Yöntem makalesi

Orbitrap Kütle Spektrometrelerine Bağlı Desorpsiyonlu Elektrosprey İyonizasyon Kullanarak Tek Hücreli Kütle Spektrometrisi Görüntüleme

DOI:

10.3791/71691

⸱

12 Haziran 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, 2Department of Biochemistry and Physiology, University of Oklahoma Health Campus

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yüksek mekansal çözünürlüklü metabolomik analiz için desorpsiyon elektrosprey iyonizasyonu ve Orbitrap kütle spektrometreleriyle eşleştirilen OVCAR-8 hücrelerinin tek hücreli kütle spektrometrisi görüntülemesini açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desorpsiyonlu elektrosprey iyonizasyon-kütle spektrometrisi görüntüleme (DESI–MSI), minimal örnek hazırlığıyla ortam, matrissiz moleküler görüntülemeyi mümkün kılar. Bu protokol, DESI ile Orbitrap kütle spektrometrelerine bağlı olarak tek hücreli OVCAR-8 hücrelerinin MSI iş akışını tanımlar. Sistem, yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntüleme için bir DESI püskürtücü, modifiye bir kütle spektrometre arayüzü, motorlu bir XYZ aşaması ve optik breadboard entegre eder. Hücreler, ızgaralı cam kapak kapaklarında kültürlenir, tuz girişimini azaltmak için amonyum format çözeltisi ile yıkanır, kurutulur ve ortam koşullarında analiz edilir. Çözücü, nano-sıvı kromatografi sistemi kullanılarak sürekli olarak teslim edilir ve nebulize azot gazı püskürtme kararlılığını korumak için düzenlenir. Protokol ayrıca raster görüntüleme, piksel kontrolü ve tek hücre lokalizasyonu için optikten kütle spektrometrisine görüntü kaydını da tanımlar. Orbitrap algılama ile sağlanan yüksek kütle çözünürlüğü ve kütle doğruluğu, yakın ilişkili moleküler türlerin farklılaşmasını sağlar ve tek hücreli metabolomik analizi destekler. Bu protokol, birden fazla Orbitrap kütle spektrometresi platformu kullanarak yüksek uzamsal çözünürlüklü tek hücreli MSI'nin uygulanması için uyarlanabilir bir strateji sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolomik, biyolojik sistemlerinfonksiyonel durumunu yansıtan küçük moleküllü metabolitleri kapsamlı şekilde tanımlamayı amaçlar 1,2,3,4,5. Metabolitler enzimatik aktivitenin doğrudan ürünleri olduğundan, hücresel fenotip ve biyokimyasal düzenlemenin dinamik bir okumasını sağlarlar. Ancak, geleneksel metabolomik iş akışları genellikle binlerce hatta milyonlarca hücre arasında sinyallerin ortalamasını sağlayan toplu çıkarma yöntemlerine dayanır ve böylece hücresel heterojenliğigizler 6,7,8.

Tek hücreli metabolomik, bireysel hücreler düzeyinde moleküler profilleme mümkün kılarak, karmaşık popülasyonlarda metabolik çeşitliliği ortaya çıkararak ve hastalık ilerlemesi, ilaç yanıtı ve hücresel farklılaşmanın mekanik anlaşılmasını geliştirerek bu sınırlamayı giderir. Kütle spektrometrisi (MS), biyolojik örneklerin moleküler analizi için vazgeçilmez bir araçtır. MS tekniklerindeki son gelişmeler, örnek hazırlama, enstrümantasyon ve veri analizi gibi, MS metabolomi çalışmalarının tek hücreseviyesi 9,10,11,12 seviyelerinde yapılmasını mümkün kılar.

Biyolojik örneklerin mekansal olarak çözülen moleküler analizini mümkün kılan MS görüntüleme (MSI), örnek hareketi, en düşük örnekleme, verimli iyonizasyon ve veri görselleştirmesini bütünleştirerek her tanımlanmış mekansal koordinatta tam kütle spektrumu eldeederek örnek yüzeyi 12,13,14. MS görüntüleri, seçilen kütle-yük oranı (m/z) değerlerinin yoğunluğunun x–y koordinatları boyunca çizilmesiyle yeniden oluşturulur; böylece karmaşık biyolojiksistemlerde kimyasal mekansal bilgi korunur 12,13,15,16,17,18. Mekansal olarak çözülen tek hücreli metabolomiklere ulaşmak, moleküler lokalizasyonu koruyabilen ve düşük bolluklu türleri tespit etmek için yeterli hassasiyet ve kütle çözünürlüğünü koruyabilenanalitik platformlar gerektirir 9,12,19,20.

Tek hücreli MSI, bireysel hücrelerin çapı genellikle 5 ila 20 μmarasında değiştiği için ek zorluklar sunar; 8,21. Bu mekansal ölçekte, örnekleme olayı başına analiz bolluğu son derece sınırlıdır. Bu nedenle, örnek hareketinin doğru kontrolü, en aza örnekleme, yüksek iyonizasyon verimliliği ve verimli iyon iletimi gibi birden fazla faktör, bireysel hücrelerden yorumlanabilir moleküler bilgi elde etmek için eşit derecede önemlidir14,22. Yüksek mekansal çözünürlüklü MSI çalışmaları için rutin olarak kullanılan vakum tabanlı bir teknik olan Matrix destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI)–MSI, matris biriktirme ve vakum işlemi gerektirir; ancak MALDI'de matris kristalleşmesi, tek hücreölçeği 23,24,25,26,27 seviyesinde analiz delokalizasyonu ve değişkenliği getirebilir. Buna karşılık, ortam MSI yaklaşımları ortam koşullarında çalışır ve örnekler neredeyse doğal kimyasal durumları korur çünkü çok az veya hiç örnek hazırlığı gerekmez. Çevresel MSI yöntemleri arasında DESI28, nano-DESI21, pnömatik destekli nano-DESI29 ve Single-probe 8,30,31,32,33,34,35 daha önce tek hücreli MSI çalışmalarında kullanılmıştır. Nano-DESI, pnömatik destekli nano-DESI ve Tek sonda dahil olmak üzere mikro-sıvı ekstraksiyonuna dayalı teknikler yüksek örnekleme ve iyonizasyon verimliliği sağlasa da, örnekleme probu ucunda stabil bir sıvı köprünün korunmasına dayanırken, sıvı köprünün yüzey morfolojisindeki değişiklikler veya prob tıkanması gibi bozulmalar MSI deneylerinin kalitesinietkileyebilir 5,8, 21,30,35.

