Gelişen Drosophila optik lobunda hibridizasyon zincirleme reaksiyonu FISH

Özet

Bu protokol, Drosophila melanogaster larva optik loblarında hibritizasyon zincir reaksiyon floresan in situ hibridizasyonu (HCR-FISH) gerçekleştirmek için gereken adımları açıklar. Prob tasarımı, hibritleşme, amplifikasyon ve doku montajı prosedürleri, gelişmekte olan optik lobun görselleştirilmesini kolaylaştırmak için ayrıntılı olarak hazırlanmıştır.

Özet

Sinirsel gelişimi anlamak, genlerin ne zaman ve nerede ifade edildiğinin kesin bir şekilde karakterizasyonunu gerektirir. Yerinde hibridizasyon gibi teknikler, gelişmekte olan dokularda gen ifadesinin görselleştirilmesini uzun süredir mümkün kılmıştır. Drosophila melanogaster embriyolarında yerinde hibritleşme yaygın olarak kullanılsa da, görsel sistem geliştirme uygulaması birkaç teknik zorlukla sınırlı olmuştur. Örneğin, uzun problar genellikle optik loba kötü nüfuz eder ve dağınık katalitik raporlayıcılara dayanan protokoller, örneğin horseradish peroksidaz, tüm montaj preparatlarında genellikle düşük sinyal-gürültü oranları verir. Hibritizasyon zincir reaksiyon floresan in situ hibritizasyon (HCR-FISH) bu sınırlamaların çoğunu aşar ve daha sağlam sinyal tespiti sağlar. Geleneksel FISH'te olduğu gibi, DNA prob monomerleri dokular içindeki RNA dizilerine hibritleşir. Ancak HCR-FISH'te, floresan konjuge edilmiş amplifikatör probları, ek monomerlerin polimerizasyonunu tetikleyen kararlı saç tokası yapıları oluşturur ve böylece sinyal yoğunluğunu artırır. Çoklanmış prob setlerinin kullanımı, daha kısa oligonukleotidlerin (~45 nt, geleneksel FISH'te 1.000 nt'ye kadar olan bir parçaya kıyasla) kullanılmasına olanak tanır; bu da prob nüfuzunu artırır ve tüm montaj örneklerinde daha uniform boyama sağlar. Bu makale, Drosophila larva optik lobu için optimize edilmiş bir HCR-FISH protokolünü tanımlar. Protokol, mevcut HCR-FISH yaklaşımlarını uyarlayarak fiksasyon koşullarını optimize eder ve sinyal yoğunluğunu ve doku nüfuzunu artırmak için prob ile konsantrasyonlarını artırır. Reaktif listeleri ve adım adım prosedürler sunulmaktadır. Gelişimsel nörobiyolojide potansiyel uygulamalar da sunulmaktadır; bunlar arasında yeni doğan nöronların görselleştirilmesi ve geleneksel yöntemlerin, örneğin endogen etiketlenmiş proteinler veya antikor boyama gibi yöntemlerin yeterli bilgi sağlamadığı durumlarda gen ifade desenlerinin karakterizasyonu yer almaktadır.

Giriş

Beynin nasıl oluşturulduğunu anlamak, hem mevcut hücre tiplerinin çeşitliliğini hem de her hücre^{tip 1} içinde ifade edilen gen repertuarlarını tanımlamayı gerektirir. Tek hücreli RNA dizilemedeki son gelişmeler, araştırmacıların bu soruları yüksek çözünürlükte ele^{almasını sağlamıştır 2}. Ancak, birçok tek hücreli yaklaşım mekânsal bilgiyi korumaz; bu nedenle transkripsiyonel hücre tipi kümeleri gelişmekte olan beyin içindeki konumlarına eşlemek için ek deneyler gerektirir.

