Schwann Hücrelerinin Uzaktan ve Kontrol Edilebilir Mekanostimülasyonu ile Gerçek Zamanlı Konfokal Görüntüleme için Manyetik Nano-Aktüasyon Platformu

Yang Wang; Ting Liu; Mingxi Yang; Chong Qi; Bin Liu

doi:10.3791/71685

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Schwann Hücrelerinin Uzaktan ve Kontrol Edilebilir Mekanostimülasyonu ile Gerçek Zamanlı Konfokal Görüntüleme için Manyetik Nano-Aktüasyon Platformu

83 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71685

⸱

8 Eylül 2026

Yang Wang¹^,² , Ting Liu³ , Mingxi Yang¹^,² , Chong Qi⁴ , Bin Liu¹^,²

¹Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, ²Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, ³International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin University, ⁴Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

Bu makalede

Özet

Bu protokol; Schwann hücrelerini uzaktan ve kontrollü bir şekilde uyarmak ve mekanosensör yanıtlarını dinamik olarak izlemek için floresan süperparamanyetik nanoparçacıklar, kalibre edilmiş bir elektromıknatıs ve gerçek zamanlı konfokal görüntülemeyi entegre eden, mikroskopla uyumlu bir manyetik nano-aktüasyon platformu sunmaktadır.

Özet

Mekanik kuvvetler hücresel davranışı kritik bir şekilde düzenler; ancak mevcut mekanik stimülasyon yöntemlerinin çoğu doğrudan fiziksel temasa veya yapay olarak tasarlanmış hücre dışı ortamlara dayalıdır, bu da dinamik canlı hücre çalışmalarındaki esnekliklerini kısıtlamaktadır. Burada, Schwann hücrelerinin in vitro ortamda uzaktan, temassız ve kontrol edilebilir mekanostimülasyonu için bir manyetik nano-aktüasyon platformu sunuyoruz. Bu entegre düzenek, aynı deneysel seansta uzaktan manyetik stimülasyona ve senkronize canlı hücre görüntülemesine olanak tanır. Bu makale; floresan süperparamanyetik nanopartiküllerin (SPION'lar), isteğe bağlı olarak aktin hedefli fonksiyonelleştirilmiş SPION'ların (f-SPION'lar) hazırlanmasını, mikroskopla uyumlu bir elektromanyetik stimülasyon cihazının kurulumunu ve kalibrasyonunu, tek partikül ve tek hücre düzeylerindeki manyetik kuvvetlerin tahminini ve manyetik aktüasyonun gerçek zamanlı konfokal görüntüleme ile entegrasyonunu açıklamaktadır. Schwann hücreleri, periferik sinirlerin gelişimi, korunması ve onarımında temel roller oynayan, mekanik uyarılara karşı oldukça hassas glial hücrelerdir. Mekanik stimülasyona verdikleri yanıtların gerçek zamanlı olarak izlenmesi, mekanik kuvvetlerin hücre iskeleti organizasyonunu ve hücresel davranışı nasıl etkilediğini anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu platform, Schwann hücresi mekanobiyolojisini incelemek için tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar ve mekanik yanıt veren diğer hücre tiplerine ve çok hücreli sistemlere uyarlanabilir.

Giriş

Mekanik uyaranlar; adezyon, migrasyon, proliferasyon, diferansiyasyon ve fenotipik plastisite dahil olmak üzere geniş bir yelpazedeki hücresel süreçleri düzenler¹^,²^,³. Mekanobiyoloji çalışmaları, hem nöronların hem de glial hücrelerin gelişim boyunca belirgin bir mekanosensitivite ve yanıt verme kapasitesi sergilediğini göstermiştir⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Hücrelerin kuvveti nasıl algıladığını ve buna nasıl yanıt verdiğini araştırmak için; atomik kuvvet mikroskobu (AFM), mikropipet aspirasyonu, optik cımbızlar, germe tabanlı kültür sistemleri ve mikroakışkan platformlar dahil olmak üzere çok sayıda deneysel yaklaşım geliştirilmiştir⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Bu teknikler, mekanotransdüksiyon çalışmalarını büyük ölçüde ilerletmiştir. Ancak, birçoğu hücrelerle doğrudan fiziksel temas gerektirmekte veya önceden tanımlanmış yapay mekanik ortamlara bağımlı kalmaktadır; bu durum onları uzaktan, dinamik olarak kontrol edilebilir ve görüntüleme ile uyumlu stimülasyonlar için daha az uygun hale getirmektedir.

Manyetik nanopartikül aracılı kuvvet iletimi, uzaktan mekanostimülasyon için alternatif bir strateji sunar¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Çoğu biyolojik doku düşük manyetik duyarlılık sergilediği için, dışarıdan uygulanan manyetik alanlar biyolojik örneklere doğrudan temas etmeden nüfuz edebilir ve hücrelere veya dokulara iletilen manyetik yanıt veren partiküller üzerinde seçici olarak etki gösterebilir. Bir manyetik alan gradyanı varlığında, bu partiküller hücre altı, hücresel veya doku düzeyinde mekanik perturbasyonlar oluşturmak için kullanılabilecek yönlü kuvvetlere maruz kalırlar⁸^,⁹. Temassız, ayarlanabilir olması, canlı görüntüleme ile uyumlu olması ve potansiyel olarak daha karmaşık biyolojik sistemlere genişletilebilir olması nedeniyle bu yaklaşım oldukça caziptir.

