Bu protokol, fibroblast aktivasyonunun boylamsal izlemesini sağlamak ve antifibrotik bileşiklerin yüksek kapasiteli taramasını kolaylaştırmak amacıyla, fare tip I kolajen promotörü tarafından yönlendirilen fibroblast tabanlı bir adenoviral raporlayıcı sistemin geliştirilmesini açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Antifibrotik İlaç Taraması için Fare Kollajen Tip I Alfa 1 Promotörü tarafından Yönlendirilen Fibroblast Tabanlı bir Adenoviral Raporlayıcı Sistem
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Anormal fibroblast aktivasyonu ve aşırı hücre dışı matris birikimi ile karakterize edilen kardiyak fibrozis, büyük ölçüde boylamsal, ölçeklenebilir ve yıkıcı olmayan in vitro tarama platformlarının eksikliği nedeniyle hedef spesifik tedavilerden yoksundur. Geleneksel uç nokta analizleri ve kaynak yoğun kök hücre modelleri, doğası gereği fibrotik ilerlemenin gerçek zamanlı izlenmesini engellemektedir. Bu sınırlamaları aşmak için bu protokol, NIH/3T3 fibroblastlarında fare kolajen tip I alfa 1 (Col1a1) promotör güdümlü bir adenoviral mCherry floresan raporlayıcı sistemin (Ad-mCol1a1p-mCherry) oluşturulmasını, optimizasyonunu ve validasyonunu açıklamaktadır. Rekombinant adenovirüs paketlemesi, sitotoksisiteyi minimize etmek için transduksiyon optimizasyonu (enfeksiyon çokluğu) ve sağlam bir transforme edici büyüme faktörü beta (TGF-β)-indüklenmiş fibrozis modelinin kurulmasına yönelik kritik adımlar detaylandırılmıştır. Hücre fiksasyonu ihtiyacını ortadan kaldıran bu sistem, canlı hücrelerde kolajen transkripsiyonunun doğrudan ve boylamsal olarak izlenmesine olanak tanır. Modelin spesifisitesi ve güvenilirliği, TGF‑β tip I reseptör (ALK5) inhibitörü SB431542 kullanılarak farmakolojik olarak valide edilmiş; floresan okumaların, ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ve enzimle bağlantılı immünosorbent analiz ile kantifiye edilen endojen fibrotik markerlar ile korele olduğu görülmüştür. Nihayetinde, bu maliyet etkin platform, yeni antifibrotik ajanların yüksek kapasiteli taraması için erişilebilir bir araç sunarak translasyonel kardiyovasküler araştırmaları hızlandırmaktadır.
Giriş
Kardiyak fibrozis yönetimi önemli klinik zorluklar sunmaktadır. Dinlenmedeki fibroblastların miyofibroblastlara anormal aktivasyonu ve aşırı hücre dışı matris (ECM) birikimi ile karakterize olan bu durum; kalp yetmezliği, miyokard enfarktüsü ve diğer kardiyovasküler hastalıklar tarafından paylaşılan geri dönüşümsüz bir terminal yolunu temsil eder1,2,3. Ancak, mevcut tedavi stratejileri önemli sınırlamalarla karşı karşıyadır. Diüretikler, β-blokerler ve renin-anjiyotensin-aldosteron sistemi inhibitörleri gibi geleneksel müdahaleler öncelikle sistemik hemodinamik stresi hafifletir ve nörohümoral aktivasyonu azaltır4,5,6,7. Bu tedaviler, fibroblast aktivasyonunu doğrudan hedeflemede veya devam eden kolajen birikimini durdurmada yetersiz kalmaktadır. Ayrıca, transforme edici büyüme faktörü beta (TGF-β)/Smad yolu, oksidatif stres ve metabolik yeniden programlama gibi sinyal kaskadları bu patolojiyi yönlendirse de, bu bulguların doğrudan etkili antifibrotik tedavilere dönüştürülmesi, sistemik toksisite ve spesifik olmayan iletim mekanizmaları nedeniyle zorlu olmaya devam etmektedir8,9,10. Bu nedenle, yeni ve hedefe yönelik antifibrotik tedavilere acil ihtiyaç vardır. Önemli bir translasyonel darboğaz, fibroblast aktivasyonunu hassas ve dinamik bir şekilde raporlayabilen fonksiyonel değerlendirme sistemlerinin eksikliğidir. Geleneksel deneysel modeller, verimli farmakolojik taramayı engelleyen önemli sınırlamalar sergilemektedir11,12. in vivo hayvan modelleri küresel kardiyak yeniden şekillenmeyi yeniden oluştururken, türler arası farklar, uzun deneysel süreçler, yüksek maliyetler ve düşük verimlilik gibi sorunlar yaşamaktadır11.
