Yöntem makalesi

Alerjik Havayolu İnflamasyonunu Etkileyen Çevresel Toksik maddelerin Taranması için STAT6 Raporlayıcı Analizinin Kurulması

108 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71694

⸱

25 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  , 
1Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, insan havayolu epitel hücrelerinde stabil bir STAT6 lusiferaz raporlayıcı deneyinin oluşturulmasını ve doğrulanmasını açıklamaktadır. Bu yöntem, kontrollü in vitro koşullar altında STAT6 aktivitesini modüle eden çevresel toksiklerin ve hava kirliliği bileşenlerinin verimli bir şekilde taranmasına olanak tanır.

Özet

Hava kirliliği ile ilişkili alerjik hava yolu inflamasyonu, artan bir halk sağlığı sorunudur. Alerjik hava yolu inflamasyonunun merkezi bir aracı olan Sinyal İletici ve Transkripsiyon Aktivatörü 6 (STAT6) yolunu aktive eden Interlökin-4 (IL-4) ve interlökin-13 (IL-13), kirleticilerin solunum toksisitesini modüle edebilir. Bu çalışma, STAT6 sinyalini modüle eden çevresel toksik maddelerin değerlendirilmesi amacıyla, insan hava yolu epitel hücrelerinde stabil bir STAT6 lusiferaz raporlayıcı deneyinin oluşturulmasını ve doğrulanmasını açıklamaktadır. İnsan bronşiyal epitel 16HBE14o− hücreleri, lentiviral bir vektör kullanılarak STAT6-yanıtlı bir lusiferaz raporlayıcısı ile transduksiyon işlemi uygulanmış, ardından puromisin seçimi ve enfeksiyon multiplicitiesi optimize edilmiş ve sınırlayıcı dilüsyon ile monoklonal izolasyon gerçekleştirilmiştir. Seri pasajlar boyunca güçlü ve tekrarlanabilir indüksiyona sahip stabil bir klon seçilmiştir. Raporlayıcı yanıtı, IL-4/IL-13 stimülasyonu ile doğrulanmış ve STAT6 bağımlılığı seçici STAT6, STAT5 ve STAT3 inhibitörleri kullanılarak onaylanmıştır. Deney performansı, tekrarlanabilir sinyal ayrımına işaret eden Z′-faktörü analizi ile nicelleştirilmiştir. Ayrıca, deney bireysel hava kirliliği bileşenlerine uygulanmış ve benzo[b]fluoranthene ile partikül maddelerin STAT6 raporlayıcı aktivitesini önemli ölçüde artırdığı görülmüştür. Bu yöntem, hava yolu epitel hücrelerinde STAT6 aktivitesini ölçmek ve alerjik hava yolu sinyalini modüle eden çevresel toksik maddeleri önceliklendirmek için ölçeklenebilir bir yaklaşım sunmaktadır.

Giriş

Hava kirliliği, derin sağlık etkileri ve sosyoekonomik etkileriyle küresel halk sağlığına yönelik en acil zorluklardan birini temsil etmektedir. Günümüzde, yıllık 8,1 milyon ölüme neden olarak mortalite için ikinci sıradaki önde gelen risk faktörü olarak sınıflandırılmaktadır1,2,3. Hava yoluyla taşınan kirleticiler arasında, çapları 2,5 mikrometrenin altında olan ince partikül madde (PM2.5), solunum yollarının derinliklerine nüfuz edebilme yeteneği nedeniyle en büyük sağlık riskini oluşturmaktadır4,5. Artan PM2.5 maruziyeti, bozulmuş akciğer fonksiyonları ve solunum yolu hastalıkları nedeniyle artan hastaneye yatış oranlarıyla tutarlı bir şekilde ilişkilendirilmiştir6. Astım, alerjik rinit ve atopik dermatit dahil olmak üzere alerjik inflamatuar hastalıkların yaygınlığı dünya genelinde artmaktadır ve yüksek düzeyde kirli megakentlerde orantısız bir şekilde yükselmiştir4.

Atopik astım gibi alerjik havayolu hastalıkları, temel olarak interlökin‑4 (IL‑4) ve interlökin‑13 (IL‑13) sitokinlerinin artmış düzeyleri ve Sinyal İleticisi ve Transkripsiyon Aktivatörü 6 (STAT6) sinyal yolunun aktivasyonu ile karakterize edilen tip 2 inflamatuar yanıt aracılığıyla gerçekleşir7. Havayolu epitelyal hücrelerinde, IL-4 ve IL-13 tarafından tetiklenen STAT6 fosforilasyonu, mukus hipersekresyonunu ve epitelyal bariyer bozulmasını teşvik ederek STAT6'nın alerjik havayolu patolojisinin merkezi bir araçsı ve uygun bir terapötik hedef olduğunu ortaya koymaktadır8,9. Fare modellerinden elde edilen deneysel kanıtlar, PM2.5 ve kükürt dioksit maruziyetinin STAT6 sinyalini artırdığını ve alerjik havayolu inflamasyonunu şiddetlendirdiğini göstermektedir10,11. Ancak, bireysel hava kirliliği bileşenlerinin insan havayolu epitelyal hücrelerinde STAT6 transkripsiyonel aktivitesini doğrudan modüle edip etmediği sistematik olarak değerlendirilmemiştir.

Hava kirliliği; partikül madde, polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH'lar), ağır metaller ve inorganik tuzlar dahil olmak üzere, solunum yolu STAT6 aktivasyonuna bireysel katkıları henüz tam olarak tanımlanmamış kimyasal olarak karmaşık bir bileşenler karışımından oluşur12,13. Solunum yolu epitel hücrelerinde STAT6 aktivitesini ölçmek için kullanılan uç nokta fosforilasyon analizleri veya geçici transfeksiyon tabanlı raporlayıcı sistemler gibi mevcut metodolojiler, geniş ölçekli kimyasal taramalara uygun değildir. Bu nedenle, insan solunum yolu epitel hücrelerinde oluşturulacak stabil, hücre tabanlı bir STAT6 raporlayıcı platformu, alerjik solunum yolu sinyalizasyonunu modüle eden kirlilik kaynaklı bileşiklerin belirlenmesi için ölçeklenebilir bir araç sağlayacaktır. Bu protokol, çevresel örneklerin ve bireysel kimyasal toksikanların sistematik taraması için STAT6 aktivasyonunun kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyan 16HBE14o− solunum yolu epitel hücrelerinde stabil bir STAT6 lusiferaz raporlayıcı analizinin geliştirilmesini ve doğrulanmasını açıklamaktadır.

Protokol

Bu çalışma, yerleşik 16HBE14o− insan bronşiyal epitelyal hücre hattını kullandığı için insan denek etik onayı gerekli değildir.

1. 16HBE14o'nun Oluşturulması− STAT6 aktivite raporlayıcısını stabil olarak eksprese eden hücreler

NOT: Şekil 1 iş akışına genel bir bakış sunmaktadır.

