Schwann Hücrelerinin Uzaktan ve Kontrol Edilebilir Mekanostimülasyonu ile Gerçek Zamanlı Konfokal Görüntüleme için Manyetik Nano-Aktüasyon Platformu

Yang Wang; Ting Liu; Mingxi Yang; Chong Qi; Bin Liu

doi:10.3791/71685

Yöntem makalesi

Schwann Hücrelerinin Uzaktan ve Kontrol Edilebilir Mekanostimülasyonu ile Gerçek Zamanlı Konfokal Görüntüleme için Manyetik Nano-Aktüasyon Platformu

21 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71685

⸱

8 Eylül 2026

Yang Wang¹^,² , Ting Liu³ , Mingxi Yang¹^,² , Chong Qi⁴ , Bin Liu¹^,²

¹Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, ²Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, ³International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin Universit, ⁴Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

Bu makalede

Özet

Bu protokol; Schwann hücrelerini uzaktan ve kontrollü bir şekilde uyarmak ve mekanosensör yanıtlarını dinamik olarak izlemek için floresan süperparamanyetik nanoparçacıklar, kalibre edilmiş bir elektromıknatıs ve gerçek zamanlı konfokal görüntülemeyi entegre eden, mikroskopla uyumlu bir manyetik nano-aktüasyon platformu sunmaktadır.

Özet

Mekanik kuvvetler hücresel davranışı kritik bir şekilde düzenler; ancak mevcut mekanik stimülasyon yöntemlerinin çoğu doğrudan fiziksel temasa veya yapay olarak tasarlanmış hücre dışı ortamlara dayalıdır, bu da dinamik canlı hücre çalışmalarındaki esnekliklerini kısıtlamaktadır. Burada, Schwann hücrelerinin in vitro ortamda uzaktan, temassız ve kontrol edilebilir mekanostimülasyonu için bir manyetik nano-aktüasyon platformu sunuyoruz. Bu entegre düzenek, aynı deneysel seansta uzaktan manyetik stimülasyona ve senkronize canlı hücre görüntülemesine olanak tanır. Bu makale; floresan süperparamanyetik nanopartiküllerin (SPION'lar), isteğe bağlı olarak aktin hedefli fonksiyonelleştirilmiş SPION'ların (f-SPION'lar) hazırlanmasını, mikroskopla uyumlu bir elektromanyetik stimülasyon cihazının kurulumunu ve kalibrasyonunu, tek partikül ve tek hücre düzeylerindeki manyetik kuvvetlerin tahminini ve manyetik aktüasyonun gerçek zamanlı konfokal görüntüleme ile entegrasyonunu açıklamaktadır. Schwann hücreleri, periferik sinirlerin gelişimi, korunması ve onarımında temel roller oynayan, mekanik uyarılara karşı oldukça hassas glial hücrelerdir. Mekanik stimülasyona verdikleri yanıtların gerçek zamanlı olarak izlenmesi, mekanik kuvvetlerin hücre iskeleti organizasyonunu ve hücresel davranışı nasıl etkilediğini anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu platform, Schwann hücresi mekanobiyolojisini incelemek için tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar ve mekanik yanıt veren diğer hücre tiplerine ve çok hücreli sistemlere uyarlanabilir.

Giriş

Mekanik uyaranlar; adezyon, migrasyon, proliferasyon, diferansiyasyon ve fenotipik plastisite dahil olmak üzere geniş bir yelpazedeki hücresel süreçleri düzenler¹^,²^,³. Mekanobiyoloji çalışmaları, hem nöronların hem de glial hücrelerin gelişim boyunca belirgin bir mekanosensitivite ve yanıt verme kapasitesi sergilediğini göstermiştir⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Hücrelerin kuvveti nasıl algıladığını ve buna nasıl yanıt verdiğini araştırmak için; atomik kuvvet mikroskobu (AFM), mikropipet aspirasyonu, optik cımbızlar, germe tabanlı kültür sistemleri ve mikroakışkan platformlar dahil olmak üzere çok sayıda deneysel yaklaşım geliştirilmiştir⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Bu teknikler, mekanotransdüksiyon çalışmalarını büyük ölçüde ilerletmiştir. Ancak, birçoğu hücrelerle doğrudan fiziksel temas gerektirmekte veya önceden tanımlanmış yapay mekanik ortamlara bağımlı kalmaktadır; bu durum onları uzaktan, dinamik olarak kontrol edilebilir ve görüntüleme ile uyumlu stimülasyonlar için daha az uygun hale getirmektedir.

Manyetik nanopartikül aracılı kuvvet iletimi, uzaktan mekanostimülasyon için alternatif bir strateji sunar¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Çoğu biyolojik doku düşük manyetik duyarlılık sergilediği için, dışarıdan uygulanan manyetik alanlar biyolojik örneklere doğrudan temas etmeden nüfuz edebilir ve hücrelere veya dokulara iletilen manyetik yanıt veren partiküller üzerinde seçici olarak etki gösterebilir. Bir manyetik alan gradyanı varlığında, bu partiküller hücre altı, hücresel veya doku düzeyinde mekanik perturbasyonlar oluşturmak için kullanılabilecek yönlü kuvvetlere maruz kalırlar⁸^,⁹. Temassız, ayarlanabilir olması, canlı görüntüleme ile uyumlu olması ve potansiyel olarak daha karmaşık biyolojik sistemlere genişletilebilir olması nedeniyle bu yaklaşım oldukça caziptir.

Schwann hücreleri, periferik sinir gelişimi, bakımı ve onarımında kritik roller oynayan,¹⁹^,²⁰ oldukça mekanosensitif glial hücrelerdir²¹^,²².Schwann hücrelerinin fiziksel stimülasyona verdiği yanıtların dinamik olarak gözlemlenmesi, kuvvetin hücre iskeleti organizasyonunu ve hücre davranışını nasıl düzenlediğini anlamak açısından önemlidir. Ancak, geleneksel kuvvet uygulama sistemlerinin çoğu, gerçek zamanlı yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile kolayca uyumlu değildir. Bu kısıtlamayı gidermek için aktin hücre iskeletini hedefleyen floresan manyetik süperpartikülleri (f-SPIONs), konfokal mikroskop tablası ile uyumlu özel bir elektromanyetik cihazı ve kuvvet tahmini için kantitatif bir çerçeveyi birleştiren manyetik nano-aktüasyon platformu geliştirdik. Bu entegre kurulum, aynı deneysel oturumda uzaktan manyetik stimülasyonu ve senkronize canlı hücre görüntülemeyi mümkün kılmaktadır.

Burada açıklanan iş akışı; floresan manyetik süperpartiküllerin (SPIONs) hazırlanmasını, f-SPIONs oluşturmak için isteğe bağlı falloidin tabanlı aktin hedefleme fonksiyonelleştirmesini, nanopartikül karakterizasyonunu, elektromanyetik cihaz kurulumu ve alan kalibrasyonunu, manyetik kuvvet tahminini ve gerçek zamanlı konfokal görüntüleme ile kombine edilmiş manyetik stimülasyonu içermektedir. Burada Schwann hücreleri için optimize edilmiş olsa da, bu platform mekanik olarak yanıt veren diğer canlı sistemlerdeki ilgili çalışmalar için pratik bir çerçeve sağlayabilir.

Protokol

Bu protokolde açıklanan deneylerde yerleşik bir sıçan Schwann hücresi hattı (RSC96) kullanılmış olup, insan katılımcılar veya canlı hayvanlar yer almamıştır. Bu çalışma, Jilin Üniversitesi Birinci Hastanesi Hayvan Refahı ve Etik Kurulu tarafından onaylanan (Onay No. 202-045), hayvan deneylerini içeren daha geniş kapsamlı bir araştırma projesinin parçası olarak yürütülmüştür.