DESI, yüklü çözücü damlalarının bir yüzeye çarptığı, analitleri çıkardığı ve iyonizetür 36 içeren ikincil damlacıklar oluşturduğu bir ortam iyonizasyon tekniğidir. DESI, raster tabanlı görüntüleme iş akışlarıyla uyumlu, temassız, tıkanıksız örnekleme sağlar; bu da onu yüksek çözünürlüklü Orbitrapplatformları 20,37,38,39,40 ile eşleştirildiğinde, optik olarak tanımlanmış tek hücrelerin yüksek çözünürlüklü, çok iyon moleküler haritalanması için oldukça uygundur. DESI doku görüntülemede yaygın olarak kullanılır ancak teknik zorluklar nedeniyle tek hücreli MSI'da nadirenuygulanmıştır 20,28. Waters DESI XS'nin ve SELECT SERIES Döngüsel IMS kütle spektrometresinin bağlanmasından oluşan ticari bir kurulum kullanılarak yapılan son çalışmalar, birden fazla hücre hattı için tek hücre çözünürlüğünün sağlanabileceğini göstermiştir. DESI–MSI'da yüksek mekansal çözünürlüğe ulaşmak, iyonizasyon verimliliği, iyon iletimi, alım oranı ve sprey hizalamasınınkoordineli kontrolünü gerektirir 12,20,28. Özellikle, DESI XS ve desorpsiyon elektro-akış odaklama iyonizasyonu (DEFFI) dahil olmak üzere yeni nesil DESI püskürtücülerinin tasarımındaki ilerlemeler, örnekleme alanınıönemli ölçüde azaltmıştır 41,42. Ayrıca, nano-sıvı kromatografi (LC) pompalarıyla sağlanan nanolitre/dakika akış hızları gibi çözücü akış hızlarını azaltmak, tek hücreli moleküler tanımlama için mekansal hapsetme (incelik) önemli ölçüde iyileştirilebilir28. Bu yaklaşım tek hücre çözünürlüklü MSI'yi sağlamış olsa da, belirli bir tedarikçiden (Waters) gelen enstrümantasyona dayanmaktadır. Bu nedenle, tek hücreli DESI–MSI'nin daha geniş uygulanması, yüksek hassasiyet, kütle doğruluğu ve çözünürlük gücü sağlamak için Orbitrap sistemleri gibi yaygın olarak erişilebilen yüksek çözünürlüklü kütle spektrometreleriyle entegre edilebilecek stratejiler gerektirir. DESI'nin Orbitrap kütle spektrometreleriyle birleştirilmesi, karmaşık hücresel ekstraktlarda yakın aralıklı ve izobarik türlerin farklılaşması dahil olmak üzere tek hücreli MSI çalışmalarında yeni fırsatlarsunar 20,43,44.

Bu protokol, tek hücreli MSI çalışmaları için Waters DESI XS püskürtücüsünü Orbitrap kütle spektrometreleriyle entegre etmek için modüler bir stratejiyi tanımlar. İş akışı, hücre bağlanması ve optik korelasyon için ızgaralı kapak kağıtlarını, kontrollü raster tarama için motorlu bir XYZ aşamasını, stabil sprey oluşumu için nano ölçekli çözücü teslimatını ve yüksek çözünürlüklü Orbitrap tespitini entegre eder. Platform olarak Thermo Orbitrap Tribrid Lumos kütle spektrometresi seçilmiş olsa da, uyumlu kaynak-arayüz geometrileriyle donatılmış birçok diğer Orbitrap kütle spektrometresi modeli, uygun mekanik uyum ve optimizasyon sonrası benzer özelleştirilmiş DESI XS konfigürasyonlarıyla eşleştirilebilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OVCAR-8 hücreleri Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu'ndan (ATCC) alındı. Tüm hücre kültürü prosedürleri kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Hücreler, üreticinin talimatlarına göre mikoplazma tespit kiti kullanılarak rutin olarak mikoplazma kontaminasyonu açısından test edildi.

NOT: Tüm prosedürleri kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirin. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Organik çözücüleri kimyasal bir buhar davlumbazında kullanın.

1. OVCAR-8 hücrelerini ızgaralı kapak kapaklarında kültürlen ve hazırlanmış

  1. RPMI-1640 ortamına %10 fetal sığır serumu ve %1 penisillin-streptomisin takviye ederek tam ortam hazırlayın. Ortamı 37°C'ye ısıtın.
  2. OVCAR-8 hücrelerini, 10 mL tam ortam içeren 10 cm hücre kültürü kablarında tutun. Hücreleri %5CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37°C'de kuluçka yapın.
  3. Kültür yüzeyinin yaklaşık %80'i görsel olarak yapışkan hücreler tarafından dolu, genellikle tanımlanan kültür koşullarında her 2 günde bir hücreler tarafından dolu.
    1. 10 cm kültür kabından ortamı aspire edin ve hücreleri 5 mL 1× fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla bir kez durulayın.
    2. Kültür kabına %0,25 tripsin–etilendiamintetraasetik asit 2 ml ekleyin. Hücreleri yaklaşık 37°C sıcaklıkta yaklaşık 3 dakika boyunca kuluçka edin, ya da mikroskop altında incelendiğinde hücrelerin çoğu kültür yüzeyinden görünür şekilde ayrılana kadar.
    3. Tripsini nötralize etmek için yemeğe 8 ml önceden ısıtılmış tam orta madde ekleyin. 10 mL'lik serolojik pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu yaklaşık 15–20 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin ve hücrelerin dağılmasına yardımcı olun.
    4. 1 mL süspansiyonu 9 mL taze tam ortama aktarın.
    5. Hücreleri otomatik hücre sayacı ile sayın. Yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonundan 10 μL doğrudan sayım sürgüsüne ek seyreltme olmadan yüklenin ve üreticinin talimatlarına göre hücre sayımı gerçekleştirilin.
      NOT: Tripan mavisi gibi hücre canlılık boyaları bu protokolde kullanılmadı. Tripsizasyondan önce hücre morfolojisi ve bağlanmasını izleyerek hücre durumunu görsel olarak değerlendirin.
  4. Hücreleri örtü kapaklarına tohumlayın.
    1. Hücreleri tam ortamda ~1 ×10 6 hücre/mL nihai konsantrasyona kadar seyreltin. Gerekli hücre süspansiyon hacmini C1V1 = C2V2 kullanarak hesaplayın; buradaC 1 sayılan hücre konsantrasyonu, V1 gereken hücre askı hacmi, C2 hedef konsantrasyon ve V2 istenen nihai hacimdir.
    2. 50 μm ızgara aralıklı bireysel 28 mm ızgara cam kapak kapaklarını 6 kuyu plakasının kuyruklarına yerleştirin.
      NOT: Hücre kültürü için kullanılmadan önce cam kapak kapağını otoklavla geçirin. Hücre büyümesine müdahaleyi en aza indirmek için ızgara tarafını aşağıya bakacak şekilde yerleştirin.
    3. Her kuyuya 2 mL tam ortam ve 200 μL hücre süspansiyonu (~2 × 105 hücre/kuyruk) ekleyin. 6 kuyu plakasını "X" şeklinde nazikçe sallayarak hücreleri örtü yüzeyi boyunca eşit şekilde dağıtın.
    4. Hücreler yaklaşık 15–20 saat kuluçka ile hücre tutunması için kullanılır.
      NOT: Hücre morfolojisini rutin olarak mikroskopla izleyerek hücre büyümesinin normalini sağlayın. Hücreler kötü büyürse mikoplazma tespit kiti kullanarak potansiyel mikoplazma kontaminasyonunu inceleyin.