Schwann hücreleri, periferik sinir gelişimi, bakımı ve onarımında kritik roller oynayan,¹⁹^,²⁰ oldukça mekanosensitif glial hücrelerdir²¹^,²².Schwann hücrelerinin fiziksel stimülasyona verdiği yanıtların dinamik olarak gözlemlenmesi, kuvvetin hücre iskeleti organizasyonunu ve hücre davranışını nasıl düzenlediğini anlamak açısından önemlidir. Ancak, geleneksel kuvvet uygulama sistemlerinin çoğu, gerçek zamanlı yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile kolayca uyumlu değildir. Bu kısıtlamayı gidermek için aktin hücre iskeletini hedefleyen floresan manyetik süperpartikülleri (f-SPIONs), konfokal mikroskop tablası ile uyumlu özel bir elektromanyetik cihazı ve kuvvet tahmini için kantitatif bir çerçeveyi birleştiren manyetik nano-aktüasyon platformu geliştirdik. Bu entegre kurulum, aynı deneysel oturumda uzaktan manyetik stimülasyonu ve senkronize canlı hücre görüntülemeyi mümkün kılmaktadır.

Burada açıklanan iş akışı; floresan manyetik süperpartiküllerin (SPIONs) hazırlanmasını, f-SPIONs oluşturmak için isteğe bağlı falloidin tabanlı aktin hedefleme fonksiyonelleştirmesini, nanopartikül karakterizasyonunu, elektromanyetik cihaz kurulumu ve alan kalibrasyonunu, manyetik kuvvet tahminini ve gerçek zamanlı konfokal görüntüleme ile kombine edilmiş manyetik stimülasyonu içermektedir. Burada Schwann hücreleri için optimize edilmiş olsa da, bu platform mekanik olarak yanıt veren diğer canlı sistemlerdeki ilgili çalışmalar için pratik bir çerçeve sağlayabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolde açıklanan deneylerde yerleşik bir sıçan Schwann hücresi hattı (RSC96) kullanılmış olup, deneyler insan katılımcılar veya canlı hayvanlar içermemiştir. Bu çalışma, Jilin Üniversitesi Birinci Hastanesi Hayvan Refahı ve Etik Kurulu tarafından onaylanan (Onay No. 2022-0045), hayvan deneylerini kapsayan daha geniş bir araştırma projesinin parçası olarak yürütülmüştür.