1. Floresan manyetik süperpartiküllerin hazırlanması

Oleik asit kaplı Fe₃O₄ nanoparçacıklar sentezleyin.
NOT: Oleik asit kaplı Fe₃O₄ nanoparçacıklar, daha önce açıklandığı gibi termal bozunma yoluyla sentezlenmiştir²⁰^,²³.
1. Bir reaksiyon balonuna 20 mL benzil eter içerisine 2 mmol Fe(ac)₃, 6 mmol oleik asit, 6 mmol oleilamin ve 5 mmol 1,2-heksadekanediol ekleyin.
2. Homojen bir öncül çözelti elde edilene kadar karışımı azot atmosferi altında 15 dk karıştırın.
3. Karışımı 20 °C/dk hızla 20 °C'ye ısıtın.
4. Reaksiyonu 30 dk boyunca 200 °C'de tutun.
5. Sıcaklığı 265 °C'ye çıkarın ve karışımı 30 dk boyunca geri soğutun.
6. Reaksiyon karışımının oda sıcaklığına doğal olarak soğumasını bekleyin.
7. Fe₃O₄ nanoparçacıkları manyetik ayırma ile toplayın.
8. Nanoparçacıkları etanol ile 3 kez yıkayın.
9. Saflaştırılmış nanoparçacıkları toluen içerisinde yeniden dağıtın.
Fe₃O₄·Cy3.5 süperparçacıklar oluşturun.
NOT: Fe₃O₄·Cy3.5 süperparçacıklar, daha önce açıklandığı gibi hazırlanmıştır²⁰^,²⁴^,²⁵.
1. 50 mL'lik üç boyunlu yuvarlak tabanlı bir balonda 28 mg oleik asit kaplı Fe₃O₄ nanoparçacığı 4 mL toluen içerisinde dağıtın.
2. 12,5 mL su içerisinde 12,5 mg sodyum dodesil sülfat ve 3 mg Cyanine 3.5 (Cy 3.5) içeren bir sulu faz hazırlayın.
3. Su içinde yağ mikroemülsiyonu oluşturmak için toluendeki Fe₃O₄ nanoparçacık süspansiyonunu (4 mL'de 28 mg; 7 mg/mL), sulu sürfaktan/boya çözeltisi ile birleştirin.
4. Kararlı bir emülsiyon elde edilene kadar iyice karıştırın.
5. Üç boyunlu yuvarlak tabanlı balonu 60 °C'ye ısıtın ve 6 saat boyunca sürekli 300 rpm'de karıştırın.
  NOT: İndirgenmiş basınç veya döner evaporasyon prosedürüne gerek yoktur.
6. Fe₃O₄ nanoparçacıklarının agregasyonunu tetiklemek için tolueni yukarıda açıklanan koşullar altında uçurun. Tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanarak çözeltiden küçük bir alikotu bir deney tüpüne aktarın ve bekletin. Faz ayrımının olmaması, toluenin tamamen uzaklaştırıldığını gösterir.
7. Fe₃O₄·Cy3.5 süperparçacık süspansiyonunu 15 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın. Süperparçacıkları toplamak için oda sıcaklığında 5 dk boyunca 2.370 × g hızda santrifüjleyin ve pellet'i bozmadan süpernatantı dikkatlice dökün.
8. Pellet'i ultra saf deiyonize su içerisinde yeniden dağıtın ve oda sıcaklığında 5 dk boyunca tekrar 2.370 × g hızda santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve kalıntı serbest Cy3.5 boyasını ve sodyum dodesil sülfatı uzaklaştırmak için yıkama prosedürünü üç kez tekrarlayın.
Süperparçacıkları polidopamin (PDA) ile kaplayın.
NOT: Polidopamin kaplı süperparçacıklar, daha önce açıklandığı gibi hazırlanmıştır²⁰^,²⁶.
1. Fe₃O₄·Cy3.5 süperparçacık süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dk boyunca 2.370 × g hızda santrifüjleyin ve süpernatantı dökün.
2. Pellet'i 10 mM Tris tamponu (pH 8,5) içerisinde yeniden dağıtın.
3. Süspansiyona 26 mg dopamin monomeri ekleyin.
4. Karışımı alkali koşullar altında oda sıcaklığında 3 saat karıştırın.
5. Süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dk boyunca 2.370 × g hızda santrifüjleyin.
6. Süpernatantı uzaklaştırın ve Fe₃O₄·Cy3.5@PDA parçacıkları (SPION'lar) elde etmek için pellet'i ultra saf su içerisinde yeniden dağıtın.
İsteğe bağlı olarak parçacıkları phalloidin-Alexa Fluor 350 ile fonksiyonelleştirin.
NOT: Süperparçacıklar, ticari olarak mevcut phalloidin-Alexa Fluor 350 kullanılarak yüzey-fonksiyonelleştirilmiştir²⁰.
1. 10 ünite phalloidin-Alexa Fluor 350 içeren 5 mL sulu çözelti hazırlayın.
2. Çözeltiye 2 mg parçacık içeren 20 µL Fe₃O₄·Cy3.5@PDA süspansiyonu ekleyin.
3. Karışımı oda sıcaklığında 24 saat boyunca nazikçe karıştırın.
4. Karışımı oda sıcaklığında 5 dk boyunca 2.370 × g hızda santrifüjleyin.
5. Süpernatantı dökün ve pellet'i deiyonize su içerisinde yeniden dağıtın.
6. Nihai Fe₃O₄·Cy3.5@PDA@phalloidin (f-SPION'lar) formülasyonunu kullanıma kadar ışıktan koruyarak saklayın.

2. Nanopartiküllerin karakterizasyonu

Morfoloji ve boyutun belirlenmesi.
1. Nanopartikül örneklerini, cihaz gereksinimlerine uygun olarak transmisyon elektron mikroskobu (TEM) veya yüksek çözünürlüklü transmisyon elektron mikroskobu (HRTEM) için hazırlayın.
2. Genel partikül morfolojisini, çekirdek-kabuk yapısını ve ortalama çapı belirlemek için görüntüler edinin (Şekil 1).
3. Dinamik ışık saçılımı (DLS) için sulu nanopartikül süspansiyonları hazırlayın.
4. Hidrodinamik çapı ve polidispersite indeksini (PDI) ölçün.
5. Formülasyon üniformitesini ve kolloidal davranışı değerlendirmek için elektron mikroskobu ve DLS sonuçlarını karşılaştırın.
Manyetik özelliklerin belirlenmesi.
1. Süperiletken kuantum girişim cihazı (SQUID) analizine uygun, kurutulmuş veya konsantre nanopartikül örnekleri hazırlayın.
2. 30 K'de manyetik histerezis eğrilerini kaydedin.
3. Doygunluk manyetizasyonunu, remanansı ve koersiviteyi belirleyin.
4. Partiküllerin, ihmal edilebilir remanans ve koersivite ile süperparamanyetik davranış sergilediğini doğrulayın.
Floresan özelliklerin belirlenmesi.
1. Ultrapure deiyonize suda bir f-SPION süspansiyonu hazırlayın ve süspansiyonu bir kuvars küvete aktarın.
2. Bir floresan spektrofotometre kullanarak fotolüminesans spektrumlarını kaydedin.
3. Yıkama ve yeniden süspansiyon sonrası floresan sinyalinin saptanabilir düzeyde kaldığını doğrulayın.
Hedeflenmiş formülasyon kullanıldığında aktinle ilişkili lokalizasyonun doğrulanması.
1. RSC96 hücreleri temin edin.
  NOT: Bu çalışmada kullanılan, primer sıçan Schwann hücrelerinin uzun süreli kültürü yoluyla oluşturulmuş kendiliğinden transforme bir sıçan Schwann hücre hattı olan RSC96 hücreleri, Çin Bilimler Akademisi Hücre Bankası'ndan (Şanghay, Çin) temin edilmiş (CSTR: 19375.09.3101RATGNR6) ve mikoplazma ile fungal kontaminasyon açısından negatif test edilmiştir. 3–10 pasajındaki hücreler kullanılmıştır.
2. Hücreleri, %10 fetal bovin serum (FBS) ve %1 penisilin–streptomisin çözeltisi (10 U/mL penisilin ve 10 µg/mL streptomisin) ile desteklenmiş Dulbecco modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) kültüre edin.
3. RSC96 hücrelerini 35 mm'lik hücre kültürü mikroskopi tabağı başına 1 × 10⁵ hücre yoğunluğunda ekimleyin ve hücrelerin tutunmasını sağlamak için %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de 24 sa boyunca kültüre edin.
4. Mevcut kültür besiyerini aspire edin, hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın ve 15 µg/mL f-SPION içeren komple kültür besiyeri ekleyin. Hücreleri f-SPION'lar ile 12 sa boyunca inkübe edin.
5. Kültür besiyerini aspire edin ve internalize olmamış partikülleri tamamen uzaklaştırmak için hücreleri 1 mM deferoksamin içeren buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.
6. Partiküllerin hücre içi dağılımını değerlendirmek için konfokal görüntüler edinin. Hücre içi yapıların yüksek çözünürlüklü optik kesitlerini elde etmek için görüntüleme parametrelerini 1 Airy ünitesi (AU) pinhole ve 0.43 µm z-adımı olarak ayarlayın.
7. Partiküllerin aktinle ilişkili hücresel bölgelerde zenginleşme gösterip göstermediğini inceleyin.

