Yöntem makalesi

Medicago sativa Kök Nodüllerinin 3B MicroCT Görüntülemesi

101 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71686

⸱

28 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Baklagiller toprakla ortaklık kurar bakteriler, bakterilerin bitki kullanımı için atmosferik azotu sabitlediği kök nodülleri oluşturur. MicroCT; kök nodüllerinin bu opak ve sert dokusundaki doku organizasyonunun, bakteroid bölgelerinin ve vasküler demetlerin tahribatsız 3D görüntülemesini sağlayarak, nodüllerin kesilmesini gerektiren geleneksel görüntüleme tekniklerine göre avantajlar sunar.

Özet

Baklagil olan Medicago sativa ile toprak bakterisi Sinorhizobium meliloti arasındaki simbiyotik ilişki, azot sabitleyici kök nodüllerinin oluşumuyla sonuçlanır. Bakterilerin nodülü nasıl işgal ettiğini görselleştirmek için parafin kesit alma, vibratom kesit alma ve kriyokesit alma dahil olmak üzere geleneksel yıkıcı yöntemler uygulanmıştır; ancak bu yöntemlerle güvenilir üç boyutlu bilgiler elde etmek oldukça zordur. Bu yaklaşımlar genellikle, bitki büyümesini ve nodül oluşumunu etkileyebilecek ek stresler yaratabilen floresan işaretleme veya boyama ile kombine edilir. MicroCT, bitki histolojik özelliklerini tahribatsız bir şekilde üç boyutta (3D) görselleştirebilen, böylece numune hazırlama sırasındaki yıkıcı artefaktların önüne geçen ve yüksek doğruluklu 3D rekonstrüksiyon sağlayan, bitki biyolojisi için nispeten hızlı, kolay ve güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. MicroCT baklagil kök nodülleri üzerinde uygulanmış olsa da, bitki hasadı ve numune hazırlığından taramaya ve yazılım görselleştirmesine kadar olan süreci belgeleyen ayrıntılı ve yerleşik bir protokol eksiktir.

Bu çalışmada, model olarak Medicago sativa kullanarak adım adım bir mikro-BT iş akışını gösteriyoruz. Protokol; köklerden nodül eksizyonu, fiksasyon, kontrast artırımı, montaj, tarama ve üç boyutlu rekonstrüksiyonu içermektedir. Görüntü kalitesi, doku korunumu ve kontrast gibi unsurları etkileyen kritik parametreler vurgulanmıştır. Bu yaklaşımı kullanarak, nodülleri fiziksel olarak kesmeden genel doku organizasyonunu, bakteroidle enfekte olmuş hücreleri ve vasküler demetleri üç boyutlu olarak görselleştirmek mümkündür. Burada açıklanan işlem hattı, doğal kök nodüllerinin tahribatsız, yüksek çözünürlüklü görüntülemesi için tekrarlanabilir bir yöntem sunmakta olup muhtemelen diğer baklagil türlerine de uyarlanabilir ve araştırmacılara nodül yapısını ve nodüller içindeki bakteriyel organizasyonu 3D olarak incelemek için pratik bir araç sağlamaktadır.

Giriş

Medicago sativa (yonca) gibi Leguminosae (veya Fabaceae) familyasındaki bitkiler, Sinorhizobium meliloti gibi Rhizobiaceae familyasından azot sabitleyici toprak bakterileriyle simbiyotik bir ilişki kurar ve bu durum kök nodüllerinin gelişimiyle sonuçlanır. Bitki, azotun sınırlı olduğu koşullarda bakterileri çekmek için flavonoidler salgılar. Bu durum, simbiyotik bakterilerde Nod faktörlerinin ekspresyonunu aktive ederek kök tüyünün kıvrılmasını ve ardından bakterileri çevreleyen bir enfeksiyon odasının oluşumunu tetikler1,2,3,4. Oda duvarının zayıflatılmış bir bölümünden bir enfeksiyon ipliği oluşur ve bakterileri kök tüyü hücresi boyunca taşıyan, uzayan bir tüp meydana getirir5. Enfeksiyon ipliği iç kortekse ulaştığında, bir dizi hücre bölünmesi kök nodülü adı verilen özelleşmiş bir kök organının oluşumunu başlatır1,2,5. Bakteriler daha sonra nodül hücresini enfekte eder ve hücre içinde, simbiyozomal membranla çevrili olarak hücre içi bölgede yaşarlar. Burada bitki, bakterilere karbon ve diğer besin maddelerini sağlar. Karşılığında bakteriler, kullanılamayan atmosferik azotu bitkinin kullanabileceği bir form olan amonyaka dönüştürerek bitki için azot sabitlemesi yaparlar2,3,4. Böylece kök nodülü, sentetik azot gübrelerinin yokluğunda bile bitki büyümesini sürdüren, azot fiksasyonu için hayati bir biyolojik fabrika olarak işlev görür. Biyolojik azot fiksasyonunun bu süreci, baklagillerin sentetik gübreler olmadan büyümesine olanak tanıdığı için ekonomik ve çevresel açıdan önemlidir6. Ayrıca, bazı baklagiller, bakterilerin farklılaştığı ve azotu daha verimli sabitlediği belirgin bölgeler oluşturan indetermine nodüller meydana getirir4. Bu nedenle, biyolojik azot fiksasyonunu detaylı olarak incelemek için hem nodül dışının hem de iç kısmının (bakterilerin nodül içindeki bitki hücrelerini fiziksel olarak doldurduğu yerin) görselleştirilmesi önemlidir. Ancak nodül, kırmızı renkli bitki proteini leghemoglobini ile dolu opak bir organ olduğundan, geleneksel görüntüleme yöntemlerini zorlaştırmaktadır.