1. Floresan manyetik süperparçacıkların hazırlanması

Oleik asit kaplı Fe₃O₄ nanoparçacıkları sentezleyin.
NOT: Oleik asit kaplı Fe₃O₄ nanoparçacıkları, daha önce açıklandığı üzere termal bozunma ile sentezlenmiştir²⁰^,²³.
1. Bir reaksiyon balonuna 20 mL benzil eter içerisine 2 mmol Fe(acac)₃, 6 mmol oleik asit, 6 mmol oleilamin ve 5 mmol 1,2-heksadekanediol ekleyin.
2. Homojen bir öncü çözelti elde edilene kadar karışımı azot atmosferi altında 15 dk boyunca karıştırın.
3. Karışımı 20 °C/dk hızla 200 °C'ye ısıtın.
4. Reaksiyonu 30 dk boyunca 200 °C'de tutun.
5. Sıcaklığı 265 °C'ye çıkarın ve karışımı 30 dk boyunca reflü edin.
6. Reaksiyon karışımının oda sıcaklığına doğal olarak soğumasını bekleyin.
7. Fe₃O₄ nanoparçacıklarını manyetik ayırma ile toplayın.
8. Nanoparçacıkları etanol ile 3 kez yıkayın.
9. Saflaştırılmış nanoparçacıkları toluen içinde yeniden dağıtın.
Fe₃O₄·Cy3.5 süperparçacıkları birleştirin.
NOT: Fe₃O₄·Cy3.5 süperparçacıkları, daha önce açıklandığı üzere hazırlanmıştır²⁰^,²⁴^,²⁵.
1. 50 mL'lik üç boyunlu yuvarlak tabanlı bir balon içerisindeki 4 mL toluen içinde 28 mg oleik asit kaplı Fe₃O₄ nanoparçacığını dağıtın.
2. 12,5 mL su içerisinde 12,5 mg sodyum dodesil sülfat ve 3 mg Cyanine 3.5 (Cy 3.5) içeren bir sulu faz hazırlayın.
3. Bir yağ-içinde-su mikroemülsiyonu oluşturmak için toluen içindeki Fe₃O₄ nanoparçacık süspansiyonunu (4 mL'de 28 mg; 7 mg/mL), sulu sürfaktan/boya çözeltisi ile birleştirin.
4. Stabil bir emülsiyon elde edilene kadar iyice karıştırın.
5. Üç boyunlu yuvarlak tabanlı balonu 60 °C'ye ısıtın ve 6 saat boyunca sürekli olarak 300 rpm'de karıştırın.
  NOT: İndirgenmiş basınç veya rotari evaporasyon prosedürüne gerek yoktur.
6. Fe₃O₄ nanoparçacıklarının agregasyonunu tetiklemek için tolueni yukarıda açıklanan koşullar altında uçurun. Tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanarak, çözeltiden küçük bir alikotu bir test tüpüne aktarın ve bekletin. Faz ayrımının olmaması, toluenin tamamen uzaklaştırıldığını gösterir.
7. Fe₃O₄·Cy3.5 süperparçacık süspansiyonunu 15 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın. Süperparçacıkları toplamak için oda sıcaklığında 5 dk boyunca 2.370 × g hızında santrifüjleyin ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice dökün.
8. Peleti ultra saf deiyonize su içinde yeniden dağıtın ve oda sıcaklığında tekrar 5 dk boyunca 2.370 × g hızında santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve kalıntı serbest Cy3.5 boyasını ve sodyum dodesil sülfatı uzaklaştırmak için yıkama prosedürünü üç kez tekrarlayın.
Süperparçacıkları polidopamin (PDA) ile kaplayın.
NOT: Polidopamin kaplı süperparçacıklar, daha önce açıklandığı üzere hazırlanmıştır²⁰^,²⁶.
1. Fe₃O₄·Cy3.5 süperparçacık süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dk boyunca 2.370 × g hızında santrifüjleyin ve süpernatantı dökün.
2. Peleti 10 mM Tris tamponunda (pH 8,5) yeniden dağıtın.
3. Süspansiyona 26 mg dopamin monomeri ekleyin.
4. Karışımı alkali koşullar altında oda sıcaklığında 3 saat boyunca karıştırın.
5. Süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dk boyunca 2.370 × g hızında santrifüjleyin.
6. Süpernatantı uzaklaştırın ve Fe₃O₄·Cy3.5@PDA parçacıkları (SPIONs) elde etmek için peleti ultra saf su içinde yeniden dağıtın.
İsteğe bağlı olarak parçacıkları phalloidin-Alexa Fluor 350 ile fonksiyonelleştirin.
NOTE: Süperparçacıklar, ticari olarak mevcut phalloidin-Alexa Fluor 350 kullanılarak yüzey fonksiyonelleştirmesine tabi tutulmuştur²⁰.
1. 100 ünite phalloidin-Alexa Fluor 350 içeren 5 mL sulu çözelti hazırlayın.
2. Çözeltiye 2 mg parçacık içeren 200 µL Fe₃O₄·Cy3.5@PDA süspansiyonu ekleyin.
3. Karışımı oda sıcaklığında 24 saat boyunca nazikçe karıştırın.
4. Karışımı oda sıcaklığında 5 dk boyunca 2.370 × g hızında santrifüjleyin.
5. Süpernatantı dökün ve peleti deiyonize su içinde yeniden dağıtın.
6. Nihai Fe₃O₄·Cy3.5@PDA@phalloidin (f-SPIONs) formülasyonunu kullanıma kadar ışıktan koruyarak saklayın.

2. Nanopartiküllerin karakterizasyonu

Morfoloji ve boyutun belirlenmesi.
1. Nanopartikül örneklerini, cihaz gereksinimlerine uygun olarak transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) veya yüksek çözünürlüklü transmisyon elektron mikroskopisi (HRTEM) için hazırlayın.
2. Genel partikül morfolojisini, çekirdek-kabuk yapısını ve ortalama çapı belirlemek için görüntüler elde edin (Şekil 1).
3. Dinamik ışık saçılımı (DLS) için sulu nanopartikül süspansiyonları hazırlayın.
4. Hidrodinamik çapı ve polidispersite indeksini (PDI) ölçün.
5. Formülasyon tekdüzeliğini ve kolloidal davranışı değerlendirmek için elektron mikroskopisi ve DLS sonuçlarını karşılaştırın.
Manyetik özelliklerin belirlenmesi.
1. Süperiletken kuantum girişim cihazı (SQUID) analizine uygun, kurutulmuş veya konsantre nanopartikül örnekleri hazırlayın.
2. 300 K sıcaklıkta manyetik histerezis eğrilerini kaydedin.
3. Doygunluk manyetizasyonunu, remanansı ve koersiviteyi belirleyin.
4. Partiküllerin, ihmal edilebilir remanans ve koersivite ile süperparamanyetik davranış sergilediğini doğrulayın.
Floresans özelliklerinin belirlenmesi.
1. Ultrapure deiyonize su içinde bir f-SPION süspansiyonu hazırlayın ve süspansiyonu bir kuvars küvete aktarın.
2. Bir floresans spektrofotometresi kullanarak fotolüminesans spektrumlarını kaydedin.
3. Yıkama ve yeniden süspansiyon sonrası floresan sinyalinin tespit edilebilir düzeyde kaldığını doğrulayın.
Hedeflenmiş formülasyon kullanıldığında aktinle ilişkili lokalizasyonun doğrulanması.
1. RSC96 hücrelerini temin edin.
  NOT: Bu çalışmada kullanılan, primer sıçan Schwann hücrelerinin uzun süreli kültürü yoluyla oluşturulmuş spontan transforme bir sıçan Schwann hücresi hattı olan RSC96 hücreleri, Çin Bilimler Akademisi Hücre Bankası, Şanghay, Çin'den (CSTR: 19375.09.3101RATGNR6) temin edilmiş olup mikoplazma ve fungal kontaminasyon açısından negatif test edilmiştir. 3–10 pasajındaki hücreler kullanılmıştır.
2. Hücreleri, %10 fetal bovin serum (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin çözeltisi (100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin) ile takviye edilmiş Dulbecco modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) kültüre edin.
3. Hücre yapışmasını sağlamak için RSC96 hücrelerini 35 mm'lik hücre kültürü mikroskopi kabına 1 × 10⁵ hücre/kap yoğunluğunda ekini yapın ve %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de 24 saat boyunca kültüre edin.
4. Mevcut kültür besiyerini aspire edin, hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın ve 15 µg/mL f-SPIONs içeren komple kültür besiyeri ekleyin. Hücreleri f-SPIONs ile 12 saat inkübe edin.
5. İnternalize olmamış partikülleri tamamen uzaklaştırmak için kültür besiyerini aspire edin ve hücreleri 1 mM deferoksamin içeren buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.
6. Partiküllerin hücre içi dağılımını değerlendirmek için konfokal görüntüler elde edin. Hücre içi yapıların yüksek çözünürlüklü optik kesitlerini elde etmek için görüntüleme parametrelerini 1 Airy birimi (AU) pinhole ve 0.43 µm z-adımı olarak ayarlayın.
7. Partiküllerin aktinle ilişkili hücresel bölgelerde zenginleşme gösterip göstermediğini inceleyin.