3. Elektromanyetik stimülasyon cihazının kurulumu ve kalibrasyonu (Şekil 2)

Elektromanyetik cihazı monte edin.
1. Konfokal mikroskop tablasına ve canlı hücre odasına sığacak boyutlarda kompakt bir elektromanyetik bobin sistemi kurun (Şekil 2A,B).
2. Bobini kontrol edilebilir bir güç kaynağına veya harici bir akım kaynağına bağlayın.
3. COMSOL Multiphysics 4.3b kullanarak gradyan manyetik alan ortamını sayısal olarak simüle edin (Şekil 2C,D).
4. Elektromıknatısın farklı giriş akımları altında ilgili gradyan manyetik alanı (GMF) oluşturduğunu doğrulayın (Şekil 2G).
Manyetik akı yoğunluğunu ölçün ve gradyan manyetik alanı kalibre edin.
1. Elektromıknatısı, kutup ucu kabın merkezine bakacak ve kabın dış duvarından 1 mm uzağa konumlanacak şekilde kültür kabının yanına yerleştirin (Şekil 2E,F).
2. Sonraki tüm canlı hücre manyetik kuvvet stimülasyonu ve görüntüleme deneyleri boyunca, elektromıknatıs ile kültür kabı arasındaki bu göreli geometrik konfigürasyonu koruyun.
3. Kültür kabının altındaki konumlandırma ızgarasını uzaysal referans olarak kullanarak, stimülasyon bölgesi içindeki önceden belirlenmiş konumlarda manyetik akı yoğunluğunu ölçmek için dijital bir Gauss metre kullanın.
4. Yerel alan gradyanını, manyetik akı yoğunluğundaki uzaysal değişime göre hesaplayın.
5. Sayısal olarak simüle edilen manyetik alan gradyanını, deneysel olarak ölçülen ve hesaplanan manyetik alan gradyanı değerlerini kullanarak kalibre edin ve doğrulayın.

4. Platform tarafından iletilen manyetik kuvvetlerin tahmini.

Kuvvet tahmin modelini tanımlayın.
1. Homojen olmayan bir manyetik alan içindeki manyetik nanopartiküller için kuvvet denklemini kullanın²⁷^,²⁸:
2. Uygulanan alanla süperparamanyetik hizalanma varsayımı altında, denklemi şu şekilde sadeleştirin:
  $Manyetik kuvvet denklemi $F_{\text{f-SPION}}=m\frac{dB}{dr}$; manyetik alan çalışması için formül.$
  burada:
  F nanomanyetik kuvvet midir
  m manyetik dipol momentidir
  manyetik alan gradyanıdır
  dB/dr ilgili manyetik alan oluşturma cihazı tarafından üretilen manyetik alan gradyanıdır (T/m).
3. Tüm hesaplamalarda, kalibre edilmiş cihazdan elde edilen ölçülmüş alan gradyanını kullanın.
Tek bir nanoparçacığe etki eden kuvveti tahmin edin.
1. HRTEM görüntülerinden ortalama partikül boyutlarını belirleyin.
2. Küresel geometri varsayılarak manyetik çekirdek hacmini hesaplayın.
3. Çekirdeğin manyetik fraksiyonuna dayanarak Fe₃O₄'e özgü manyetik hacmi tahmin edin.
4. ...-e göre manyetik dipol momentini hesaplayın $Kimyasal kütle hesaplama formülü $m=\rho \cdot V \cdot M_m$, stokiyometri denklemi.$
  burada:
  M_m f-SPION'ların kütle mıknatıslanmasını temsil eder (16 A·m²verilen alan şiddeti altında /kg);
  ρ Fe₃O₄'ün yoğunluğu (5,24 g/cm³³).
  V her bir f-SPION içerisindeki Fe₃O₄ manyetik çekirdeğinin hacmi (5,89 × 10⁻¹⁷ cm³).
5. Tek bir nanoparçacığa etki eden kuvveti tahmin etmek için dipol momentini ölçülen alan gradyanı ile çarpın ().
Schwann hücresi başına nanoparçacık alımını tahmin edin.
1. RSC96 Schwann hücrelerini 5 × 10 yoğunluğunda ekleyin⁵ 35 mm hücre kültürü mikroskopi kaplarındaki kuyuk başına hücre sayısı.
2. Hücreleri standart kültür koşulları altında 24 saat inkube edin.
3. Besiyerini, şunları içeren taze besiyeri ile değiştirin: 15 µg/mL f-SPIONlar.
4. Hücreleri 12 saat daha inkübe edin.
5. Hücreleri, 1 mM deferoksamin içeren buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin ile iki kez yıkayın.
6. Hücreleri toplayın ve sayın.
7. İndüktif eşleşmiş plazma atomik emisyon spektroskopisi (ICP-AES) kullanarak hücre içi demir içeriğini ölçün.
8. Hücre başına ortalama demir kütlesinin, partikül başına düşen demir kütlesine bölünmesiyle hücre başına internalize olan partikül sayısı hesaplanır. .
Tek bir Schwann hücresine iletilen kuvveti tahmin edin.
1. şuna göre hücre düzeyindeki kuvveti hesaplayın
  
  burada:
  tek bir f-SPION üzerine uygulanan manyetik kuvvettir.
  $SPION konsantrasyon denklemi, $ n^\text{f-SPIONs}_\text{cell} $, bilimsel gösterim, diyagram.$ hücre başına internalize edilen f-SPION sayısıdır.
  F_hücre tek bir hücreye uygulanan manyetik kuvvettir.
2. Elde edilen değeri, tek bir Schwann hücresine uygulanan tahmini manyetik kuvvet olarak raporlayın (F_hücre).
3. Değerin, doğrudan bir hücre içi kuvvet ölçümü değil, modele dayalı bir tahmin olduğu açıkça belirtilmelidir.