2. Amonyum format (AF) çözeltisi ile hücre yıkama

NOT: Her kullanımdan önce taze AF çözeltisi hazırlayın.

  1. Kullanımdan hemen önce izotonik AF yıkama tamponu hazırlayın. 0,45 g AF ağırlığını alın ve 50 mL LC/MS kalitesinde suda çözerek nihai AF konsantrasyonu 0,14 M (%0,9 w/w/w) hazırlanır. pH 5,45'i ayarlamayın.
    NOT: Taze hazırlanmış AF çözeltisini aynı hazırlık gününde kullanın. Çözeltiyi buz gibi (0°C–4°C) kullanana kadar tutun.
  2. Kültür ortamını 6 delikli plakanın her kuyusundan aspire edin. Her kuyuya hemen 2 mL soğuk AF çözeltisi ekleyin.
  3. Steril forseps kullanarak, yapışkan hücreleri içeren her örtü kuyudan nazikçe kaldırın ve hücre kaplı yüzeyi yukarıya bakmasını sağlar. Kısaca 2–3 saniye boyunca 2 mL soğuk 0,9% AF çözeltisi ile önceden doldurulmuş ayrı bir kuyuya kısa bir şekilde yerleştirin.
  4. Her durkalama için taze AF çözeltisi kullanarak toplam iki durulama işlemi tekrarlanın. Son durulamadan sonra, AF çözeltisinden kapak kapağını çıkarın ve DESI–MSI analizinden önce oda sıcaklığında kimyasal bir davlumbonda yaklaşık 20–30 dakika hava kurumasına izin verin.
    NOT: Yıkama aşamasında hücreleri rahatsız etmemek için hücreleri nazikçe durulayın.

3. Değiştirilmiş FAIMS tabanlı MS arayüzünün üretimi

  1. İç elektrot bölgesine erişmek için FAIMS Pro elektrot iyon kaynağı yuvası adaptörünü söküp alın. Adaptörün FAIMS Pro arayüz konfigürasyonuna sahip Thermo Orbitrap kütle spektrometreleriyle uyumlu olup olmadığını doğrulayın.
  2. FAIMS elektrot bileşenlerini, iç kabloları, elektrot montajlarını, O-halkalarını ve destekleyici iç yapıları dahil olmak üzere çıkarın. Adaptörün kütle spektrometresi tanıması için gereken dış gövde kabuğunu, montaj flanşlarını ve arayüz tespit pinini koruyun.
  3. Dairesel açılışı standart makine atölyesi işleme prosedürleriyle değiştirin. Açıklığı, çıkıntılı Orbitrap giriş/iyon hunisi montajının etrafında yeterli boşluk sağlayana kadar büyütün.
  4. Kesimden sonra işlenmiş kenarı pürüzsüzleştirin ve partadan çıkarın. Değiştirilmiş açıklığın, kütle spektrometresinde gövde adaptörünün engelsiz konumlandırılmasını sağladığını doğrulayın.
  5. Gövde adaptörünün iki ayağının uzunluğunu testere kullanarak değiştirin. Bacakları yaklaşık 2 1/4 inç nihai uzunluğa kadar kesin, böylece optik breadboard ile bağlantı sağlanabilir.
    NOT: Uygun işleme aletleri kullanın ve kalan gövdenin yapısal bütünlüğüne zarar vermekten kaçının.
  6. Alüminyum optik breadboard hazırlayın (10 inç × 12 inç × 0,5 inç, 1/4"-20 kanallı delikler). Breadboard'u modifiye edilmiş FAIMS adaptörünün altına yatay olarak konumlandırın.
  7. Modifiye edilmiş FAIMS adaptörünü optik breadboard'a bağlamak için iki montaj braketi kullanın. Braketleri gerektiği gibi kesin ve ağırlığı azaltmak ve breadboard'un Orbitrap girişine göre doğru konumlandırılmasını sağlamak için ayarlayın.
  8. Değiştirilmiş FAIMS arayüzünü, mekanik olarak uyumlu montaj donanımı ile 1/4"-20 kılavuzlu delik deseniyle uyumlu olarak optik breadboard'a sabitleyin. Görüntüleme deneyleri sırasında sabit konumlandırma sağlanın.
    NOT: Aşama hareketi ve veri toplama sırasında titreşimi en aza indirmek için arayüzün sert şekilde sabitlendiğinden emin olun.
  9. Optik breadboard'a FAIMS konut temas bölgesinin hemen altında sığ bir oluk kesin veya makine yapın. Ayarlanmış FAIMS gövdesinin Orbitrap girişine göre sabit oturma ve hizalanması için yeterli boşluk sağlamak için oluğu boyutlandırın ve konumlandırın.
    NOT: Oluğu, FAIMS gövde adaptörünün tabanına uyacak şekilde boyutlandırın ve konumsal tekrarlanabilirliği artırın.
  10. Monte edilmiş arayüzü kütle spektrometresi girişiyle hizala. Sabit montaj flanşlarının enstrumana doğru oturduğunu ve optik breadboard'un arayüz altında düz kaldığını doğrulayın.
  11. DESI püskürtücüsünü takmadan önce, modifiye edilmiş dairesel açıklığın Orbitrap giriş/iyon huni montajı etrafında engelsiz bir boşluk sağladığını kontrol edin.