Bu engelleri aşmak için çeşitli in vitro tarama platformları geliştirilmiştir; ancak kritik metodolojik kusurlar devam etmektedir. Yüksek içerikli immünofloresan analizler, hücrelerin yıkıcı şekilde tespitini ve zahmetli işlemleri gerektirmekte, fibroblast aktivasyonunun gerçek zamanlı kinetiğini yakalamak yerine yalnızca statik bir anlık görüntü sunmaktadır. Benar şekilde, etiketsiz empedans izlemesini kütle spektrometrisi (MS/MS) ile entegre eden platformlar, genel hücresel toksisitenin neden olduğu empedans düşüşlerinin gerçek antifibrotik etkinlik ile kolayca karıştırılabilmesi nedeniyle özgüllük eksikliği ve düşük ölçeklenebilirlik sorunları yaşamaktadır. Ayrıca,le sitoskeletal markerları (örneğin, alfa-düz kas aktini [α-SMA]/ACTA2) takip etmek için indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) kullanan, kümelenmiş düzenli aralıklarla ayrılmış kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) ile mühendisliği yapılmış reporter sistemleri, ciddi translasyonel engeller sunmaktadır13. Bu iPSC tabanlı modeller aşırı derecede pahalı, teknik olarak zorlayıcıdır ve rutin yüksek kapasiteli taramalar için büyük ölçüde erişilemez durumdadır. Dahası, α-SMA gibi sitoskeletal markerlara güvenmek, bu markerların ekspresyonu ECM'nin fonksiyonel sekresyonu ve aşırı depozisyonu ile kesin bir korelasyon göstermediğinden, patolojik son noktayı doğru şekilde yansıtmayabilir14. Bu nedenle, bu sistemler farmakolojik müdahalelere karşı erken evre hücresel yanıtların boylamsal olarak haritalanması için yetersizdir.
Buna karşılık, bu protokol, fibroblast aktivasyonunu izlemek için tahribatsız ve güçlü bir platform oluşturma amacıyla, kollajen tip I alfa 1 (Col1a1) promotörü tarafından yönlendirilen boylamsal bir fonksiyonel raporlayıcı sistemi tanımlamaktadır. Tip I kollajen, kardiyak yeniden şekillenme sırasında birikmiş baskın ECM bileşeni olduğundan, onu kodlayan Col1a1 geninin transkripsiyonel aktivasyonunun yakalanması, fibroblast aktivasyonu için doğrudan ve patolojik olarak ilgili bir okuma sağlar. Bu Col1a1 promotörü tabanlı model, fibrotik süreçlerin moleküler düzeyde sürekli izlenmesine olanak tanıyarak, mekanizma tabanlı ilaç taraması için optimize edilmiş, hassas, boylamsal ve nicelenebilir bir platform sunar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneylerin kurumsal ve ulusal kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirildiğini onaylarız. Bu çalışma, münhasıran yerleşik NIH Swiss fare embriyonik fibroblast hücre hattını (NIH/3T3) ve mCol1a1p-mCherry raporlayıcı sistemini kullandığı için ve herhangi bir omurgalı hayvan, embriyo veya insan denek içermediği için, bu makalede açıklanan prosedürler için bir kurumsal inceleme kurulundan etik onay alınması gerekmemiştir.
Rekombinant adenoviral vektörleri içeren tüm prosedürler, kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerine ve standart Biyogüvenlik Düzeyi 2 (BSL-2) uygulamalarına uygun olarak yürütülmüştür. Viral işlemler, transdüksiyon, saklama ve atık imhası, sertifikalı biyolojik güvenlik kabinleri ve uygun kişisel koruyucu donanımlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Adenoviral materyal içeren sıvı atıklar, imha edilmeden önce taze hazırlanmış çamaşır suyu çözeltisi ile dekontamine edilmiş ve kontamine sarf malzemeleri kurumsal biyogüvenlik protokollerine göre otoklavlanmıştır. Kazara meydana gelen dökülmeler, kurumsal dökülme müdahale prosedürleri takip edilerek onaylanmış virüsid ajanlar kullanılarak derhal dezenfekte edilmiştir.
1. Deneysel İş Akışına Genel Bakış
- Adım 2'de açıklandığı şekilde, fare Col1a1 promotörü tarafından yönlendirilen rekombinant bir adenovirüs üretin.
- Adım 3'te açıklandığı şekilde, NIH/3T3 fibroblastlarında viral transdüksiyon koşullarını optimize edin.
- Adım 4'te açıklandığı şekilde, TGF-β'ye yanıt veren bir in vitro fibrozis raporlayıcı model oluşturun.
- Adım 4'te açıklandığı şekilde, zamana ve doza bağlı TGF-β stimülasyonu kullanarak modelin stabilitesini, özgüllüğünü ve biyolojik tekrarlanabilirliğini doğrulayın.
- Adım 5'te açıklandığı şekilde, SB431542 kullanarak farmakolojik inhibisyon gerçekleştirin.
- Adım 5'te açıklandığı şekilde, ardışık enzimle bağlantılı immünosorbent analiz (ELISA) ve kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizlerini gerçekleştirin.
NOT: Deneysel iş akışının şematik genel görünümü için Şekil 1A'ya bakın. Deneysel cihazlar ve reaktifler için Materyal Tablosu'na bakın.