Geçmişte kullanılan görüntüleme teknikleri yıkıcı olmuştur. Doku kesitleri üretmek için parafin kesme, vibratom kesme ve kriyokesitleme yöntemleri kullanılmıştır ancak bunlar dokunun doğal durumunu bozar ve üç boyutlu (3D) yeniden yapılandırmayı zorlaştıran artefaktlar oluşturur6,7,8,9,10. Parafin gömülü nodül doku kesitlerinden yeniden yapılandırma başarıyla tamamlanmıştır, ancak bu yöntem dehidre edilmiş örnekler kullanır ve 200'den fazla bireysel kesit gerektirir8. Bireysel kesitlerde vasküler sistemin bölümleri görülebilse de, demetlerin nasıl ayrıldığı ve nodül etrafını nasıl sardığı görülemez. Konfokal mikroskopi öncesinde doku kesitleri üzerinde çeşitli floresan işaretleme ve boyama teknikleri uygulanmıştır, ancak bunlar genellikle şu sorunlara yol açmaktadır8,9,10: (i) Bitki nodül dokusu yüksek derecede otofloresan özelliktedir, (ii) birçok yöntem görüntüleme öncesinde doku şeffaflaştırma gerektirir, (iii) floresan boyama nodül dokusuna zarar verebilir, iv) bitkilerin yeşil floresan protein (GFP) işaretli bakterilerle inokülasyonu, hem bitki büyümesini hem de nodül oluşumunu etkileyen bir stres yaratır ve v) doğal nodüller, tüm örneği kolayca kesmek için çok büyüktür5,11.

Tıbbi ortamlarda yaygın olarak kullanılan bilgisayarlı tomografi (BT) görüntüleme, hem tanısal hem de terapötik amaçlar için kullanılır12,13. Bunun daha küçük bir versiyonu olan X-ışını mikrotomografisi (MicroCT), küçük deneklerin tahribatsız üç boyutlu (3D) görselleştirilmesine olanak tanıyan bir görüntüleme tekniğidir. BT'de cihaz büyük denek etrafında dönerken, microCT'de küçük denek X-ışını kaynağına yakın bir konumda döndürülür. Bu durum çok daha yüksek çözünürlük sağlar. MicroCT, hayvan gelişim biyolojisinde uygulanmıştır ancak bitki biyolojisinde de gelecek vaat eden bir araç olarak ortaya çıkmıştır6,10,14,15,16,17,18,19. Önemli bir nokta olarak, microCT ve sinkrotron tabanlı X-ışını tomografisi, ksilem embolisini incelemek ve görüntüleme tabanlı tahminleri geleneksel hidrolik akış ölçümleriyle çapraz doğrulamak için bitki fizyolojisinde yaygın olarak kullanılmıştır20,21,22. Fiziksel kesit alma işlemi olmadan organları olduğu gibi görüntülediği için microCT, tüm nodül boyunca uzanan uzaysal ilişkileri korur. Uygun kontrast ajanları ile iletim demetleri ve enfeksiyon bölgeleri gibi doku düzeyindeki yapıları çözümler ve ışık saçılımının geleneksel optik yaklaşımları sınırladığı noktaların ötesine nüfuz edebilir; bu özellik özellikle opak ve oto-floresan nodüller için değerlidir. Örnekler ayrıca yeniden taranabilir, ışık veya elektron mikroskobu örnekleme işlemlerinin ardından alt akışlı korelatif iş akışlarına dahil edilebilir veya gelecekteki analizler için arşivlenebilir. Birkaç çalışma, soya fasulyesi kök nodüllerini incelemek için microCT ve sinkrotron tabanlı X-ışını BT kullanmış olsa da, nodül hasadı ve boyamadan görüntüleme ve yeniden yapılandırmaya kadar tüm süreci kapsayan, özellikle yonca nodülleri gibi daha küçük nodüller için ayrıntılı bir kayıt bulunmamaktadır6,14. X-ışını kontrastı doku yoğunluğuna bağlıdır ve çoğu bitki dokusu düşük yoğunluklu olup X-ışınlarını zayıf şekilde soğurur. Bir kontrast ajanı olmadan, nodüller geleneksel bir masaüstü microCT cihazında arka plandan ayırt edilemez. Proteinlere ve diğer biyomoleküllere bağlanan ve bitki dokusunda yüksek kontrast oluşturduğu gösterilen spesifik olmayan bir boya olan fosfotungstik asit (PTA) kullandık14.

Bu çalışma, X-ışını mikroskopisine (XRM) ve sinkrotron tabanlı platformlara6,14 kıyasla daha erişilebilir bir alternatif sunan geleneksel laboratuvar tabanlı bir sistem üzerinde, yonca model alınarak baklagil kök nodüllerinin mikroBT görüntülemesi için ayrıntılı ve adım adım bir protokol sunmaktadır. Bu iş akışı; nodüllerin kökten hasadı, fiksasyon, boyama, kontrast artırma, montaj, tarama, 3D rekonstrüksiyon ve analiz için özel talimatlar içermektedir (Şekil 1). Bu adımlar arasında, stabil montajı, nem tutulumunu ve iyi kontrastı sağlamak için detaylı parametreler sunuyoruz. Nihayetinde, bu mikroBT hattı; genel doku organizasyonu, bitki hücrelerindeki bakteriyel yerleşim, belirgin azot fiksasyon bölgeleri ve bütün yonca kök nodüllerinin doğal durumundaki vasküler demetleri dahil olmak üzere 3D histolojik özelliklerin tahribatsız ve yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesine olanak tanıyan tekrarlanabilir bir yöntemdir. Bu protokolün diğer baklagil türlerine de uyarlanabileceğine ve araştırmacılara bu çok önemli kök organının 3D yapısını ve organizasyonunu görselleştirmek için pratik ve bozulmamış bir yöntem sunacağına inanıyoruz.