5. Manyetik stimülasyonun gerçek zamanlı konfokal lazer tarama mikroskobisi (CLSM) görüntüleme ile birleştirilmesi

Schwann hücrelerini manyetik nanoparçacıklarla yükleyin.
1. Schwann hücrelerini görüntülemeyle uyumlu ibidi kültür kaplarına veya mikroakışkan kültür odacıklarına ekin.
2. Hücrelerin yapışması ve toparlanması için bekleyin.
3. Mevcut besiyerini, 15 µg/mL f-SPIONs içeren taze kültür besiyeri ile değiştirin.
4. f-SPION yüklenmesini sağlamak için hücreleri 12 h inkübe edin.
5. Devam etmeden önce hücre morfolojisini inceleyin.
İçselleştirilmemiş parçacıkları uzaklaştırın.
1. Nanoparçacık içeren besiyerini uzaklaştırın.
2. Hücreleri, 1 mM deferoksamin içeren PBS ile iki kez yıkayın.
3. Yıkama solüsyonunu, görüntülemeyle uyumlu canlı hücre besiyeri ile değiştirin.
4. Görüntüleme öncesinde düşük hücre dışı parçacık arka planını doğrulayın.
Elektromıknatıs cihazını CLSM görüntüleme sistemi ile entegre edin.
1. Elektromıknatısı, önceden kalibre edilmiş konumuna yerleştirerek canlı hücre kültür odacığı ile monte edin.
2. Monte edilmiş canlı hücre kültür odacığını konfokal mikroskobun tablasına yerleştirin (Şekil 3). Kültür kabının etkili stimülasyon bölgesi içinde bulunduğunu doğrulayın (Şekil 3A).
3. Elektromıknatısı önceden ayarlanmış parametrelere göre enerjilendirin ve kültür kabı alanında etkili gradyan manyetik alan maruziyetini doğrulayın (Şekil 3B).
4. Objektif lensin herhangi bir girişim olmaksızın odak düzlemine ulaşabildiğini doğrulayın.
5. Cihazın objektif konumlandırmasını veya tabla hareketini engellemediğini doğrulayın.
6. Elektromıknatıs çalışması sırasında oluşan ısıyı göz önünde bulundurarak, 37 °C ve 5% CO₂ internal ortamı sağlamak için canlı hücre odacığı bileşenlerinin sıcaklık ayarlarını önceden belirlenmiş optimal kültür koşullarına göre ayarlayın (Şekil 3C).
7. Tüm sistemin normal ve stabil çalıştığını doğrulayın.
Canlı hücrelerde fonksiyonel Ca²⁺ görüntüleme.
1. Hücreleri 3 µM Fluo-4 AM ve 0.1% Pluronic F-127 içeren Krebs–Ringer solüsyonu (pH 7.4) ile 37 °C'de 30 min inkübe edin.
2. İnkübasyon sonrası kültürleri PBS ile iki kez yıkayın ve görüntüleme için CLSM sisteminin canlı hücre görüntüleme platformuna aktarın (Şekil 4A).
3. ibidi kültür kabının altındaki konumlandırma ızgarasını kullanarak önceden tanımlanmış beş konumu görüntüleyin.
4. Her görüntüleme alanını eşit olarak 25 bölgeye ayırın ve bölgedeki gerçek hücre yoğunluğuna bağlı olarak floresans kantifikasyonu için her bölgeden 0–3 hücre seçin.
5. Tek bir hücrenin tam dış hattını ilgi bölgesi (ROI) olarak tanımlayın ve ROI içindeki floresans yoğunluğu değişikliklerini (ΔF) analiz ederek manyetik olarak indüklenen kalsiyum yanıtını izleyin.
6. Floresans yoğunluğundaki değişimi ΔF = (F_stim- F₀) olarak hesaplayın. Stimülasyon öncesi ve sonrası floresans yoğunluğundaki değişimin (ΔF/F₀) %10'u aşmasını bir kalsiyum yanıt olayı olarak kabul edin.
  NOT: F_unstim manyetik kuvvet stimülasyonu öncesindeki floresans yoğunluğunu, F₀ bazal floresans yoğunluğunu ve F_stim manyetik kuvvet stimülasyonu sonrası uyarılmış floresans yoğunluğunu temsil eder.
7. Arka plan düzeltmesi için, hücre bulunmayan bir bölgede ölçülen ortalama arka plan floresans yoğunluğunu her bir ROI'nin floresans yoğunluğu değerinden çıkarın.
8. Her bir deneyde bir kültür kabı olacak şekilde üç bağımsız deney gerçekleştirin.
Zaman ayarlı (time-lapse) görüntüleme yapın ve görüntüleme sırasında manyetik stimülasyon uygulayın.
1. Zaman ayarlı görüntüleme parametrelerini şu şekilde ayarlayın: kare başına 2.1 s kazanım aralığı, toplam 650 s kazanım süresi ve 1 AU kullanılarak standart yüksek çözünürlüklü optik kesit görüntüleme.
2. Hücresel görüntüleme sırasında, manyetik kuvvet stimülasyonu yokluğunda hücre içi kalsiyum floresans yoğunluğunu (F_unstim) kaydetmek için akım girişi olmadan 50 s boyunca sürekli görüntüler alın (Şekil 2H ve Şekil 4B).
3. İlk 50 s boyunca kaydedilen floresans yoğunluğunu normalize edin ve bunu bazal floresans yoğunluğu (F₀) olarak tanımlayın.
4. Ardından, elektromıknatısa 3.0 A sabit akım girişi uygulayarak, manyetik nanoparçacıklarla yüklü Schwann hücrelerini 3.25 T/m gradyan manyetik alana maruz bırakın ve böylece onları manyetik kuvvet stimülasyonuna tabi tutun. Manyetik kuvvet stimülasyonu sırasında hücre içi kalsiyum floresans yoğunluğunu (F_stim) kaydetmek için zaman ayarlı görüntülemeye 10 min boyunca devam edin (Şekil 2H ve Şekil 4C).
5. Floresans yoğunluğundaki değişimi ΔF/F₀ olarak kantitatif olarak hesaplayın (Şekil 4D,E).
İstatistiksel analiz yapın ve Ca²⁺ floresans verilerini analiz edin.
1. Her bir hücre için, analiz edilen zaman serisi boyunca medyan ΔF/F₀ değerini hesaplayın ve bu değeri hücre düzeyindeki Ca²⁺ yanıt metriği olarak kullanın.
2. Her deneysel koşul için, her deneyde koşul başına bir kültür kabı olacak şekilde üç bağımsız deney gerçekleştirin. Tanımlayıcı sunum için üç bağımsız deneyde analiz edilen hücreleri havuzlayın ve n değerini her grupta analiz edilen toplam hücre sayısı olarak raporlayın.
3. Hücre düzeyindeki ΔF/F₀ verilerinin normalliğini Kolmogorov-Smirnov testi ile değerlendirin.
4. Ca²⁺ floresans yanıt verileri normal dağılmadığı için verileri medyan ve çeyrekler arası aralık (IQR) olarak sunun.
5. Gruplar arasındaki farkları, daha önce rapor edildiği gibi, önce parametrik olmayan Friedman testi, ardından ikili karşılaştırmalar için Wilcoxon işaretli sıra testleri kullanarak analiz edin.
6. İstatistiksel anlamlılığı belirtmek için P < 0.05 değerini esas alın.

Sonuçlar

Yüksek çözünürlüklü transmisyon elektron mikroskopisi (HRTEM), nihai nanoparçacık formülasyonunun yüzey modifikasyonundan sonra kümelenmiş bir manyetik çekirdeğe ve bir dış kabuğa sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 1). Nihai f-SPION'lar, yaklaşık 56.60 ± 6.19 nm boyutunda Fe₃O₄ açısından zengin bir manyetik çekirdek ve yaklaşık 5.79 ± 1.36 nm ortalama kalınlığında polidopamin ile phalloidin-Alexa Fluor 350'den oluşan bir dış kabuk ile birlikte 63.36 ± 16.65 nm ortalama genel çapa sahipti. Bu sonuçlar, manyetik aktivasyon ve floresan tabanlı görselleştirme için uygun bir süperparçacık mimarisinin başarıyla oluşturulduğunu doğrulamıştır.

