Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bu protokol, deterjan aracılı bir zar proteini olan sitokrom bo3 ubiquinol oksidazın, PDMS-g-PEO'dan oluşan büyük unilamellar veziküllere dönüşmesini ve bunların füzyon-elektroformasyon yoluyla dev veziküllere dönüşmesini göstermektedir. Ortaya çıkan fonksiyonel polimer bazlı bölmeler, ileri biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için uygundur.
Amfifilik kopolimerlerden oluşan veziküller, tek başına veya fosfolipidlerle karıştırılmış olarak, geleneksel lipid veziküllerine kıyasla üstün mekanik ve kimyasal stabiliteler sunar. Bu da onları çekici bir şasi haline getirir; ilaç dağıtımı, tanısal biyosensör, yapay hücre inşası ve biyo-ilham mikro ve nanoreaktörler gibi belirli uygulamaları mümkün kılacak şekilde daha da geliştirilip genişletilebilir. Özellikle, membran proteininin dahil edilmesi yoluyla işlevselleştirme, bu uygulamaların çoğunda gereklidir. Burada, greft kopolimeri PDMS-g-PEO'dan deterjan aracılı yeniden yapılandırılma yoluyla membran protein-fonksiyonelleştirilmiş büyük unilameller veziküllerin (LUV) hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, bu büyük veziküllerin füzyon-elektroformasyon yaklaşımıyla dev unilamellar veziküllere (GUV) nasıl dönüştürülebileceğini açıklıyoruz. Protokol, membran proteinlerinin floresan etiketlenmesi, polimer ve hibrit LUV'ların hazırlanması, membran proteininin yeniden yapılandırılması, dinamik ışık saçılması (DLS) ile boyut dağılımı analizi, oksijen tüketimi ölçümleriyle protein aktivitesinin değerlendirilmesi, protein-fonksiyonel GUV'ların hazırlanması ve konfokal mikroskopi ile GUV'lerde protein yerleştirme ve proton pompalama aktivitesinin analizini kapsar. Temsil eden sonuçlar, polidispersite indeksi (PDI) 0.2'nin altında olan monodispers proteo-LUV'ların oluştuğunu ve çapı 5–35 μm arasında başarılı proteo-GUV üretimini göstermektedir. Protein aktivitesi, hem polimer LUV'larında (18,2 nmol/min/mL) hem de hibrit LUV'larda (26,9 nmol/min/mL) oksijen tüketimi ölçümleriyle doğrulanır. GUV'lara protein eklenmesi floresans yoğunluğuyla nicel olarak belirlenir; polimer GUV'lar için 20,6 ± 3,7 a.u., hibrit GUV'lar için ise 26,2 ± 5,0 a.u. verir. GUV'lerde kapsüllü pH-duyarlı boya ile izlenen proton pompalama aktivitesi, protein fonksiyonelliğiyle tutarlıdır ve içe doğru proton pompalama baskındır. Kopolimerin mekanik yumuşaklığı ve lipid benzeri çift katmanlı kalınlığı (~5,3 nm), verimli protein yerleştirilmesini ve işlevselliğin korunmasını destekler.
Amfifilik blok kopolimerler, sulu çözelti içinde kendiliğinden bir şekilde birleşerek membranlara dönüşebilir; membranlar kendiliğinden eğriler ve kapanarak polimersomlar (polimer vezikülleri) olarak bilinen küresel membran kaplı bölmeler oluşturur. Lipid zarlarına kıyasla, polimer bazlı bölmeler daha fazla kimyasal yönlülük ve geliştirilmiş kimyasal1 ile mekanikstabilite2 sunar; bu da ilaç dağıtımı, nano- ve mikroreaktörler ile dayanıklı yapay hücrelerin inşası gibi uygulamalar için oldukça cazip hale getirir. Hem bizim grubumuz hem de diğerleri, membran proteinleri eklenerek yapay orga....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
NOT: Bu protokol sırasında oluşan tüm tehlikeli kimyasal atıklar, kurumsal ve yerel düzenlemelere uygun olarak bertaraf edilmelidir.
1. Bio-Beads SM-2 için Hazırlık
NOT: Bio-Beads SM-2, deterjan adsorpsiyonundan önce koruyucuları ve organik kirleticileri gidermek için metanol ile önceden yıkanır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
E. coli sitokrom bo3 oksidaz, plazmid pETcyo'dan E. coli suşu C43 (DE3) ΔcyoABCDE'de eksprese edildi ve daha önce tarif edildiğigibi saflaştırıldı 29. Arıtılmış bo3 oksidaz, doğrudan yeniden yapılandırılma ve aktivite ölçümleri için kullanıldı ya da ATTO 643 (bu çalışma) veya diğer ATTOboyaları 1,15 gibi floresan boyalarla etiketlendi. ATTO 643 gibi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Polimersomlar ve polimer/lipid hibrit veziküller, geleneksel lipid veziküllerine kıyasla gelişmiş kimyasal ve mekanik kararlılık sergiler; bu da ilaç dağıtımı ve biyosensörlemeden nano- ve mikroreaktörler ile yapay hücrelere kadar çeşitli uygulamalar için oldukça cazip hale gelir. Ancak, ayırt edici membran mimarisi ve biyofiziksel özellikleri, lipid vezikülleri için optimize edilmiş protokollerin polimer bazlı sistemlere doğrudan aktarılmasınısıklıkla engeller 15.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarlar belirtmemektedir.
Bu araştırma, Dieter Schwarz Vakfı ve Max Planck Derneği iş birliği içinde desteklenen Max Planck Okulu Matter to Life kapsamında yürütülmüştür. Sitokrom bo3 oksidazın izolasyonu ve saflaştırılması için Claudia Bednarz'a, vezikül hazırlama ve mikroskopi konusundaki yardımları için ise Anne Christin Weinrich'e minnettarız.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| ÄKTA pure™ chromatography system | Cytiva | 29018224 | |
| 18:1 Liss Rhod PE | Avanti Research | 810150 | |
| 8 well chambered coverglass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | Sigma Aldrich | UFC5030 | |
| ATTO 643 NHS ester | ATTO-TEC | AD 643-31 | |
| Bio-Beads SM-2 | Bio-Rad | 1523920 | |
| Cholic acid-Na-salt (sodium cholate) | Serva | 361-09-1 | |
| Coenzyme Q1 | TargetMol | TGM-T19594 | |
| Confocal microscope STELLARIS 5 | Leica Microsystems | 603810 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Merck | 10197777001 | |
| Fine Tip Ultra Micro Pastette | Pastette | LW4243 | |
| HPTS (pyranine, 8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid, Trisodium Salt) | Sigma Aldrich | 6358-69-6 | |
| ITO-coated glass slides (25×75×1.1 mm, ≤20 Ohm/sq.) | pgo | CEC020S | |
| LAS X software | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Mini centrifuge MCF-2360 | LMS | 24572 | |
| Mini-extruder | Avanti Research | 610000 | |
| Oxytherm+P system | Hansatech Instruments | / | |
| Plasma cleaner (benchtop) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| Polycarbonate membranes 0.1 μm | Avanti Research | 610005 | |
| Press-to-seal silicone isolator (round, 20 mm diameter, 1 mm depth) | Grace Bio-Labs | 41161502 | |
| Silicone spacers (round, 24.2 mm outer diameter, 14.3 mm inner diameter, 1.8 mm depth) | laboratory-made, cut from silicone sheet | ||
| Soy PC (95%) | Avanti Research | 441601 | |
| Specord 50 PLUS spectrophotometer | Analytik Jena | 823-0200P-3 | |
| Superdex 200 10/300 GL column (column L × I.D. 30 cm × 10 mm) | Cytiva | 28-9909-44 | |
| Test tube shaker (2800 rpm) | IKA Lab Dancer | 3365000 | |
| Thermomixer comfort 5355 | Eppendorf | 5355000.011 | |
| Xiameter OFX-5329 (PDMS-g-PEO; MW 3000) | Dow Corning | 000000000004109892 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | ZEN3600 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu makale yayımlandı
Video yakında