Protokol

1. Nodül hasadı ve fiksasyonu

  1. İlgilenilen nodülün her iki yanından kökü boyunca düz bir kesik atarak nodülün köke bağlı kalmasını sağlamak için bir skalpel kullanın (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 2).
  2. Sekiz ila on iki nodülü, 10 mL %70 (v/v) etanol içeren 20 mL'lik bir cam şişeye aktarın (bkz. Malzeme Tablosu).

2. Nodül boyama

  1. 200 mL'lik geniş ağızlı kare bir şişeye (bkz. Materyaller Tablosu) 200 mL %70 etanol içerisine 2 g PTA tozu ekleyerek %1 (w/v) PTA'yı %70 etanolde hazırlayın. Tamamen çözünene kadar çalkalayın ve ardından 4 °C'de saklayın. Boyayı kullanımdan 1 gün önce hazırlayın.
  2. Fiksasyon sırasında kullanılan %70 etanolü uzaklaştırın ve yerine 10 mL %1'lik PTA çözeltisi ekleyin (bkz. Materyaller Tablosu).
  3. Cam şişeyi, oda sıcaklığında, 80 rpm hızda, 4 hafta boyunca orbital çalkalayıcıya yerleştirin. Boyama çözeltisini her hafta 10 mL taze %1'lik PTA ile değiştirin (bkz. Materyaller Tablosu, Şekil 2).

3. Nodül montajı

  1. Parafini, 100 mL'lik açık bir cam beher içinde 100 °C'de bir ısıtıcı tabla kullanarak eritin (Bkz. Materyaller Tablosu).
  2. Numune gömme işlemi için 200 µL'lik pipet uçları seçin. Uçların dar uçlarını, eritilmiş parafine sığ bir şekilde (1–2 mm) daldırarak mühürleyin (Bkz. Materyaller Tablosu).
  3. Numuneyi, 35 mm'lik bir mikrokuyu tabağında 2 mL %70'lik etanol ile 5 dakika boyunca durulayın (Bkz. Materyaller Tablosu).
  4. 25 mL'lik bir Erlenmeyer balonuna 0,2 g düşük erime noktalı agaroz ekleyin ve %1 (w/v) düşük erime noktalı agaroz elde etmek için 20 mL demineralize su ile karıştırın. 50 °C'deki bir ısıtıcı tablaya yerleştirin ve tamamen çözülene kadar birkaç kez çalkalayın. Ardından balonu 40 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin (Bkz. Materyaller Tablosu).
  5. Ters çevrilmiş mühürlü pipet uçlarına yaklaşık 25 µL %1'lik düşük erime noktalı agaroz ekleyin ve soğuması için 1 dakika bekleyin (Bkz. Materyaller Tablosu).
  6. Bir nodülü alın ve %1'lik düşük erime noktalı agaroz içinde sabitlemek için ince bir penset yardımıyla pipet ucuna aktarın. Kök nodülüne zarar vermeden, nodülü pipet ucunun parafinle mühürlenmiş tarafına mümkün olduğunca yaklaştırmak için bir jel yükleme ucu kullanın (Bkz. Materyaller Tablosu).
  7. Düşük erime noktalı agarozun katılaşması için kök nodüllü uçları bir rafa yerleştirin. Katılaştıktan sonra, nemi korumak için pipet uçlarının açık uçlarını Parafilm ile mühürleyin (Bkz. Materyaller Tablosu). Numuneyi 4 °C'deki buzdolabında saklayın ve gömülmüş numuneleri bir hafta içinde tarayın.

4. MicroCT görüntüleme

  1. X-ışını kaynağına en yakın konumlandırmayı sağlamak ve numunenin doğru şekilde merkezlenmesini garanti etmek için pipet uçlarını uygun boyutlu bir numune tutucuya ters şekilde monte edin (Bkz. Malzemeler Tablosu).
  2. CT yazılımını açın. Numuneyi tutucusuyla birlikte microCT rotasyon tablasına sıkıca vidalayın (Bkz. Malzemeler Tablosu, Şekil 3, Ek Şekil 1).
  3. Kamera görüntüsünü ve X-ışını kaynağını açın, ardından sürekli X-ışını görüntüleme ekranını aktif hale getirin (Ek Şekil 1).
  4. İlgi bölgesini X-ışını sürekli ekranının merkezine getirmek için numune yüksekliğini dikey olarak ayarlayın. Bu yüksekliği adım 4.10'da kullanmak üzere not edin (Ek Şekil 1).
  5. Binning değeri 512 × 512 iken, numunenin X-ışını sürekli görüntüsü görüş alanının çoğunu dolduracak ancak her iki yanda bir miktar boşluk kalacak şekilde piksel boyutunu ayarlayın (bkz. Ek Tablo 1, Ek Şekil 1).
  6. Sürekli X-ışını görüntüleme ekranında numuneyi, her 45° döndürerek ve merkeze ayarlayarak merkezleyin (Ek Şekil 1).
  7. Binning değerini 2048 × 2048 olarak değiştirin (bkz. Ek Tablo 1, Ek Şekil 1).
  8. Tarama Modları menüsünden filtre seçmeyin, voltajı 50 kV ve akımı 40 µA olarak ayarlayın (bkz. Ek Tablo 1, Ek Şekil 1).
  9. Numuneyi 68 mm aşağı indirerek sürekli X-ışını görüntüleme ekranının görüş alanının dışına çıkarın ve düz alan düzeltmesi (flat field correction) yapın. Düz Alan Düzeltmesi seçeneğini kapatın ve ortalama X-ışını transmisyonu %55 olacak şekilde Pozlama Süresini ayarlayın. Düz Alan Düzeltmesi seçeneğini açın (bkz. Ek Tablo 1, Ek Şekil 1).
  10. Numuneyi adım 4.4'te belirlenen yüksekliğe geri getirin (Ek Şekil 1).
  11. Tarama Seçenekleri kısmından dosya adını ve klasör konumunu belirleyin (Ek Şekil 1).
  12. Rotasyon adımını 0.200° olarak ayarlayın. Kare Ortalamasını 3 ve Rastgele Hareket değerini 30 yapın. 360° taramayı seçin (bkz. Ek Tablo 1, Ek Şekil 1).
  13. İsteğe bağlı olarak, aşırı boşlukları hariç tutmak ve veri boyutunu azaltmak için Kısmi genişlik ayarını düzenleyin (Ek Şekil 1).
  14. Taramayı başlatmak için Tara düğmesine tıklayın (Ek Şekil 1).