Manyetik histerezis analizi, partiküllerin ihmal edilebilir remanans ve koersivite ile belirgin süperparamanyetik davranış sergilediğini göstermiştir. Uygulanan 10,00 Oe (1.0 T) manyetik alan altında, doygunluk mıknatıslanmaları yaklaşık 35 A·m²/kg değerine ulaşmıştır (Şekil 5). Bir manyetik alan gradyanı yokluğunda, f-SPION'lar sulu ortamda iyi dağılabilirlik sergilemiştir (Şekil 6A). Gradyan bir manyetik alana maruz kaldıklarında, f-SPION'lar hassas manyetik yanıt vermişlerdir (Şekil 6B). Floresans analizi, partiküllerin sentez ve yüzey modifikasyonu sonrası optik tespit edilebilirliğini koruduğunu daha da doğrulamıştır (Şekil 7).

Elektromanyetik stimülasyon cihazı, canlı hücre görüntüleme sistemine başarıyla entegre edilmiştir (Şekil 3). Manyetik alan kalibrasyonu, cihazın hücre kültürü bölgesi boyunca stabil bir gradyan manyetik alan oluşturduğunu göstermiştir (Şekil 2E,F); mevcut deneysel konfigürasyon altında in vitro gradyan manyetik alan yaklaşık 3.25 T/m olarak belirlenmiştir (Şekil 2G).

Konfokal görüntüleme, floresan manyetik nanoparçacıkların Schwann hücrelerine etkin bir şekilde yüklendiğini göstermiştir (Şekil 7). Yıkama işleminden sonra floresans sinyali, ortamdaki serbest parçacıklardan ziyade temel olarak hücrelerle ilişkili kalmaya devam etmiştir. Aktin hedefli formülasyon için konfokal görüntüleme, parçacıkların aktinle ilişkili hücresel bölgelerde zenginleştiğini daha ayrıntılı bir şekilde göstermiştir.

Zaman ayarlı konfokal görüntüleme, stimülasyon süresi boyunca hücrelere kararlı optik erişim sağlanırken, manyetik stimülasyonun ve canlı hücre görüntülemenin aynı deneysel iş akışı dahilinde gerçekleştirilebileceğini göstermiştir (Şekil 2H ve Şekil 4A).

Nicel bir özet; nanoparçacık tasarımını, cihaz kalibrasyonunu ve hücresel yüklemeyi birbirine daha fazla bağlamıştır. 3.25 T/m in vitro gradyan manyetik alan altında, tek bir f-SPION üzerine etki eden manyetik kuvvetin yaklaşık 1.59 × 10^-5 pN olduğu tahmin edilmiştir. Hücre içi demir miktar belirlemesine dayanarak, her bir RSC96 Schwann hücresinin yaklaşık 9.30 ± 2.8 × 10³ parçacık internalize ettiği, bunun da hücre başına yaklaşık 0.15 ± 0.05 pN tahmini toplam manyetik kuvvete karşılık geldiği hesaplanmıştır.

Bazal floresansa kıyasla, f-SPION'lar aracılığıyla uygulanan manyetik stimülasyon altında, RSC96 hücreleri aktif Ca²⁺ dinamikleri ve önemli ölçüde artmış Ca²⁺ floresans sinyalleri sergilemiştir (Şekil 4D). Ca²⁺ floresans sinyallerinin kantitatif analizi, manyetik stimülasyon grubundaki RSC96 hücrelerinde meydana gelen Ca²⁺ floresans yoğunluğu değişiminin (ΔF/F₀) (62,96 [35,07–91,67]), normal kontrol grubuna (-5,74 [-15,6–1,20]), f-SPION'lar kontrol grubuna (-16,70 [-2,02–-12,0]) ve gradyan manyetik alan kontrol grubuna (-12,90 [-21,24–-6,97]) göre anlamlı derecede daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 4E).

TEM görüntülerinde nanopartikül yapısı; kümelenmiş nanopartikül detaylarını gösteren elektron mikroskobu analizi.
Şekil 1HRTEM ile f-SPION'ların morfolojisi ve çekirdek-kabuk yapısı. (A) f-SPION'lar küreseldir ve Fe₃O₄ nanopartikülleri ile Cy3.5'ten oluşan dahili bir manyetik çekirdeğe sahip tipik bir çekirdek-kabuk yapısı sergilerler.B) Dış kabuk, PDA ve falloidin-Alexa Fluor 350'den oluşmaktadır. Panel B'deki görüntüler, panel A'daki kırmızı kutuyla işaretlenmiş bölgelerin temsilci büyütülmüş görünümlerini göstermekte olup, beyaz çizgiler ve oklar ölçülen kabuk kalınlığını belirtmektedir. Panel B'deki ölçek çubuğu 10 nm'yi temsil etmektedir. Toplam 680 nanoparçacığın analiz edildiği üç bağımsız ölçüm gerçekleştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bakır tel ve demir çekirdek içeren elektromanyetik cihaz şeması; manyetik alan simülasyonları; grafiğe dökülmüş alan.
Şekil 2Canlı hücre manyetik stimülasyonu için özel elektromıknatısın kurulumu, kalibrasyonu ve çalıştırılması. (A,B) Elektromıknatıs bobini, 1,1 mm emaye bakır tel kullanılarak bir demir çekirdek etrafına toplam 410 sarım şeklinde sarılmıştır. Bobinin dış çapı 60 mm, iç çapı 20 mm, uzunluğu 110 mm ve doğru akım direnci yaklaşık 1,2 Ω'dur. 13,0 mm × 12,0 mm × 3,0 mm (uzunluk × genişlik × yükseklik) ölçülerindeki kutup ucu, 1J50 permalloy'den imal edilmiştir.C,DElektromıknatısın maksimum giriş akımı 3 A'i geçmemiştir. 3 A giriş akımında, kutup ucuna yakın bölgede yaklaşık 6,7 T/m'lik bir manyetik alan gradyenti oluşturulmuştur.E,F) 3 A giriş akımında, kutup ucuna yakın kültür kabı içindeki gradyan manyetik alanın dağılımı. Hücresel görüntüleme bölgesi boyunca yaklaşık 3,25 T/m'lik ortalama bir statik manyetik alan gradyanı oluşturulmuştur. (G) 1 A, 2 A ve 3 A'lik farklı giriş akımlarında elektromıknatıs tarafından oluşturulan manyetik alan gradyanları. (H) Bu çalışmadaki canlı hücre zaman ayarlı görüntüleme, akım uygulaması ve gradyan manyetik alan maruziyeti protokolü. Zaman ayarlı görüntüler, akım girişi olmadan 50 saniye boyunca sürekli olarak elde edilmiştir. Ardından 3,0 A'lik sürekli sabit bir akım uygulanmış ve zaman ayarlı görüntülemeye 10 dakika boyunca devam edilmiştir. DC: Doğru akım. GMF: Gradyan manyetik alan. E, F ve G panelleri Liu ve arkadaşlarından alınan izinle uyarlanmıştır.²⁰. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