Şekil 1. Fibroblastlarda mCol1a1p-mCherry adenoviral reporter sisteminin kurulum ve doğrulama iş akışı. (A) Adenoviral (AdV) mCol1a1p-mCherry reporter sisteminin oluşturulmasının şematik özeti ve NIH/3T3 fibroblastlarında model doğrulaması için deneysel iş akışı. İş akışı; promotör klonlama, rekombinant adenovirüs montajı, HEK293 hücrelerinde viral paketleme, enfeksiyon çokluğunun (MOI) optimizasyonu ve ardından yüksek içerikli floresan taramasını içermektedir. (B) 0, 1, 10, 100 ve 1000 MOI değerlerinde Ad-mCol1a1p-mCherry adenovirüsü ile enfekte edilmiş NIH/3T3 fibroblastlarının temsilci floresan görüntüleri. Çekirdekler Hoechst 33342 (mavi) ile boyanmıştır ve mCherry floresansı (kırmızı), Col1a1 promotör aktivitesini göstermektedir. Floresan yoğunluğu, yüksek içerikli görüntüleme kullanılarak nicelendirilmiş ve çekirdek sayılarına göre normalize edilmiştir. Minimal morfolojik değişikliklerle birlikte güçlü ve homojen reporter ekspresyonuna dayanarak, sonraki deneyler için 100 MOI seçilmiştir. Ölçek çubukları = 200 µm. Bu şekil, onaylı lisanslar ile BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
2. mCol1a1 Promotör Adenovirüsünün Oluşturulması, Paketlenmesi ve Amplifikasyonu
- Rekombinant adenoviral vektörün oluşturulması
- 2354 bp'lik fare Col1a1 promotör fragmanını (genomik koordinatlar: chr11:94824779–94827132; transkripsiyon başlangıç bölgesine [TSS] göre −2271 ila +83 bp), pDC315 adenoviral shuttle vektörü içindeki mCherry reporter geninin yukarısına klonlayın.
NOT: Col1a1 promotörünün tam dizisi ve detaylı pDC315-mCol1a1p-mCherry plazmit haritası Ek Dosya 1 ve Ek Şekil 1'de sunulmuştur. - pDC315 vektörünü BamHI ve KpnI kullanarak lineerleştirin. Promotör insertini 15–25 bp homoloji kolları içeren primerler kullanarak amplifiye edin.
NOT: in vitro rekombinasyonu kolaylaştırmak için homolog rekombinasyon tabanlı dikişsiz (seamless) klonlama stratejisi kullanın. - Elde edilen plazmiti PCR taraması ve Sanger sekanslama ile doğrulayın.
NOT: Çerçeve kayması (frameshift) veya erken stop kodonlarının bulunmadığından emin olmak için promotör-reporter bağlantı dizisini dikkatlice inceleyin. - Hücre içi Cre aracılı rekombinasyon yoluyla AdMax sistemini kullanarak rekombinant adenovirüsü üretin.
NOT: pBHGloxΔE1,3Cre backbone plazmiti, E1/E3 delesyonlarına sahip nonreplikatif bir Ad5 genomu ve shuttle vektör üzerindeki loxP bölgesiyle bölgeye özgü rekombinasyonu kolaylaştıran bir Cre rekombinaz ekspresyon kaseti içerir. - HEK293 hücrelerini, doğrulanmış pDC315-mCol1a1p-mCherry shuttle vektörü ve pBHGloxΔE1,3Cre adenoviral backbone plazmiti ile ko-transfekte edin.
- 2354 bp'lik fare Col1a1 promotör fragmanını (genomik koordinatlar: chr11:94824779–94827132; transkripsiyon başlangıç bölgesine [TSS] göre −2271 ila +83 bp), pDC315 adenoviral shuttle vektörü içindeki mCherry reporter geninin yukarısına klonlayın.
- Adenovirüs paketleme ve amplifikasyon
- HEK293 hücrelerini %10 fetal bovin serum (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Eagle Besiyeri'nde (DMEM) muhafaza edin. Adenoviral paketleme için düşük pasajlı hücreler (<20 pasaj) kullanın.
- Transfeksiyon anında %50–60 konfluansa ulaşmak için HEK293 hücrelerini transfeksiyondan 24 saat önce %30–40 konfluansla ekin.
- HEK293 hücrelerini, Lipofectamine 2000 transfeksiyon reaktifi kullanarak 5 µg shuttle plazmit ve 5 µg pBHGloxΔE1,3Cre yardımcı plazmit ile ko-transfekte edin.
NOT: 1:1 oranında bir DNA-reaktif oranı koruyun (toplam 10 µg DNA'ya 10 µL transfeksiyon reaktifi). - Transfekte edilen hücreleri 37°C'de %5 CO₂ ile kültüre edin ve sitopatik etkileri günlük olarak izleyin.
NOT: İlk CPE'nin ortaya çıkması 7–14 gün sürebilir. Besiyeri asidleşirse (sararırsa), hücreleri rahatsız etmeden nazik bir yarı-besiyeri değişimi gerçekleştirin. - Hücrelerin yuvarlaklaşması ve büzülmesiyle karakterize edilen tipik CPE gözlemlendiğinde ve hücrelerin en az %50'si kültür yüzeyinden ayrıldığında hücreleri ve süpernatantı hasat edin.
NOT: Bu aşamaya genellikle transfeksiyondan 10–15 gün sonra ulaşılır. - Numuneleri −70°C'de 30 dk dondurup 37°C'lik su banyosunda çözerek üç dondurma-çözme döngüsü gerçekleştirin.
- Hücre lizisini kolaylaştırmak için her çözme adımından sonra süspansiyonu 30 s boyunca vorteksleyin.
NOT: Viral stabiliteyi korumak için çözme sırasında 37°C'de uzun süreli inkübasyondan kaçının. - Tam DMEM kullanarak viral lizatın 10 katlı seri dilüsyonlarını (10−1 ila 10−13) hazırlayın. Her bir viral dilüsyondan 90 µL'yi, dilüsyondan 10 replika kuyucuk kullanarak 96 kuyucuklu plakalara ekilmiş HEK293 hücrelerine ekleyin.