5. Görüntü rekonstrüksiyonu

  1. Görüntü yeniden yapılandırma yazılımını açın ve taramadaki tüm 2D projeksiyonları yükleyin (bkz. Materyaller Tablosu, Şekil 4).
  2. Yeşil çizginin bulunduğu konumdaki yeniden yapılandırma sonuçlarını görselleştirmek için Preview seçeneğine tıklayın (Ek Şekil 2).
  3. Output sekmesindeki histogramı ayarlayın. Sağdaki düz alanı kesin ve soldaki değeri 0 veya 0'dan biraz daha düşük tutun (Ek Şekil 2).
  4. Start sekmesinde, hizalama sonrası işlem için Fine Tuning seçeneğine tıklayın. Parameter adımını bir ve deneme Number değerini beş olarak başlatın. Start ve OK butonlarına tıklayın. Sonuçlar Output sekmesinde göründüğünde, prv penceresine tıklayın ve en iyi hizalamayı seçmek için sonuçlar arasında oklarla ilerleyin. En iyi görüntü üzerinde bırakın (Ek Şekil 2).
  5. Output sekmesinde, Use ROI yanındaki kutucuğa tıklayarak ROI'yi etkinleştirin. ROI şekli olarak circle seçeneğini belirleyin. Start sekmesine dönüp farklı konumları önizlemek için yeşil çizgiyi hareket ettirerek, ROI boyutunu veri hacmi boyunca örnek boyutuna göre ayarlayın. Örnek etrafında biraz boşluk bırakın (Ek Şekil 2).
  6. Tekrar Start sekmesine tıklayın. Yeniden yapılandırma verilerinde ihtiyaç duyulmayan alanları kesmek için üst ve alttaki kırmızı çizgileri kaydırın. Yeşil çizgiyi kırmızı çizgilere yakınlaştırıp Output sekmesindeki yeniden yapılandırmaları önizleyerek, önemli verilerin hariç tutulup tutulmadığını kontrol edin (Ek Şekil 2).
  7. Output sekmesinde, yeniden yapılandırmayı TIFF (16-bit) görüntüleri olarak istenen konuma kaydedin (Ek Şekil 2).
  8. Start sekmesine geri dönün ve Start seçeneğine tıklayın (Ek Şekil 2).

6. 3D görselleştirme

  1. Dragonfly Yazılımını açın (bkz. Materyaller Tablosu).
    NOT: Dragonfly ve yetenekleri hakkında ek bilgi için lütfen https://dragonfly.comet.tech/ adresine başvurun.
  2. Rekonstrüktör TIFF görüntülerini içe aktarın.
  3. Tüm görüntüleri seçin ve görüntü aralığının, tarama metin dosyasındaki (Ek Şekil 3) Ölçeklendirilmiş Görüntü Piksel Boyutu ile aynı olduğunu doğrulayın.
  4. İyi bir kontrasta sahip 3D görünüm elde etmek için pencere seviyelendirmesini ayarlayın (Ek Şekil 3).
  5. Farklı 2D kesit düzlemleri (XY, transvers; XZ, koronal; YZ, sagital) arasında kaydırma yaparak inceleyin (Ek Şekil 3).
  6. Görüntüye sağ tıklayın ve kesit görünümlerini gerektiği gibi kaydetmek için görünümün bir ekran görüntüsünü dışa aktarın (Şekil 4).

Sonuçlar

Üç M. sativa bitkisinin her birinden ikişer kök nodülü topladık. İki nodül boyama süresi karşılaştırmaları için kullanıldı ve dördü, kontrast artırımı amacıyla %70 etanol içinde %1 PTA ile yapılan 28 günlük tam boyamanın ardından görüntüledik. Pipet uçlarında montaj medyumu olarak %1 düşük erime noktalı agaroz kullanarak, numuneyi çevreleyen düşük X-ışını yoğunluğuna sahip bir montaj ortamı elde ettik. Boyama çözeltisi bitki dokusunun kontrastını başarıyla artırdı (Şekil 5A,B, Ek Şekil 4). Numuneden gelen sinyal, veri histogramı ile arka plandan ve pipet ucundan kolayca ayrıldı ve böylece tüm kök nodülünün dış ve iç yapısının engelsiz bir şekilde 3D görselleştirilmesine olanak sağladı (Şekil 5A,B).