4. DESI püskürtücüsünü ve Orbitrap arayüzünü birleştirin

  1. DESI püskürtücünü, özelleştirilmiş FAIMS çerçevesi, motorlu XYZ aşaması, gaz regülatörü ve optik breadboard'dan oluşan entegre kuruluma monte edin. CONEX-MFACC kontrolcüsü tarafından kontrol edilen motorlu bir aşama kullanın.
  2. x eksenini soldan sağa raster tarama yönü olarak tanımlayın ve y eksenini yukarıdan aşağıya doğru çizgi adım yönü olarak tanımlayın. Z-eksenini satın almadan önce ayarlayın ve görüntüleme sırasında sabit tutun.
  3. X-yönde yaklaşık 1 mm, y yönünde ise 1 mm kademe hareket mesafesi kullanın. Satın alma sırasında z-ekseni hareketi uygulanmayın.
  4. DESI püskürtücünü örnek yüzeyine göre yaklaşık 70° açıda konumlandırın. Örneği doğrudan püskürtücünün altına yerleştirin ve püskürtücünün ucunu fiziksel temas olmadan mümkün olduğunca Orbitrap girişine yakın konumlandırın.
  5. DESI topraklama metalini kütle spektrometresinin altındaki bir toprak kaynağına bağlayın. Raster hareketini sahne kontrol yazılımı ile kontrol edin (Şekil 1).
    NOT: Bu çalışmada kullanılan DESI püskürtücü, yalnızca DESI–MSI aletlerine sahip kullanıcılar için mevcuttur.
  6. Sahne hareketi ve konumlandırması için motorlu bir XYZ aşama kontrolörü kullanın. Çalışmadan önce voltaj hattı, azot gaz hattı, çözücü hattı ve topraklama hattını bağlayın.
  7. Orbitrap iyon kaynağı girişine uygun olarak özel olarak üretilmiş paslanmaz çelik iyon transfer tüpü (1/16 inç OD × 0.033 inç) takın. İyon transfer borusunu, Orbitrap girişiyle doğrudan hizalanacak şekilde konumlandırın ve dışarıya doğru yeterince uzanarak DESI bulutuna engelsiz erişim sağlansın.
    NOT: İyon transfer tüpünü kütle spektrometresi konfigürasyonuna göre özelleştirin. İyon transfer borusunu uygun işleme prosedürleriyle üretin.
  8. DESI püskürtücünün örnek yüzeyine ve Orbitrap girişine göre konumlanmasını iyileştirmek için eğik geometriye sahip bir iyon transfer tüpü kullanın.
  9. Püskürtücüyü, örnek yüzeyine göre yaklaşık 70° açıda hizala, böylece DESI püskürtme bulutu örnek yüzeyine temas etmeden Orbitrap giriş bölgesini kesecektir.
  10. Stabil bir püskürtme bulutunu sabit kütle spektrumları ve tutarlı normalleştirilmiş seviye (NL) değerleri ile tanımlayın. Püskürtücünün konumunu sabit bir iyon sinyali gözlemlenene kadar ayarlayın.
  11. Püskürtme-yüzey mesafesini başlangıç koşulu olarak yaklaşık 1,0–1,5 mm olarak ayarlayın. En yüksek kararlı iyon sinyalini elde etmek için NL değerlerini izlerken püskürtücünün konumunu manuel olarak ince ayarlayın.

Şekil 1
Şekil 1. Entegre desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon (DESI)–kütle spektrometrisi görüntüleme (MSI) kurulumu, Orbitrap kütle spektrometresine bağlanmıştır. DESI püskürtücü, modifiye edilmiş yüksek alan asimetrik dalgaform iyon hareketlilik spektrometrisi (FAIMS)  adaptörü, motorlu XYZ aşaması, gaz regülatörü ve optik breadboard'dan oluşan entegre bir platforma monte edilmiştir. Çözücü, nano-sıvı kromatografi sistemi kullanılarak teslim edilir ve azot gazı yaklaşık 12 psi ile püskürtme stabilizasyonu için sağlanır. Şekil ayrıca iyonlaşma gerilim bağlantısı, çözücü hattı ve spreyleyicinin Orbitrap girişine göre konumunu da göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

5. Çözücü teslimat ve püskürtme koşullarını yapılandırın

  1. DESI–MSI analizinden önce metanol/su/formik asit (98:2:0.1, v/v/v) içeren taze sprey çözücü hazırlayın.
    NOT: Asetonitril bazlı çözücüler ve farklı metanol/su oranları dahil olmak üzere diğer DESI uyumlu çözücü sistemleri optimizasyondan sonra kullanılabilir. Metanol/su/formik asit (98:2:0.1, v/v/v), bu protokolde standart başlangıç koşulu olarak kullanılmıştır; çünkü tek hücreli DESI–MSI deneylerinde stabil tüy oluşumu, azaltılmış çözücü yayılımı ve tekrarlanabilir pozitif iyon modlu lipid sinyalleri sağlamıştır.
    DIKKAT: Metanol yanıcı ve toksiktir. Formik asit aşındırıcıdır. Çözücüleri kimyasal bir buharlı davlumbazda kullanın.
  2. Rapor edilen deneyler için 750 nL/dakika ile izokratik çözücü pompası olarak çalışan Ultimate 3000 nano-LC sistemi kullanılarak çözücü teslim edilir. Nano-LC prizini DESI püskürtücüye PEEK tüpü ile bağlayın (1/16 inç OD × 0.005 inç ID).
  3. Düşük akış hızlarında stabil sprey oluşumu için yeterli geri basınç sağlamak amacıyla bir C18 kolonu (örneğin, nanoEase M/Z Peptit BEH; 130 Å, 1.7 μm, 300 μm × 150 mm) hat içinde yerleştirilin.
  4. Kütle spektrometresi yöntemini pozitif iyon moduna ayarlayın; Orbitrap tespiti, 0.85 kV püskürtme voltajı, 200 m/z çözünürlükte 120.000 Orbitrap çözünürlüğü ve 150–1200 m/z aralığı.
  5. Normalize edilmiş AGC hedefini %100, maksimum enjeksiyon süresini 100 ms'e, RF lensi %45'e ve mikrotaramaları %1'e ayarlayın. Dörtlü izolasyonu ve kaynak parçalanmasını devre dışı bırakın.
  6. DESI püskürtme bulutunu stabilize etmek için yaklaşık 12 psi hızında bir azot jeneratöründen veya sıvı azot kaynağından azot kılıfı gazı verin. Başlangıç çalışma basıncı olarak 12 psi kullanın ve NL değerlerini iyileştirmek ve istikrarlı bir kütle spektrumunu korumak için sadece gerekirse küçük manuel ayarlamalar yapın.