  1. Hücre kültürü
    NOT: Tüm prosedürleri Sınıf II biyogüvenlik kabininde aseptik teknik kullanarak gerçekleştirin. Kullanmadan önce hücrelerin mikoplazma kontaminasyonu içermediğini doğrulayın.
    1. 16HBE14o− hücrelerini %10 fetal bovine serum ve %1 penisilin–streptomisin ile desteklenmiş minimum esansiyel ortamda sürdürün. Hücreleri %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de inkübe edin ve kültür ortamını gün aşırı yenileyin.
    2. Hücrelerin yaklaşık %80 konfluense ulaşmasını bekleyin. Kültür ortamını aspire edin ve hücre monokatmanını fosfat tamponlu salin ile bir kez durulayın.
    3. Hücre monokatmanını kaplayacak kadar fosfat tamponlu salin ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 20 dk inkübe edin. Fosfat tamponlu salini tamamen aspire edin.
      NOT: Bu hücre hattı tarafından oluşturulan sık hücreler arası bağlantıların bozulmasını kolaylaştırmak için 20 dk'lık fosfat tamponlu salin inkübasyonunu kullanın. Bu süre, kurum içi optimize edilmiş bir modifikasyonu temsil eder.
    4. Hücre monokatmanını kaplayacak kadar %0,25'lik tripsin–etilendiamintetraasetik asit çözeltisi ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 10 dk inkübe edin.
      NOT: Hücre ayrılmasını ters ışık mikroskobu kullanarak izleyin. Ayrılmayı kolaylaştırmak için gerektiğinde kültür kabına hafifçe vurun.
    5. Enzimatik aktiviteyi sonlandırmak için tripsin–etilendiamintetraasetik asit çözeltisinin hacmine oranla yaklaşık beş hacim tam kültür ortamı ekleyin. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için süspansiyonu nazikçe pipetleyin.
    6. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Süspansiyonu 25 °C'de 5 dk boyunca 300 × g hızda santrifüjleyin.
    7. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini taze kültür ortamında yeniden süspande edin. Süspansiyonu nazikçe tritüre edin ve ters ışık mikroskobu altında tek hücreli bir süspansiyonun varlığını doğrulayın.
    8. Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın ve hücre konsantrasyonunu sonraki deney için gereken yoğunluğa ayarlayın. Rutin bir bölme oranı olarak 1:8 kullanın.
      NOT: Kültür kaplarının büyüme alanları ve buna karşılık gelen fosfat tamponlu salin ile tripsin–etilendiamintetraasetik asit çözeltisi hacimleri için Ek Tablo 1 ve Ek Tablo 2'ye bakın.
  2. Puromisinle indüklenen sitotoksisitenin belirlenmesi
    ​NOT: Antibiyotiği, lentiviral konstrükt tarafından kodlanan direnç genine göre seçin.
    1. 16HBE14o− hücrelerini, kuyuk başına 100 µL tam kültür ortamı içeren 96 kuyucuklu bir kültür plakasına kuyuk başına 2 × 104 hücre olacak şekilde ekimleyin. Hücreleri gece boyunca inkübe edin.
    2. Kültür ortamını, nihai konsantrasyonları 0,5, 1, 2 veya 4 µg/mL olan puromisin içeren taze ortamla değiştirin. 24, 48 ve 72 saatlik zaman noktaları için ayrı plakalar hazırlayın.
    3. Her kuyucuğa 5 µL hücre sayım reaktifi ekleyin. Plakayı 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
      NOT: Absorbans ölçümlerini etkileyebileceği için kuyucuklara hava kabarcığı girmesini önleyin.
    4. 650 nm'yi referans dalga boyu olarak kullanarak 450 nm'de absorbansı ölçün. Absorbansı son nokta modunda kaydetmeden hemen önce plakayı 15 sn boyunca sallayın.
    5. Denklem 1'i kullanarak hücre canlılığını14 hesaplayın.
      Hücre canlılığı denklemi, örnekler, kontrol ve kör için OD450-650; biyolojik analiz formülü.
      burada:
      Absorbans denklemi OD450-650, çıkarma yöntemi, spektrofotometride kullanılır, formül.
      Spektroskopi deneylerinde absorbsiyon analizi için optik yoğunluk formülü (OD450-650).
      Spektroskopik veri analizi için optik yoğunluk denklemi, OD450-650blank=OD450blank-OD650blank.
      NOT: Kontrolü işlem görmemiş hücreler, körü ise analiz reaktifi içeren hücreden arındırılmış ortam olarak tanımlayın. 48–72 saat içinde transduksiyon yapılmamış hücreleri tamamen yok eden en düşük puromisin konsantrasyonunu seçin.
  3. Optimal enfeksiyon çokluğunun belirlenmesi
    DİKKAT: Lentiviral partikülleri, kayıtlı bir Biyogüvenlik Seviye 2 tesisinde, Biyogüvenlik Seviye 2 koşulları altında ve kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak taşıyın. Tüm virüs manipülasyonlarını Sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. Virüsle kontamine olmuş sarf malzemelerini ve dökülmeleri, biyotehlikeli atık olarak bertaraf etmeden önce en az 1 saat boyunca %10'luk çamaşır suyu ile kaplayın.
    ​NOT: Transdüksiyon verimliliğini doğrudan etkilediği için enfeksiyon çokluğunu optimize edin.
    1. Denklem 2'yi kullanarak gerekli lentiviral stok hacmini15 hesaplayın.
      MOI hesaplama formülü, virüs partikülleri ile hedef hücrelerin oranı, moleküler biyoloji denklemi.
      burada:
      Fonksiyonel virüs titresi formülü, T_virus = TU/mL, viroloji araştırma veri analizi denklemi.
      Virüs hacmi denklemi, V_virus=mL cinsinden virüs hacmi, formül, viroloji çalışması, hesaplama yöntemi
      Statik denge, denklem: N_cells = hedef hücre sayısı, eğitim araştırması kullanımı için diyagram.
      NOT: Bu protokolde kullanılan STAT6 lusiferaz raporcu lentiviral stoğun fonksiyonel titresi 5 × 107 transdüksiyon birimi/mL idi. 2 × 104 hedef hücre için 20'lik bir MOI, kuyuk başına 8 µL lentiviral stoğa karşılık gelir. Virüs hacmi, farklı titrelerdeki virüs preparasyonları için yeniden hesaplanmalıdır.
    2. 16HBE14o− hücrelerini, kuyuk başına 100 µL tam kültür ortamı içeren 96 kuyucuklu beyaz şeffaf tabanlı bir plakaya kuyuk başına 2 × 104 hücre olacak şekilde ekimleyin. Hücreleri yaklaşık %80 konfluense ulaşana kadar gece boyunca inkübe edin.
    3. Kültür ortamını, 5 µg/mL polybrene ve 1, 5, 10 ve 20 MOI'lerde STAT6 lusiferaz raporcu lentivirüs içeren taze ortamla değiştirin. Lentivirüs içermeyen, transduksiyon yapılmamış bir yalancı-kontrol (mock-control) kuyucuğu ekleyin.
      NOT: Her MOI için gereken lentiviral hacmi, stoğun fonksiyonel titresinden hesaplayın.
    4. Hücreleri lentiviral partiküllerle 48 saat boyunca inkübe edin. Transdüksiyon ortamını taze kültür ortamıyla değiştirin ve hücreleri ek 24 saat daha inkübe edin.
    5. Kültür ortamını, her biri 10 ng/mL konsantrasyonda interlökin-4 ve interlökin-13 içeren taze ortamla değiştirin. Hücreleri 24 saat inkübe edin.
    6. Her kuyucuğa 25 µL lusiferaz analiz reaktifi ekleyin16. Plakayı ışıktan koruyun ve oda sıcaklığında 20 dk inkübe edin.
    7. Plakayı 20 saniye boyunca lineer olarak sallayın. Tüm plaka okuması ve 120 kazanç (gain) ayarı kullanarak son nokta modunda lüminesansı ölçün.
      DİKKAT: Maksimal sinyali yakalamak için lüminesansı, lusiferaz analiz reaktifi eklendikten sonra 1 saat içinde kaydedin. Reaktif üreticisinin güvenlik ve kullanım talimatlarını izleyin.
      NOT: Tüm absorbans ve lüminesans ölçümleri için aynı multimode mikroplaka okuyucuyu ve veri toplama ayarlarını kullanın.
  4. Transduksiyona uğramış hücrelerin seçimi
    1. 16HBE14o− hücrelerini 24 kuyucuklu bir kültür plakasına 2 × 105 hücre/mL olacak şekilde ekimleyin. Hücreleri gece boyunca inkübe edin.
    2. Kültür ortamını, 20 MOI'de STAT6 lusiferaz raporcu lentivirüs ve 5 µg/mL polybrene içeren taze ortamla değiştirin. Hücreleri 48 saat inkübe edin.
    3. Transdüksiyon ortamını taze kültür ortamıyla değiştirin. Hücreleri ek 24 saat daha inkübe edin.
    4. Kültür ortamını aspire edin ve 1 µg/mL puromisin içeren taze ortam ekleyin. Seçim ortamını her 2 günde bir yenileyerek hücreleri 5 gün boyunca inkübe edin.
    5. Transduksiyon yapılmamış yalancı-kontrol kuyucuğundaki tüm hücreler yok olana kadar puromisin seçimini sürdürün.
      ​NOT: Direnç geninin ekspresyonuna izin vermek için antibiyotik seçimi uygulamadan önce transduksiyondan sonra en az 24 saat bekleyin.
  5. Limitli dilüsyon ile tek hücreli klonların izolasyonu
    1. Puromisinle seçilmiş STAT6 raporcu hücrelerini ayırın ve sayın. Seri dilüsyon yoluyla 5 hücre/mL'lik tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.
      ​NOT: Dilüsyon sırasında hücre kümelenmesini önleyin. Gerektiğinde süspansiyonu bir hücre süzgecinden geçirin.
    2. Kuyuk başına yaklaşık bir hücre ortalama yoğunluğu elde etmek için 96 kuyucuklu bir kültür plakasının her kuyucuğuna 200 µL hücre süspansiyonu dağıtın.
    3. 24 saat içinde her kuyucuğu ters mikroskopla inceleyin ve tek bir hücre içeren kuyucukları belirleyin. Birden fazla hücre veya mekansal olarak ayrılmış birden fazla hücre odağı içeren kuyucukları hariç tutun.
    4. Klonal büyümeyi doğrulamak için seçilen kuyucukları ilk hafta boyunca izleyin. Kültür ortamını her 3 günde bir yenileyin.
    5. Her klonu orijinal 96 kuyucuklu plakada yaklaşık 20 gün boyunca veya hücreler konfluense ulaşana kadar genişletin. Her klonu sırayla 6 kuyucuklu bir plakaya ve ardından T-25 kültür balonuna aktarın.
      NOT: Hücreleri T-25 balonuna aktarmadan önce yaklaşık 6 gün boyunca 6 kuyucuklu plakada kültüre edin veya uygun konfluense ulaştıklarında aktarın.
      ​DURAKLAMA NOKTASI: Klonları genişletmeye devam edin veya 90% fetal bovine serum ve %10 dimetil sülfoksit içeren 1 mL kriyoprezervasyon ortamında, vial başına 1 × 106 hücre olacak şekilde kriyoprezerve edin.
    6. Genişletilmiş her klonu 96 kuyucuklu beyaz şeffaf tabanlı bir plakaya 2 × 105 hücre/mL olacak şekilde ekimleyin. Hücreleri gece boyunca inkübe edin.
    7. Kültür ortamını, her biri 10 ng/mL olan IL-4 ve IL-13 içeren taze ortamla değiştirin. Hücreleri 24 saat inkübe edin.
    8. 1.3.6–1.3.7 adımlarında açıklandığı gibi lusiferaz aktivitesini ölçün. Münferit klonlar arasındaki indüklenmiş raporcu aktivitesini karşılaştırın.
    9. Lusiferaz analizini artan hücre pasaj sayıları üzerinden tekrarlayın. Pasajlar boyunca tutarlı sitokin-indüklenmiş raporcu aktivitesini koruyan klonları seçin.
      NOT: Klon 3, düşük bazal lüminesansı ve seri pasajlar boyunca tutarlı bir sitokin-indüklenmiş aktivasyon sinyalini koruma yeteneği nedeniyle seçilmiştir.

2. STAT6 aktivite raporlayıcı analizinin kurulması ve doğrulanması

NOT: Şekil 2 iş akışına genel bir bakış sunmaktadır.

  1. STAT6 aktivite raporlayıcı deneye doğrulanması
    1. STAT6 raporlayıcı hücreleri, kuyuk başına 100 µL tam kültür medyumu kullanarak 96 kuyucuklu beyaz şeffaf tabanlı bir plakaya 2 × 105 hücre/mL yoğunlukta ekin. Hücreleri gece boyunca inkübe edin.
    2. Kültür medyumunu, her biri 10 ng/mL son konsantrasyonda IL-4 ve IL-13 içeren taze medyum ile değiştirin. Seçici inhibitörleri eş zamanlı olarak şu şekilde ekleyin: 100 nM AS1517499 (STAT6 inhibitörü), 2.5 µM AC-4-130 (STAT5 inhibitörü) veya 2.5 µM Stattic (STAT3 inhibitörü).
    3. 0.1% dimetil sülfoksit (DMSO) içeren bir taşıyıcı kontrol ekleyin. Hücreleri 24 sa boyunca inkübe edin.
    4. Hücre canlılığını, 1.2.3–1.2.5 adımlarında açıklanan hücre sayım deneyi ile belirleyin.
    5. Lusiferaz aktivitesini, 1.3.6–1.3.7 adımlarında açıklanan şekilde ölçün.
    6. Her kuyucuğun lüminesans sinyalini, ilgili hücre canlılığına göre normalize edin. Normalize edilen değerleri, sitokinle işlem görmüş kontrol grubuna oranla ifade edin.
      NOT: Azalmış hücre canlılığı, STAT6 aktivitesinden bağımsız olarak lusiferaz sinyalini düşürebilir. Raporlayıcı aktivitesini yalnızca kabul edilebilir hücre canlılığı onaylandıktan sonra yorumlayın.
  2. Deney sağlamlığının değerlendirilmesi
    1. Hem pozitif hem de negatif kontrol grupları için 21 tekrarlı kuyucuk kullanarak Z′-faktörünü hesaplayıp deney sağlamlığını değerlendirin.
    2. Z′-faktörünü Denklem 3'ü kullanarak hesaplayın.
      Statik denge denklemi, Z-faktörü formülü, deney kalite kontrolü için matematiksel ifade.
      burada:
      Statik denge denklemi, σₚ kontroldeki standart sapmayı belirtir, eğitimsel formül örneği.
      Standart sapma denklemi, σn, negatif kontrol doğruluğu için istatistiksel analizde kullanılır.
      Denklem μ<sub>p</sub>=pozitif kontrolün ortalama sinyali; istatistiksel veri analizi kavramı.
      Statik denge, denklem μn= negatif kontrolün ortalama sinyali, eğitimsel analiz.
      NOT: 0.5 ile 1.0 arasındaki bir Z′-faktörü, deneyin yüksek kapasiteli tarama için uygun olduğunu gösterir.

3. Çevresel toksik maddelerin taranması için STAT6 raporlayıcı analizinin uygulanması

DİKKAT: Polisiklik aromatik hidrokarbonlar ve ağır metal tuzları, toksik ve potansiyel olarak kanserojen maddeler olarak ele alınmalıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın, tüm işlemleri sertifikalı bir kimyasal çeker ocak içerisinde gerçekleştirin ve kontamine olmuş malzemeleri kurumun tehlikeli atık prosedürlerine uygun olarak bertaraf edin.

  1. Çevresel toksikant taraması
    1. STAT6 reporter hücrelerini, kuyu başına 100 µL tam kültür ortamı kullanarak, 2 × 105 hücre/mL yoğunlukta 96 kuyucuklu beyaz şeffaf tabanlı plakaya ekleyin. Hücreleri gece boyunca inkübe edin.
    2. Kültür ortamını, her bir test bileşiğini istenen final konsantrasyonda (bu protokol için 10 µM) içeren taze ortamla değiştirin ve hücreleri IL-4 ve IL-13 yokluğunda işleme tabi tutun.
    3. %0,1 dimetil sülfoksit içeren bir negatif kontrol grubu ile her biri 10 ng/mL IL-4 ve IL-13 içeren bir pozitif kontrol grubu ekleyin. Hücreleri 24 sa boyunca inkübe edin.
    4. Hücre canlılığını, adım 1.2.3–1.2.5'te açıklandığı şekilde hücre sayım testi ile belirleyin.
    5. Lusiferaz aktivitesini, adım 1.3.6–1.3.7'de açıklandığı şekilde ölçün.
    6. Her kuyucuktan gelen lüminesans sinyalini, ilgili hücre canlılığı değerine göre normalize edin. Normalize edilmiş sonucu negatif kontrol grubuna göre ifade edin.
    7. Hücre canlılığını %80'in altına düşüren bileşikleri STAT6 reporter aktivitesi yorumlamasından hariç tutun.
      NOT: Sitotoksik koşullar altında elde edilen reporter sinyallerini güvenilmez olarak değerlendirin; çünkü azalmış hücre canlılığı, lüminesansı STAT6 yolak aktivitesinden bağımsız olarak değiştirebilir.

Sonuçlar

Stabil seçilim için optimal puromisin konsantrasyonunu belirlemek amacıyla, parental 16HBE14o− hücreleri artan puromisin konsantrasyonlarına (0.5–4 µg/mL) maruz bırakılmış ve hücre canlılığı, bir hücre canlılık testi kullanılarak 24, 48 ve 72 saatin ardından değerlendirilmiştir. Puromisin, hücre canlılığını doz ve zamana bağlı olarak azaltmış; 48–72 saat sonunda tüm konsantrasyonlar canlılığı %20'nin altına düşürmüştür (Şekil 3). 1 µg/mL konsantrasyonu, transdüksiyon yapılmamış hücreleri tamamen ortadan kaldıran en düşük konsantrasyon olmuş ve kalıntı canlılık sinyalini 48 saat içinde yaklaşık %4,5'e indirmiştir (p < 0.0001). Puromisin konsantrasyonunun artırılması, hücre canlılığında herhangi bir ek azalma sağlamamıştır. Bu nedenle, transdükte hücrelerin sonraki seçilimi için 1 µg/mL puromisin tercih edilmiştir.

Lentiviral transdüksiyon verimliliğini optimize etmek için, 16HBE14o− hücreleri 1, 5, 10 ve 20'lik enfeksiyon çoklukları (MOI) ile 48 saat boyunca STAT6 lüsiferaz raporcu lentivirus ile transdükte edilmiş, ardından STAT6 sinyal yolunu aktive etmek için IL-4 ve IL-13 (her biri 10 ng/mL) ile 24 saat boyunca stimüle edilmiştir. Şekil 4'te gösterildiği üzere, bağıl lüminesans birimleri (RLU) MOI'ye bağımlı olarak artmıştır. 20'lik bir MOI, stimüle edilmemiş kontrolle karşılaştırıldığında lüminesansta yaklaşık 50 katlık bir artışla (p < 0.0001) en yüksek raporcu indüksiyonunu sağlamıştır. Bu sonuçlara dayanarak, sonraki deneyler için 20'lik bir MOI seçilmiştir.

Optimize edilmiş koşullar altında transdüksiyon ve puromisin seçimi sonrası, transdükse edilmemiş hücrelerde yaygın hücre ölümü görülürken, transdükse edilmiş hücreler normal morfolojilerini ve canlılıklarını korumuştur (Şekil 5). Hayatta kalan hücreler daha sonra, monoklonal STAT6 raporlayıcı hücre hatları oluşturmak amacıyla sınırlayıcı dilüsyon işlemine tabi tutulmuştur.

Tek hücrelerden türetilen üç monoklonal reporter hücre hattı, STAT6 reporter aktivitesi açısından değerlendirildi. Tüm klonlar düşük bazal lüminesans (<1,000 RLU) sergiledi. IL-4 ve IL-13 ile stimülasyon, 2 ve 3 numaralı klonlarda 20,000 RLU'yu aşan lüminesans ile 20 kattan fazla indüksiyona karşılık gelen güçlü bir reporter aktivitesi indükledi (Şekil 6A). Klon 3 en düşük bazal lüminesansı sergiledi ve bu nedenle ileri karakterizasyon için seçildi. Uzun süreli stabiliteyi değerlendirmek amacıyla klon 3'teki reporter aktivitesi seri pasajlar (P9–P21) boyunca incelendi. Şekil 6B'de gösterildiği üzere, STAT6'ya bağımlı reporter indüksiyonu, değerlendirilen pasaj aralığı boyunca stabil kaldı. Normal büyüme hızı sergileyen, bazal lüminesansı yaklaşık 1,000 RLU'nun altında olan ve sitokin stimülasyonu sonrası 20 kattan fazla indüksiyon gösteren bir klon, sonraki deneyler için uygun kabul edildi.

IL-4 ve IL-13, STAT3 ve STAT5 dahil olmak üzere ek STAT ailesi üyelerini aktive edebildiğinden, raporlayıcı assay'in özgünlüğü daha ayrıntılı olarak değerlendirilmiştir17,18. STAT6 raporlayıcı hücreler, STAT6, STAT5 veya STAT3'ü hedefleyen seçici inhibitörlerin varlığında veya yokluğunda 24 saat boyunca IL-4 ve IL-13 ile stimüle edilmiştir19,20,21. Tüm uygulama koşulları altında hücre canlılığı %90'ın üzerinde kalmıştır (STAT6 inhibitörü AS1517499, 100 nM: %98,4; STAT5 inhibitörü AC-4-130, 2.5 µM: %97,4; STAT3 inhibitörü Stattic, 2.5 µM: %96,2; Şekil 7A). STAT6'nın inhibisyonu lusiferaz aktivitesini belirgin şekilde azaltırken (p < 0.0001), STAT5 veya STAT3 inhibisyonu raporlayıcı aktivite üzerinde anlamlı bir etki yaratmamıştır (p = 0.2593 ve p = 0.8857; sırasıyla; Şekil 7B). Bu bulgular, raporlayıcı aktivasyonunun ağırlıklı olarak STAT6 bağımlı olduğunu doğrulamıştır.

Analizin sağlamlığı, IL-4 ve IL-13 stimüle edilmiş hücreler yüksek sinyal kontrolü, STAT6 inhibitörü ile tedavi edilmiş hücreler ise düşük sinyal kontrolü olarak kullanılarak Z′-faktörü hesaplanmasıyla değerlendirildi. Analiz sonucunda 0,703 ± 0,097 değerinde bir Z′-faktörü elde edildi; bu değer, mükemmel analiz performansı, geniş bir sinyal penceresi ve yüksek çıktılı taramaya uygunluk göstermektedir.

Son olarak, partikül maddenin seçilen çevresel bileşenlerinin STAT6 sinyal yolunu modüle etme yeteneklerini taramak için STAT6 reporter deneyi uygulanmıştır. 24 saatlik tedavinin ardından, benzo[b]fluoranthene (10 µM) STAT6 reporter aktivitesini yaklaşık 1,75 kat önemli ölçüde artırırken (p = 0,0006), partikül madde (100 µg/mL) reporter aktivitesini yaklaşık 1,5 kat artırmıştır (p = 0,0398; Şekil 8). Buna karşın, CdCl2, HgCl2 ve NiSO4 (her biri 10 µM) dahil olmak üzere geri kalan polisiklik aromatik hidrokarbonlar ve ağır metal bileşikleri reporter aktivitesini anlamlı düzeyde değiştirmemiştir. Toplu olarak bu sonuçlar, STAT6 reporter deneyinin kararlı, spesifik, güçlü ve STAT6 sinyal yolunu modüle eden çevresel bileşiklerin yüksek kapasiteli taraması için uygun olduğunu göstermektedir.

Hücre transduksiyon diyagramı; STAT6 lusiferaz raporlayıcısı; antibiyotik seçimi; MOI optimizasyonu.
Şekil 1: 16HBE14o− STAT6 raporlayıcı hücrelerin oluşturulma iş akışı. STAT6 lusiferaz raporlayıcısını stabil olarak eksprese eden 16HBE14o− hücrelerin oluşturulmasına yönelik protokolün şematik özeti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

STAT6 reporter hücre analizi işlem diyagramı; IL4/13 stimülasyonu, CCK8, lusiferaz ilavesi, sonuçlar.
Şekil 2: STAT6 reporter analizinin kurulumu ve uygulanması için iş akışı. Analiz validasyonu ve çevresel toksik maddelerin taranması için STAT6 reporter analizinin şematik genel görünümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

24-72 saat boyunca 0,5-4µg/mL puromisin etkilerini gösteren hücre canlılığı sütun grafiği; istatistiksel analiz.
Şekil 3: Stabil hücre seçimi için optimal puromisin konsantrasyonunun belirlenmesi.Parental 16HBE14o− hücreleri puromisin (0,5, 1, 2 veya 4 µg/mL) ile 24, 48 veya 72 saat boyunca işleme tabi tutulmuştur. Taşıyıcı kontrol hücreleri %0,1 dimetil sülfoksit (DMSO) almıştır. Hücre canlılığı, bir hücre canlılığı testi kullanılarak belirlenmiştir. Hücre canlılığı, kör çıkarma ve taşıyıcı kontrole normalizasyondan sonra 450 ve 650 nm arasındaki absorbans farkından hesaplanmıştır. Veriler, teknik tekrarları olan üç bağımsız biyolojik tekrardan (n = 3) elde edilen ortalama ± SD olarak sunulmuştur. İstatistiksel anlamlılık, tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi kullanılarak belirlenmiştir. Taşıyıcı kontrol ile karşılaştırmalar için p-değerleri belirtilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Lüminesans ile MOI karşılaştırmalı sütun grafikleri; RLU kat değişimi veri analizi ve istatistiksel p-değerleri.
Şekil 4: Lentiviral transduksiyon verimliliğinin optimizasyonu. 16HBE14o− hücreleri, 1, 5, 10 veya 20 enfeksiyon çokluklarında (MOI) STAT6 lüsiferaz raporlayıcı lentivirüs ile 48 sa boyunca transdukte edilmiştir. 24 saatlik bir toparlanma süresinin ardından, hücreler IL-4 ve IL-13 (her biri 10 ng/mL) ile 24 saat boyunca stimüle edilmiştir. (A) Mock-transdukte edilen hücrelerde ve belirtilen MOI'larda raporlayıcı-transdukte edilen hücrelerdeki bağıl lüminesans birimleri (RLU). İstatistiksel analiz, tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett çoklu karşılaştırma testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. (B) Stimüle edilmemiş MOI 20 kontrolüne kıyasla sitokin stimülasyonu sonrası kat artışı. İstatistiksel analiz, eşleştirilmemiş Student t-testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veriler, üç bağımsız biyolojik tekrardan (n = 3) elde edilen ortalama ± SD olarak sunulmuştur. p-değerleri belirtilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Puromisin maruziyeti altındaki hücre morfolojisi; 50 μm ölçeğindeki varyasyonları gösteren mikroskopi görüntüsü.
Şekil 5: Puromisin seleksiyonu sonrası hücrelerin temsili görüntüleri. 16HBE14o− hücreleri, STAT6 lusiferaz raporer lentivürüsü ile transdüse edilmiş veya edilmemiş (MOI = 20) ve ardından 5 gün boyunca 1 µg/mL puromisin ilele işleme tabi tutulmuştur. Görüntüler, özdeş görüntüleme koşulları altında, 100× büyütmede faz-kontrast evirtmiş mikroskop kullanılarak elde edilmiştir. İşlem görmemiş parental hücreler normal bir epitelyal monokatman oluşturmuştur (solda). Puromisinle işlem görmüş transdüse edilmemiş hücreler yaygın hücre ölümü ve kopma göstermiş (ortada), puromisinle seçilmiş transdüse hücreler ise canlı kalmış ve normal morfolojilerini korumuştur (sağda). Ölçek çubuğu = 50 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Lüminesans analiz sonuçları; hücre klonlarında ve pasajlarda kontrol ile IL koşullarını karşılaştıran sütun grafiği.
Şekil 6: STAT6 raporlayıcı klonların tanımlanması ve raporlayıcı stabilitesinin değerlendirilmesi. Sınırlayıcı dilüsyonun ardından, üç monoklonal STAT6 raporlayıcı hücre hattı genişletilmiş ve 24 saat boyunca IL-4 ve IL-13 (her biri 10 ng/mL) ile stimüle edilmiştir. (A) Sitokin stimülasyonu sonrası bireysel raporlayıcı klonların lüsiferaz aktivitesinin stimüle edilmemiş kontrollerle karşılaştırılması. (B) Seri pasajlar (P9–P21) boyunca klon 3'teki STAT6 raporlayıcı aktivitesinin stabilitesi. Veriler, teknik tekrarların ortalaması ± SD olarak sunulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İlaçla işlem görmüş hücre deneylerinde % hücre canlılığını ve normalize edilmiş lüminesansı karşılaştıran sütun grafikleri.
Şekil 7: Hücre canlılığını etkilemeden STAT6 raporlayıcı aktivitesinin seçici inhibisyonu. STAT6 raporlayıcı hücreler, STAT6 inhibitörü AS1517499 (100 nM), STAT5 inhibitörü AC-4-130 (2.5 µM) veya STAT3 inhibitörü Stattic (2.5 µM) varlığında 24 saat boyunca IL-4 ve IL-13 (her biri 10 ng/mL) ile stimüle edilmiştir. Sitokinle stimüle edilen taşıyıcı kontrol grubu %0.1 DMSO almıştır. (A) Hücre canlılığı, bir hücre canlılığı deneyi kullanılarak belirlenmiştir. (B) Sitokinle stimüle edilen kontrole göre normalize edilmiş STAT6-bağımlı lusiferaz aktivitesi. Veriler, üç bağımsız biyolojik tekrardan (n = 3) elde edilen ortalama ± SD olarak sunulmuştur. p-değerleri belirtilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Kimyasal işlemleri kontrol örnekleriyle karşılaştıran normalize edilmiş lüminesans analiz sonuçlarının sütun grafiği.
Şekil 8: Çevresel toksiklerin STAT6-modülatör etkilerinin değerlendirilmesi.STAT6 reporter hücreleri 24 saat boyunca partikül madde (100 µg/mL) veya polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH'lar) ve ağır metaller (her biri 10 µM) dahil olmak üzere belirtilen çevresel toksikler ile işlem görmüştür. STAT6-bağımlı lusiferaz aktivitesi, taşıyıcı kontrole (0.1% DMSO) göre normalize edilmiştir. Veriler, üç bağımsız biyolojik tekrardan (n = 3) elde edilen ortalama ± SD olarak sunulmuştur. İstatistiksel anlamlılık, taşıyıcı kontrol ile karşılaştırma yapılarak belirlenmiş ve p-değerleri belirtilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: 16HBE14o− hücre kültürü için kültür kabı özellikleri ve pasajlama parametreleri.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: STAT6 aktivitesini ölçme yöntemlerinin karşılaştırılması.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Tartışma

IL-4/IL-13–JAK–STAT6 sinyal yolu, yalnızca önemli bir terapötik hedef değil, aynı zamanda astım ve alerjik rinit dahil olmak üzere alerjik hastalıkların patogenezinin temel bir itici gücüdür22. Bu protokol, STAT6 aktivitesinin modülatörlerini belirlemek için hücre hattı tabanlı, basit ve stabil bir reporter assay yöntemini açıklamaktadır. Assay, geniş bir yelpazedeki çevresel bileşiklerin STAT6 modülatör etkilerini değerlendirmek için uygulanabilir ve kavram kanıtlama tarama çalışmasında gösterildiği üzere (Şekil 8), yüksek kapasiteli taramaya (high-throughput screening) kolayca uyarlanabilir. Bir lusiferaz reporter ile paralel bir hücre canlılığı assay'ini birleştiren bu yöntem, bileşik kaynaklı sitotoksisiteden kaynaklanan karıştırıcı etkileri en aza indirirken STAT6 yolak modülasyonunun kantitatif değerlendirmesini sağlar.

Bu yöntemin ayırt edici bir özelliği, kirletici kaynaklı IL-4/IL-13 sinyalizasyonunun alerjik havayolu inflamasyonuna katkıda bulunduğu, fizyolojik olarak ilgili bir hücre tipi olan stabil olarak transduce edilmiş insan bronşial epitel 16HBE14o− hücrelerinin kullanılmasıdır. STAT6 aktivitesini ölçmeye yönelik mevcut yaklaşımlar önemli pratik sınırlamalara sahiptir. Western blotting veya enzimle bağlantılı immünosorbent assay (ELISA) ile STAT6 fosforilasyonunun veya aşağı akış hedef proteinlerinin saptanması emek yoğundur ve nispeten düşük kapasitelidir. Geçici transfeksiyon lüsiferaz raporlayıcı assayleri, STAT6 transkripsiyonel aktivitesini doğrudan ölçer ancak değişken transfeksiyon verimliliğinden, lotlar arası değişkenlikten ve her deney için transfeksiyonun tekrarlanması gerekliliğinden etkilenerek tekrarlanabilirliği ve kapasiteyi düşürür.

Çalışmada açıklanan stabil reporter hücre hattı, bu kısıtlamaların çoğunu ortadan kaldırmaktadır. Reporter konstrükt genomik olarak entegre edildiği ve klonal olarak seçildiği için, reporter ekspresyonu hücre popülasyonu genelinde tekdüze kalmakta ve pasajlar arasında tekrarlanabilmekte, böylece geçici transfeksiyonla ilişkili değişkenlik ortadan kalkmaktadır. Lüminesans sinyali canlı hücrelerde ölçülmektedir ve sitotoksik artefaktları dışlamak için paralel bir hücre canlılığı ölçümüne göre normalize edilebilir. Ek olarak, analiz orta ve yüksek kapasiteli uygulamalar için 96 kuyucuklu formata kolaylıkla uyum sağlamaktadır. Analiz 0,703'lük bir Z′-faktörü vermiş olup, bu durum yüksek ve düşük sinyalli kontroller arasında mükemmel bir ayrım olduğunu göstermekte ve yüksek kapasiteli tarama için uygunluğunu doğrulamaktadır. STAT6 aktivitesini ölçmek için yaygın olarak kullanılan yaklaşımların bir karşılaştırması Ek Tablo 2'de sunulmuştur. Buna rağmen, analiz endojen hedef gen ekspresyonundan ziyade STAT6'ya yanıt veren bir promotörün aktivasyonunu raporladığı için, MUC5AC ve CCL26 gibi aşağı akış STAT6 hedefleri kullanılarak yapılan ortogonal doğrulama önemini korumaktadır.

STAT6 raporlayıcı deneyinin başarılı bir şekilde kurulması ve uygulanması için birkaç adım kritik öneme sahiptir. Lentiviral enfeksiyon çokluğu (MOI) optimizasyonu esastır; çünkü yetersiz viral girdi transdüksiyon verimliliğini düşürürken, aşırı viral maruziyet hücresel strese yol açabilir ve hücre canlılığını tehlikeye atabilir. Benzer şekilde, dirençli raporlayıcı hücrelerin canlılığını korurken transdükse edilmemiş hücreleri ortadan kaldırmak için puromisin seçilim konsantrasyonunun optimizasyonu gereklidir. Lentiviral transdüksiyona ve antibiyotik seçilimine karşı duyarlılık hücre tipleri arasında farklılık gösterdiğinden, stabil raporlayıcı hücre hatları kurulmadan önce her iki parametre de ampirik olarak optimize edilmelidir. 16HBE14o− hücre hattı, fonksiyonel sıkı bağlantılar oluşturduğu ve mukus ürettiği için hava yolu inflamasyonunu araştırmak amacıyla yaygın olarak kullanılan ölümsüzleştirilmiş bir insan bronşiyal epitel hücre hattıdır8,23. Raporlayıcı oluşturma için seçilen hücreler, fonksiyonel IL-4 ve IL-13 reseptörleri eksprese etmeli ve bozulmamış aşağı akış JAK–STAT sinyal yolunu korumalıdır24. Stabil raporlayıcı hatlar kurulmadan önce raporlayıcı konstrükt; sitokin stimülasyonuna yanıtın, yol spesifik inhibitörler tarafından baskılanmanın ve seçilen deney koşulları altında sitotoksik etkilerin yokluğunun doğrulanmasıyla valide edilmelidir. Bu validasyon adımları, raporlayıcı aktivitesindeki değişikliklerin spesifik olmayan hücresel stres yerine STAT6'ya bağımlı sinyalizasyonu doğru bir şekilde yansıttığından emin olmaya yardımcı olur.

Bu yöntemin bazı kısıtlamaları da göz önünde bulundurulmalıdır. Lentiviral vektörler konak genomuna rastgele entegre olur; bu durum, bazal raporlayıcı aktivitesinde, indüklenebilirlikte ve uzun süreli ekspresyon stabilitesinde klondan klona varyasyonlara yol açabilir. Ek olarak, analiz STAT6-yanıtlı bir promotörün aktivasyonunu ölçtüğü için, upstream reseptör aktivasyonunu veya downstream endojen sinyalizasyon olaylarını doğrudan değerlendirmez. Stabil raporlayıcı hücrelerin uzun süreli kültürü, epigenetik susturmaya veya transgen ekspresyonunda azalmaya da neden olabilir. Bu etkileri minimize etmek için, erken pasajlı ana hücre bankaları oluşturulmalı ve raporlayıcı yanıt verme kapasitesi, tanımlanmış bir pasaj aralığında periyodik olarak doğrulanmalıdır. Ayrıca, analiz henüz primer insan hava yolu epitelyal hücrelerinde veya tamamen otomatik bir yüksek kapasiteli tarama platformunda valide edilmemiştir. Son olarak, bu çalışmada değerlendirilen çevresel toksikantlar, kapsamlı bir kimyasal kütüphaneden ziyade bir kavram kanıtlama panelini temsil etmektedir.

Hava kirliliği, özellikle ince partikül madde (PM2.5), siyah karbon, inorganik tuzlar, polisiklik aromatik hidrokarbonlar ve ağır metaller dahil olmak üzere kimyasal ve fiziksel olarak çeşitli bileşenlerden oluşan karmaşık bir karışımdır12,13. Emisyon kaynaklarındaki ve atmosferik işlemlerdeki varyasyonlar, partikül kompozisyonunda önemli farklılıklar yaratarak farklı olumsuz sağlık sonuçlarına katkıda bulunabilir. Sonuç olarak, epidemiyolojik ve in vivo çalışmalarda alerjik yanıtardan sorumlu spesifik bileşenlerin belirlenmesi zor olmaya devam etmektedir. Çalışmada açıklanan STAT6 raporlayıcı testi; tekil hava yolu toksikantlarının, kaynağı belirlenmiş partikül madde ekstraktlarının veya kimyasal olarak tanımlanmış partikül fraksiyonlarının STAT6-modülatör aktivitesini taramak için pratik bir in vitro platform sunar. Bu protokol, mekanistik çalışmalar için aday toksikantların önceliklendirilmesini kolaylaştırabilir ve karmaşık hava kirliliği karışımlarının risk odaklı değerlendirmesini destekleyebilir.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Tayland Ulusal Araştırma Konseyi (NRCT) (Hibe No. N42A680388) tarafından desteklenmiştir ve bu araştırma projesi Mahidol Üniversitesi (Stratejik Araştırma Fonu: 2025) (Hibe No. 35) tarafından desteklenmektedir. Şekil 1 ve 2, BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur (Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200072Hücre ayrıştırma reaktifi
15 mL konik santrifüj tüpüCorningCLS430791Steril polipropilen santrifüj tüpü
16HBE14o- insan bronşiyal epitel hücre hattıDr. Nawiya Huipao (Prince of Songkla University, Tayland) ve Prof. Dr. Dieter C. Gruenert (University of California San Francisco, ABD) tarafından hediye edilmiştirRRID:CVCL_0112İnsan bronşiyal epitel hücre hattı (pasaj 35–40); mikoplazma içermediği onaylanmış olup farklılaşmış hava yolu epitel morfolojisini ve bariyer özelliklerini korumaktadır. Referans: Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47.
24 kuyucuklu şeffaf düz tabanlı doku kültürü işlem görmüş plakaCorning3527Hücre kültürü plakası
6 kuyucuklu şeffaf düz tabanlı doku kültürü işlem görmüş plakaCorning3516Hücre kültürü plakası
96 kuyucuklu şeffaf düz tabanlı polistiren doku kültürü işlem görmüş mikroplakaCorning3599Hücre canlılığı analizi plakası
96 kuyucuklu beyaz şeffaf tabanlı polistiren doku kültürü işlem görmüş mikroplakaCorning3610Lüminesans analizi plakası
AC-4-130 (STAT5 inhibitörü)MedChemExpressHY-124500Selektif STAT5 inhibitörü
AS1517499 (STAT6 inhibitörü)MedChemExpressHY-100614Selektif STAT6 inhibitörü
Benzo[b]fluorantheneAccuStandardH-128NPolisiklik aromatik hidrokarbon
Biyolojik güvenlik kabini, Sınıf IINuaireNU-543-400EAseptik hücre kültürü prosedürleri için
Kadmiyum klorür (CdCl2)Sigma202908Ağır metal bileşiği
Hücre sayım kiti-8 (CCK-8)MedChemExpressHY-K0301Hücre canlılığı analizi
Hücre kültürü flaskı, 25 cm² (T-25)Corning430639Doku kültürü flaskı
CO2 inkübatörüNuaireNU-5710E37 °C, %5 CO2, nemlendirilmiş atmosferde tutulmuştur
Dimetil sülfoksit (DMSO)SigmaD2650Çözücü (final konsantrasyon %0.1) ve kriyoprotektan (%10)
Fetal Bovin Serum (FBS)SigmaF7524Besiyeri takviyesi (%10) ve kriyoprezervasyon besiyeri (%10)
HemositometreBOECOBOE14Manuel hücre sayımı
Ters faz-kontrast ışık mikroskobuZEISSPrimovertHücre morfolojisi gözlemi
Lusiferaz analiz sistemi (ONE-Step)BPS Bioscience60690Lusiferaz reporter analizi
Cıva klorür (HgCl2)Sigma215465Ağır metal bileşiği
Mikroplaka okuyucuBioTekSynergy Neo2Gen5 yazılımı (v3.08.01) ile kontrol edilen multimod mikroplaka okuyucu/lüminometre. Absorbans, 15–20 s doğrusal sallama sonrası 650 nm referans ile 450 nm'de ölçülmüştür. Lüminesans, 20 s doğrusal sallama sonrası 120 dedektör kazancı kullanılarak uç nokta modunda ölçülmüştür.
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)Gibco11095-080Bazal kültür besiyeri
Nikel sülfat (NiSO4)Tokyo Chemical IndustryN1203Ağır metal bileşiği
Partikül madde (PM)National Institute of Standards and TechnologySRM 2975Partikül madde için standart referans materyal
Penisilin-streptomisin (100×)Gibco15140122Antibiyotik takviyesi (final konsantrasyon %1)
Fosfat tamponlu salin (PBS)Gibco18912014Yıkama tamponu
PolybreneSigmaTR-1003-GLentiviral transdüksiyon artırıcı
PuromisinMedChemExpressHY-B1743AStabil hücre seçimi için antibiyotik
Rekombinant insan IL-13Thermo Fisher ScientificA42526Stimülasyon için sitokin
Rekombinant insan IL-4Thermo Fisher ScientificA42602Stimülasyon için sitokin
STAT6 lusiferaz reporter lentivirusBPS Bioscience78799Lentiviral reporter konstrüktü; stok titresi 5 × 107 TU/mL
Stattic (STAT3 inhibitörü)MedChemExpressHY-13818Selektif STAT3 inhibitörü

Kaynaklar

  1. Organisation for Economic Co-operation and Development. The Economic Consequences of Outdoor Air Pollution. OECD Publishing; Paris; 2016.
  2. Thailand Pollution Control Department. Air Quality Assessments for Health and Environment Policies in Thailand. Thailand Pollution Control Department; Bangkok; 2018.
  3. Health Effects Institute. State of Global Air Report 2024. Available at: https://www.stateofglobalair.org/resources/report/state-global-air-report-2024
  4. State of Global Air. Trends in Air Quality and Health Impacts: Insights from Central, South, and Southeast Asia. 2025. Available at: https://www.stateofglobalair.org/
  5. Shi X. Acute effects of air pollution on human health in China: Evidence and prospects. China CDC Wkly. 2021;3(45):941-942.
  6. Tsai YG, et al. Long-term PM2.5 exposure impairs lung growth and increases airway inflammation in Taiwanese school children. ERJ Open Res. 2025;11(4).
  7. Walford HH, Doherty TA. STAT6 and lung inflammation. JAKSTAT. 2013;2(4):e25301.
  8. Moonwiriyakit A, et al. GPR120/FFAR4 stimulation attenuates airway remodeling and suppresses IL-4- and IL-13-induced airway epithelial injury via inhibition of STAT6 and Akt. Biomed Pharmacother. 2023;168:115774.
  9. Pelaia C, et al. Biological therapy of severe asthma with dupilumab, a dual receptor antagonist of interleukins 4 and 13. Vaccines (Basel). 2022;10(6).
  10. Yang Y, et al. Continuous exposure to PM2.5 exacerbates ovalbumin-induced asthma in mouse lung via the JAK-STAT6 signaling pathway. Adv Clin Exp Med. 2020;29(7):825-832.
  11. Li X, Huang L, Wang N, Yi H, Wang H. Sulfur dioxide exposure enhances Th2 inflammatory responses via activation of the STAT6 pathway in asthmatic mice. Toxicol Lett. 2018;285:43-50.
  12. Reiss R, et al. Evidence of health impacts of sulfate- and nitrate-containing particles in ambient air. Inhal Toxicol. 2007;19(5):419-449.
  13. Li R, et al. Key toxic components and sources affecting oxidative potential of atmospheric particulate matter using interpretable machine learning: Insights from fog episodes. J Hazard Mater. 2024;465:133175.
  14. Posimo JM, et al. Viability assays for cells in culture. J Vis Exp. 2014;(83):e50645.
  15. Baumlin-Schmid N, Salathe M, Fregien NL. Optimal lentivirus production and cell culture conditions necessary to successfully transduce primary human bronchial epithelial cells. J Vis Exp. 2016;(113).
  16. Nozeret K, Pernin A, Buddelmeijer N. Click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein N-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening. J Vis Exp. 2020;(159).
  17. Rolling C, Treton D, Pellegrini S, Galanaud P, Richard Y. IL-4 and IL-13 receptors share the γc chain and activate STAT6, STAT3, and STAT5 proteins in normal human B cells. FEBS Lett. 1996;393(1):53-56.
  18. Deimel LP, Li Z, Roy S, Ranasinghe C. STAT3 determines IL-4 signalling outcomes in naïve T cells. Sci Rep. 2021;11(1):10495.
  19. Wingelhofer B, et al. Pharmacologic inhibition of STAT5 in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2018;32(5):1135-1146.
  20. McMurray JS. A new small-molecule STAT3 inhibitor. Chem Biol. 2006;13(11):1123-1124.
  21. Chiba Y, Todoroki M, Nishida Y, Tanabe M, Misawa M. A novel STAT6 inhibitor, AS1517499, ameliorates antigen-induced bronchial hypercontractility in mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2009;41(5):516-524.
  22. Zhang X, et al. The immunogenetic landscape of allergic rhinitis: From cellular effectors to gene regulation and targeted therapies. Int J Biol Sci. 2026;22(3):1322-1345.
  23. Yu H, Li Q, Kolosov VP, Perelman JM, Zhou X. Interleukin-13 induces mucin 5AC production involving STAT6/SPDEF in human airway epithelial cells. Cell Commun Adhes. 2010;17(4-6):83-92.
  24. White SR, Martin LD, Stern R, Laxman B, Marroquin BA. Expression of IL-4/IL-13 receptors in differentiating human airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010;299(5):L681-L693.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hava Yolu Epitel HücreleriSTAT6 SinyaliLüsiferaz ReporterIL-4 StimülasyonuIL-13 StimülasyonuZ-Faktör AnaliziLentiviral Transdüksiyon

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.