Dış epidermis görünür durumdadır, ancak diğer dokulara göre daha az kontrast göstermektedir (Şekil 5C–E). Öte yandan, vasküler demetler belirgindir ve örneğin alt kısmından üst kısmına kadar iyi bir şekilde birbirine bağlıdır (Şekil 5A,B). Enine kesitlerde, bu demetlerin sayısını ve ayrılmasını net bir şekilde görebiliriz (Şekil 5C). Ayrıca, iç doku iyi bir kontrast sergilemekte, bu da korteksin ve bitki vakuollerinin tanımlanmasına olanak sağlamaktadır (Şekil 5C–E). Yüksek kontrast, enfekte ve enfekte olmamış hücrelerin tespitini de kolaylaştırmaktadır (Şekil 5C–E). Koronal ve sagital kesitler; meristematik, enfeksiyon ve diferansiyasyon bölgelerinin dağılımını ortaya koymaktadır (Şekil 5D). Ek Video 1, 3D olarak rekonstrükte edilmiş bir nodülün 360° görünümünü sunmaktadır.

figure-results-1
Şekil 1: Protokol iş akışı. Baklagil kök nodüllerini görüntülemek için microCT kullanımına yönelik iş akışının genel görünümü ve her bir adım için gereken süre. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Bu protokol için M. sativa kök nodülleri. (A) S. meliloti bakterileri ile inokülasyondan 28 gün sonra (28 dpi) M. sativa bitkisi. Siyah noktalı çizgiler, gösterilen nodüllerin çıkarılması için önerilen kesim hatlarını temsil etmektedir. Üç bitkinin her birinden ikişer nodül çıkarılmış ve dört örnek taranmıştır. (B) 4 haftalık PTA boyamasından sonra M. sativa 28 dpi nodülü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: microCT örnek kurulumuna genel bakış. Kontrast ajanla boyanmış kök nodülü, bir mikropipet ucunda düşük erime noktalı agaroz ile stabilize edilmiştir. Mikropipet ucunun bir ucu parafin mumu ile kapatılmış ve microCT cihazındaki rotasyon tablasına sabitlenmiştir. X-ışını kaynağı (filtresiz) cihazın bir tarafında yer alır ve ışınlar, örneğin içinden geçerek diğer taraftaki X-ışını dedektörüne ulaşır. Tarama sonucunda doku yoğunluğuna dayalı 2D bir projeksiyon elde edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4Örnek görüntü rekonstrüksiyonu ve 3B görselleştirme. (Sol) 2B projeksiyon. (Orta) Rekonstrüksiyon bölümü. A1, B1 ve C1, mikroBT 2D projeksiyonundan A, B ve C konumlarındaki yeniden yapılandırılmış enine kesitleri göstermektedir. (Sağda) Yeniden yapılandırılan görüntülerden oluşturulmuş kök nodülünün 3D görselleştirmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Açıklamalı temsilci görüntüler. (A) M. sativa kök nodülünün açıklamalı 3D görselleştirmesi. (B) Sırasıyla transvers (C), koronal (D) ve sagital (E) düzlemleri gösteren 3D görüntü üzerindeki kırmızı, mavi ve yeşil ana hatlar. M. sativa kök nodülünün açıklamalı transvers (C), koronal (D) ve sagital (E) kesitleri. Kısaltmalar: c – korteks; e – epidermis; ic – enfekte hücre; r – kök; uc – enfekte olmamış hücre; v – vakuol; vb – vasküler demet; ZI – Bölge I (meristematik); ZII – Bölge II (enfeksiyon); ZIII – Bölge III (farklılaşma). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1. microCT görüntüleme için yazılım ekran görüntüleri. (A1) Sahne kapağını açın ve kapatın. (A2) Kamera görünümünü açın. (A3) X-ışını kaynağını açın. (A4) Sürekli X-ışını görünümünü açın. (A5) Numune yüksekliğini ayarlayın. (A6) Piksel boyutunu ayarlayın. (A7) Numuneyi döndürün. (A8) Binning ayarını değiştirin. (A9) Filtreyi değiştirin. (A10) Tarama Modlarına erişim seçenekleri. (A11) X-ışını kaynağı voltajını ve akımını ayarlayın. (A12) Flat-field düzeltmesini kapatmak için çift tıklayın. (A13) Tarama seçenekleri. (B1) Flat-field düzeltmesi kapalı. (B2) Tarama Modlarına erişim seçenekleri. (B3) Ortalama X-ışını transmisyonu. (B4) Pozlama süresini ayarlayın. (B5) Flat-field'leri güncelleyin. (C1) Dosyayı adlandırın ve verileri nereye kaydedeceğinizi seçin. (C2) Rotasyon adımını, kare ortalamasını, rastgele hareketi ve 360 deg taramayı ayarlayın. (C3) Kısmi genişliği ayarlayın. (C4) Taramayı başlatın.