NOT: ≥1 × 109 PFU/mL viral titre, sonraki saflaştırma işlemleri için yeterli amplifikasyon son noktası olarak tanımlanmıştır. - Hücresel debrisleri uzaklaştırmak için 10 mL ham viral lizatı 0.45 µm'lik bir filtreden geçirin.
- Saflaştırılmış lizatı 37°C'de 30 dk boyunca Benzonase nükleaz (10 U/mL) ile işleyin.
- Rekombinant adenovirüsü, üretici talimatlarına göre Adeno-X Virus Purification Kit kullanarak saflaştırın.
NOT: Lizatı, ön dengelenmiş saflaştırma filtresine yüklemeden önce 1× dilüsyon tamponu ile karıştırın. Filtreyi 1× Yıkama Tamponu ile yıkayın ve saflaştırılmış virüsü 3 mL 1× Elüsyon Tamponu kullanarak elüe edin. - Plakaları 10 gün boyunca inkübe edin ve sitopatik etkileri (CPE) ışık mikroskobu altında değerlendirin. Karakteristik hücre yuvarlaklaşması ve ayrılmasına göre pozitif CPE skorlaması yapın. CPE skorlamasına dayalı olarak Spearman–Karber yöntemini kullanarak enfeksiyöz viral titre'yi hesaplayın.
NOT: Son viral stokun, sonraki uygulamalar için en az 1 × 1011 PFU/mL titreye ulaştığından emin olun. - Saflaştırılmış adenovirüsü alikotlayın ve viral stoku −80°C'de saklayın.
NOT: Saflaştırılmış adenoviral alikotları uzun süreli koruma için −80°C'de saklayın. Viral enfektiviteyi korumak için tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçının.
3. Hücre Kültürü ve Viral Enfeksiyon Koşullarının Optimizasyonu
- NIH/3T3 fibroblastlarını %10 FBS ve %1 gratitude penisilin–streptomisin ile desteklenmiş DMEM/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) içerisinde kültüre edin.
NOT: Hücre durumunun tutarlılığını sağlamak için, kaynak flaskta %70–80 konfluensa ulaşmış 3 ile 8. pasajlar arasındaki hücreleri kullanın. - NIH/3T3 fibroblastlarını, kuyuk başına 4 × 103 hücre olacak şekilde, 40 µL tam kültür ortamı ile 384 kuyucuklu plakalara ekleyin.
- Hücrelerin tutunması ve logaritmik büyüme fazına girmesi için hücreleri 37°C'de, %5 CO₂ içeren inkübatörde 12 saat boyunca inkube edin.
NOT: Düzensiz hücre dağılımını ve kenar etkilerini minimize etmek için, inkübasyondan önce plakaları oda sıcaklığında 20–30 dakika bekletin. En dıştaki kuyucukları steril fosfat tamponlu salin (PBS) veya steril su ile doldurun. - Hücreleri, enfekte edilmemiş bir kontrolle birlikte, 1–1.000 arasında değişen enfeksiyon çoklukları (MOI) ile rekombinant adenovirüsle enfekte edin.
NOT: Gerekli adenoviral hacmi aşağıdaki formülü kullanarak hesaplayın:
Burada, V adenoviral stok hacmi (mL), N kuyucuk başına ekilen hücre sayısı (4 × 103), MOI istenen enfeksiyon çokluğu ve T enfeksiyöz viral titre (PFU/mL)'dir. Bu çalışmada kullanılan viral stok, Adım 2.2.12'de açıklanan Spearman–Karber yöntemiyle belirlendiği üzere 1 × 1011 PFU/mL enfeksiyöz titreye sahipti. - Eklenen viral stok hacminin, toplam kuyucuk hacminin %10'unu geçmediğinden emin olun.
NOT: Aşırı viral stok hacimleri ortam pH'ını değiştirebilir ve spesifik olmayan sitotoksisiteye neden olabilir. - Enfeksiyondan 24 saat sonra, virüs içeren ortamı 40 µL taze tam kültür ortamı ile değiştirin.
NOT: Adım 3.1 ile tutarlı olarak %10 FBS ve %1 penisilin–streptomisin ile desteklenmiş DMEM/F12 kullanın. - Besiyeri değişimini, düşük hızlı otomatik bir sıvı taşıyıcı kullanarak veya çok kanallı pipet uçlarını her kuyucuğun üst yan duvarına dikkatlice yaslayarak gerçekleştirin.
NOT: Hücre kopmasını minimize etmek için 384 kuyucuklu plakalarla çalışırken standart vakum aspirasyonundan kaçının. - Optimal MOI'yi, hücre morfolojisini ve nükleer sayısını enfekte edilmemiş kontrol hücreleriyle karşılaştırılabilir düzeyde tutarken, görünür ve homojen mCherry floresansı üreten en düşük viral doz olarak tanımlayın.