CLSM görüntüleme, elektromıknatıs, ısıtıcılar ve doğru akım düzeneğine sahip canlı hücre kültür odacığı.
Şekil 3Elektromıknatısın canlı hücre kültür odasına entegrasyonu. (A) Hücre kültürü kabı alanının gradyan manyetik alan maruziyetine tabi tutulması için canlı hücre kültür odası içindeki kalibre edilmiş konumda yerleştirilmiş özel kompakt bir elektromıknatıs.B) CLSM görüntüleme sisteminin, manyetik nano-aktüasyon platformunun ve harici doğru akım güç kaynağının entegre kurulumu. (CHücre kültürü haznesinin münferit bileşenleri için sıcaklık ayarlarının optimizasyonu, elektromıknatıs çalışması sırasında kültür kabı içinde stabil bir sıcaklık sağlar.D) Hücre kültürü odasının münferit bileşenleri için sıcaklık ayar parametreleri. CLSM: konfokal lazer taramalı mikroskopi. PV: Ölçülen Değer. SV: Ayarlanan Değer. Üst Isıtıcı: Üst kapak ısıtıcısının sıcaklığı. Tabla ısıtıcısı: Mikroskop tablasının ve kültür odasının alt kısmının ısıtma sıcaklığı. Benmari ısıtıcısı: Su banyosunun sıcaklığı. Lens ısıtıcısı: Objektif lens ısıtıcısının sıcaklığı. Sıcaklık sensörü: Sıcaklık probu tarafından ölçülen gerçek sıcaklık. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Manyetik nano-aktüasyon diyagramı; f-SPION'lar, kalsiyum iyonları, DIC mikroskopisi, floresan sonuçları.
Şekil 4Manyetik kuvvet stimülasyonu altındaki Schwann hücrelerinde kalsiyum yanıtlarının temsili görüntüleri. (A) Manyetik stimülasyon ve canlı hücre Ca2+ görüntüleme için entegre iş akışı²⁺ manyetik nano-aktüasyon platformunda görüntüleme. (B) Bazal Ca²⁺ manyetik stimülasyon öncesinde elde edilen floresan görüntü (F_{uyarılmamış}). (C) Ca²⁺ manyetik stimülasyondan sonra elde edilen floresan görüntü (F_stimulasyon), floresans yoğunluğundaki değişimi (ΔF) göstermektedir. (D) Zaman çözünürlüklü Ca²⁺ manyetik stimülasyon öncesi ve sonrası izlenen sinyal izleri. (E) Ca değişimlerinin kantitatif analizi ve karşılaştırılması²⁺ farklı deney grupları arasındaki floresans (ΔF/F₀). DIC: Diferansiyel Girişim Kontrastı. F_{uyarılmamış}: manyetik kuvvet stimülasyonu öncesindeki floresan yoğunluğu. F₀: bazal floresan yoğunluğu. F_stimülasyonevoked floresans yoğunluğu, manyetik kuvvet stimülasyonu sonrası oluşan değerdir. ΔF: floresans yoğunluğundaki değişimdir. “Normal” normal kontrol grubunu, “f-SPIONs+GMF” manyetik nano-aktüasyon grubunu, “f-SPIONs” f-SPIONs kontrol grubunu ve “GMF” gradyan manyetik alan kontrol grubunu temsil eder. Her bir deneyde, her deneysel koşul için bir kültür kabı kullanılarak üç bağımsız deney gerçekleştirilmiştir. Her bir hücre için, analiz edilen zaman serisi boyunca medyan ΔF/F₀ değeri, hücre düzeyindeki yanıt metriği olarak kullanılmıştır. Veriler medyan ve çeyrekler arası aralık (IQR) olarak sunulmuş olup n, üç bağımsız deney boyunca analiz edilen toplam hücre sayısını belirtmektedir. İstatistiksel analizler, Liu ve ark. tarafından daha önce raporlandığı üzere, Friedman testi ve ardından Wilcoxon işaretli sıra testi kullanılarak yapılmıştır. Panel E'deki kantitatif veriler, Liu ve ark.'dan alınan izinle uyarlanmıştır.²⁰. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Manyetizasyon ve Alan grafikleri, 30K'de histerezis döngüsü, manyetik özellik analizi, grafik.
Şekil 5f-SPION'ların süperparamanyetik özellikleri. (A) Tipik süperparamanyetik davranış sergileyen f-SPION'ların manyetik histerezis döngüsü. (B) Sıfır manyetik alan yakınındaki histerezis döngüsünün büyütülmüş görünümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Manyetik alan deneyi: flakonlu bobin. GMF açma/kapama etkisinin dağılım üzerindeki etkisi (PDI: 0,16).
Şekil 6f-SPION'ların sulu dağılabilirliği ve gradyan manyetik alan duyarlılığı. (AGradyan manyetik alanın yokluğunda, f-SPION'lar sulu ortamda iyi dağılmış halde kalır.B) Gradyan manyetik alan uygulandığında, f-SPION'lar hızla göç eder ve alan gradyanı yönünde birikir. GMF: Gradyan manyetik alan. PDI: Polidispersite indeksi. Ok, gradyan manyetik alanın yönünü göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Fe3O4 nanopartikülleri ile hücre görüntüleme; DIC, Cy3.5 ve falloidin birleşimini gösteren floresan mikroskopi.
Şekil 7Schwann hücrelerinde f-SPION internalizasyonunun CLSM floresan görüntülemesi. (A) f-SPION'lar ile birlikte inkübasyon sonrası Schwann hücrelerinin CLSM görüntülemesi (15 µg/mL) 12 saat boyunca ve ardından yıkama (pinhole = 1 AU; z-adımı = 0.43 µm), korunan hücre morfolojisini ve minimal hücre dışı partikül arka planını göstermektedir. (B) Cy3.5 kanalında (Ex/Em: 561–568/607 nm) saptanan kırmızı floresans, Schwann hücreleri içinde Cy3.5 ile işaretlenmiş f-SPION'ların varlığını göstermektedir.C) Alexa Fluor 350 kanalında (Ex/Em: 350–360 nm/40–460 nm) saptanan mavi floresans, phalloidin-Alexa Fluor 350 fonksiyonelleştirme modülünün başarıyla entegre edildiğini desteklemektedir.D) Kırmızı ve mavi floresan sinyalleri arasında belirgin bir uzaysal örtüşmeyi gösteren birleştirilmiş görüntü; bu durum manyetik-floresan süperpartiküllerin başarılı bir şekilde oluşturulduğu ile uyumludur. DIC: Diferansiyel interferans kontrastı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Demir oksit nanopartikülleri, uygun biyouyumluluğa sahip manyetik nanomalzemeler olarak yaygın şekilde kabul edilmektedir. Yaygın olarak kullanılan manyetik rezonans görüntüleme kontrast ajanları olan süperparamanyetik Fe₃O₄ nanopartikülleri, klinik görüntüleme tanısında kapsamlı bir şekilde uygulanmıştır²⁹^,³⁰. Grubumuzun yakın tarihli çalışmasında²⁰, f-SPION'ların son derece düşük sitotoksisite ve mükemmel biyogüvenlik sergilediği gösterilmiştir. Kontrol edilebilir bir elektromıknatıs ile kombinasyon halinde mekanik aktüatörler olarak f-SPION'lar kullanılarak oluşturulan nanomanyetik aktivasyon platformu; Schwann hücrelerinde hücre iskeleti dinamiğini etkili bir şekilde aktive etmiş, mekanosensitif Piezo1 iyon kanalının açılmasını tetiklemiş, transmembran Ca²⁺ akışını başlatmış ve ardından hücrelerde gen ekspresyonu "yeniden programlamasını" ve fenotipik değişiklikleri teşvik etmiştir²⁰.

Bu platformun başarılı bir şekilde uygulanması için birkaç adım özellikle önemlidir. İlk kritik adım, nanoparçacık hazırlama aşamasıdır. Parçacıklar; sentez ve yüzey modifikasyonundan sonra iyi dağılmış, manyetik olarak yanıt verebilir ve optik olarak saptanabilir durumda kalmalıdır. Herhangi bir aşamadaki agregasyon, hücresel alım tutarlılığını azaltabilir, etkili manyetik özellikleri değiştirebilir ve canlı hücre görüntüleme kalitesini bozabilir.