6. Raster görüntüleme ve piksel kontrolü gerçekleştirin

  1. Izgara örtülü örtükleri referans olarak kullanarak optik olarak görülebilir tek hücrelerin bulunduğu ilgi çekici bir bölgeyi belirleyin. Komşu hücrelerden net görsel ayrım, sağlam yapışkan morfolojiye sahip ve enkaz veya hücre kümeleriyle belirgin bir örtüşme olmayan izole hücreleri seçin.
  2. Fance Stage Controlleryazılımı 46 kullanarak raster bölgesini tanımlayın. Raster adım boyutunu 0.01 mm'ye, aşama hızını 0.01 mm/s ve dwell süresini 20 saniyeye ayarlayın.
  3. Her satırda soldan sağa raster tarama yapın, ardından y yönündeki bir sonraki satıra hareket edin. Raster çizgiler arasındaki ortogonal basamak boyutunu 10 μm olarak ayarlayın.
  4. Pist hızını, istenen tarama yönü piksel boyutuna (örneğin, yaklaşık 2,5–6,5 μm) ulaşmak için Orbitrap alım hızına göre ayarlayın. Tarama yönü piksel boyutunu şu ilişkiyle hesaplayın: tarama yönü piksel boyutu = tarama başına aşama hızı × alım süresi.
  5. 0,01 mm/s (10 μm/s) aşama hızı kullanılarak, 102 saniye boyunca 376 tarama elde edilerek tarama başına 0,271 saniye alınma süresi ve yaklaşık 2,7 μm tarama yönü piksel boyutu elde edilir. Orbitrap alım zamanlamasını birleşik aşama hareketi ve dwell zaman parametrelerinden biraz daha kısa ayarlayarak aşama hareketi ve kütle spektral alımını senkronize edin.
    NOT: Ortogonal piksel boyutu, programlanmış adım boyutu ve aşamanın fiziksel ve mekanik sınırlamalarıyla belirlenirken, tarama yönü boyutu aşama hızı ve spektral alım oranı ile belirlenir.
  6. Önceden tanımlanmış raster bölgesi tamamlanana kadar seçilen kütle aralığında görüntüleme verileri elde edin. 0,01 mm çizgi adım ve 0,01 mm/s aşama hızıyla alınan 1 mm × 1 mm görüntüleme bölgesi için, toplam alım süresi yaklaşık 4–5 saattir.
  7. Edinim sırasında RAW veri dosyaları üretin ve belirtilen x–y raster koordinatları ile ilgili cihaz yöntemi süresi tamamlandıktan sonra alınımı durdurun. Burada açıklanan pozitif iyon modu koşullarında, her raster satır genellikle yaklaşık 50 MB RAW dosya üretir ve 101 raster satır için toplam yaklaşık 5 GB veri elde eder.

7. Optikten MS'e görüntü kaydı

  1. AF yıkama ve kurutmadan sonra ve DESI alınmadan önce seçilen ızgara bölgesindeki hücrelerin parlak alan görüntülerini 10× hedefli parlak alan mikroskobu ile yakalayın.
  2. ProteoWizard48'den msConvert kullanarak RAW dosyaları mzML dosyalarına dönüştürün. mzML dosyalarını imzML Dönüştürücü49 kullanarak imzML formatına dönüştürün.
  3. Edinilen veri formatıyla tutarlı centroid/profil dönüşüm ayarlarını kullanın. imzML dosyalarını doğrudan METASPACE (https://metaspace2020.eu)50'ye yükleyin ve görüntü görselleştirmesini yapın.
  4. Görselleştirmeden önce normalizasyon, sıcak nokta kaldırma veya ek görüntü işleme düzeltmeleri uygulamayın. Optik ve MS görüntülerini, ızgara işaretlerini konumsal referans olarak kullanarak manuel hizalayın.
  5. Optik görüntüyü bilinen görüntü boyutları ve ızgara aralığı kullanarak ölçeklendirin. MS görüntüsünü manuel olarak üst üste bindirerek optik olarak görünür hücre pozisyonları ile lokalize iyon sinyalleri arasındaki uyumu değerlendirin.
  6. Parlak alan görüntüsündeki izole hücreler ile ilgili MS iyon dağılımları arasındaki görsel uyumla tek hücre lokalizasyonunu doğrulayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün başarılı şekilde uygulanması, optik olarak tanımlanmış tek hücrelerin lokal moleküler iyon sinyallerine uzamsal olarak karşılık verdiği DESI–MSI veri setleri oluşturur (Şekil 2). DESI–MSI analizinden önce elde edilen parlak alan mikroskopi görüntüleri, bireysel OVCAR-8 hücrelerinin görsel olarak tanımlanmasını sağlar ve ızgaralı kapak defterini konumsal referans olarak kullanarak optikten MS'e görüntü kaydını kolaylaştırır. Temsil DESI–MSI iyon görüntüleri, ilgili parlak alan görüntüsünde tanımlanan bireysel hücrelerle mekansal olarak korelasyon yapan yerel iyon dağılımlarını gösterir (Şekil 2A–2D).

Şekil 2
Şekil 2. OVCAR-8 hücrelerinin parlak alan mikroskobu ve MSI'sının karşılaştırılması. (A) 10× büyütmede alınan OVCAR-8 hücrelerinin parlak alan mikroskobu görüntüsü. (B–D) DESI–MSI kullanılarak alınan MS görüntüleri, piksel boyutu 5,5 μm × 10 μm. Temsil edici iyon dağılımları (B) m/z 317.111, (C) m/z 808.562 ve (D) m/z 788.616 için gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bireysel hücreler, birden fazla lipid ilişkili iyon ve küçük moleküller içeren tam kütle spektrumları üretir. Tek bir moleküler belirteçeğe dayanmak yerine, her hücre kimyasal parmak izi olarak işlev gören çok iyonlu moleküler profil sergiler. m/z 317.111, m/z 808.562 ve m/z 788.616'daki temsil etkileyici iyon görüntüleri, komşu hücreler arasında heterojen moleküler dağılımlar göstermekte olup, tek hücre düzeyinde ölçülebilir metabolik heterojenliği gösterir (Şekil 2B–2D). METASPACE tabanlı açıklamalar, m/z 808.562 ve m/z 788.616'da tespit edilen iyonların öncelikle fosfatidilkolin ve fosfatidiletanolamin lipid türleriyle ilişkili olduğunu, m/z 317.111'in ise birkaç aday küçük molekül ve dipeptid ilişkili türlerle ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu sonuçlar, platformun ortam koşullarında optik olarak tanımlanmış tek hücrelerden mekansal olarak lokalize moleküler özelliklerin tespit edilmesini sağladığını göstermektedir. Ek sonuçlar, geçici olarak notlanmış türler, MS/MS tarafından tanımlanan türler, temsil MS görüntüleri ve kütle spektrumları gibi önceki çalışmalardasunulmaktadır 20.

Entegre DESI–MSI platformu, bir DESI püskürtücü, modifiye edilmiş bir FAIMS adaptörü, motorlu bir XYZ aşaması ve Orbitrap girişine monte edilmiş optik breadboard'dan oluşur (Şekil 1). Bu kurulum, stabil çözücü teslimatını, kontrollü aşama hareketini ve DESI sprey bulutunun kütle spektrometresi girişiyle hizalanmasını sağlar; ortam tek hücreli görüntüleme deneyleri için bu giriş. Şekil 3'te gösterilen özelleştirilmiş iyon transfer tüpü, DESI kaynak bölgesi ile Orbitrap girişi arasında iyon iletimini sağlar. Eğik kapiller geometri, DESI püskürtücüsünün örnek yüzeyi ve giriş bölgesine göre konumlanmasını kolaylaştırırken, iyon transferini engelsiz korur.

Şekil 3
Şekil 3. Orbitrap MSI için özelleştirilmiş iyon transfer tüpü. DESI püskürtücüsünü Orbitrap Fusion Lumos kütle spektrometresine bağlamak için kullanılan özel üretim iyon transfer tüpünün fotoğrafı. Şekil, ortam tek hücreli MSI deneyleri sırasında iyon iletimi için kullanılan eğik transfer kapiler geometrisi ve montaj montajını göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4 , optik breadboard ve motorlu XYZ aşaması ile entegre edilmiş modifiye FAIMS adaptörü gösterilmektedir. Üstten görünüm (Şekil 4A), örnek aşamasının ve modifiye edilmiş adaptörün Orbitrap girişine göre konumlanmasını gösterirken, alt görünüm (Şekil 4B) görüntüleme platformunu desteklemek için kullanılan montaj braketleri ve aşama montajını gösterir. Entegre montajın mekanik stabilitesi, tutarlı raster hareketini korumak ve görüntüleme kaydımı sırasında konumsal kaymayı en aza indirmek için önemlidir.

Şekil 4
Şekil 4. Optik breadboard ve motorize XYZ aşaması ile entegre edilmiş modifiye yüksek alan asimetrik dalgaform iyon hareketlilik spektrometrisi (FAIMS) adaptörü. (A) Orbitrap girişi ve örnek aşamasının yanına monte edilmiş modifiye edilmiş adaptörün üst görünümü. (B) Alt görünüm, görüntüleme platformunu desteklemek ve hizalamak için kullanılan modifiye braketler, optik breadboard ve motorlu XYZ aşama montajını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Orbitrap algılama ile sağlanan yüksek kütle çözünürlüğü, yakın aralıklı ve izobarik lipid türlerinin farklılaşmasını sağlar; böylece moleküler özgüllük ve görüntü kontrastı daha düşük kütle çözünürlüklü sistemlere göre iyileştirilir. Küçük piksel boyutları, aşama hızı ve spektral alım hızının senkronizasyonu yoluyla elde edilebilir. Örneğin, hızlı edinim Orbitrap platformları ve optimize edilmiş rasterparametreleri kullanılarak 2,7 μm × 10 μm kadar küçük piksel boyutları elde edilmiştir 42. Yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntüleme, yakın bitişik hücrelerin moleküler olarak tanımlanmasını sağlarken, komşu hücresel bölgeler arasındaki sinyal örtüşmesini en aza indirir.

Başarılı DESI–MSI deneyleri, stabil püskürtme koşulları, raster çizgiler boyunca tutarlı iyon yoğunluğu ve optik görüntüdeki bireysel hücrelere karşılık gelen moleküler sinyallerin mekansal lokalizasyonu ile karakterize edilir. Optimal olmayan deneyler, dengesiz sprey oluşumu, yanlış sprey hizası, aşırı çözücü yayılması veya numune hareketi nedeniyle yayılmış iyon dağılımları, düşük sinyal yoğunluğu, tutarsız raster desenleri veya hücresel lokalizasyon kaybı üretebilir. Sprey hizası, çözücü akış hızı, aşama hızı ve örnek konumlandırmasının dikkatli optimizasyonu, tek hücreli görüntüleme deneylerinde mekânsal isayeti ve iyon sinyal kararlılığını artırır.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hassas aşama kontrolü, nano ölçekli çözücü teslimatı, optik hedefleme ve yüksek mekansal çözünürlüklü kütle analizi ile yüksek kütle çözünürlüklü Orbitrap kütle spektrometreleri kullanılarak ortam tek hücreli DESI–MSI'yı mümkün kılar. Bu unsurların birleşimi, tarihsel olarak DESI–MSI'nin tek hücre düzeyinde uygulanmasını kısıtlayan birçok teknik engeli gider. Özellikle, püskürtme kararlılığı, iyon iletimi ve alım zamanlamasının koordineli kontrolü, bireysel hücrelere karşılık gelen çok küçük örnekleme hacimlerinden moleküler sinyallerin güvenilir şekilde tespit edilmesini sağlar. Bu iş akışında performansı yöneten merkezi bir faktör, DESI püskürtme bulutunun stabilitesi ve hapsedilmesidir. Mikrometre ölçeğindeki mekansal çözünürlüklerde, çözücü akış hızı, gaz basıncı veya püskürtücünün konumlanmasındaki küçük bozulmalar, etkili örnekleme alanını önemli ölçüde değiştirebilir. Nano ölçekli çözücü teslimatının uygun geri basınç ile birleşmesi, püskürtme kararlılığını artırır ve çözücü yayılmasını azaltır, böylece mekansal sadıklığı artırır. Ayrıca, püskürtülebilir iyonizasyon verimliliği için tutarlı bir püskürtme mesafesi ve açısını korumak, kritik öneme sahiptir. Geometrideki küçük sapmalar bile, özellikle heterojen hücresel örnekler analiz edilirken, sinyal yoğunluğunda önemli farklılıklara yol açabilir. Pratikte, DESI püskürtme koşullarının optimizasyonu, toplam iyon akımı, spektral kararlılık ve NL değerleri (genellikle yaklaşık 105–106) izlenerek ampirik olarak gerçekleştirilmiştir. Tekrarlanabilir sinyal kalitesi, püskürtücünün konumu, çözücü akışı kararlılığı, gaz basıncı ve DESI bulutunun Orbitrap girişine göre hizalanmasının yinelemeli ayarlanmasıyla sağlandı.

İyon iletim verimliliği, tek hücre ölçeğinde bir diğer önemli sınırlamayı temsil eder çünkü analiz bolluğu bireysel hücrelerde doğası gereği düşüktür. Bu mekansal ölçeklerde, verimli iyon iletimi, bazı uygulamalarda iyonizasyon verimliliğinden daha büyük bir pratik sınırlama haline gelebilir çünkü desorbe iyonların çok küçük bir kısmı nihayetinde kütle spektrometresi girişine ulaşır. Bu nedenle, örnekleme bölgesinden iyonların kütle spektrometresi girişine verimli şekilde aktarılması gereklidir. Bu protokolte kullanılan modifiye edilmiş FAIMS konut adaptörü, DESI sprey kaynağı ile Thermo kütle spektrometresi arasında bir arayüz sağlar ve Orbitrap Tribrid, Exploris ve Astral serisi platformlar dahil olmak üzere birden fazla cihaz modeliyle uyumluluk sağlar. Modifiye FAIMS gövde adaptörünün optik breadboard ile entegrasyonu da mekanik stabiliteyi sağlar ve böylece uzun süreli görüntüleme deneylerinde hizalanma yanlışlığını en aza indirir. Aşama hareketi ile kütle spektrumu edinimi arasındaki senkronizasyon, yüksek mekansal çözünürlüğe ulaşmak için eşit derecede kritiktir. DESI–MSI'da, tarama yönündeki piksel boyutu aşama hızı ile kazanım oranı arasındaki ilişkiyle belirlenirken, ortogonal boyut programlanmış adım boyutuyla tanımlanır. Bu parametrelerin doğru kontrolü, hassas örnekleme yapılmasını sağlar. Birçok memeli hücresi genellikle yaklaşık 5–20 μm çapında olduğundan, bitişik hücreler arasındaki sinyal örtüşmesini en aza indirmek ve moleküler özelliklerin bireysel hücre bölgelerine lokalizasyonunu iyileştirmek için sadece birkaç mikrometreye yakın piksel boyutları gereklidir. Ancak, nominal piksel boyutu mutlaka gerçek örnekleme alanına karşılık gelmez çünkü çözücü tüyünün örnek yüzeyiyle etkileşimi, yan yayılma ve bitişik pikseller arasında kısmi sinyal örtüşmesine neden olabilir. Bu nedenle, bildirilen piksel boyutları, tamamen geometrik tanımlar yerine etkili mekânsal çözünürlük bağlamında yorumlanmalıdır. Bu çalışmada kullanılan özelleştirilmiş iyon transfer tüpü, standart iyon transfer tüpünün geometrisine göre tasarlandı; böylece iyon iletim özellikleri korunur ve DESI kaynak konfigürasyonu ile entegrasyon mümkün olur.

Orbitrap kütle spektrometrelerinin sağladığı yüksek kütle çözme gücü ve kütle doğruluğu, bireysel hücrelerde bulunan metabolitler ve lipidlerin karmaşık karışımını çözmek için gereklidir. Tespit edilen birçok moleküler özellik, doğru kütle ölçümleri ve METASPACE analiziyle geçici olarak açıklama yapıldı. Birden fazla aday atamaları tek ölçülen m/z değerine karşılık gelebileceğinden, ek MS/MS doğrulama ve ortogonal moleküler doğrulama stratejileri gelecekteki çalışmalarda moleküler tanımlamayı daha da güçlendirebilir. Pozitif iyon modunda, DESI spektrumları genellikle yakın aralıklı veya izobarik m/z değerlerine sahip fosfolipid türleri tarafından baskın olur. Yüksek çözünürlüklü Orbitrap tespiti, bu türlerin farklılaşmasını sağlar, böylece moleküler özgüllüğü artırır ve spektral belirsizliği azaltır. Bu yetenek, sınırlı sayıda iyyona güvenmenin hücresel heterojenliğin yanlış anlaşılmasına yol açabileceği tek hücreli analizler için özellikle önemlidir. Bu uyum sağlama yeteneği, benzer stratejilerin uygun modifikasyonlarla ilgili arayüzler kullanarak diğer kütle spektrometrisi platformlarına da uygulanabileceğini gösterir. Bu avantajlara rağmen, birkaç sınırlama göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, mevcut çalışmada kullanılan DESI kaynağı yalnızca DESI–MSI sistemlerine sahip kullanıcılar için mevcuttur ve DESI püskürtme/Orbitrap sistemlerinin inşası, DESI kaynağı kullanılabilirliğiyle sınırlı olabilir. Ancak, DEFFI dahil alternatif DESI cihazları yüksek mekansal çözünürlüklü MSI çalışmaları için deuygulanabilir 42,47. İkinci olarak, bu platformun uygulanması, enstrüman arayüzlerinin işlenilmesi ve montaj bileşenlerinin üretimi gibi önemli özelleştirmeler gerektirir. Bu gereksinimler, enstrüman geliştirme veya mekanik üretim deneyimi olmayan laboratuvarların erişimini sınırlayabilir. Mevcut uygulamada, FAIMS arayüz komarı, DESI püskürtücü montajının Orbitrap girişine göre konumlandırılması için uygun bir mekanik montaj platformu olarak hizmet vermiştir. Sonuç olarak, tarif edilen konfigürasyonun uygulanması, FAIMS uyumlu Orbitrap sistemlerine erişimi ve temel işleme desteğine sahip laboratuvarlar için daha pratiktir. Ancak, DESI kaynaklarını Orbitrap girişlerine mekanik olarak bağlama daha geniş bir kavramı, FAIMS arayüz donanımını değiştirmeden alternatif tasarımlar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Üçüncü olarak, düşük çözücü akış hızları mekânsal hapsetmeyi iyileştirse de, genel iyon verimini de azaltabilir ve hassasiyet ile mekansal çözünürlük dengesi için dikkatli optimizasyon gerekebilir.

Bir diğer önemli husus, örnekleme sırasında analiz delokalizasyonunun potansiyelidir. DESI ortam koşullarında çalışsa ve matris uygulaması gerektirmese de, çözücü damlacıklarının örnek yüzeyiyle etkileşimi özellikle yüksek çözünürücü türler için analitlerin yeniden dağılımına yol açabilir. Bu nedenle, çözücü hacminin en aza indirilmesi ve püskürtme koşullarının optimize edilmesi, tek hücre düzeyinde mekânsal bütünlüğün korunması için kritik öneme sahiptir. Benzer şekilde, izotonik amonyum formatı kullanılarak yapılan yıkama prosedürü, daha önce tek hücreli MS iş akışlarında bildirildiği gibi, hücre bütünlüğünü korurken ve hücre türlerini korurken tuzla ilişkili iyon baskısınıazaltabilir.

Gelecekteki gelişmeler, bu platformun performansını ve uygulanabilirliğini daha da artırabilir. Örneğin, daha hızlı veri toplama sistemleriyle entegrasyon, daha küçük etkili piksel boyutları ve daha yüksek verimli MSI deneyleri mümkün olabilir. Otomatik hizalama sistemlerinin veya gerçek zamanlı geri besleme kontrolünün uygulanması, değişkenliği azaltabilir ve tekrarlanabilirliği artırabilir. Ayrıca, bu yaklaşımı floresan görüntüleme veya hedefli etiketleme stratejileri gibi tamamlayıcı tekniklerle birleştirmek, hücre tipi tanımlamayı geliştirebilir ve çoklu modal analizler yapılmasını mümkün edebilir.

Teknik değerlendirmelerin ötesinde, bu platform biyolojik ve biyomedikal araştırmalar için geniş kapsamlı sonuçlar taşımaktadır. Çevresel koşullarda bireysel hücreler düzeyinde moleküler profillerin karakterize edilmesi yeteneği, karmaşık sistemlerde hücresel heterojenliği incelemek için yeni fırsatlar sunar. DESI–MSI, tümör mikro ortamları, nörolojik hastalıklar, konak-patojenler etkileşimleri ve ilaç dirençli hücreselpopülasyonlar 12,15,16,35 üzerine doku düzeyinde başarıyla uygulanmıştır. DESI–MSI'nin tek hücre seviyesine genişletilmesi, komşu hücreler arasında lokal kimyasal heterojenliği ayırt etme, nadir hücresel alt popülasyonları tanımlama ve hacimli doku ölçümlerinde gizlenmiş olabilecek moleküler belirteçleri keşfetme yeteneğini daha da artırabilir. Ancak mevcut çalışma, basitleştirilmiş bir tek katmanlı hücre-kültür modeli kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve farklı hücre modelleri, dokular, organoidler ve 3D kültürler dahil olmak üzere diğer karmaşık biyolojik sistemlerle uyumluluğu göstermek için ek çalışmalara ihtiyaç vardır. Mevcut iş akışı, daha fazla doğrulama ve optimizasyonun ardından yüksek mekansal çözünürlüklü DESI ölçümlerinin giderek heterojen biyolojik ortamlara genişletilmesi için bir temel sağlayabilir. Bu yöntem, mekânsal bağlamı korurken ayrıntılı moleküler bilgi sağladığı için, görüntüleme ile omik tabanlı yaklaşımlar arasında bir köprü görevi görebilir. Özetle, bu protokol Orbitrap kütle spektrometrelerinde tek hücre çözünürlüklü DESI–MSI elde etmek için esnek ve uyarlanabilir bir çerçeve oluşturur. İyonlaşma verimliliği, iyon iletimi, mekansal kontrol ve kütle çözünürlüğüyle ilgili temel zorlukları ele alarak, bu yaklaşım bireysel hücrelerin ayrıntılı moleküler karakterizasyonunu mümkün kılar. Daha fazla optimizasyon ve doğrulama gerekse de, metodoloji, tek hücreli ve mekansal metabolomik çalışmalarında çevresel MSI kullanımının genişletilmesi için bir temel sağlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (1R01AI177469), Ulusal Bilim Vakfı (2305182), Chan Zuckerberg Girişimi ve Savunma Bakanlığı (DoD OC220161) fonları tarafından desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
−80 °C freezerEppendorf New BrunswickU700Biological örneklerin hazırlanmasından önce depolanması.
6" vertical bracket for breadboards, 1/4"-20 holes (2 pieces)Millipore SigmaVB01AÖzel püskürtücü-montaj tertibatının mekanik desteği ve stabilizasyonu
AcetonitrileFisher Chemical240744DESI uyumlu çözücü hazırlama ve optimizasyonu için organik çözücü
Ammonium formateThermo Fisher Scientific401152500DESI–MSI öncesi hücre yıkama için izotonik amonyum formiat yıkama tamponu hazırlanması
Brightfield microscopeFisher Scientific12575252DESI–MSI edimi öncesi yapışık hücrelerin optik görüntüleme ve görselleştirilmesi
C18 columnWaters186009259Kararlılık sağlamak için in-line geri basınç üretimi nano-flow DESI püskürtme sprey oluşumu
Copper wireN/AN/APüskürtücü-montaj yapımı sırasında elektrik bağlantısı ve topraklama
DESI XS sprayerWaters700014033Tek hücreli DESI–MSI deneyleri için ortam DESI iyonizasyon kaynağı
Epoxy resinDevcon20945Özel püskürtücü-montaj bileşenlerinin mekanik stabilizasyonu ve fiksasyonu
FAIMS Pro electrode ion source housing adaptorThermo Fisher Scientific98100-20046Orbitrap uyumlu özel DESI arayüzünün modifiye edilmesi ve yapılması
Formic acidWard’s Science470301-120DESI püskürtme çözücüsü hazırlanması için asit değiştirici
MethanolFisher ChemicalA456-4 OptimaDESI püskürtme çözücüsü hazırlanması için organik çözücü
Gas regulatorMillipore Sigma23831-UDESI işlemi sırasında nitrojen kılıf gazı basıncının düzenlenmesi
Gridded glass coverslipIbidi10817Hücre kültürü substratı ve optik-MS görüntü kaydı için pozisyonel referans
Grounding wireN/AN/ADESI püskürtücü ve arayüz tertibatı için elektrik topraklama bağlantısı
IncubatorHeraCell51026282Kontrollü sıcaklık ve CO2 koşullarında memeli hücre kültürlerinin korunması
LC/MS-grade waterThermo Fisher ScientificW6500Amonyum formiat yıkama tamponu ve DESI püskürtme çözücüsü hazırlanması
METASPACE platformMETASPACEhttps://metaspace2020.euBulut tabanlı MS görüntü görselleştirme ve uzamsal metabolomik veri analizi
Modified FAIMS interfaceThermo Fisher Scientific98100-20046DESI püskürtücünü Orbitrap kütle spektrometresi ile birleştirmek için özelleştirilmiş arayüz
Motorized XYZ stageNewport CorporationCONEX-MFACCDESI–MSI ediminin kontrollü raster aşaması hareketi
MycoAlert PLUS mycoplasma detection kitLonzaLT07-703Kültürlenen hücrelerde mikoplazma kontaminasyonunun rutin izlenmesi
Nano-liquid chromatography systemThermo Fisher Scientific5200.0355DESI püskürtme oluşumu için nano-akış çözücü dağıtım sistemi
Optical breadboardThorlabsMB1012DESI püskürtücü ve modifiye edilmiş arayüz tertibatı için mekanik destek platformu
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometerThermo Fisher ScientificUVPDDESI–MSI veri ediminin yüksek çözünürlüklü Orbitrap kütle spektrometresi
PEEK tubingIDEX1535Nano-LC sistemi ve DESI püskürtücü arasındaki çözücü hattı bağlantısı
Penicillin–streptomycinGibco15140-122Memeli hücre kültürü ortamı için antibiyotik takviye
Phosphate-buffered saline (PBS)VWR0780-50LHücre geçişi sırasında kültürlenen hücreler için yıkama solüsyonu
RPMI-1640 mediumGibco11875093OVCAR-8 hücrelerinin korunması için memeli hücre kültürü ortamı
Stage-control softwareLasken GroupVersion 6Raster tarama, aşama hareketi ve görüntü alma parametrelerinin yazılım kontrolü
Stainless steel tubingMicroGroup316H16HOrbitrap arayüz entegrasyonu için özel yapılmış iyon transfer borusu (1/16" OD, 0.033" ID)
Syringe, 250 µLHamilton1725LTN250ULÇözücü yükleme ve nano-akış çözücü dağıtımı
Synthetic fetal bovine serum (FBS)HyCloneSH3006603Tam memeli hücre kültürü ortamının hazırlanması için serum takviyesi
TC20 Automated Cell CounterBio-Rad Laboratories1450102EDUKaplamalar üzerinde tohumlama öncesi kültürlenen hücrelerin otomatik sayımı
Tissue culture dish, 100 mmFisher ScientificFB012924Yapışık OVCAR-8 hücre kültürlerinin genişletilmesi ve korunması
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072Hücre geçişi sırasında yapışık hücrelerin enzimatik koparılması
UV-curing resinPrime Dental6.03Özel DESI püskürtücü-montaj bileşenlerinin yapımı ve stabilizasyonu
Xcalibur software

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek H creli MSIOVCAR 8 H creleriY ksek Uzamsal z n rl kNano S v KromatografisiMetabolomik AnalizMolek ler G r nt leme
Video yakında

İlgili makaleler