GAL4-UAS gibi ikili gen ifade sistemleri konumsal bilgi sağlayabilir ancak nicel^{değildir 3}. Ayrıca, gen ekspresyonu ile raporlayıcı tespit arasındaki gecikmeler, erken gelişim evrelerinde fizyolojik olarak ilgili ifade kalıplarını gizleyebilir. İmpolojiboyama, dokuya özgü ifade kalıplarını belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir diğer^{yaklaşımdır 4}. Ancak, salgılanan proteinler genellikle dağınık ve doğru şekilde lokalize edilmesi zordur.

Nukleotid etiketleme yaklaşımları, örneğin in situ hibridizasyon (ISH), gen^{ifadesi 5} hakkında mekansal bilgi elde etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. ISH'de, etiketlenmiş DNA oligonukleotidleri, ilgi çekici ters tamamlayıcı RNA dizilerine bağlanır. Erken ISH yöntemleri radyo etiketli DNA^{probları 6} kullanırken, sonraki protokoller digoksigenin, floressein ve rodamin ^7,8,9 gibi daha güvenli etiketler içeriyordu. Bilim insanları, ISH'yi Drosophila melanogaster'de kullanmak için hızla uyarladı; burada politen kromozom organizasyonunu karakterize etmek ve kambur gibi boşluk genlerinin ifade kalıplarını tam montaj embriyolarında haritalamak^{için kullanıldı 10,11}.

Yaygın kullanımına rağmen, ISH'nin larva optik lobu gibi daha kalın tam montaj preparatlarında benimsenmesini birkaç teknik sınırlama engelledi. Birçok yerinde uygulanan protokol, dağınık katalitik raporlayıcılara dayanıyordu; örneğin yaban turpu peroksidaz gibi, bu da genellikle düşük sinyal-gürültü^{oranlarına yol açıyordu 12}. Ayrıca, birçok yaklaşımda özgüllüğü artırmak için tek dizileri hedefleyen uzun problar kullanıldı. Drosophila embriyolarında ve politen kromozomlarında etkili olmasına rağmen, uzun problar larva beynine kötü nüfuz eder ve genellikle düzensiz^{etiketlemeler üretir} 10,11,13.

Tek moleküllü floresan ISH (smFISH) ve hibritizasyon zincir reaksiyon floresan in situ hibritizasyonun (HCR-FISH) geliştirilmesi bu sınırlamaların çoğunu ele^{aldı 14,15}. Tek bir gen bölgesine kayıklanan kısa prob setleri kullanılarak smFISH, ortalama prob uzunluğunu yaklaşık 1.000 nt'den yaklaşık 40 nt^16'ya düşürür. Bu, güçlü sinyal yoğunluğunu korurken prob nüfuzunu önemli ölçüde artırır. HCR-FISH, konum doğruluğunu artıran ve sinyal çıkışını güçlendiren floresan konjuge amplifikator probları kullanarak sinyal-gürültü oranlarını daha da iyileştirir. Önemli olarak, bu amplifikasyon adımı transkript konsantrasyonuyla doğrusal olarak ölçekleniyor ve gen ifade^{seviyelerinin 17'nin} nicel ölçümü mümkün oluyor.

HCR-FISH, hedef dizisine tamamlayıcı başlatıcı problarla başlar. Bu etiketlenmemiş DNA oligonukleotidleri, floresan işaretli H1 amplifikasyon probun giriş alanına bağlanan tek zincirli bir başlatıcı dizisi içerir. H1 amplifikatörleri, başlatıcı dizisine bağlanana kadar katalitik inaktiviteyi koruyan saç tokası yapısına sahiptir. Bağlandığında, H1 amplifikatörü açılır ve bir partner prob olan H2'ye bağlanan bir diziyi ortaya çıkarır. Bu etkileşim, H2 saç tokasını açar ve başka bir H1 probuna bağlanmasını sağlar (Şekil 1)¹⁵. H1/H2 bağlanmasının tekrarlanan döngüleri, floresans sinyalini güçlendirirken arka plan gürültüsünü azaltan kararlı bir polimer üretir. Her başlatıcı dizisi karşılık gelen bir H1/H2 çiftine özgü olduğundan, aynı örneklemdeki birkaç geni aynı anda etiketlemek için farklı başlatıcı dizileri ve floroforlara sahip birden fazla prob kullanılabilir.

Şekil 1: HCR-FISH iş akışının grafiksel temsili. Başlatıcı dizileri içeren DNA probları, hedef RNA transkriptine hibritize olur. Fluoresan olarak etiketlenmiş DNA amplifikasyon saç tokaları başlatıcı dizisine bağlanır ve ardışık polimerizasyondan geçerek kararlı, çift zincirli amplifikasyon zincirleri oluşturur. Doğrudan florofor konjugasyonu, sinyal güçlendirmesini ve sinyal-gürültü oranını iyileştirir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

HCR-FISH'deki son iyileştirmeler, faydasını daha da artırmıştır. Bölünmüş başlatıcı prob tasarımı, amplifikatör özgüllüğünü artırır ve HCR başlatıcılarına konjuge edilen ikincil antikorlar eşzamanlı immünohistokimya ile HCR-FISH^18'i mümkün kılar. Ayrıca, genişletilmiş florofor seçenekleri artık aynı anda 10 genin (^19,20) çoklu görüntülemesine olanak sağlamaktadır.

HCR-FISH için ilk kavram kanıtı deneyleri zebrabalıklarda (Danio rerio) yapılmış olsa da, yöntem birçok sistemde, özellikle antikorların pahalı veya bulunamadığı model olmayan organizmalarda yaygın olarak^{kullanılmıştır 15}. Prob sentezi ayrıca aylarca süren bir geliştirme gerektirebilen antikor üretimine daha hızlı bir alternatif sunar. Sonuç olarak, HCR-FISH, tek hücreli RNA dizileme veri setleri²¹ üzerinden tanımlanan aday genlerin doğrulaması için hızlı bir yaklaşım sunar. Yerleşik genetik model organizmalarda bile, HCR-FISH GAL4 raporlayıcıları veya immünohistokimya spesifik hücre popülasyonlarını yeterince etiketleyemediğinde yeni doğan nöronları mekânsal olarak haritalamak için değerli bir yöntem sunar.

Bu makale, üçüncü instar larva Drosophila optik lobu için optimize edilmiş bir HCR-FISH protokolünü tanımlar. Protokol, daha önce diğer organizmalarda yayımlanmış yöntemleri Drosophila görsel^{sisteminde kullanılmak üzere uyarlamaktadır 22}. Drosophila immünohistokimyasında yaygın olarak kullanılan fiksasyon koşulları, FISH uygulamaları için optimize edilmiştir. Sinyal yoğunluğunu ve doku nüfuzunu artırmak için prob ve saç tokası konsantrasyonları artırıldı. Reaktif tüketimini azaltmak ve küçük doku örneklerinin işlenmesini kolaylaştırmak için spot plakalar yerine PCR tüpleri kullanıldı. Ayrıca, HCR-FISH için yaygın olarak kullanılan diğer böcek sistemlerine kıyasla Drosophila beyninin daha küçük boyutunu karşılamak için yıkama ve hibritleşme süreleri kısaltıldı.

Temsilci uygulamalar, bu yaklaşımın gelişim sırasında belirli nöronal popülasyonlar için konumsal bilgi sağlayabileceğini gösterir. Bu deneyler, aniden boyanan gibi bazı transkriptlerin HCR-FISH ile antikor boyama veya raporlayıcı hatlara göre daha erken tespit edilebileceğini göstermektedir. Drosophila'da görsel sistem geliştirme çalışmalarında HCR-FISH'in potansiyel zorlukları, sorun giderme stratejileri ve uygulamaları da tartışılır.

Protokol

Tüm Drosophila melanogaster deneyleri, New York Şehir Koleji, Columbia Üniversitesi ve New York Üniversitesi araştırma organizmalarının bakımı ve kullanımı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolde kullanılan araştırma araçları Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Tamponları hazırlayın

NOT: Tüm reaktifleri filtre uçlarıyla nukleazsız tüplerde hazırlayın.
NOT: İşlem boyunca eldiven takın. Başlamadan önce çalışma yüzeylerini RNase dekontaminasyon çözeltisi ile temizleyin.

1. Nükleaz içermeyen çözeltiler hazırlayın
   1. 1x PBS-T, 20x PBS, Triton X-100 ve glisini nukleazsız suda 1x PBS, %1 (v/v) Triton X-100 ve 1 mM glisin konsantrasyonlarına kadar seyreltileyerek hazırlayın.
   2. Nükleaz içermeyen suda 20x SSC ve Tween-20'yi seyreltirerek %0,1 (v/v) Tween-20 içeren 5x SSCT hazırlayın.
   3. 1x PBS hazırlamak için 20x PBS'yi nükleaz içermeyen suda seyreltirin.

2. Probları tasarla

1. Probları ticari olarak tasarlamak için, ilgi duyulan tür için ilgi gören izoformu seçin ve tedarikçinin web arayüzü kullanarak istenen amplifikatora eşleştirilen probları sipariş edin.
   NOT: Ticari HCR prob kimyaları ve başlatıcı dizileri, Molecular Instruments tarafından patentli ve özel mülkiyetlidir.
   1. Eğer transkript-spesifik veya pre-mRNA tespiti isteniyorsa, web arayüzünde hedef bölgeyi değiştirin.
   2. Yüksek şekilde ifade edilen transkriptler için yaklaşık 20 prob sipariş edin. Tüm mount Drosophila hazırlıklarında düşük bolluklu transkriptler için 40'a kadar prob kullanın.
      NOT: Daha az prob bağlanma noktası barındıran kısa transkriptler için özel oligolar sipariş edin.
2. Probları manuel olarak tasarlamak için, hedef transkript için FASTA dizisini indirin. Tek bir izoformu mu yoksa genin tüm izoformlarını mı hedeflemeyi belirleyin.
   NOT: Sinyali iyileştirmek için RNA dizileme veri setlerinden tanımlanan yapısal ekzonlar veya yüksek ekspresyonlu izoformlara öncelik verin.
   1. Pre-mRNA algısı için problar tasarlanırsanız, intron-ekzon bağlantılarını kapsayan problar tasarlayın. Olgun transkriptleri tespit etmek için bağlantı bağlantılarını kapsayan problar tasarlar. Çekirdekler içindeki yeni başlayan transkripsiyonları tespit etmek için intronik problar kullanın.
      NOT: İntronik problar, olgun sitoplazmik transkriptlerle kolokalize olmayabilir ve hücre tanımlaması için ek belirteçler gerektirebilir.
   2. Prob seti boyutunu belirleyin. Daha büyük prob setleri tasarlanamazsa, kısa transkriptler için en az yaklaşık 5 prob kullanın. Standart uygulamalar için 20 prob ve tam montajlı örneklerde optimal hassasiyet için yaklaşık 40 prob^{kullanın 18,23}.
   3. Kendi problarınızı tasarlıyorsanız, 25nt dizilerini 2bp aralıkla ayıran kullanın ve her oligo'nun 5' ucuna bölünmüş başlatıcı dizilerini ekleyin.
      NOT: Birinci nesil bölünmüş başlatıcı dizileri halka açık olsa da, sonraki nesil ticari başlatıcı dizileri tescilli¹⁸.
   4. Kendi sondalarınızı tasarlıyorsanız, prob dizilerini doğrulayın. Her setteki probların benzer erime sıcaklıklarına sahip olduğundan emin olun. Problar arasında %100 kimlik doğrulama.
      NOT: Güçlü G açısından zengin bölgelerden kaçının ve problar arasında benzer GC içeriğini^{koruyun 24}. Tekrarlayan dizileri en aza indirin ve BLAST²⁵ kullanarak hedef dışı bağlanmayı değerlendirin.
   5. Uygun olduğunda halka açık prob tasarım yazılımı^{kullanın 26,27}.
      NOT: Açık kaynak tasarım araçları, ticari prob tasarım boru hatlarının optimize edilmiş performansını yeniden üretemeyebilir.

3. Beyinleri ayrıştırın, düzeltin ve önceden hibritleştirin

1. Ön Isıtma Probu Hibridizasyon Tamponunu 37 °C'ye Kadar.
   DIKKAT: Prob Hibridizasyon Tamponu formamid içerir. Uygun kişisel koruyucu ekipman takarak kimyasal bir duman kaputu altında tutun.
2. Her sonda, nukleazsız damıtılmış su kullanarak son konsantrasyona 1 μM olarak ayarlanmış olarak seyreltin.
3. Yaklaşık 250 μL nükleazsız PBS'yi diseksiyon kabına koyun.
4. Gerginle üçüncü instar larvayı PBS'ye aktarın. Karın bölgesini bir çift forseps ile tutun ve ikinci bir çift ile ağız kancalarını tutun. Ağız kancalarını vücuttan uzaklaştırarak beyin ve ventral sinir kordonunu (VNC) izole edin.
5. VNC'yi koruyarak yağ vücutlarını ve tükürük bezlerini çıkarın. Diseksiyon edilen beyinleri, 600 μL buz gibi soğuk nükleaz içermeyen PBS içeren bir tüpe aktarın.
   NOT: Doku kurumasını önlemek için diseksiyon boyunca optik lobları su altında tutun.
6. Yaklaşık altı optik lob toplanana kadar diseksiyon tekrarlanın. Doku bozulmasını en aza indirmek için 20 dakika içinde diseksiyonları tamamlayın.
7. %4 PFA nihai konsantrasyon elde etmek için %16 paraformaldehit (PFA) 200 μL ekleyin. Tüpü nazikçe ters çevirerek oda sıcaklığında 15 dakika karıştırıp kuluçka yapın.
   DIKKAT: PFA toksik ve mutajeniktir. Eldiven takarken kimyasal bir buhar kaputu altında tutun.
8. Numunelerden fiksantif çıkarın ve belirlenmiş kimyasal atık olarak depolayın. Örnekleri 600 μL soğuk nükleaz içermeyen PBS ile üç kez yıkayın; yıkama çözeltilerini yakalamak için bir diseksiyon kabı kullanın.
   NOT: Yıkama çözeltilerini doku kaybı açısından inceleyin ve yerinden edilmiş beyinleri disseksiya mikroskobu altında geri alın.
9. Beyinleri, önceden ısıtılmış 100 μL Prob Hibridizasyon Tamponu içeren bir PCR tüpüne aktarın.
   Tüpü hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
   NOT: Beyinlerin suyun altında kalmasını ve tüp duvarlarına yapışmamasını sağla.

4. Probları hibritleştirin

1. Her prob setinden 0.4 pmol ekleyerek son 100 μL hacim için her prob setinden 0.4 pmol ekleyerek 4 nM prob çözümü hazırlayın.
   NOT: Eğer sinyal yoğunluğu ilk boyalarda düşükse, prob konsantrasyonunu 16 nM'ye kadar artırın.
2. Dokuyu rahatsız etmeden prehibridizasyon tamponunu çıkarın. Her numuneye seyreltilmiş prob çözeltisi ekleyin.
3. Numuneleri 37 °C'de nutatorda 16–24 saat kuluçka edin.

5. Prob sinyalini güçlendirin

1. Amplifikasyon Tamponunu oda sıcaklığına getirin. Her örnek başına yaklaşık 200 μL Amplifikasyon Tamponu hazırlayın.
2. Dengeli yıkama tamponu yapın. Prob Yıkama Tamponunu su banyosu ile 37 °C'ye kadar ısıtın.
   DIKKAT: Prob Wash Buffer formamid içerir. Kimyasal bir duman davlumbağı altında tutun.
3. Prob çözeltisi çıkarın ve tekrar kullanmak üzere -20 °C'de sakla.
   NOT: Boyama yoğunluğu düşene kadar prob çözeltilerini tekrar kullanın.
4. Örnekleri 37 °C'de önceden ısıtılmış Prob Yıkama Tamponunda her biri 10 dakika boyunca dört kez yıkayın. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca iki kez yıka, 5x SSCT.
5. Saç tokaları olmadan 100 μL Amplifikasyon Tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın.
6. Termosiklleri 95 °C'ye ısıtın. PCR tüplerini ayırmak için her 3 μM'lik saç tokası stokundan 2 μL ekleyin. Her saç tokası türü için bir tüp hazırlayın.
   NOT: Eğer boyama seyrek nokta veya düşük sinyal-gürültü oranı yaratıyorsa, amplifikatör konsantrasyonunu artırın.
7. Saç tokası 95 °C'de 90 saniye kuluçka yapın. Tüpleri ışıktan koruyun ve en az 30 dakika oda sıcaklığında kuluçka yapın.
8. Amplifikasyon çözeltisi hazırlayın. Amplifikasyon Tamponunda saç tokalarını her örnek için 100 μL nihai hacme ile birleştirin.
9. Örneklerden Amplifikasyon Tamponunu çıkarın. Saç tokası içeren Amplifikasyon Tamponu ekleyin.
   Gece boyunca oda sıcaklığında, ışıktan korunan bir nutator (folyoya sarılı) inkübe yapın.
10. Amplifikasyon çözeltisini çıkarın. Örnekleri 150 μL 5x SSCT'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayın. Numuneleri 10 dakika boyunca 150 μL 5x SSCT'de nutatorda üç kez yıkayın. Deterjanı çıkarmak için nükleaz içermeyen PBS ile iki kısa yıkama yapın.

6. Görüntüleme için beyin montajı

1. Bir görüntü aralığı çıkartmasını cam slayta yapıştırın. Sıkışmış hava kabarcıklarını çıkarmak için forsepsin alt ucuyla hafifçe basın.
2. Beyni, ventral sinir kordonundan pens kullanarak ikiye böl.
3. Beyni boşluk yuvasının ortasına yerleştirin. Dokuyu yan tarafa yönlendirin, optik lob yukarıya bakacak şekilde yönlendirin.
4. Yeterli antiifade montaj ortamı (yaklaşık 25 μL) ekleyin, böylece hava kabarcıkları oluşmadan kuyu doldurulur. Montaj ortamını forseps kullanarak eşit şekilde dağıtın.
5. Numunenin üzerine bir örtü yapıştırın ve oje ile mühürleyin.

Sonuçlar

Gelişimsel nörobiyolojiyi inceleyen bilim insanları için HCR-FISH, gen ifade desenlerini görselleştirmek ve Drosophila optik lobundaki gelişmekte olan nöronların mekansal konumlarını belirlemek için sağlam bir yöntem sunar.

Drosophila optik lobunda (Şekil 2A), medulla nöropil içindeki nöronlar Dış Proliferasyon Merkezi (OPC) adı verilen mekansal desenli nöroepitelden (nöroblastlar) kaynaklanır (

Tartışma

Bu çalışma, HCR-FISH'in Drosophila melanogaster larva optik lobunda kullanılmak üzere adaptasyonunu tanımlar. Geleneksel in situ hibritizasyon yaklaşımları, sınırlı prob penetrasyonu ve düşük sinyal yoğunluğu nedeniyle tüm mount larva beyin dokularında genellikle kötü performans gösterir. Burada sunulan protokol, gelişmekte olan optik lobda boyama kalitesini artırmak için birkaç kritik adımı optimize eder. Drosophila immünohistokimyasında yaygın olarak kullanıl...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10% Tween-20	Bio-Rad Laboratories	1662404	NA
20x PBS, pH7.4	Growcells.com	MRGF-6396	2.74M NaCl, 53.7 mM KCl, 20.3 mM Na2HPO4, 29.4 mM KH2PO4
20x SSC	Quality Biological	351-003-131	3M NaCl, 0.3M Sodium Citrate
37 °C incubator	Fisher Scientific (Isotemp)	15-015-2633	NA
37 °C water bath	Fisher Scientific	FSGPD15D	NA
Aluminum foil	Reynolds Wrap/Fisher Brand	15-078-291	NA
Antibody: Mouse-anti-Abrupt	DSHB	Abrupt; RRID: AB_528344	Dilution: 1:20
Antibody: Chicken anti-GFP	Millipore Sigma	Catalog# 06-896; RRID: AB-619712	Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-GFP	Life Technologies	#11122; RRID: AB_221569	Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-Dll	Genscript/Desplan lab	-	Dilution: 1:200
Antibody: Rat anti-NCadherin	DSHB	DN-Ex #8, RRID: AB_528121	Dilution: 1:50
Antibody: Rabbit anti-SoxN	Genscript/Desplan lab	-	Dilution: 1:200
Antibody: Guinea Pig anti-Traffic jam	Gift from D. Godt	-	Dilution: 1:2,000
Antibody: Donkey anti-Rat 405	Jackson ImmunoResearch	Code # 712-475-150; RRID: AB_2340680	Dilution: 1:100
Antibody: Donkey anti-Chicken 488	Jackson ImmunoResearch	Code #703-545-155; RRID: AB_2340375	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Mouse 488	Jackson ImmunoResearch	Code #715-545-151; RRID: AB_2341099	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit 488	Jackson ImmunoResearch	Code #711-545-152; RRID: AB_2313584	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit A555	Thermo Scientific	Catalog #A-31572; RRID: AB_162543	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat Cy3	Jackson ImmunoResearch	Code #712-165-153; RRID: AB_2340667	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Guinea Pig 647	Jackson ImmunoResearch	Code #706-605-148; RRID: AB_2340476	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat 647	Jackson ImmunoResearch	Code #712-605-153; RRID: AB_2340694	Dilution: 1:200
Antifade mountant	Thermo Fisher Scientific	S36940 (SlowFade Gold Antifade Mountant)	Other slowfades will work as well, including ones with DAPI (S36936)
Confocal Microscope	Zeiss	LSM-880	NA
Cover slips (22 x 30)	VWR	16004-332	NA
Fly: D. melanogaster: ab-GFP-FLAG	BDSC	38626; RRID: BDSC_38626	NA
Fly: D. melanogaster: Canton S	BDSC	64349; RRID: BDSC_64349	NA
Fly: D. melanogaster: dpp-Gal4	BDSC	1553; RRID: BDSC_1553	NA
Fly: D. melanogaster: ham-GFP.FPTB	BDSC	83660; RRID: BDSC_83660	NA
Fly: D. melanogaster: yw; 10xUAS-myr-GFP;	BDSC	32198; RRID: BDSC_32198	NA
Fly: D. melanogaster: UAS-Stinger	BDSC	84277; RRID: BDSC_84277	NA
Fly: D. melanogaster:  wit-KO-Gal4	BDSC	600136; RRID: BDSC_600136	NA
Forceps	Dumont	#5 or #55s	NA
Glass slides	VWR	16005-106	NA
Glycine	Millipore Sigma	G7126-10MG	NA
HCR Amplification buffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	NA
HCR-Gold Amplifiers	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	NA
HCR HiFi Probes	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	NA
HCR Probe Hybridization Buffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	Contains formamide
HCR Probe Wash Buffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	Contains formamide
Nail polish (clear)	Electron Microscopy Sciences	72180	NA
Nuclease-free water (not DEPC-treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9937	NA
Nutating mixer	Corning/Fisher Scientific	10-320-100	NA
Paraformaldehyde, 16% (w/v)	Electron Microscopy Sciences	15710	Toxic
PCR Machine/Thermal Cycler	Bio-Rad	1851148 (C1000 Touch Thermal Cycler)	NA
PCR pull-apart tube strips with dome cap strips (0.2 mL)	USA Scientific	#1402-2400	NA
Petri dishes (150 x 15 mm; for making dissecting dishes)	Fisher Scientific	FB0875714	NA
RNase ZAP	ThermoFisher Scientific	AM9780	NA
Slide spacer stickers	SUNJin	IS016 (iSpacer stickers (0.2 mm deep))	NA
Sylgard elastomer kit (for making dissecting dishes)	Fisher Scientific	NC9285739	NA
Triton X-100	Merck Millipore Sigma	X100	NA