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Şekil 2. Görüntü rekonstrüksiyonu için yazılım ekran görüntüleri. (A1) Numunenin nerede önizleneceğini seçin. (A2) Numune önizleme. (A3) Parametrelerin ince ayarı. (A4) Hizalama sonrası için deneme sayısını ve parametre adımını belirleyin. (A5-6) Rekonstrüksiyon alanının üst ve alt kısımları. (A7) Rekonstrüksiyonu başlatın. (B1) Kontrastı ayarlayın. (B2) Hizalama sonrası sonuçlarını görüntüleyin ve tıklayarak ilerleyin. (B3) Daire şeklinde ROI oluşturun. (B4) Dosya formatını ve verilerin nereye kaydedileceğini seçin.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3. 3D görselleştirme için yazılım ekran görüntüleri. (A) Görüntü aralığı bilgileri. (B) Seçme, döndürme ve yakınlaştırma araçları (üst). Kontrast için pencere seviyelendirme (alt). (C) Ölçek çubuğunu görüntüleme (üst). Arka plan rengini değiştirme (alt). Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Şekil 4. 14, 17 ve 28 günlük PTA boyama sonrası MicroCT rekonstrüksiyonu. (A) 14 günlük PTA boyama sonrası rekonstrükte edilmiş M. sativa kesiti, dış katmanda gürültü göstermektedir (n = 1). (B) 17 günlük PTA boyama sonrası rekonstrükte edilmiş M. sativa kesiti, (A) ile karşılaştırıldığında dış katmanda daha yüksek kontrast ancak iç kısımda daha az netlik göstermektedir (n = 1). (C) 28 günlük PTA boyama sonrası rekonstrükte edilmiş M. sativa kesiti, (A) ve (B) ile karşılaştırıldığında hem dış hem de iç katmanlarda daha yüksek kontrast göstermektedir (n = 4).Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: mikroCT görüntüleme parametreleri.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Video 1: 3B nodül videosu.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Aşağıda, numune hazırlama ve boyama ile ilgili bazı öneriler yer almaktadır. MicroCT görüntüleme için numune hazırlama sırasında, yapısal bütünlüğü korumak adına nodüllerin dikkatli bir şekilde çıkarılması esastır. Mekansal bağlamı korumak ve doku hasarını en aza indirmek için nodül bağlantı noktasının her iki yanındaki küçük bir kök segmentinin tutulmasını öneririz. X-ışını zayıflamasını artırmak ve internal anatomik özellikleri görselleştirmek için bir kontrast maddesinin kullanılması kritik öneme sahiptir14. PTA boyamasının kullanıldığı önceki bir çalışma, farklı bitki türleri ve doku tipleri arasında yeterli kontrast elde etmek için, aşırı boyanma kanıtı olmaksızın, minimum 14 günlük bir boyama süresinin gerektiğini göstermiştir14. Söz konusu çalışmada, Bradyrhizobium tarafından indüklenen soya fasulyesi kök nodülleri (14 dpi'de fikse edilmiş), 35 gün boyunca boyanmıştır14. Bu aralığı (14–35 gün) referans alarak, kendi nodül numunelerimiz üzerinde birkaç farklı zaman noktasında (14, 17 ve 28 gün) ön boyama denemeleri gerçekleştirdik ve sonuçtaki görüntü kontrastını karşılaştırdık. Daha kısa zaman noktalarına kıyasla daha iyi kontrast, daha net hücre sınırları ve daha homojen boyama sağladığı için, bu protokol için 28 günlük bir boyama süresi seçilmiştir (Ek Şekil 4). 14 ve 17 günlük rekonstrüksiyonların sistematik bir replika çalışmasından ziyade tek bir nodülden elde edildiğini, 28 günlük koşulun ise taranan dört nodülün tamamını içerdiğini ve boyama süresinin çalışmanın gerektirdiği çözünürlüğe göre ayarlanması gerektiğini belirtmek isteriz. 28 günlük bir boyama süresi ayrıca kısa bir zaman dilimi değildir. Önceki çalışmalarda önerildiği gibi, mikrodalga destekli boyama PTA penetrasyonunu hızlandırmaya ve böylece gerekli boyama süresini kısaltmaya yardımcı olabilir14. Lugol çözeltisi gibi iyot bazlı ajanlar da bitki dokusunda kontrastı artırmak için kullanılır23,24. Bu çalışmanın temel amacı tek bir tekrarlanabilir protokol oluşturmak olduğundan, boyama ajanlarını karşılaştırmadık ve nodül dokusundaki kanıtlanmış performansı nedeniyle PTA'yı seçtik14. Gelecekteki çalışmalar, farklı bitki türleri ve doku tiplerinde diğer boyaları test etmelidir.

Uygun gömme işlemi de aynı derecede önemlidir. Dehidrasyonu önlemek ve doğal morfolojiyi korumak için numune, düşük erime noktalı agaroz ile tamamen kaplı kalmalıdır. Gömme işleminin ardından, tarama sırasında stabiliteyi sağlamak ve agarozun katılaşmasını gerçekleştirmek için numuneler 4 °C'de gece boyunca saklanmalıdır. Veri toplama sırasında sürüklenme veya titreşim artefaktlarını önlemek için monte edilen numune, tarama tablasına güvenli bir şekilde sabitlenmelidir.

MicroCT, tüm nodül dokusunun ışık ve elektron mikroskopisinden daha kaba bir çözünürlükte, tahribatsız ve üç boyutlu görsellemesine olanak tanır. Hem XRM hem de sinkrotron tabanlı X-ışını CT, genellikle geleneksel microCT'den daha yüksek kaliteli ve çözünürlüklü görüntüler sağlar. Sinkrotron tabanlı X-ışını CT, yüksek foton akısı ve ışın koherensinin, kontrast artırıcı ajanlar olmadan hızlı görüntüleme ve yeterli kontrast sağlaması sayesinde, taze ve boyanmamış örneklerin doğrudan taranmasına da imkan tanır6. Duncan ve ark. (2022)14 ve Nakhforoosh ve ark. (2024)6 ile yapılan doğrudan karşılaştırma; tür (soya fasulyesi vs Medicago sativa), nodül tipi (belirli vs belirsiz) ve görüntüleme yöntemi (XRM ve sinkrotron tabanlı X-ışını CT vs geleneksel microCT) gibi çalışma tasarımındaki farklılıklar nedeniyle sınırlıdır. Buna rağmen, nodül rekonstrüksiyonlarımızın nominal piksel boyutu yaklaşık 1,75 µm olup, Duncan ve ark. (2022)14 çalışmasındaki nodül taramasından (2,2 µm, Şekil 4A) daha incedir; ancak onların rekonstrüksiyonları hala bizimkinden daha fazla netlik göstermektedir. Bu durum muhtemelen etkili çözünürlüğün nominal piksel boyutundan daha fazlasına bağlı olduğunu yansıtmaktadır; XRM'nin objektif lenslerinin optik büyütmesi, dedektör hassasiyeti, kaynak stabilitesi, kamera kalitesi ve rekonstrüksiyon yöntemlerinin tamamı buna katkıda bulunur. Burada gösterildiği gibi, vakuoller gibi büyük, düşük yoğunluklu özellikler kolayca ayırt edilebilse de, tekil hücrelerin bakteroidler ve daha küçük veya daha az yoğun organeller tarafından doldurulma durumu ayırt edilemez ve dinamik biyolojik süreçler gerçek zamanlı olarak yakalanamaz. PTA ve iyot tabanlı kontrast ajanları spesifik değildir ve moleküler kimlik hakkında bilgi veremezler. Hücre altı sorular hala floresan veya elektron mikroskopisini gerektirecektir. Bu görüntüleme yaklaşımları birbirini tamamlayıcı niteliktedir; microCT tüm organ morfolojisi ve 3D doku mimarisi için oldukça uygundur ve daha ince yapısal ve moleküler detayları ele alan ışık ve elektron mikroskopisi için bağlam sağlar.

Bu iş akışını, diğer S. meliloti suşları ile inoküle edilmiş M. sativa ve çeşitli farklı S. meliloti suşları ile inoküle edilmiş M. truncatula ile Trigonella foenum-graecum türlerinden benzer zaman noktaları ve gelişim aşamalarındaki nodüllerle başarıyla tekrarladık (yayımlanmamış veriler). Amacımız olgun, azot sabitleyen nodülleri karakterize etmek ve tekrarlanabilir bir protokol sağlamak olduğu için farklı gelişim aşamalarındaki nodülleri test etmedik. Buna rağmen, asıl kısıtlayıcı faktör nodül boyutu olduğundan, bu iş akışı farklı gelişim aşamalarındaki nodüllere de uygulanabilir olmalıdır. Taradığımız nodüller yaklaşık 2,5 mm uzunluğundaydı (Ek Tablo 1). Bu çalışmada kullanılan microCT cihazında, önerdiğimiz minimum uzunluk 1 mm'dir. Görüntülenebilecek boyut, büyütmeler farklılık gösterebileceğinden kullanılan cihaza göre değişiklik gösterecektir.

Güncel kanıtlar, nodül içindeki doluluğun, azot fiksasyonu verimliliği ile doğrudan ilişkili önemli bir parametre olduğunu göstermektedir. Enfekte hücre oranının daha yüksek olduğu nodüllerin, daha az hücrenin bakteriler tarafından doldurulduğu nodüllere göre azotu daha iyi fiksasyon yaptığı gösterilmiştir25. Ayrıca, nodül sağlığı vasküler yapının kapsamına bağlıdır ve bozulmuş veya sınırlı vasküler yapı, defektli nodüllere ve azalmış bitki sağlığına işaret eder26. Doluluk oranını ve vasküler mimariyi görüntüleme potansiyeli göz önüne alındığında, microCT, azot fiksasyonu alanındaki önemli bir boşluğu doldurmaktadır. Bu iş akışı, kök nodüllerinin iç ve dış yapılarının tahribatsız görselleştirmesini rutin olarak erişilebilir kılmakta olup; bu yapılar, ürünlere simbiyotik azot kaynağı sağlayan fiksasyon verimliliğinin doğrudan belirleyicileridir.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bitki hazırlama konusundaki yardımları için Stephanie Sage'e teşekkür ederiz. Xia Zhao örnek gömmeye yardımcı olmuştur. Projenin başlangıç tartışmaları için Madi Mitchell'a minnettarız. Veri yorumlama konusundaki tavsiyeleri için Tom Kleist ve Kexi Yi'ye teşekkür ederiz. Ayrıca protokol tavsiyeleri için Keith Duncan'a (Donald Danforth Plant Science Center) teşekkür ederiz. Bu proje, Stowers Institute for Medical Research tarafından finanse edilmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
20 mL Cam flakonSigma-AldrichZ190527Fiksasyon ve boyama için nodülleri tutmak amacıyla kullanılır.
200 µL Pipet uçlarıFisherbrand02-717-144Görüntüleme için nodülleri tutmak amacıyla kullanılır.
35 mm Mikrokuyucuklu kapFisher Scientific507532924Boyama sonrası nodülleri yıkamak amacıyla kullanılır.
Dragonfly YazılımıComet Technologies Canada Inc.V2022.22D rekonstrüksiyonları 3D görünümde görselleştirmek ve manipüle etmek için kullanılır.
EtanolDecon LabsV1001Nodülleri fikse etmek ve yıkamak için kullanılır.
İnce pensDumontAA-Inox-EPipet ucundaki nodülleri ayarlamak için kullanılır.
Gel yükleme ucuCorning (Costar)4853Pipet ucundaki agaroz içerisinde nodülü manipüle etmek için kullanılır.
Isıtıcı tablaMirakSP72725Parafini eritmek ve lowMelt agarozu çözmek için kullanılır.
LowMelt agarozGeneMate490001-602Yönlendirmeyi ve nemi korumak amacıyla kök nodülü gömmek için kullanılır.
MicroCTBrukerBruker SkyScan 1272Nodülü taramak için kullanılır.
NRecon YazılımıBrukerV2.2.0.62D projeksiyonların rekonstrüksiyonu için kullanılır.
Orbital çalkalayıcıVWR77591-858Boyama penetrasyonunu hızlandırmak için kök nodülünü çalkalamak amacıyla kullanılır.
ParafinMcCormick Scientific39503002Pipet ucunun dar ucunu mühürlemek için kullanılır.
ParafilmAlkali ScientificPM996Numunenin kurumasını önlemek için pipet uçlarını mühürlemek amacıyla kullanılır.
Fosfotungstik asitElectron Microscopy Science (EMS)19500Nodül boyama için kullanılır.
Numune tutucu - L 3.4 cm D 0.63 mmBrukerSet from Bruker with machineGörüntüleme sırasında pipet ucunu ve numuneyi tutmak için kullanılır.
SakalpelFisher ScientificS07890Kök nodüllerini toplamak için kullanılır.
Skyscan yazılımıBrukerv1.5.1.0MicroCT'yi yönetmek için kullanılır.
BenmariBoekel Grant640013001Nodüller gömülürken agarozu sıvı halde tutmak için kullanılır.

Kaynaklar

  1. Oldroyd GED, Murray JD, Poole PS, Downie JA. The rules of engagement in the legume-rhizobial symbiosis. Annu Rev Genet. 2011;45:119-44.
  2. Gibson KE, Kobayashi H, Walker GC. Molecular determinants of a symbiotic chronic infection. Annu Rev Genet. 2008;42:413-41.
  3. Porter SS, et al. Host-imposed control mechanisms in legume-rhizobia symbiosis. Nat Microbiol. 2024;9:1929-39.
  4. Guerra-García FJ, Sankari S. NCR peptides in plant-bacterial symbiosis: applications and importance. Trends Microbiol. 2025;33(2):147-50.
  5. Rae AE, Rolland V, White RG, Mathesius U. New methods for confocal imaging of infection threads in crop and model legumes. Plant Methods. 2021;17:24.
  6. Nakhforoosh A, et al. Visualization and quantitative evaluation of functional structures of soybean root nodules via synchrotron X-ray imaging. Plant Phenomics. 2024;6.
  7. Nierenberger M, Rémond Y, Ahzi S, Choquet P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. C R Biol. 2015;338(7):425-33.
  8. Livingston D, Tuong T, Nogueira M, Sinclair T. Three-dimensional reconstruction of soybean nodules provides an update on vascular structure. Am J Bot. 2019;106(3):507-13.
  9. Warner CA, et al. An optical clearing technique for plant tissues, allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy. Plant Physiol. 2014;166(4):1684-7.
  10. Indore NS, Karunakaran C, Jayas DS. Synchrotron tomography applications in agriculture and food sciences research: a review. Plant Methods. 2022;18:101.
  11. Novák K. Determination of symbiotic nodule occupancy in the model Vicia tetrasperma using a fluorescence scanner. Ann Bot. 2011;107(4):709-15.
  12. Martin L, et al. Cancer cachexia in the age of obesity: Skeletal muscle depletion is a powerful prognostic factor, independent of body mass index. J Clin Oncol. 2013;31(12):1539-47.
  13. Liguori C, et al. Emerging clinical applications of computed tomography. Med Devices (Auckl). 2015;8:265-78.
  14. Duncan KE, et al. X-ray microscopy enables multiscale high-resolution 3D imaging of plant cells, tissues, and organs. Plant Physiol. 2022;188(2):831-45.
  15. Wang J, et al. A deep learning-based micro-CT image analysis pipeline for nondestructive quantification of the maize kernel internal structure. Plant Phenomics. 2025;7(1).
  16. Brackin R, Atkinson BS, Sturrock CJ, Rasmussen A. Roots-eye view: Using microdialysis and microCT to non-destructively map root nutrient depletion and accumulation zones. Plant Cell Environ. 2017;40(12):3135-42.
  17. Brodersen CR, Roddy AB. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. Am J Bot. 2016;103(2):184-8.
  18. Schoborg TA, et al. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 2019;146(23).
  19. Wang M, et al. Nanoplastics causes extensive congenital malformations during embryonic development by passively targeting neural crest cells. Environ Int. 2023;173.
  20. Brodersen CR, et al. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiol. 2010;154(3):1088-95.
  21. Brodersen CR, et al. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiol. 2013;161(4):1820-9.
  22. Nolf M, et al. Visualization of xylem embolism by X-ray microtomography: a direct test against hydraulic measurements. New Phytol. 2017;214(2):890-8.
  23. Karahara I, Yamauchi D, Uesugi K, Mineyuki Y. Three-dimensional visualization of plant tissues and organs by X-ray micro-computed tomography. Microscopy (Oxf). 2023;72(4):310-25.
  24. Staedler YM, Masson D, Schönenberger J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 2013;8(9).
  25. Sánchez-Cañizares C, et al. Developmental fates and N2-fixing efficiency of terminally-differentiated versus undifferentiated bacteroids from legume nodules. Plant Physiol. 2026;200(3).
  26. Pepper AN, Morse AP, Guinel FC. Abnormal root and nodule vasculature in R50 (sym16), a pea nodulation mutant which accumulates cytokinins. Ann Bot. 2007;99(4):765-76.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Üç Boyutlu RekonstrüksiyonBitki HistolojisiTahribatsız GörüntülemeKontrast ArtırımıDoku KorumaBakteriyel OrganizasyonBaklagil Simbiyozu

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.