İkinci kritik adım, hücresel yükleme ve yıkama prosedürüdür. Nanopartikül konsantrasyonu ve inkübasyon süresi, aşırı hücre dışı birikime neden olmadan veya hücre morfolojisini bozmadan, saptanabilir düzeyde hücre içi yükleme sağlamak için yeterli olmalıdır. Özellikle hücre içi lokalizasyonu değerlendirmek için floresan görüntüleme kullanıldığında, internalize olmamış ve membrana ilişkilendirilmiş partiküllerin tamamen uzaklaştırılması esastır. Yetersiz yıkama, lokalizasyon modellerinin yanlış yorumlanmasına yol açabilir ve ayrıca hücre düzeyindeki kuvvet tahminlerini bozabilir.

Üçüncü kritik adım, manyetik stimülasyon cihazının örneğe göre geometrik olarak hizalanmasıdır. Manyetik kuvvet doğrudan yerel alan gradyanına bağlı olduğundan, elektromanyetik bobin ile örnek düzleminin göreceli konumu, kalibrasyon konfigürasyonu ile tutarlı kalmalıdır. Bobin-örnek mesafesindeki veya hizalamadaki küçük değişiklikler bile etkin stimülasyon koşullarını değiştirebilir.

Platform, ele alınan biyolojik soruya göre modifiye edilebilir. Genel manyetik yükleme ve kuvvet iletimi yeterli olduğunda, PDA kaplı floresan süperpartiküller (SPION'lar) aktin hedefleme fonksiyonelleştirmesi olmadan kullanılabilir. Aktinden zengin bölgelerin yakınında hücre altı lokalizasyon istendiğinde, bunun yerine faloidin fonksiyonelleştirilmiş formülasyon (f-SPION'lar) kullanılabilir. Bu modülerlik, platformun pratik bir avantajıdır.

Mevcut tekniğin birkaç sınırlaması vardır. Birincisi, hücre başına alınan manyetik partikül sayısının hesaplanmış değeri popülasyon ortalamasını temsil ederken, tek hücre düzeyindeki partikül yüklemesi kaçınılmaz olarak heterojenlik gösterir. İkincisi, bu çalışmada rapor edilen manyetik kuvvet değerleri, hücre içi mekanik yüklerin doğrudan ölçümleri değil, model tabanlı tahminlerdir. Üçüncüsü, bu protokol öncelikle in vitro görüntüleme koşulları altında kültüre edilen Schwann hücreleri için tasarlanmış ve geliştirilmiştir. Yoğun üç boyutlu hücre kültürü sistemlerinde ve dokularda; nanopartikül alımı, hücre içi dağılım, optik erişilebilirlik ve mekanik etkileşim iki boyutlu kültürlerden farklılık gösterebileceği için kapsamlı optimizasyonlar gerekebilir. Son olarak, isteğe bağlı aktin hedefleme stratejisi, partiküllerin aktinle ilişkili bölgelerde lokalizasyon olasılığını artırır ancak canlı hücrelerdeki tüm aktin bakımından zengin yapıların tekdüze veya spesifik olarak hedeflenmesini garanti etmez.

Bu kısıtlamalara rağmen, mevcut manyetik nano-aktüasyon platformu, mevcut kuvvet uygulama tekniklerine göre birkaç belirgin metodolojik avantaj sunmaktadır. Örneğin, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) hassas lokalize kuvvet uygulamasına olanak tanır ancak hedefle doğrudan mekanik temas gerektirir ve her zaman uzun süreli canlı hücre görüntülemesiyle kolayca entegre edilemez⁸. Germe tabanlı sistemler ve mühendislik ürünü substratlar, hücre popülasyonu düzeyinde mekanik ipuçları sağlayabilir, ancak bunlar önceden tanımlanmış malzeme arayüzlerine dayanır ve hücre içi uzak kuvvet iletimi için pek uygun değildirler¹⁰. Optik cımbızlar, kuvvet uygulaması için yüksek uzamsal çözünürlük sağlar ancak lazer kaynaklı doku hasarı riskleri taşırlar⁸. Mikropipet tabanlı yöntemlerin çalıştırılması nispeten basittir ancak işlem kapasiteleri ve kuvvet çözünürlükleri nispeten düşüktür¹². Mikroakışkan sistemler, kayma gerilmesi ve sıvı basıncı gibi spesifik mekanik mikroortamlar oluşturmak için avantajlıdır, ancak karmaşık hücresel ortamların yeniden oluşturulmasında ve birden fazla mekanik stimülasyon modunun entegrasyonunda teknik zorluklarla karşılaşırlar¹¹. Buna karşılık, mevcut platform; uzak, temassız stimülasyonu, kontrol edilebilir manyetik aktüasyonu, floresan tabanlı partikül takibini ve gerçek zamanlı konfokal görüntüleme ile doğrudan uyumluluğu tek bir iş akışı içinde birleştirmektedir.

Aynı genel strateji, mekanik olarak yanıt veren diğer hücre tiplerine ve daha karmaşık biyolojik modellere uyarlanabilir. Bu yöntem; nöral organoidler, epitel kistler veya Madin-Darby canine kidney (MDCK) benzeri epiteller gibi daha yoğun çok hücreli sistemlere de genişletilebilir. Bu tür ortamlarda; partikül penetrasyonu, partikül dağılımı ve mekanik olarak kenetlenmiş üç boyutlu örneklerdeki kuvvet tahmini için ek optimizasyon gerekecektir. Bu zorluklara rağmen, mevcut iş akışı, canlı sistemlerde magnetomekanik stimülasyon stratejilerinin daha geniş kapsamlı geliştirilmesi için pratik bir temel sunmaktadır.