NOT: Reporter ekspresyonunu, Hoechst ile boyanmış nükleer sayımlar ve floresan görüntüleme kullanarak değerlendirin. Hücreler, yuvarlaklaşma veya kopma olmadan karakteristik iğ şeklinde morfolojilerini korumalıdır. Aşırı yüksek MOI değerleri, hücresel stres yanıtları yoluyla bazal mCherry aktivasyonunu tetikleyebilir. Farklı MOI değerlerindeki temsili floresan sonuçları Şekil 1B'de gösterilmiştir. - Tüm sonraki deneyler için optimize edilmiş MOI'yi seçin.
NOT: Bu çalışmada, sonraki deneyler için 100 MOI seçilmiştir.
4. TGF-β Stimülasyonu Kullanılarak Model Stabilitesinin Değerlendirilmesi
- NIH/3T3 fibroblastlarını, Adım 3.9'da belirlenen 100'lük optimize edilmiş MOI değerinde rekombinant adenovirüs ile enfekte edin.
- TGF-β stimülasyonundan önce fibroblastları %0,2 FBS içeren DMEM/F12 içerisinde 12 saat boyunca serumdan yoksun bırakın.
NOT: Hücreleri senkronize etmek ve bazal aktivasyonu en aza indirmek için serum açlığı uygulanmıştır. Col1a1 promotör - şu konsantrasyonda rekombinant insan TGF-β stok çözeltisi hazırlayın 100 µg/mL %0,1 sığır serum albümini (BSA) içeren 4 mM HCl kullanılarak.
NOT: TGF-β stok çözeltisini küçük hacimlerde alikotlayın ve − sıcaklığında saklayın80°C tekrarlayan dondurma-çözme döngülerinden kaçınmak için. - Hücreleri, altı bağımsız biyolojik replikatta, 0–40 ng/mL arasında değişen bir TGF-β konsantrasyon gradyanı ile işleme tabi tutun.
NOT: 0 ng/mL koşulu, uyarılmamış kontrol grubu olarak kullanılmıştır. - Stimüle edilen hücreleri şu koşullarda inkübe edin: 37°C %5 CO₂ ile 24, 48 veya 72 saat boyunca inkübe edin. Kümülatif fototoksisiteyi en aza indirmek için her görüntüleme zaman noktası için ayrı paralel plakalar kullanın.
- Hücreleri, nihai çalışma konsantrasyonu ... olan Hoechst 33342 çözeltisi ile boyayın 2.5 µg/mL görüntüleme öncesinde 15 dakika boyunca.
NOT: Boyama solüsyonunu, 10 mg/mL Hoechst 33342 stok solüsyonunu steril PBS içerisinde 1:4.000 oranında seyrelterek hazırlayın. Fotobeyazlamayı en aza indirmek için boyama işlemini ışık korumalı koşullar altında gerçekleştirin. - 10× kuru objektif lensle donatılmış yüksek içerikli bir görüntüleme sistemi kullanarak floresan görüntülerini edinin.
- Her bir deneysel koşul için 384 kuyuklu plak formatındaki her kuyukta, birbirinin üzerine binmeyen beş alan görüntüleyin.
NOT: Karşılaştırılabilirliği sağlamak için tüm deneysel gruplarda aynı görüntüleme ayarlarını koruyun. Otomatik lazer tabanlı otofokus kullanın ve çevresel kontrol koşullarını şu değerlerde tutun: 37°C canlı hücre görüntüleme sırasında %5 CO₂ ile. - Edinme mCherry 561 nm eksitasyon, 600/52 Bandpass (BP600/52) emisyon filtresi ve 200 ms pozlama süresi kullanılarak floresan görüntüler.
- 405 nm eksitasyon, BP445/45 emisyon filtresi ve 30 ms pozlama süresi kullanarak Hoechst floresan görüntülerini elde edin.
NOT: Lineer floresans deteksiyonunu korumak ve uzamsal çözünürlüğü maksimize etmek için kamera kazancını 1,0'a ayarlayın ve tüm görüntüleri 1 × 1 binning kullanarak tam kamera çözünürlüğünde edinin. - Elde edilen görüntüleri CellPathfinder görüntü analiz yazılımını kullanarak analiz edin.
- Referans nükleer çapını kullanarak Hoechst kanalındaki çekirdekleri birincil nesneler olarak tanımlayın 20 µm ve 20– arasındalık bir alan aralığı400 µm2.
- ... içindeki sitoplazmik ilgi bölgelerini (ROI'leri) tanımlayın mCherry referans hücre çapı kullanılarak nükleer sınırdan genişletilen kanal ile 60 µm.
NOT: Görüntü kenarlarına temas eden kısmi hücreleri çıkarmak için segmentasyon sırasında bir “Exclude Edge” (Kenarları Hariç Tut) filtresi uygulayın. - Tanımlanan her bir hücre için ortalama floresan yoğunluğunu hesaplayın ve yakalanan beş alanın tamamından kuyuk başına düşen ortalama floresan yoğunluğunu belirleyin.
5. ELISA ve Kantitatif Real-Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanılarak Model Güvenilirliğinin Doğrulanması
- Adım 3.9'da açıklandığı gibi, NIH/3T3 fibroblastlarını 100'lük optimize edilmiş MOI ile rekombinant adenovirüs ile enfekte edin.
- TGF-β stimülasyonundan önce hücreleri 30–60 dk boyunca SB431542 ile ön işlemden geçirin.
NOT: Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 20 mM SB431542 stok çözeltisi hazırlayın ve alikotları −20°C'de saklayın. - Hücreleri 10 ng/mL TGF-β ve 1, 5, 10 ve 15 µM final konsantrasyonlarında SB431542 ile işleme tabi tutun. SB431542 işlemi uygulanmayan, %0,1 (v/v) DMSO içeren bir taşıyıcı kontrol grubu ekleyin.
NOT: Tüm işlem gruplarında final DMSO konsantrasyonunu %0,1 (v/v) düzeyinde tutun. - İki aşamalı dilüsyon yöntemini kullanarak TGF-β çalışma çözeltisini hazırlayın.
NOT: 10 ng/mL final çalışma konsantrasyonuna ulaşmak için, %0,1 BSA içeren 4 mM HCl içinde hazırlanan 100 µg/mL TGF-β stok çözeltisini, komple kültür ortamına daha fazla dilüsyondan önce steril PBS içinde 1:100 oranında dilüye edin. - İşlem görmüş hücreleri 6 kuyucuklu plaklarda 24 sa boyunca 37°C'de ve %5 CO₂ altında inkübe edin.
- ELISA analizi için her kuyucuktan 2 mL kültür süpernatanı toplayın.
- Hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için toplanan süpernatanları 4°C'de 5 dk boyunca 1.000 × g'de santrifüj edin.
- Berraklaştırılmış süpernatanları alikotlara ayırın ve ELISA analizine kadar −80°C'de saklayın.
NOT: Berraklaştırılmış süpernatanlar, ELISA analizinden önce −80°C'de saklanabilir. - Süpernatan uzaklaştırıldıktan sonra adherent hücreleri buz gibi soğuk PBS ile nazikçe yıkayın.
- Hücreleri liz etmek için her kuyucuğa doğrudan 1 mL TRIzol reaktifi ekleyin.
NOT: Örnekleri mikrosantrifüj tüplerine aktarmadan önce tam homojenizasyon sağlamak için lizatı birkaç kez pipetleyin. RNA lizatları, RNA ekstraksiyonundan önce −80°C'de saklanabilir. - Ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) analizi için lizatlardan toplam RNA ekstrakte edin.
- 1 µg toplam RNA kullanarak ters transkripsiyon gerçekleştirin.
NOT: Ters transkripsiyonu şu reaksiyon koşullarını kullanarak yürütün: 10 dk boyunca 25°C, 15 dk boyunca 42°C ve 2 dk boyunca 85°C. - PerfectStart Green qPCR SuperMix kullanarak kantitatif PCR gerçekleştirin. Her reaksiyonu, 5 µL komplemanter DNA (cDNA) kalıbı içeren 20 µL final hacminde hazırlayın.
- qPCR reaksiyonlarını şu döngü koşullarını kullanarak çalıştırın: 30 sn boyunca 94°C'de başlangıç denatürasyonu, ardından 40 döngü boyunca 5 sn 94°C, 15 sn 60°C ve 10 sn 72°C.
NOT: Ürün özgüllüğünü onaylamak için amplifikasyondan sonra erime eğrisi analizi gerçekleştirin. - İç kontrol olarak Col1a1 gen ekspresyonunu 18S rRNA'ya göre normalize edin.
NOT: Tüm primer dizileri Ek Tablo 1'de verilmiştir. - Sekrete edilen Kolajen I protein seviyelerini, üretici talimatlarına göre ELISA kullanarak berraklaştırılmış süpernatanlarda nicelikle. Fare tip I kolajen ELISA testi için standart eğri aralığı 0,78–50 ng/mL olup, test tespit hassasiyeti 0,37 ng/mL'dir.
- Tüm standartları ve örnekleri teknik düplikatlarda analiz edin ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak 450 nm'de optik yoğunluğu (OD) ölçün.
NOT: Sekrete edilen Col1a1 tespiti için test hassasiyetini maksimize etmek amacıyla seyreltilmemiş berraklaştırılmış süpernatanlar kullanın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
mCol1a1p-mCherry rekombinant adenovirüsün oluşturulması ve paketlenmesinin şematik bir genel görünümü Şekil 1A'da gösterilmiştir. Fare Col1a1 promotörü, mCherry reporter geninin yukarı akışına klonlanmış ve bir adenoviral vektöre dahil edilmiş, ardından HEK293 hücrelerinde viral paketleme ve amplifikasyon gerçekleştirilmiştir. İş akışı; viral enfeksiyon, fibrotik stimülasyon, farmakolojik müdahale ve floresan tabanlı sinyal okuma dahil olmak üzere temel de...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kardiyak fibrozis, kalp yetmezliğinin ilerlemesine katkıda bulunur ve etkili antifibrotik tedavilerin geliştirilmesi, boylamsal tarama platformlarının eksikliği nedeniyle sınırlıdır2,13. Western blotting, RT-qPCR ve immünofloresan boyama dahil olmak üzere antifibrotik etkinliği değerlendirmek için kullanılan geleneksel yöntemler, hücre lizisi veya fiksasyon gerektiren uç nokta ölçümlerine dayanmaktadır. Bu yaklaşımlar, canlı hücrelerde fibrotik ilerlemenin gerçek...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğal Bilimler Vakfı'nın (H.X.'e 32371158 numaralı) ve Ulusal Temel Araştırma Programı'nın hibeleri tarafından desteklenmiştir.&D Programı (2023YFA1800902, H.X.'e), "Tianchi Talent" program, Ulusal Vasküler Homeostaz ve Yeniden Yapılanma Ana Laboratuvarı (Pekin Üniversitesi) Açık Projesi (R.Z'ye 202404; Y.M.W.'ye 202403), Eğitim Bakanlığı Xinjiang Endemik ve Etnik Hastalıklar Ana Laboratuvarı (Pekin Üniversitesi) Açık Projesi (H.X.'e KF202404).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 384 Kuyucuklu Cam Tabanlı Mikroplaka | Cellvis, USA | P384-1.5H-N | Hücre ekimi, viral enfeksiyon, boyama ve floresan görüntüleme için kullanılan 384 kuyucuklu cam tabanlı plaka. |
| Adenoviral Backbone Plazmidi | Microbix, Canada | pBHGloxΔE1,3Cre | Tam uzunluktaki rekombinant adenoviral genomu oluşturmak için kullanılan plazmid. |
| Adenoviral Shuttle Vektörü: pDC315-mCol1a1p-mCherry | GeneChem, China | Custom service | mCherry ekspresyonunu yönlendiren 2354 bp fare Col1a1 promoterini içeren rekombinant adenoviral shuttle vektörü. |
| Benzonaz Nukleaz | Merck Millipore, USA | 70664-3 | Adenoviral purifikasyon sırasında kontamine nükleik asitleri uzaklaştırmak için kullanılan endonukleaz. |
| Biyolojik Güvenlik Kabini (Sınıf II) | Esco Lifesciences Group, Singapore | AC2-4S1 | Rekombinant adenoviral işlemler ve steril hücre kültürü prosedürleri için kullanılan sertifikalı biyogüvenlik kabini. |
| Hücre Kültür Besiyeri (Complete DMEM/F12) | HyClone, USA | 12800-017 | NIH/3T3 ve HEK293 hücrelerinin idamesi için kullanılan komple kültür besiyeri. |
| CellPathfinder Görüntü Analiz Yazılımı | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Version 3.08.01 | Otomatik floresan kantifikasyonu ve hücre segmentasyonu için kullanılan görüntü analiz yazılımı. |
| CellVoyager CV8000 Yüksek İçerikli Tarama Sistemi | Yokogawa Electric Corporation, Japan | CV8000 | mCherry ve Hoechst floresan kazanımı için kullanılan yüksek içerikli görüntüleme sistemi. |
| CO2 Hücre Kültürü İnkübatörü | Thermo Fisher Scientific, USA | 3111 | Memeli hücre kültürü için %5 CO2 içeren ve 37 °C'de tutulan nemlendirilmiş inkübatör. |
| Dimetil Sülfoksit (DMSO) | Sigma-Aldrich, USA | D2650 | SB431542 hazırlama için kullanılan çözücü. |
| Dulbecco’s Modifiye Eagle Besiyeri/Besin Karışımı F-12 (DMEM/F-12) | Servicebio, China | G4610 | NIH/3T3 fibroblastları için kullanılan bazal kültür besiyeri. |
| Fetal Bovin Serum (FBS) | Ausbian, Australia | VS500T | Komple kültür besiyeri hazırlama için %10 (v/v) oranında kullanılan serum takviyesi. |
| Hoechst 33342 Floresan Boyası | Invitrogen, USA | H3570 | Floresan görüntüleme ve nükleer sayım normalizasyonu için kullanılan nükleer boya. |
| HEK293 Hücreleri | ATCC, USA | CRL-1573 | Adenoviral üretim ve amplifikasyon için kullanılan paketleme hücre hattı. |
| İnsan Rekombinant TGF-β1 | MedChemExpress, China | HY-P78214 | NIH/3T3 fibroblastlarında fibrotik aktivasyonu indüklemek için kullanılan sitokin. |
| Görüntü Kazanım Yazılımı | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Version 3.08.01.03 | Otomatik floresan görüntü kazanımı ve mikroskop kontrolü için kullanılan yazılım. |
| Lipid Bazlı Transfeksiyon Reajeni | Invitrogen, USA | 11668-019 | Adenoviral plazmidin HEK293 hücrelerine aktarımı için kullanılan transfeksiyon reajeni. |
| Mikrosantrifüj Tüpleri | Axygen, USA | MCT-150-C | RNA lizat depolama ve numune işleme için kullanılan tüpler. |
| Mikroplaka Okuyucu | Tecan, Switzerland | Spark | ELISA absorbans ölçümleri için kullanılan çok modlu mikroplaka okuyucu. |
| Fare Tip I Kolajen ELISA Kiti | Meike Biotechnology, China | MK6778A | Kültür süpernatantlarındaki salgılanmış tip I kolajeni kantifiye etmek için kullanılan ELISA kiti. |
| NIH/3T3 Fare Fibroblastları | Procell Life Science, China | CL-0171 | Reporter model kurulumu ve validasyonu için kullanılan fare fibroblast hücre hattı. |
| PacI Restriksiyon Enzimi | New England Biolabs, USA | R0547S | Adenoviral plazmid lineerizasyonu için kullanılan restriksiyon enzimi. |
| Penisilin–Streptomisin Solüsyonu | Gibco, USA | 15140-122 | Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için %1 (v/v) oranında eklenen antibiyotik solüsyonu. |
| PerfectStart Green qPCR SuperMix | TransGen Biotech, China | AQ602 | Kantitatif PCR analizi için kullanılan SYBR Green bazlı qPCR master mix. |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Servicebio, China | G4202 | Hücrelerin yıkanması ve reajen hazırlama için kullanılan tampon. |
| pDC315-EGFP Shuttle Vektörü | GeneChem, China | N/A | Reporter plazmid konstrüksiyonu için kullanılan ana adenoviral shuttle vektörü. |
| qPCR Sistemi | Applied Biosystems, USA | QuantStudio 5 | Kantitatif gen ekspresyon analizi için kullanılan real-time PCR sistemi. |
| Restriksiyon Enzimleri (BamHI ve KpnI) | Abclonal, China | RK21101, RK21104 | Shuttle-vektör lineerizasyonu için kullanılan restriksiyon enzimleri. |
| Reverse Transkripsiyon Kiti | TransGen Biotech, China | AT311 | RT-qPCR öncesi cDNA sentezi için kullanılan reverse-transkripsiyon kiti. |
| RNA Lizis Reajeni | Invitrogen, USA | 15596026 | Kültürlenmiş hücrelerden toplam RNA ekstraksiyonu için kullanılan reajen. |
| SB431542 | MedChemExpress, China | 301836-41-9 | Farmakolojik inhibisyon deneyleri için kullanılan TGF-β tip I reseptör inhibitörü. |
| Sanger Sekanslama Hizmeti/Reajenleri | Shanghai Boshang Biotechnology Co., Ltd., China | Custom Service | Plazmid sekans doğrulaması için kullanılan sekanslama hizmeti/reajenleri. |
| Serolojik Pipetler | Corning, USA | 4488 | Hücre kültürü prosedürleri sırasında sıvı transferi için kullanılan steril pipetler. |
| T30 Termal Döngüleyici | LongGene Scientific Instruments, China | T30 | Reverse transkripsiyon ve PCR amplifikasyonu için kullanılan termal döngüleyici. |
| Trypsin-EDTA Solüsyonu | Gibco, USA | 25200-056 | Rutin hücre pasajlama için kullanılan hücre disosiyasyon reajeni. |
| Viral Purifikasyon Kiti | Takara Bio USA | 631533 | Rekombinant adenovirüs purifikasyonu için kullanılan kit. |
| Su Banyosu | Shanghai Yiheng Scientific Instruments,China | HWS-12 | Adenoviral dondurma–çözme döngüleri sırasında kullanılan sıcaklık kontrollü su banyosu. |
Kaynaklar
- Frangogiannis NG. Cardiac fibrosis. Cardiovasc Res. 2021;117(6):1450–1488.
- Ghazal R, et al. Cardiac fibrosis in the multi-omics era: implications for heart failure. Circ Res. 2025;136(7):773–802.
- Kurose H. Cardiac fibrosis and fibroblasts. Cells. 2021;10(7):1716.
- Heidenreich PA, et al. 2022 AHA/ACC/HFSA guideline for the management of heart failure. J Am Coll Cardiol. 2022;79(17):e263–e421.
- Fang L, et al. A clinical perspective of anti-fibrotic therapies for cardiovascular disease. Front Pharmacol. 2017;8:186.
- Khalid A, et al. Breaking new ground in heart failure management: novel therapies and future frontiers. Front Cardiovasc Med. 2025;12:1643971.
- González A, et al. New targets to treat the structural remodeling of the myocardium. J Am Coll Cardiol. 2011;58(18):1833–1843.
- Tuleta I, et al. Fibroblast-specific TGF-β signaling mediates cardiac dysfunction, fibrosis, and hypertrophy in obese diabetic mice. Cardiovasc Res. 2024;120(16):2047–2063.
- Li C, et al. Mechanism of action of non-coding RNAs and traditional Chinese medicine in myocardial fibrosis: focus on the TGF-β/Smad signaling pathway. Front Pharmacol. 2023;14:1092148.
- Vistnes M. Hitting the target: challenges and opportunities for TGF-β inhibition for the treatment of cardiac fibrosis. Pharmaceuticals (Basel). 2024;17(3):267.
- Cardona-Timoner M, et al. Dressed in collagen: 2D and 3D cardiac fibrosis models. Int J Mol Sci. 2025;26(7):3038.
- Garvin AM, et al. Primary cardiac fibroblast cell culture: methodological considerations for physiologically relevant conditions. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2023;325(4):H869–H881.
- Zhang H, et al. Multiscale drug screening for cardiac fibrosis identifies MD2 as a therapeutic target. Cell. 2024;187(25):7143–7163.e22.
- Bollong MJ, et al. Small molecule-mediated inhibition of myofibroblast transdifferentiation for the treatment of fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(18):4679–4684.
- Stepanenko AA, et al. Transient and stable vector transfection: pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutat Res Rev Mutat Res. 2017;773:91–103.
- Tallquist MD. Cardiac fibroblast diversity. Annu Rev Physiol. 2020;82:63–78.
- Hofbauer P, et al. Modeling acute myocardial infarction and cardiac fibrosis using human induced pluripotent stem cell-derived multicellular heart organoids. Nat Commun. 2024;15:308.
- Li Q, et al. Human iPSC-based modeling of central nervous system disorders for drug discovery. Int J Mol Sci. 2021;22(3):1203.
- Icha J, et al. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 2017;39(8):1700003.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.