3. Elektromanyetik stimülasyon cihazının kurulumu ve kalibrasyonu (Şekil 2)

Elektromanyetik düzeneği kurun.
1. Konfokal mikroskop tablasına ve canlı hücre haznesine sığacak boyutta kompakt bir elektromanyetik bobin sistemi oluşturun (Şekil 2A,B).
2. Bobini kontrol edilebilir bir güç kaynağına veya harici bir akım kaynağına bağlayın.
3. COMSOL Multiphysics 4.3b kullanarak gradyan manyetik alan ortamını sayısal olarak simüle edin (Şekil 2C,D).
4. Elektromıknatısın farklı giriş akımları altında ilgili gradyan manyetik alanı (GMF) oluşturduğunu doğrulayın (Şekil 2G).
Manyetik akı yoğunluğunu ölçün ve gradyan manyetik alanı kalibre edin.
1. Elektromıknatısı, kutup ucu kabın merkezine bakacak şekilde ve kabın dış duvarından 1 mm uzaklıkta olacak şekilde kültür kabının yanına yerleştirin (Şekil 2E,F).
2. Sonraki tüm canlı hücre manyetik kuvvet stimülasyonu ve görüntüleme deneyleri boyunca elektromıknatıs ile kültür kabı arasındaki bu göreceli geometrik konfigürasyonu koruyun.
3. Kültür kabının altındaki konumlandırma ızgarasını uzamsal referans olarak kullanarak, stimülasyon bölgesi içindeki önceden tanımlanmış pozisyonlarda manyetik akı yoğunluğunu ölçmek için dijital bir Gauss metre kullanın.
4. Yerel alan gradyanını, manyetik akı yoğunluğundaki uzamsal değişimden hesaplayın.
5. Sayısal olarak simüle edilen manyetik alan gradyanını, deneysel olarak ölçülen ve hesaplanan manyetik alan gradyanı değerlerini kullanarak kalibre edin ve doğrulayın.

4. Platform tarafından iletilen manyetik kuvvetlerin tahmini.

Kuvvet tahmin modelini tanımlayın.
1. Homojen olmayan bir manyetik alandaki manyetik nanopartiküller için kuvvet denklemini kullanın²⁷^,²⁸:
2. Uygulanan alanla süperparamanyetik hizalanma varsayımı altında, denklemi şu şekilde sadeleştirin
  $SPION dinamiğini hesaplamak için manyetik kuvvet denklemi diyagramı, $ F_{f-SPION} = m \frac{dB}{dr} $ formülünü göstermektedir.$
  burada:
  F nanomanyetik kuvvettir
  m manyetik dipol momentidir
  manyetik alan gradyanıdır
  dB/dr, ilgili manyetik alan oluşturma cihazı tarafından üretilen manyetik alan gradyanıdır (T/m).
3. Tüm hesaplamalarda kalibre edilmiş cihazdan elde edilen ölçülmüş alan gradyanını kullanın.
Tek bir nanopartiküle etki eden kuvveti tahmin edin.
1. HRTEM görüntülerinden ortalama partikül boyutlarını belirleyin.
2. Küre geometri varsayarak manyetik çekirdek hacmini hesaplayın.
3. Çekirdeğin manyetik fraksiyonuna dayanarak Fe₃O₄-özgü manyetik hacmi tahmin edin.
4. Manyetik dipol momentini şu formüle göre hesaplayın:
  burada:
  M_m, verilen alan yoğunluğu altında f-SPION'ların kütle mıknatıslanmasını (16 A·m²/kg) temsil eder;
  ρ , Fe₃O₄ yoğunluğudur (5.24 g/cm³).
  V, her bir f-SPION içindeki Fe₃O₄ manyetik çekirdeğinin hacmidir (5.89 × 10⁻¹⁷ cm³).
5. Tek bir nanopartiküle etki eden kuvveti tahmin etmek için dipol momentini ölçülen alan gradyanı ile çarpın ( $Statik sürtünme SPION'lar; formül $F_{f-SPION}$; manyetik nanopartikül kuvvetleri analizinde kavram.$ ).
Schwann hücresi başına nanopartikül alımını tahmin edin.
1. RSC96 Schwann hücrelerini 35 mm'lik hücre kültürü mikroskopi kaplarında, kuyuk başına 5 × 10⁵ hücre olacak şekilde ekin.
2. Hücreleri standart kültür koşulları altında 24 saat inkübe edin.
3. Besiyerini, 15 µg/mL f-SPION içeren taze besiyeri ile değiştirin.
4. Hücreleri ek 12 saat daha inkübe edin.
5. Hücreleri, 1 mM deferoksamin içeren buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın.
6. Hücreleri toplayın ve sayın.
7. Hücre içi demir içeriğini indüktif eşleşmiş plazma atomik emisyon spektroskopisi (ICP-AES) kullanarak ölçün.
8. Hücre başına ortalama demir kütlesini, partikül başına demir kütlesine bölerek hücre başına internalize olan partikül sayısını hesaplayın .
Tek bir Schwann hücresine iletilen kuvveti tahmin edin.
1. Hücre düzeyindeki kuvveti şu formüle göre hesaplayın
  