Açıklamalar

Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Y.W.'ye verilen 82571677 ve 82001304 numaralı hibeler), Jilin Eyaleti Tıp ve Sağlık Bakımı Yetenekleri Özel Programı (Y.W.'ye verilen JLSRCZX2025-134 numaralı hibe) ve Jilin Üniversitesi Bethune Program Projesi (Y.W.'ye verilen 2024B19 numaralı hibe) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar; nanomalzemelerin tasarımı, sentezi ve karakterizasyonu konusundaki yardımları için Jilin Üniversitesi Kimya Fakültesi'ne (Supramoleküler Yapı ve Materyaller Devlet Anahtar Laboratuvarı) ve Çin Bilimler Akademisi Changchun Uygulamalı Kimya Enstitüsü'ne teşekkür ederler. Yazarlar ayrıca, CLSM görüntüleme konusundaki yardımları için Jilin Üniversitesi Birinci Hastanesi Translasyonel Tıp Enstitüsü'ne teşekkür ederler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,2-Heksadekandiyol	Sigma-Aldrich	213748	Teknik sınıf, %90; termal bozunma sentezinde kullanılır
35 mm ibidi µ-kaplar	ibidi	80156	Schwann hücresi kültürü ve görüntülemesi için kullanılır
Benzil eter	Sigma-Aldrich	108014	%98; Fe için çözücü₃O₄ nanopartikül sentezi
Konfokal lazer tarama mikroskobu	Nikon	AXR (Ti2-E)	Canlı hücre ve floresan görüntülemede kullanılır
Özel yapım elektromıknatıs	Özel yapım	Lütfen çevirmem için kaynak metni sağlayın.	In vitro gradyan manyetik alan üretimi için kompakt unipolarmanyetik
Siyanin3.5 karboksilik asit	Duofluor Inc.	D10128	Fe için kullanılan floresan boya₃O₄·Cy3.5 süperpartikül montajı; MW 593,20; -'de saklayınız20 °C, ışıktan korunarak
Deferoksamin mezilat tuzu	Sigma-Aldrich	D9533	İçselleştirilmemiş ve membrana ilişkili demiri uzaklaştırmak için kullanılan demir şelatlayıcı ajan
Dijital Gaussmetre	GENİŞ MIKNATISLI	WT103	Manyetik akı yoğunluğunu ölçmek ve özel elektromıknatıs tarafından oluşturulan gradyan manyetik alanı kalibre etmek için kullanılır
Dopamin hidroklorür	Sigma-Aldrich	H8502	≥%98 (TLC); polidopamin kaplama için kullanılmıştır
Dinamik ışık saçılım cihazı	Malvern Instruments	Zetasizer Nano-ZS	Hidrodinamik çap ve PDI ölçümü için kullanılır
Fluo-4 AM	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	F14201	Canlı hücre Ca ölçümleri için kullanılan kalsiyum indikatörü²⁺ görüntüleme
Floresans spektrofotometre	Shimadzu	RF-6000	Fotolüminesans karakterizasyonu için kullanılır
Yüksek çözünürlüklü transmisyon elektron mikroskobu	JEOL	JEM-F200	Nanoparçacık morfolojisi ve çekirdeğinin HRTEM görüntülemesi için kullanılır–kabuk yapısı
İndüktif eşleşmiş plazma atomik emisyon spektrometresi	PerkinElmer	Optima 3300 DV	Hücre içi demir miktarının belirlenmesinde kullanılır
Demir(III) asetilasetonat, Fe(acac)₃	Sigma-Aldrich	F300	%97; Fe öncülü₃O₄ nanopartikül sentezi
Canlı hücre sahne üstü inkübatörü	TOKAI HIT	TENP&CO₂	Manyetik stimülasyon sırasında canlı hücre konfokal görüntüleme için kullanılır
Oleik asit	Sigma-Aldrich	O1008	≥%99 (GC); Fe için yüzey ligandı₃O₄ nanoparçacık sentezi
Oleilamin	Sigma-Aldrich	O7805	Teknik kalite, %70; nanopartikül sentezi için ligand
Falolidin–Alexa Fluor 350	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	A22281	Opsiyonel aktin hedefli fonksiyonelleştirme reaktifi
Pluronic F-127	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	P3000MP	Canlı hücre Ca²⁺ ölçümleri için Fluo-4 AM yüklemesini kolaylaştırmak amacıyla kullanılır²⁺ görüntüleme
Programlanabilir DC regüleli güç kaynağı	Tongmen	eTM-L605SPL (60 V, 5 A)	In vitro gradyan manyetik alan üretimi için özel elektromıknatısa güç sağlamak amacıyla kullanılır
RSC96 Schwann hücreleri	Çin Bilimler Akademisi Hücre Bankası	Girdi sağlanmadığı için çeviri yapılamamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni giriniz.	Sıçan kaynaklı Schwann hücresi hattı
Sodyum dodesil sülfat (SDS)	Sigma-Aldrich	436143	ACS ayıracı, ≥%99,0; yağ-içinde-su mikroemülsiyonu için sürfaktan
SQUID manyetometresi	Quantum Design Inc.	MPMS-XL	300 K'de manyetik histerezis ölçümü için kullanılmıştır
Toluen	Sigma-Aldrich	244511	Susuz, %99,8; süperparçacık montajı için çözücü
Transmisyon elektron mikroskobu	FEI	EP 5018/40, Tecnai Spirit Biotwin	Hücresel ve sinir dokusu ultrastrüktür gözlemi için kullanılır

Kaynaklar

Cheng B, et al. Mechanobiology across timescales. Nat Rev Phys. 2025;7:621-44.
Di X, et al. Cellular mechanotransduction in health and diseases: from molecular mechanism to therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:282.
Pillai EK, Franze K. Mechanics in the nervous system: from development to disease. Neuron. 2024;112(3):342-61.
Franze K. The mechanical control of nervous system development. Development. 2013;140(15):3069-77.
Franze K, Guck J. The biophysics of neuronal growth. Rep Prog Phys. 2010;73:094601.
Moore SW, Sheetz MP. Biophysics of substrate interaction: influence on neural motility, differentiation, and repair. Dev Neurobiol. 2011;71(11):1090-101.
Franze K, Janmey PA, Guck J. Mechanics in neuronal development and repair. Annu Rev Biomed Eng. 2013;15:227-51.
Sun W, et al. Biophysical approaches for applying and measuring biological forces. Adv Sci (Weinh). 2022;9(5):e2105254.
Mohammed D, et al. Innovative tools for mechanobiology: unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:162.
Constantinou I, Bastounis EE. Cell-stretching devices: advances and challenges in biomedical research and live-cell imaging. Trends Biotechnol. 2023;41:939-50.
Polacheck WJ, Li R, Uzel SGM, Kamm RD. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 2013;13(12):2252-67.
Li Z, et al. Non-invasive acquisition of mechanical properties of cells via passive microfluidic mechanisms: a review. Biomicrofluidics. 2021;15(3):031501.
Xiao Y, Du J. Superparamagnetic nanoparticles for biomedical applications. J Mater Chem B. 2020;8(3):354-67.
Yang X, et al. Nanotechnology enables novel modalities for neuromodulation. Adv Mater. 2021;33(52):e2103208.
Semeano AT, et al. Effects of magnetite nanoparticles and static magnetic field on neural differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev Rep. 2022;18(4):1337-54.
Lee B, et al. Design of oxide nanoparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 2025;10:252-67.
Kim YJ, et al. Magnetoelectric nanodiscs enable wireless transgene-free neuromodulation. Nat Nanotechnol. 2025;20:121-31.
Signorelli L, Hescham SA, Pralle A, Gregurec D. Magnetic nanomaterials for wireless thermal and mechanical neuromodulation. iScience. 2022;25(11):105401.
Liu T, Wang Y, Lu L, Liu Y. SPIONs-mediated magnetic actuation promotes nerve regeneration by inducing and maintaining repair-supportive phenotypes in Schwann cells. J Nanobiotechnology. 2022;20:159.
Liu T, et al. f-SPION-mediated magnetic stimulation induces reparative Schwann cell reprogramming via cytoskeletal dynamics-gated activation of Piezo1. J Nanobiotechnology. 2026;24:298.
Jessen KR, Mirsky R, Lloyd AC. Schwann cells: development and role in nerve repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(7):a020487.
Jessen KR, Mirsky R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. J Physiol. 2016;594(13):3521-31.
Sun S, Zeng H. Size-controlled synthesis of magnetite nanoparticles. J Am Chem Soc. 2002;124(28):8204-5.
Zhuang J, Wu H, Yang Y, Cao YC. Controlling colloidal superparticle growth through solvophobic interactions. Angew Chem Int Ed Engl. 2008;47(12):2208-12.
Bai F, et al. A versatile bottom-up assembly approach to colloidal spheres from nanocrystals. Angew Chem Int Ed Engl. 2007;46(35):6650-3.
Tang L, et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(43):15344-9.
Tay A, Kunze A, Murray C, Di Carlo D. Induction of calcium influx in cortical neural networks by nanomagnetic forces. ACS Nano. 2016;10(2):2331-41.
Tay A, Di Carlo D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Lett. 2017;17(2):886-92.
Cheng FY, et al. Characterization of aqueous dispersions of Fe(3)O(4) nanoparticles and their biomedical applications. Biomaterials. 2005;26(7):729-38.
Lee N, et al. Iron oxide-based nanoparticles for multimodal imaging and magnetoresponsive therapy. Chem Rev. 2015;115(19):10637-89.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

S perparamanyetik Nanopar ac klar Manyetik Stim lasyon Canl H cre G r nt leme Sitoskeletal Organizasyon Elektromanyetik Stim lasyon Mekanobiyoloji

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Beni bilgilendir: