yakalanan beş alanın tamamından kuyuk başına düşen ortalama floresan yoğunluğunu belirleyin.

5. ELISA ve Kantitatif Real-Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanılarak Model Güvenilirliğinin Doğrulanması

1. Adım 3.9'da açıklandığı gibi, NIH/3T3 fibroblastlarını 100'lük optimize edilmiş MOI ile rekombinant adenovirüs ile enfekte edin.
2. TGF-β stimülasyonundan önce hücreleri 30–60 dk boyunca SB431542 ile ön işlemden geçirin.
   NOT: Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 20 mM SB431542 stok çözeltisi hazırlayın ve alikotları −20°C'de saklayın.
3. Hücreleri 10 ng/mL TGF-β ve 1, 5, 10 ve 15 µM final konsantrasyonlarında SB431542 ile işleme tabi tutun. SB431542 işlemi uygulanmayan, %0,1 (v/v) DMSO içeren bir taşıyıcı kontrol grubu ekleyin.
   NOT: Tüm işlem gruplarında final DMSO konsantrasyonunu %0,1 (v/v) düzeyinde tutun.
4. İki aşamalı dilüsyon yöntemini kullanarak TGF-β çalışma çözeltisini hazırlayın.
   NOT: 10 ng/mL final çalışma konsantrasyonuna ulaşmak için, %0,1 BSA içeren 4 mM HCl içinde hazırlanan 100 µg/mL TGF-β stok çözeltisini, komple kültür ortamına daha fazla dilüsyondan önce steril PBS içinde 1:100 oranında dilüye edin.
5. İşlem görmüş hücreleri 6 kuyucuklu plaklarda 24 sa boyunca 37°C'de ve %5 CO₂ altında inkübe edin.
6. ELISA analizi için her kuyucuktan 2 mL kültür süpernatanı toplayın.
7. Hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için toplanan süpernatanları 4°C'de 5 dk boyunca 1.000 × g'de santrifüj edin.
8. Berraklaştırılmış süpernatanları alikotlara ayırın ve ELISA analizine kadar −80°C'de saklayın.
   NOT: Berraklaştırılmış süpernatanlar, ELISA analizinden önce −80°C'de saklanabilir.
9. Süpernatan uzaklaştırıldıktan sonra adherent hücreleri buz gibi soğuk PBS ile nazikçe yıkayın.
10. Hücreleri liz etmek için her kuyucuğa doğrudan 1 mL TRIzol reaktifi ekleyin.
    NOT: Örnekleri mikrosantrifüj tüplerine aktarmadan önce tam homojenizasyon sağlamak için lizatı birkaç kez pipetleyin. RNA lizatları, RNA ekstraksiyonundan önce −80°C'de saklanabilir.
11. Ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) analizi için lizatlardan toplam RNA ekstrakte edin.
12. 1 µg toplam RNA kullanarak ters transkripsiyon gerçekleştirin.
    NOT: Ters transkripsiyonu şu reaksiyon koşullarını kullanarak yürütün: 10 dk boyunca 25°C, 15 dk boyunca 42°C ve 2 dk boyunca 85°C.
13. PerfectStart Green qPCR SuperMix kullanarak kantitatif PCR gerçekleştirin. Her reaksiyonu, 5 µL komplemanter DNA (cDNA) kalıbı içeren 20 µL final hacminde hazırlayın.
14. qPCR reaksiyonlarını şu döngü koşullarını kullanarak çalıştırın: 30 sn boyunca 94°C'de başlangıç denatürasyonu, ardından 40 döngü boyunca 5 sn 94°C, 15 sn 60°C ve 10 sn 72°C.
    NOT: Ürün özgüllüğünü onaylamak için amplifikasyondan sonra erime eğrisi analizi gerçekleştirin.
15. İç kontrol olarak Col1a1 gen ekspresyonunu 18S rRNA'ya göre normalize edin.
    NOT: Tüm primer dizileri Ek Tablo 1'de verilmiştir.
16. Sekrete edilen Kolajen I protein seviyelerini, üretici talimatlarına göre ELISA kullanarak berraklaştırılmış süpernatanlarda nicelikle. Fare tip I kolajen ELISA testi için standart eğri aralığı 0,78–50 ng/mL olup, test tespit hassasiyeti 0,37 ng/mL'dir.
17. Tüm standartları ve örnekleri teknik düplikatlarda analiz edin ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak 450 nm'de optik yoğunluğu (OD) ölçün.
    NOT: Sekrete edilen Col1a1 tespiti için test hassasiyetini maksimize etmek amacıyla seyreltilmemiş berraklaştırılmış süpernatanlar kullanın.

Sonuçlar

mCol1a1p-mCherry rekombinant adenovirüsün oluşturulması ve paketlenmesinin şematik bir genel görünümü Şekil 1A'da gösterilmiştir. Fare Col1a1 promotörü, mCherry reporter geninin yukarı akışına klonlanmış ve bir adenoviral vektöre dahil edilmiş, ardından HEK293 hücrelerinde viral paketleme ve amplifikasyon gerçekleştirilmiştir. İş akışı; viral enfeksiyon, fibrotik stimülasyon, farmakolojik müdahale ve floresan tabanlı sinyal okuma dahil olmak üzere temel deneysel adımları göstermektedir. Bu şema, reporter sisteminin uygulanması için görsel bir çerçeve sunmakta ve sonraki fonksiyonel doğrulama deneylerinin yorumlanmasını desteklemektedir.

Optimal viral enfeksiyon koşullarını belirlemek için, NIH/3T3 fibroblastları çeşitli MOI değerlerinde mCol1a1p-mCherry adenovirüsü ile enfekte edilmiştir. Şekil 1B'de gösterildiği gibi, mCherry floresan yoğunluğu MOI arttıkça artmıştır. Düşük MOI değerlerinde, reporter ekspresyonu zayıf ve heterojen olup nicel analiz için suboptimal bir durumu temsil etmiştir. Yüksek MOI değerlerinde hücreler, yuvarlaklaşma ve kopma dahil olmak üzere değişmiş bir morfoloji sergilemiş ve bu da sitotoksik etkileri göstermiştir. 100'lük bir MOI, hücre morfolojisi korunmuş bir şekilde güçlü ve homojen floresan üretmiş ve bu nedenle sonraki deneyler için optimal koşul olarak seçilmiştir.

Optimize edilmiş MOI değerinde, NIH/3T3 fibroblastları artan konsantrasyonlarda TGF-β ile stimüle edilmiştir. Reporter floresansı, stimülasyonu takiben 24, 48 ve 72. saatlerde ölçülmüştür. Şekil 2A–C'de gösterildiği üzere, tüm zaman noktalarında mCherry floresans yoğunluğu konsantrasyona bağlı olarak artış göstermiştir. Sinyal yoğunluğu 24–72 saat arasında kademeli olarak artarak zamana bağlı bir yanıt sergilemiştir. Bu sonuçlar, reporter sisteminin fibrotik stimülasyona boylamsal ve tekrarlanabilir şekilde yanıt verdiğini belirten pozitif bir sonucu temsil etmektedir.

Şekil 2. Transforming büyüme faktörü beta (TGF-β) stimülasyonu ile mCol1a1p-mCherry reporter aktivasyonunun zamana ve doza bağlı değişimi. Optimize edilmiş MOI ile Ad-mCol1a1p-mCherry adenovirüsü enfekte edilen NIH/3T3 fibroblastları, artan TGF-β konsantrasyonları ile stimüle edilmiştir. Stimülasyon sonrası 24. saat (A), 48. saat (B) ve 72. saatteki (C) temsili floresan görüntüler ve bunlara karşılık gelen mCherry reporter aktivitesinin kantitatif analizleri gösterilmektedir. mCherry floresansı (kırmızı), Col1a1 promoter aktivitesini yansıtmaktadır ve çekirdekler Hoechst 33342 (mavi) ile karşıt boyanmıştır. Floresan yoğunluğu, yüksek içerikli görüntüleme kullanılarak kantifiye edilmiş ve çekirdek sayılarına normalize edilmiştir. Veriler, her koşul için altı bağımsız biyolojik tekrardan elde edilen ortalama ± ortalamanın standart hatası (SEM) olarak sunulmuştur. İstatistiksel karşılaştırmalar, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi kullanılarak işlem görmemiş kontrol grubuna göre yapılmıştır. Görüntüleme parametreleri tüm deneysel koşullarda sabit tutulmuştur. Ölçek çubukları = 200 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yolak özgüllüğünü değerlendirmek için NIH/3T3 fibroblastları, TGF-β stimülasyonu altında TGF-β tip I reseptör (ALK5) inhibitörü olan SB431542 ile işleme tabi tutuldu. Şekil 3A–C'de gösterildiği gibi, SB431542 mCherry floresan yoğunluğunu doz bağımlı bir şekilde azaltmıştır. Reporter aktivitesindeki inhibisyon, incelenen tüm zaman noktalarında gözlemlenmiş ve daha yüksek inhibitör konsantrasyonlarında daha fazla baskılanma meydana gelmiştir. Bu sonuçlar, reporter aktivasyonunun TGF-β sinyalleriyle ilişkili olduğunu ve farmakolojik olarak modüle edilebileceğini gösteren pozitif bir sonucu temsil etmektedir.

Şekil 3. SB431542, TGF-β ile indüklenen mCol1a1p-mCherry reporter aktivasyonunu zaman ve doz bağımlı olarak inhibe eder. Ad-mCol1a1p-mCherry adenovirüsü ile enfekte edilen NIH/3T3 fibroblastları, transforme eden büyüme faktörü beta tip I reseptör (ALK5) inhibitörü SB431542'nin artan konsantrasyonları (0, 1, 5, 10 ve 15 µM; şekil panellerinde SB43 olarak kısaltılmıştır) varlığında TGF-β (10 ng/mL) ile stimüle edilmiştir. İşlem sonrası 24. saat (A), 48. saat (B) ve 72. saatte (C) elde edilen temsili floresans görüntüleri ve ilgili kantitatif analizler gösterilmiştir. mCherry floresansı (kırmızı), Col1a1 promotör aktivitesini yansıtmaktadır ve çekirdekler Hoechst 33342 (mavi) ile karşıt boyanmıştır. Floresans yoğunluğu, yüksek içerikli görüntüleme kullanılarak kantifiye edilmiş ve çekirdek sayılarına normalize edilmiştir. Veriler, her koşul için altı bağımsız biyolojik tekrardan elde edilen ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. İstatistiksel karşılaştırmalar, tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi kullanılarak TGF-β ile işlem görmüş gruba göre gerçekleştirilmiştir. Görüntüleme parametreleri tüm deneysel koşullarda sabit tutulmuştur. Ölçek çubukları = 200 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Reporter aktivitesinin endojen fibrotik yanıtları yansıtıp yansıtmadığını değerlendirmek için NIH/3T3 fibroblastları optimize edilmiş enfeksiyon, stimülasyon ve inhibisyon koşulları altında analiz edildi. Reporter-sistem validasyonu için kullanılan deneysel iş akışı Şekil 4A'da özetlenmiştir. Fibrozis ile ilişkili markörler protein ve mRNA düzeylerinde ölçülmüştür. Şekil 4B–C'de gösterildiği gibi, ELISA, TGF-β stimülasyonu sonrası fibrozis ile ilişkili proteinlerin sekresyonunda artış olduğunu ve bu artışın SB431542 tedavisi ile azaldığını göstermiştir. Tutarlı bir şekilde, RT-qPCR, Col1a1 dahil olmak üzere fibrozis ile ilişkili genlerin ekspresyonunda karşılık gelen değişiklikler saptamıştır. Floresan okuması, protein sekresyonu ve gen ekspresyonu arasındaki uyum, reporter sisteminin bu koşullar altında fibrotik aktivasyonu yansıttığını gösteren pozitif bir validasyon sonucunu temsil etmektedir.

Şekil 4. mCol1a1p-mCherry raporlayıcı sistemin ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ve enzimle bağlantılı immunosorbent analiz (ELISA) ile doğrulanması. (A) Raporlayıcı sistem doğrulaması için deneysel iş akışının şematik genel görünümü. NIH/3T3 fibroblastları TGF-β (10 ng/mL) ile stimüle edilmiş ve artan konsantrasyonlarda TGF-β reseptör inhibitörü SB431542 (SB43) ile işleme tabi tutulmuştur. Hücre lizatları ve kültür süpernatanları sonraki analizler için toplanmıştır. (B) SB431542 konsantrasyon gradyanı boyunca TGF-β stimülasyonu altında RT-qPCR ile belirlenen Col1a1 haberci RNA (mRNA) ekspresyonunun kantitatif analizi. Göreceli Col1a1 mRNA ekspresyon seviyeleri 18S ribozomal RNA'ya (18S rRNA) normalize edilmiş ve işlenmemiş kontrol grubuna göre kat değişim (fold change) olarak ifade edilmiştir. (C) Panel B'deki ile aynı deneysel koşullar altında, hücre kültürü süpernatanlarındaki salgılanmış tip I kolajen seviyelerinin ELISA kullanılarak kantifikasyonu. Tip I kolajen konsantrasyonları ng/mL olarak ifade edilmiştir. Veriler, her koşul için altı bağımsız biyolojik tekrardan elde edilen ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. İstatistiksel karşılaştırmalar, tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi kullanılarak TGF-β ile işlenmiş gruba göre yapılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1. Adenoviral reporter vektörünün konstrüksiyonu için kullanılan fare Col1a1 promoter fragmanının tam nükleotid dizisi. 2354 bp'lik promoter bölgesi, chr11:94824779–94827132 (NC_000077.7) genomik koordinatlarına karşılık gelmekte olup TSS'ye göre −2271 ile +83 bp arasını kapsamaktadır. Rekombinant adenoviral reporter sisteminin oluşturulması için promoter fragmanı, pDC315 shuttle vektöründeki mCherry reporter geninin upstream bölgesine klonlanmıştır.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S1. RT-qPCR analizi için kullanılan primer dizileri. Col1a1 ve internal referans gen 18S rRNA için ileri (forward) ve geri (reverse) primer dizileri 5′–3′ yöneliminde listelenmiştir.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1. pDC315-mCol1a1p-mCherry adenoviral taşıyıcı vektörün plazmit haritası. Rekombinant adenoviral rapor konstrüktunun oluşturulması için, 2354 bp'lik fare Col1a1 promotör fragmanı, homolog rekombinasyon tabanlı dikişsiz bir klonlama stratejisi kullanılarak mCherry rapor geninin yukarı akımına yerleştirilmiştir.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Tartışma

Kardiyak fibrozis, kalp yetmezliğinin ilerlemesine katkıda bulunur ve etkili antifibrotik tedavilerin geliştirilmesi, boylamsal tarama platformlarının eksikliği nedeniyle sınırlıdır^2,13. Western blotting, RT-qPCR ve immünofloresan boyama dahil olmak üzere antifibrotik etkinliği değerlendirmek için kullanılan geleneksel yöntemler, hücre lizisi veya fiksasyon gerektiren uç nokta ölçümlerine dayanmaktadır. Bu yaklaşımlar, canlı hücrelerde fibrotik ilerlemenin gerçek zamanlı izlenmesini engellemekte ve boylamsal ile yüksek kapasiteli analizler için uygulanabilirliklerini kısıtlamaktadır. Ek olarak, plazmid transfeksiyonu veya lentiviral entegrasyon yoluyla stabil raporcu hücre hatlarının oluşturulması; fibroblastlardaki düşük transfeksiyon verimliliği, rastgele genomik entegrasyonla ilişkili değişkenlik ve sürekli pasajlar boyunca raporcu ekspresyonunun aşamalı olarak susturulması nedeniyle sıklıkla kısıtlanmaktadır¹⁵.

Lentiviral vektörler NIH/3T3 fibroblastlarında gen iletimi için sıklıkla kullanılsa da, çalışmamızda fibroblastların fizyolojik sadakatini korumak için özellikle bir adenoviral raporlayıcı sistem kullanılmıştır. Lentivirüsler, konak genomuna kalıcı olarak entegre olur ve endojen sinyal ağlarını istemeden bozabilecek yerleşimsel mutajenez riskini beraberinde getirirler; bu durum, TGF-β kaynaklı fibrogenez gibi karmaşık kaskadların değerlendirilmesinde kritik bir endişe kaynağıdır. Buna karşın, adenoviral vektörler episomal kalır ve böylece genomik bütünlüğü sağlar. Ayrıca, stabil lentiviral hücre hatları için gereken uzun süreli antibiyotik seleksiyonunun atlanması, terapi kaynaklı fenotipik kaymaları önleyerek yüksek kapasiteli taramaya uygun, hızlı, güçlü ve oldukça verimli geçici ekspresyona olanak tanır.

Bu teknik sınırlamaları gidermek için, mCol1a1 promotörü ile güdümlenen mCherry adenoviral reporter sistemi, fibroblast aktivasyonunun in vitro izlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Sistem, adenoviral iletimi, fibroblast aktivasyonu ve ECM birikimi ile ilişkili bir transkripsiyonel marker olan fare Col1a1 promotörü ile birleştirir¹⁶. Col1a1 promotör aktivitesinin floresan bir reporter'a bağlanması, canlı hücrelerde fibrotik transkripsiyonel yanıtların görselleştirilmesini ve kantifikasyonunu sağlar. Reporter floresansı, farklı zaman noktalarında TGF-β stimülasyonunu takiben artarak fibroblast aktivasyonunun boylamsal ilerlemesini yansıtır. ALK5 inhibitörü SB431542 ile reporter aktivitesinin inhibe edilmesi, yolak bağımlı düzenlemeye işaret eder. RT-qPCR ve ELISA ile ölçüldüğü üzere, reporter floresansı ile endojen fibrozis ilişkili gen ve protein ekspresyonu arasındaki uyum, bu yöntemin söz konusu koşullar altında fibrotik yanıtların izlenmesi için kullanımını desteklemektedir.

Güncel çalışmalar, ilaç taraması ve hedef belirleme amacıyla CRISPR-Cas9 tabanlı genetik pertürbasyonla kombine edilmiş iPSC kaynaklı kardiyak hücreleri kullanmıştır^11,13. Örneğin, CRISPR ile mühendisliği yapılmış floresan raporlu iPSC kaynaklı kardiyak fibroblastlar, geniş ölçekli bileşik tarama yaklaşımlarında uygulanmıştır^11,17. Bu yöntemler yüksek genetik hassasiyet sağlasa da uzun diferansiyasyon süreleri, teknik karmaşıklık, partiler arası değişkenlik ve artan deneysel maliyetlerle ilişkilidir^13,18. Buna karşılık, burada açıklanan adenoviral rapor platformu, genom düzenleme veya uzun süreli hücre diferansiyasyonu gerektirmeden daha hızlı uygulamaya imkan tanır. Bu yaklaşımlar birbirini tamamlayıcı şekilde kullanılabilir; mCol1a1p-mCherry rapor sistemi başlangıç tarama aracı olarak, iPSC tabanlı modeller ise sonraki validasyon aşamaları için uygulanabilir¹¹.

Burada açıklanan mCol1a1p-mCherry reporter sistemi, metabolik modülatörler ve doğal ürünler dahil olmak üzere aday bileşiklerin fibroblast tabanlı bir modelde taranması için bir yöntem sunmaktadır. Bu protokolün tekrarlanabilirliğini sağlamak için birkaç kritik adım ve sorun giderme hususuna dikkat edilmesi gerekmektedir. İlk olarak, adenoviral preparasyonun saflığı esastır. Saflaştırılmamış viral lizatların kullanımı, konak hücre kalıntılarını ve sitotoksik bileşenleri sisteme dahil ederek NIH/3T3 fibroblastlarında spesifik olmayan etkilere yol açabilir ve reporter okumasını yanıltabilir. Ayrıca, sonraki tarama uygulamaları için katı bir tekrarlanabilirlik ve partiler arası tutarlılık sağlamak amacıyla, her viral preparasyon standart bir saflaştırma işlemine tabi tutulmuş ve bir uç nokta dilüsyon analizi ile kesin olarak nicelendirilmiştir. Volumetrik miktarlar yerine fonksiyonel viral titrelere (PFU/mL) dayalı olarak hassas bir şekilde tanımlanmış bir enfeksiyon çokluğu (MOI) uygulanarak, partiler arası varyasyonlar başarıyla nötralize edilmiş ve böylece tüm bağımsız deneysel çalışmalar boyunca reporter yanıtı standart hale getirilmiştir. İkinci olarak, bu MOI'nin optimizasyonu sırasında, viral inokülüm hacminin toplam kültür hacminin %10'unu aşmadığından emin olmak önemlidir. Aşırı miktardaki viral tampon, kültür ortamının pH ve osmolaritesini değiştirerek TGF-β stimülasyonundan bağımsız olarak hücresel stres yanıtlarını tetikleyebilir.

Ayrıca, yüksek içerikli görüntüleme için 384 kuyucuklu plakaların kullanımı teknik zorluklar teşkil eder. NIH/3T3 fibroblastları, besiyeri değişimi ve yıkama basamakları sırasında yerinden kopmaya meyillidir. Düşük dağıtım hızına sahip otomatik sıvı aktarma sistemlerinin kullanılması veya pipet uçlarının kuyucuk yan duvarlarına eğik tutulması gibi nazik sıvı işlemleri, hücre kaybını azaltabilir. Col1a1 promoterinin bazal aktivasyonunu minimize etmek ve sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için, TGF-β stimülasyonundan önce 12–24 h boyunca serum açlığı uygulanabilir. Birden fazla zaman noktasında (örneğin 24, 48 ve 72 h) gerçekleştirilen ardışık canlı hücre görüntüleme sırasında, tekrarlanan Hoechst boyamasından kaynaklanan kümülatif fototoksisite ve DNA-bağlanma etkileri, pozlama koşulları optimize edilerek veya her zaman noktası için paralel deneysel plakalar kullanılarak minimize edilmelidir¹⁹.

Bu yöntemin bazı kısıtlamaları göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, sistem ölümsüzleştirilmiş bir fibroblast hücre hattına dayanmaktadır ve kardiyak fibroblastların in vivo hücresel heterojenliğini tam olarak temsil etmez. İkinci olarak, reporter Col1a1 transkripsiyonel aktivasyonunu yansıtır; transkripsiyon sonrası düzenlemeyi veya ekstrasellüler matriks olgunlaşmasını kapsamaz. Gelecekteki uyarlamalar, fizyolojik uygunluğu artırmak için primer kardiyak fibroblastların, ko-kültür sistemlerinin veya üç boyutlu modellerin kullanımını içerebilir. Özetle, bu protokol, fibroblast aktivasyonunu izlemek için Col1a1 promotör tarafından yönlendirilen adenoviral bir reporter sistemini tanımlamaktadır. Yöntem, canlı hücrelerde boylamsal ve yıkıcı olmayan analizlere olanak sağlamak için viral iletimi, farmakolojik modülasyonu ve tamamlayıcı moleküler analizleri entegre eder. Bu yaklaşım, kontrollü in vitro koşullar altında bileşik taramalarına ve fibrotik sinyal süreçlerinin incelenmesine uygulanabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
384 Kuyucuklu Cam Tabanlı Mikroplaka	Cellvis, USA	P384-1.5H-N	Hücre ekimi, viral enfeksiyon, boyama ve floresan görüntüleme için kullanılan 384 kuyucuklu cam tabanlı plaka.
Adenoviral Backbone Plazmidi	Microbix, Canada	pBHGloxΔE1,3Cre	Tam uzunluktaki rekombinant adenoviral genomu oluşturmak için kullanılan plazmid.
Adenoviral Shuttle Vektörü: pDC315-mCol1a1p-mCherry	GeneChem, China	Custom service	mCherry ekspresyonunu yönlendiren 2354 bp fare Col1a1 promoterini içeren rekombinant adenoviral shuttle vektörü.
Benzonaz Nukleaz	Merck Millipore, USA	70664-3	Adenoviral purifikasyon sırasında kontamine nükleik asitleri uzaklaştırmak için kullanılan endonukleaz.
Biyolojik Güvenlik Kabini (Sınıf II)	Esco Lifesciences Group, Singapore	AC2-4S1	Rekombinant adenoviral işlemler ve steril hücre kültürü prosedürleri için kullanılan sertifikalı biyogüvenlik kabini.
Hücre Kültür Besiyeri (Complete DMEM/F12)	HyClone, USA	12800-017	NIH/3T3 ve HEK293 hücrelerinin idamesi için kullanılan komple kültür besiyeri.
CellPathfinder Görüntü Analiz Yazılımı	Yokogawa Electric Corporation, Japan	Version 3.08.01	Otomatik floresan kantifikasyonu ve hücre segmentasyonu için kullanılan görüntü analiz yazılımı.
CellVoyager CV8000 Yüksek İçerikli Tarama Sistemi	Yokogawa Electric Corporation, Japan	CV8000	mCherry ve Hoechst floresan kazanımı için kullanılan yüksek içerikli görüntüleme sistemi.
CO2 Hücre Kültürü İnkübatörü	Thermo Fisher Scientific, USA	3111	Memeli hücre kültürü için %5 CO2 içeren ve 37 °C'de tutulan nemlendirilmiş inkübatör.
Dimetil Sülfoksit (DMSO)	Sigma-Aldrich, USA	D2650	SB431542 hazırlama için kullanılan çözücü.
Dulbecco’s Modifiye Eagle Besiyeri/Besin Karışımı F-12 (DMEM/F-12)	Servicebio, China	G4610	NIH/3T3 fibroblastları için kullanılan bazal kültür besiyeri.
Fetal Bovin Serum (FBS)	Ausbian, Australia	VS500T	Komple kültür besiyeri hazırlama için %10 (v/v) oranında kullanılan serum takviyesi.
Hoechst 33342 Floresan Boyası	Invitrogen, USA	H3570	Floresan görüntüleme ve nükleer sayım normalizasyonu için kullanılan nükleer boya.
HEK293 Hücreleri	ATCC, USA	CRL-1573	Adenoviral üretim ve amplifikasyon için kullanılan paketleme hücre hattı.
İnsan Rekombinant TGF-β1	MedChemExpress, China	HY-P78214	NIH/3T3 fibroblastlarında fibrotik aktivasyonu indüklemek için kullanılan sitokin.
Görüntü Kazanım Yazılımı	Yokogawa Electric Corporation, Japan	Version 3.08.01.03	Otomatik floresan görüntü kazanımı ve mikroskop kontrolü için kullanılan yazılım.
Lipid Bazlı Transfeksiyon Reajeni	Invitrogen, USA	11668-019	Adenoviral plazmidin HEK293 hücrelerine aktarımı için kullanılan transfeksiyon reajeni.
Mikrosantrifüj Tüpleri	Axygen, USA	MCT-150-C	RNA lizat depolama ve numune işleme için kullanılan tüpler.
Mikroplaka Okuyucu	Tecan, Switzerland	Spark	ELISA absorbans ölçümleri için kullanılan çok modlu mikroplaka okuyucu.
Fare Tip I Kolajen ELISA Kiti	Meike Biotechnology, China	MK6778A	Kültür süpernatantlarındaki salgılanmış tip I kolajeni kantifiye etmek için kullanılan ELISA kiti.
NIH/3T3 Fare Fibroblastları	Procell Life Science, China	CL-0171	Reporter model kurulumu ve validasyonu için kullanılan fare fibroblast hücre hattı.
PacI Restriksiyon Enzimi	New England Biolabs, USA	R0547S	Adenoviral plazmid lineerizasyonu için kullanılan restriksiyon enzimi.
Penisilin–Streptomisin Solüsyonu	Gibco, USA	15140-122	Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için %1 (v/v) oranında eklenen antibiyotik solüsyonu.
PerfectStart Green qPCR SuperMix	TransGen Biotech, China	AQ602	Kantitatif PCR analizi için kullanılan SYBR Green bazlı qPCR master mix.
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)	Servicebio, China	G4202	Hücrelerin yıkanması ve reajen hazırlama için kullanılan tampon.
pDC315-EGFP Shuttle Vektörü	GeneChem, China	N/A	Reporter plazmid konstrüksiyonu için kullanılan ana adenoviral shuttle vektörü.
qPCR Sistemi	Applied Biosystems, USA	QuantStudio 5	Kantitatif gen ekspresyon analizi için kullanılan real-time PCR sistemi.
Restriksiyon Enzimleri (BamHI ve KpnI)	Abclonal, China	RK21101, RK21104	Shuttle-vektör lineerizasyonu için kullanılan restriksiyon enzimleri.
Reverse Transkripsiyon Kiti	TransGen Biotech, China	AT311	RT-qPCR öncesi cDNA sentezi için kullanılan reverse-transkripsiyon kiti.
RNA Lizis Reajeni	Invitrogen, USA	15596026	Kültürlenmiş hücrelerden toplam RNA ekstraksiyonu için kullanılan reajen.
SB431542	MedChemExpress, China	301836-41-9	Farmakolojik inhibisyon deneyleri için kullanılan TGF-β tip I reseptör inhibitörü.
Sanger Sekanslama Hizmeti/Reajenleri	Shanghai Boshang Biotechnology Co., Ltd., China	Custom Service	Plazmid sekans doğrulaması için kullanılan sekanslama hizmeti/reajenleri.
Serolojik Pipetler	Corning, USA	4488	Hücre kültürü prosedürleri sırasında sıvı transferi için kullanılan steril pipetler.
T30 Termal Döngüleyici	LongGene Scientific Instruments, China	T30	Reverse transkripsiyon ve PCR amplifikasyonu için kullanılan termal döngüleyici.
Trypsin-EDTA Solüsyonu	Gibco, USA	25200-056	Rutin hücre pasajlama için kullanılan hücre disosiyasyon reajeni.
Viral Purifikasyon Kiti	Takara Bio USA	631533	Rekombinant adenovirüs purifikasyonu için kullanılan kit.
Su Banyosu	Shanghai Yiheng Scientific Instruments,China	HWS-12	Adenoviral dondurma–çözme döngüleri sırasında kullanılan sıcaklık kontrollü su banyosu.