  burada:
  $Statik sürtünme SPION'lar; formül $F_{f-SPION}$; manyetik nanopartikül kuvvetleri analizinde kavram.$ tek bir f-SPION'a uygulanan manyetik kuvvettir.
  hücre başına internalize olan f-SPION sayısıdır.
  F_cell tek bir hücreye uygulanan manyetik kuvvettir.
2. Elde edilen değeri, tek bir Schwann hücresine iletilen tahmini manyetik kuvvet (F_cell) olarak raporlayın.
3. Bu değerin doğrudan bir hücre içi kuvvet ölçümü değil, model tabanlı bir tahmin olduğunu açıkça belirtin.

5. Manyetik stimülasyonun gerçek zamanlı konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) görüntülemesi ile birleştirilmesi

Schwann hücrelerini manyetik nanopartiküllerle yükleyin.
1. Schwann hücrelerini, görüntülemeye uygun ibidi kültür kaplarına veya mikroakışkan kültür odacıklarına ekleyin.
2. Hücrelerin yapışması ve toparlanması için bekleyin.
3. Mevcut besiyerini, içeriğinde ... bulunan taze kültür besiyeri ile değiştirin 15 µg/mL f-SPION'lar.
4. f-SPION yüklenmesini sağlamak için hücreleri 12 saat inkübe edin.
5. Devam etmeden önce hücre morfolojisini inceleyin.
İçselleştirilmemiş partikülleri uzaklaştırın.
1. Nanoparçacık içeren ortamı uzaklaştırın.
2. Hücreleri, 1 mM deferoksamin içeren PBS ile iki kez yıkayın.
3. Yıkama solüsyonunu, görüntüleme ile uyumlu canlı hücre besiyeri ile değiştirin.
4. Görüntüleme öncesinde, hücre dışı partikül arka planının düşük olduğunu doğrulayın.
Elektromıknatıs cihazını CLSM görüntüleme sistemi ile entegre edin.
1. Elektromıknatısı, önceden kalibre edilmiş konumuna yerleştirerek canlı hücre kültür odasıyla birlikte monte edin.
2. Montajı tamamlanmış canlı hücre kültür odasını konfokal mikroskobun tablasına yerleştirin (Şekil 3). Kültür kabının etkili stimülasyon bölgesi içinde yer aldığını doğrulayın (Şekil 3A).
3. Elektromıknatısı önceden belirlenmiş parametrelere göre enerjilendirin ve kültür kabı alanı içerisinde etkili gradyan manyetik alan maruziyetini doğrulayın (Şekil 3B).
4. Objektif lensinin herhangi bir engelle karşılaşmadan odak düzlemine ulaşabildiğinden emin olun.
5. Cihazın, objektif konumlandırmasını veya tabla hareketini engellemediğinden emin olun.
6. Elektromıknatıs çalışması sırasında açığa çıkan ısı göz önünde bulundurularak, dahili bir ortam sağlamak için canlı hücre odası bileşenlerinin sıcaklık ayarları, önceden belirlenmiş optimal kültür koşullarına göre düzenleyin 37 °C ve %5 CO₂ (Şekil 3C).
7. Tüm sistemin normal ve kararlı şekilde çalıştığını doğrulayın.
Fonksiyonel Ca2+²canlı hücrelerde ⁺ görüntüleme.
1. Hücreleri, içeriğinde şunlar bulunan Krebs-Ringer çözeltisi (pH 7,4) ile inkübe edin: 3 µM Fluo-4 AM ve %0,1 Pluronic F-127... 37 °C 30 dk boyunca.
2. İnkübasyonun ardından, kültürleri iki kez PBS ile yıkayın ve görüntüleme için CLSM sisteminin canlı hücre görüntüleme platformuna aktarın (Şekil 4A).
3. ibidi kültür kabının altındaki konumlandırma ızgarasını kullanarak, önceden tanımlanmış beş konumu görüntüleyin.
4. Her bir görüntüleme alanını eşit olarak 25 bölgeye ayırın ve o bölgedeki gerçek hücre yoğunluğuna bağlı olarak, floresans kantifikasyonu için her bölgeden 0–3 hücre seçin.
5. Tek bir hücrenin tüm dış hattını ilgi alanı (ROI) olarak tanımlayın ve ROI içindeki floresans yoğunluğu değişimlerini (ΔF) analiz ederek manyetik olarak indüklenen kalsiyum yanıtını izleyin.
6. Floresans yoğunluğundaki değişimi ΔF = (F_uyarıcı- F₀). Stimülasyon öncesi ve sonrası floresan yoğunluğundaki değişimi dikkate alın (ΔF/F₀%10'u aşan bir kalsiyum yanıt olayı.
  NOT: F_{uyarılmamış} manyetik kuvvet stimülasyonu öncesindeki floresans yoğunluğunu temsil eder, F₀ bazal floresan yoğunluğunu ve F'yi temsil eder_{uyarı/stimülasyon} manyetik kuvvet stimülasyonu sonrası uyarılan floresans yoğunluğunu temsil eder.
7. Arka plan düzeltmesi için, hücre içermeyen bir bölgede ölçülen ortalama arka plan floresans yoğunluğunu, her bir ROI'nin floresans yoğunluğu değerinden çıkarın.
8. Her bir deneyde bir kültür kabı yer alacak şekilde üç bağımsız deney gerçekleştirin.
Zaman ayarlı görüntüleme gerçekleştirin ve görüntüleme sırasında manyetik stimülasyon uygulayın.
1. Zaman atlamalı görüntüleme parametrelerini şu şekilde ayarlayın: kare başına 2,1 s'lik bir edinme aralığı, toplam 650 s'lik bir edinme süresi ve 1 AU kullanılarak standart yüksek çözünürlüklü optik kesit görüntüleme.
2. Hücresel görüntüleme sırasında, manyetik kuvvet stimülasyonu yokken (F) hücre içi kalsiyum floresans yoğunluğunu kaydetmek için akım girişi olmadan 50 saniye boyunca sürekli olarak görüntüler edinin._{stimüle edilmemiş}) (Şekil 2H ve Şekil 4B).
3. İlk 50 saniye boyunca kaydedilen floresans yoğunluğunu normalize edin ve bunu bazal floresans yoğunluğu (F₀) olarak tanımlayın.₀).
4. Ardından, elektromıknatısa 3,0 A'lik sabit bir akım girişi uygulayarak, manyetik nanoparçacık yüklü Schwann hücrelerini 3,25 T/m'lik bir gradyan manyetik alana maruz bırakın ve böylece onları manyetik kuvvet stimülasyonuna tabi tutun. Manyetik kuvvet stimülasyonu sırasında hücre içi kalsiyum floresans yoğunluğunu (F_stimülasyon) (Şekil 2H ve Şekil 4C).
5. Floresans yoğunluğundaki değişimi ΔF/F olarak nicel olarak hesaplayın₀ (Şekil 4D,E).
İstatistiksel analiz gerçekleştirin ve Ca'yı analiz edin²⁺ floresans verileri.
1. Her bir hücre için, analiz edilen zaman serisi boyunca medyan ΔF/F₀ değerini hesaplayın ve bu değeri hücre düzeyindeki Ca için kullanın.²⁺ yanıt metriği.
2. Her bir deneysel koşul için, her deneyde koşul başına bir kültür kabı olacak şekilde üç bağımsız deney gerçekleştirin. Betimleyici sunum için üç bağımsız deney boyunca analiz edilen hücreleri havuzlayın ve n değerini, her grupta analiz edilen toplam hücre sayısı olarak raporlayın.
3. Hücre düzeyindeki ΔF/F₀ verilerinin normalliğini Kolmogorov-Smirnov testi kullanarak değerlendirin.
4. Ca nedeniyle²⁺ floresans yanıt verileri normal dağılım göstermiyorsa, verileri medyan ve çeyrekler arası aralık (IQR) olarak sunun.
5. Gruplar arasındaki farklar, daha önce bildirildiği üzere, önce parametrik olmayan Friedman testi, ardından ikili karşılaştırmalar için Wilcoxon işaretli sıralama testleri kullanılarak analiz edin.
6. Dikkate alın P < İstatistiksel anlamlılığı belirtmek için 0,05.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yüksek çözünürlüklü transmisyon elektron mikroskopisi (HRTEM), yüzey modifikasyonundan sonra nihai nanoparçacık formülasyonunun kümelenmiş bir manyetik çekirdeğe ve bir dış kabuğa sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 1). Nihai f-SPION'lar, yaklaşık 56.60 ± 6.19 nm boyutunda Fe₃O₄ bakımından zengin bir manyetik çekirdek ve yaklaşık 5.79 ± 1.36 nm ortalama kalınlığa sahip, polidopamin ile phalloidin-Alexa Fluor 350'den oluşan bir dış kabuk ile birlikte 63.36 ± 16.65 nm ortalama genel çapa sahipt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Demir oksit nanopartikülleri, uygun biyouyumluluğa sahip manyetik nanomalzemeler olarak yaygın şekilde kabul edilmektedir. Yaygın olarak kullanılan manyetik rezonans görüntüleme kontrast ajanları olan süperparamanyetik Fe₃O₄ nanopartikülleri, klinik görüntüleme tanısında kapsamlı bir şekilde uygulanmıştır²⁹^,³⁰. Grubumuzun yakın tarihli çalışmasında²⁰, f-SPION'ların son derece düşük sitotoksisite ve mükemmel biyogüvenlik sergilediği gösteri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Y.W.'ye verilen 82571677 ve 82001304 numaralı hibeler), Jilin Eyaleti Tıp ve Sağlık Bakımı Yetenekleri Özel Programı (Y.W.'ye verilen JLSRCZX2025-134 numaralı hibe) ve Jilin Üniversitesi Bethune Program Projesi (Y.W.'ye verilen 2024B19 numaralı hibe) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar; nanomalzemelerin tasarımı, sentezi ve karakterizasyonu konusundaki yardımları için Jilin Üniversitesi Kimya Fakültesi'ne (Supramoleküler Yapı ve Materyaller Devlet Anahtar Laboratuvarı) ve Çin Bilimler Akademisi Changchun Uygulamalı Kimya Enstitüsü'ne teşekkür ederler. Yazarlar ayrıca, CLSM görüntüleme konusundaki yardımları için Jilin Üniversitesi Birinci Hastanesi Translasyonel Tıp Enstitüsü'ne teşekkür ederler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,2-Heksadekandiyol	Sigma-Aldrich	213748	Teknik sınıf, %90; termal bozunma sentezinde kullanılır
35 mm ibidi µ-kaplar	ibidi	80156	Schwann hücresi kültürü ve görüntülemesi için kullanılır
Benzil eter	Sigma-Aldrich	108014	%98; Fe için çözücü₃O₄ nanopartikül sentezi
Konfokal lazer tarama mikroskobu	Nikon	AXR (Ti2-E)	Canlı hücre ve floresan görüntülemede kullanılır
Özel yapım elektromıknatıs	Özel yapım	Lütfen çevirmem için kaynak metni sağlayın.	In vitro gradyan manyetik alan üretimi için kompakt unipolarmanyetik
Siyanin3.5 karboksilik asit	Duofluor Inc.	D10128	Fe için kullanılan floresan boya₃O₄·Cy3.5 süperpartikül montajı; MW 593,20; -'de saklayınız20 °C, ışıktan korunarak
Deferoksamin mezilat tuzu	Sigma-Aldrich	D9533	İçselleştirilmemiş ve membrana ilişkili demiri uzaklaştırmak için kullanılan demir şelatlayıcı ajan
Dijital Gaussmetre	GENİŞ MIKNATISLI	WT103	Manyetik akı yoğunluğunu ölçmek ve özel elektromıknatıs tarafından oluşturulan gradyan manyetik alanı kalibre etmek için kullanılır
Dopamin hidroklorür	Sigma-Aldrich	H8502	≥%98 (TLC); polidopamin kaplama için kullanılmıştır
Dinamik ışık saçılım cihazı	Malvern Instruments	Zetasizer Nano-ZS	Hidrodinamik çap ve PDI ölçümü için kullanılır
Fluo-4 AM	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	F14201	Canlı hücre Ca ölçümleri için kullanılan kalsiyum indikatörü²⁺ görüntüleme
Floresans spektrofotometre	Shimadzu	RF-6000	Fotolüminesans karakterizasyonu için kullanılır
Yüksek çözünürlüklü transmisyon elektron mikroskobu	JEOL	JEM-F200	Nanoparçacık morfolojisi ve çekirdeğinin HRTEM görüntülemesi için kullanılır–kabuk yapısı
İndüktif eşleşmiş plazma atomik emisyon spektrometresi	PerkinElmer	Optima 3300 DV	Hücre içi demir miktarının belirlenmesinde kullanılır
Demir(III) asetilasetonat, Fe(acac)₃	Sigma-Aldrich	F300	%97; Fe öncülü₃O₄ nanopartikül sentezi
Canlı hücre sahne üstü inkübatörü	TOKAI HIT	TENP&CO₂	Manyetik stimülasyon sırasında canlı hücre konfokal görüntüleme için kullanılır
Oleik asit	Sigma-Aldrich	O1008	≥%99 (GC); Fe için yüzey ligandı₃O₄ nanoparçacık sentezi
Oleilamin	Sigma-Aldrich	O7805	Teknik kalite, %70; nanopartikül sentezi için ligand
Falolidin–Alexa Fluor 350	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	A22281	Opsiyonel aktin hedefli fonksiyonelleştirme reaktifi
Pluronic F-127	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	P3000MP	Canlı hücre Ca²⁺ ölçümleri için Fluo-4 AM yüklemesini kolaylaştırmak amacıyla kullanılır²⁺ görüntüleme
Programlanabilir DC regüleli güç kaynağı	Tongmen	eTM-L605SPL (60 V, 5 A)	In vitro gradyan manyetik alan üretimi için özel elektromıknatısa güç sağlamak amacıyla kullanılır
RSC96 Schwann hücreleri	Çin Bilimler Akademisi Hücre Bankası	Girdi sağlanmadığı için çeviri yapılamamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni giriniz.	Sıçan kaynaklı Schwann hücresi hattı
Sodyum dodesil sülfat (SDS)	Sigma-Aldrich	436143	ACS ayıracı, ≥%99,0; yağ-içinde-su mikroemülsiyonu için sürfaktan
SQUID manyetometresi	Quantum Design Inc.	MPMS-XL	300 K'de manyetik histerezis ölçümü için kullanılmıştır
Toluen	Sigma-Aldrich	244511	Susuz, %99,8; süperparçacık montajı için çözücü
Transmisyon elektron mikroskobu	FEI	EP 5018/40, Tecnai Spirit Biotwin	Hücresel ve sinir dokusu ultrastrüktür gözlemi için kullanılır

Kaynaklar

Cheng B, et al. Mechanobiology across timescales. Nat Rev Phys. 2025;7:621-44.
Di X, et al. Cellular mechanotransduction in health and diseases: from molecular mechanism to therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:282.
Pillai EK, Franze K. Mechanics in the nervous system: from development to disease. Neuron. 2024;112(3):342-61.
Franze K. The mechanical control of nervous system development. Development. 2013;140(15):3069-77.
Franze K, Guck J. The biophysics of neuronal growth. Rep Prog Phys. 2010;73:094601.
Moore SW, Sheetz MP. Biophysics of substrate interaction: influence on neural motility, differentiation, and repair. Dev Neurobiol. 2011;71(11):1090-101.
Franze K, Janmey PA, Guck J. Mechanics in neuronal development and repair. Annu Rev Biomed Eng. 2013;15:227-51.
Sun W, et al. Biophysical approaches for applying and measuring biological forces. Adv Sci (Weinh). 2022;9(5):e2105254.
Mohammed D, et al. Innovative tools for mechanobiology: unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:162.
Constantinou I, Bastounis EE. Cell-stretching devices: advances and challenges in biomedical research and live-cell imaging. Trends Biotechnol. 2023;41:939-50.
Polacheck WJ, Li R, Uzel SGM, Kamm RD. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 2013;13(12):2252-67.
Li Z, et al. Non-invasive acquisition of mechanical properties of cells via passive microfluidic mechanisms: a review. Biomicrofluidics. 2021;15(3):031501.
Xiao Y, Du J. Superparamagnetic nanoparticles for biomedical applications. J Mater Chem B. 2020;8(3):354-67.
Yang X, et al. Nanotechnology enables novel modalities for neuromodulation. Adv Mater. 2021;33(52):e2103208.
Semeano AT, et al. Effects of magnetite nanoparticles and static magnetic field on neural differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev Rep. 2022;18(4):1337-54.
Lee B, et al. Design of oxide nanoparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 2025;10:252-67.
Kim YJ, et al. Magnetoelectric nanodiscs enable wireless transgene-free neuromodulation. Nat Nanotechnol. 2025;20:121-31.
Signorelli L, Hescham SA, Pralle A, Gregurec D. Magnetic nanomaterials for wireless thermal and mechanical neuromodulation. iScience. 2022;25(11):105401.
Liu T, Wang Y, Lu L, Liu Y. SPIONs-mediated magnetic actuation promotes nerve regeneration by inducing and maintaining repair-supportive phenotypes in Schwann cells. J Nanobiotechnology. 2022;20:159.
Liu T, et al. f-SPION-mediated magnetic stimulation induces reparative Schwann cell reprogramming via cytoskeletal dynamics-gated activation of Piezo1. J Nanobiotechnology. 2026;24:298.
Jessen KR, Mirsky R, Lloyd AC. Schwann cells: development and role in nerve repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(7):a020487.
Jessen KR, Mirsky R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. J Physiol. 2016;594(13):3521-31.
Sun S, Zeng H. Size-controlled synthesis of magnetite nanoparticles. J Am Chem Soc. 2002;124(28):8204-5.
Zhuang J, Wu H, Yang Y, Cao YC. Controlling colloidal superparticle growth through solvophobic interactions. Angew Chem Int Ed Engl. 2008;47(12):2208-12.
Bai F, et al. A versatile bottom-up assembly approach to colloidal spheres from nanocrystals. Angew Chem Int Ed Engl. 2007;46(35):6650-3.
Tang L, et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(43):15344-9.
Tay A, Kunze A, Murray C, Di Carlo D. Induction of calcium influx in cortical neural networks by nanomagnetic forces. ACS Nano. 2016;10(2):2331-41.
Tay A, Di Carlo D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Lett. 2017;17(2):886-92.
Cheng FY, et al. Characterization of aqueous dispersions of Fe(3)O(4) nanoparticles and their biomedical applications. Biomaterials. 2005;26(7):729-38.
Lee N, et al. Iron oxide-based nanoparticles for multimodal imaging and magnetoresponsive therapy. Chem Rev. 2015;115(19):10637-89.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Süperparamanyetik Nanoparçacıklar Manyetik Stimülasyon Canlı Hücre Görüntüleme Sitoskeletal Organizasyon Elektromanyetik Stimülasyon Mekanobiyoloji

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Beni bilgilendir: