Membran Protein-Fonksiyonelleştirilmiş Polimer ve Polimer/Lipid Hibriti Büyük ve Devasa Unilamellar Veziküllerin Hazırlanması

Nika Otrin; Chee Seng Man; Wenqi Huang; Kai Sundmacher; Lado Otrin

doi:10.3791/71699

Yöntem makalesi

Membran Protein-Fonksiyonelleştirilmiş Polimer ve Polimer/Lipid Hibriti Büyük ve Devasa Unilamellar Veziküllerin Hazırlanması

DOI:

10.3791/71699

⸱

7 Ağustos 2026

Nika Otrin¹ , Chee Seng Man¹^,² , Wenqi Huang¹ , Kai Sundmacher¹^,²^,³ , Lado Otrin¹

¹Process Systems Engineering, Max Planck Institute for Dynamics of Complex Technical Systems, ²Max Planck School Matter to Life, ³Process Systems Engineering, Otto von Guericke University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, deterjan aracılı bir zar proteini olan sitokrom bo3 ubiquinol oksidazın, PDMS-g-PEO'dan oluşan büyük unilamellar veziküllere dönüşmesini ve bunların füzyon-elektroformasyon yoluyla dev veziküllere dönüşmesini göstermektedir. Ortaya çıkan fonksiyonel polimer bazlı bölmeler, ileri biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için uygundur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amfifilik kopolimerlerden oluşan veziküller, tek başına veya fosfolipidlerle karıştırılmış olarak, geleneksel lipid veziküllerine kıyasla üstün mekanik ve kimyasal stabiliteler sunar. Bu da onları çekici bir şasi haline getirir; ilaç dağıtımı, tanısal biyosensör, yapay hücre inşası ve biyo-ilham mikro ve nanoreaktörler gibi belirli uygulamaları mümkün kılacak şekilde daha da geliştirilip genişletilebilir. Özellikle, membran proteininin dahil edilmesi yoluyla işlevselleştirme, bu uygulamaların çoğunda gereklidir. Burada, greft kopolimeri PDMS-g-PEO'dan deterjan aracılı yeniden yapılandırılma yoluyla membran protein-fonksiyonelleştirilmiş büyük unilameller veziküllerin (LUV) hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, bu büyük veziküllerin füzyon-elektroformasyon yaklaşımıyla dev unilamellar veziküllere (GUV) nasıl dönüştürülebileceğini açıklıyoruz. Protokol, membran proteinlerinin floresan etiketlenmesi, polimer ve hibrit LUV'ların hazırlanması, membran proteininin yeniden yapılandırılması, dinamik ışık saçılması (DLS) ile boyut dağılımı analizi, oksijen tüketimi ölçümleriyle protein aktivitesinin değerlendirilmesi, protein-fonksiyonel GUV'ların hazırlanması ve konfokal mikroskopi ile GUV'lerde protein yerleştirme ve proton pompalama aktivitesinin analizini kapsar. Temsil eden sonuçlar, polidispersite indeksi (PDI) 0.2'nin altında olan monodispers proteo-LUV'ların oluştuğunu ve çapı 5–35 μm arasında başarılı proteo-GUV üretimini göstermektedir. Protein aktivitesi, hem polimer LUV'larında (18,2 nmol/min/mL) hem de hibrit LUV'larda (26,9 nmol/min/mL) oksijen tüketimi ölçümleriyle doğrulanır. GUV'lara protein eklenmesi floresans yoğunluğuyla nicel olarak belirlenir; polimer GUV'lar için 20,6 ± 3,7 a.u., hibrit GUV'lar için ise 26,2 ± 5,0 a.u. verir. GUV'lerde kapsüllü pH-duyarlı boya ile izlenen proton pompalama aktivitesi, protein fonksiyonelliğiyle tutarlıdır ve içe doğru proton pompalama baskındır. Kopolimerin mekanik yumuşaklığı ve lipid benzeri çift katmanlı kalınlığı (~5,3 nm), verimli protein yerleştirilmesini ve işlevselliğin korunmasını destekler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amfifilik blok kopolimerler, sulu çözelti içinde kendiliğinden bir şekilde birleşerek membranlara dönüşebilir; membranlar kendiliğinden eğriler ve kapanarak polimersomlar (polimer vezikülleri) olarak bilinen küresel membran kaplı bölmeler oluşturur. Lipid zarlarına kıyasla, polimer bazlı bölmeler daha fazla kimyasal yönlülük ve geliştirilmiş kimyasal¹ ile mekanik^stabilite2 sunar; bu da ilaç dağıtımı, nano- ve mikroreaktörler ile dayanıklı yapay hücrelerin inşası gibi uygulamalar için oldukça cazip hale getirir. Hem bizim grubumuz hem de diğerleri, membran proteinleri eklenerek yapay organeller ve hücreler oluşturmak için polimer zarlarını^{işlevselleştirmiştir} 1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Poli(dimetilsiloksan) (PDMS) hidrofobik çekirdek içeren polimerler, yüksek zincir esnekliği ve membran hidrofobik kalınlığını proteinin transmembran^{domainine daha iyi uydurma imkanı} sayesinde membran proteini dahil etmek için özellikle uygundur 5. Laboratuvarımız ağırlıklı olarak greft kopolimeri poli(dimetilsiloksan)-greft-poli(etilen oksit) (PDMS-g-PEO) üzerine yoğunlaşmış olsa da, bu polimer, geleneksel lipid çift katmanlarından daha yumuşak ve yaklaşık 5,3 nm¹ kalınlığa sahip yüksek dinamik^{membranlar 4,16,17} oluştururken, diğer gruplar PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA⁵ gibi PDMS tabanlı triblok kopolimerleri başarıyla kullanmıştır^,6,7,8,9,10,11 ve PEtOz-b-PDMS-b-PEtOz¹² membran proteini yeniden yapılandırılması için. Özellikle lipidlerle karıştırılmış hibrit sistemlerde PBD-b-PEO gibi nispeten sert diblok kopolimerler bile, başarılı protein^{inkorporasyonu için kullanılmıştır 13}. Bu örnekler, polimer bazlı zarların yeniden yapılandırılma platformları olarak çok yönlülüğünü vurgular; bu da entegre zar proteinleri için geliştirilmiş kimyasal stabilite^/14 ve uzun fonksiyonel ömür¹⁴ sağlayabilir. Polimer/lipid hibrit zarlar her zaman saf polimer sistemlerinin kimyasal stabilitesine^{uymasa da}, polimerlerin mekanik dayanıklılığını lipidlerin biyolojik önemiyle birleştirerek cazip bir uzlaşma sunarlar. Bu, doğal biyolojik zarları daha yakından taklit eden ve sentetik malzemelerin temel avantajlarını koruyan bir zar ortamı ortaya çıkarır. Bu tür hibrit mimariler, nano ölçekli yeniden düzenleme^1'den kaynaklanan proton geçirgenliğinin azalması ve membran¹⁵ içinde alan oluşumu gibi ek avantajlar da sağlayabilir.

Membran proteinlerinin nanoboyutlu veziküllere (LUV) yeniden yapılandırılması için organik çözücü aracılı yeniden yapılandırma (örneğin, ters faz buharlaştırma, lipid-protein filmlerinin yeniden hidratlanması), mekanik yaklaşımlar (örneğin, sonikasyon, pres, dondurma-eritme) ve deterjan aracılı yeniden yapılandırma (deterjan çıkarma, seyreltme veya doğrudan inkorporasyon yoluyla)¹⁸ ve stiren-maleik asit kopolimer nanodisklerden doğrudan transfer gibi daha yeni stratejiler yer alır¹⁹. Porinler, örneğin rehidrasyon sırasında polimer filmine protein eklenerek doğrudan yerleştirilerek polimer LUV'lara başarıyla^{dahil edilmiştir 8}. Bu yaklaşım genellikle daha büyük veya daha karmaşık membran proteinleri için düşük yerleştirme verimliliğine yol açar ve genellikle rastgele protein yönelimine yol açar. Sonuç olarak, deterjan aracılı yeniden yapılandırma, kontrollü deterjan eklenip ardından çıkarılmasını içerir ve en yaygın yöntem olarak kalır. Ayrıca, özellikle kontrollü yönelimin işlev için kritik olduğu asimetrik proteinler için, polimer bazlı LUV'lara daha büyük zar proteinlerinin dahil edilmesinde tercih edilen stratejidir. Bu yaklaşımda, vezikül membranları önce tercih edilen deterjanla doyurulur (doygun deterjan konsantrasyonu R_satu olarak gösterilir), kısmen çözünür (veziküller ve misellerin birlikte var olması) veya tamamen çözünür, yani misellere parçalanır (deterjan konsantrasyonu R_sol olarak gösterilir). Bu ilk zar tedavisi ardından protein ekleme, kuluçka ve deterjan^{çıkarımı yapılır.} İkincisi, diyaliz, boyut dışlama kromatografisi veya hidrofobik polistiren boncuklara adsorpsiyon yoluyla (örneğin, Biyo-Boncuklar) sağlanabilir. Deterjan seçimi, konsantrasyonu ve çıkarma yöntemi, her membran tipi ve protein için optimize edilmiştir; böylece inişleme verimliliği en üst düzeye çıkarılır ve protein^{yönelimi kontrol edilir 20}.

LUV'lar toplu aktivite ölçümleri için oldukça uygun olsa da, tek vezikül çalışmaları ve optik mikroskopi tabanlı analizler zar proteinlerinin dev unilamellar veziküllere (GUV) yeniden oluşturulmasını gerektirir. GUV'lara protein dahil etmek için beş ana yaklaşım kullanılır: protein ve organik çözücü²¹ varlığında birlikte oluşum, deterjan²² varlığında birlikte oluşum, önceden oluşturulmuş GUV'lara deterjan^{seyreltme 23} ile yerleştirme, proteo-LUV'lar^16,24 ile membran füzyonu ile yerleştirme ve füzyon-elektroformasyon²⁵. Bu yaklaşımlar lipid GUV'lara başarıyla uygulanmış olsa da, polimer veya polimer/lipid hibrit GUV'lara transferi genellikle zordur. Özellikle, birlikte oluşum ve deterjan seyreltme yöntemleri, polimer membranlarında düşük yerleştirme verimliliğine yol açar veya bazı polimer bileşimleriyle uyumsuz^{olur 15}. Ek fuzojenik ajanlara dayanan füzyon tabanlı^stratejiler 4,16,24,26,27 de sorunlu olabilir; çünkü sentetik katyonik lipidler/polimerler veya fuzojenik peptitler zar protein stabilitesini zayıflatabilir, membran özelliklerini değiştirebilir veya hedef proteinin dahil etme verimliliğini azaltabilir. Füzyon elektroformasyonu, bu sınırlamaların çoğunu aşar ve membran proteinlerini polimer ile polimer/lipid hibrit GUV'lara entegre etmek için sağlam ve verimli bir yöntem^{olduğunu kanıtlamıştır} ^1,5,15. Bu yaklaşım, zar bütünlüğünü ve protein işlevselliğini korurken kontrollü protein dahil edilmesini sağlar ve özellikle proteinle işlevselleştirilmiş polimer GUV'ların üretimi için uygundur.

Proton pompalarının polimer bazlı veziküllere yeniden oluşturulması, dayanıklı yapay hücrelerin inşası için gereklidir; çünkü bu, canlı sistemlerin temel enerji para birimi olan transmembran proton gradyanlarının üretilmesini sağlar. Kontrollü minimal bir zar ortamında kemiosmotik enerji^{dönüşümü yeniden yaratarak 28}, bu veziküller ATP sentezini, aktif taşınımı ve metabolik reaksiyonları yönlendirebilir ve otonom, yaşam benzeri işlevsellik için gerekli enerjik temeli oluşturur. Bu tür sistemlerde kullanılan temsilci proton pompası, E. coli'den alınan sitokrom bo₃oksidazdır; bu terminal solunum enzimi oksijen indirgemesini membran boyunca proton translokasyonuna bağlayır. Elektron transferi ve proton pompalaması sıkı bağlantılı olduğundan, sentetik veziküllerdeki aktiviteleri ya oksijen tüketimi ^1,20 ile ya da proton gradyanı^{oluşumu 1} takip ederek nicel olarak izlenebilir.

Bu protokolde, saf polimer ve polimer/lipid hibrit zarları içeren PDMS-g-PEO tabanlı LUV'ların hazırlanması, bunların membran proteinleriyle işlevselleştirilmesi, GUV'lara ölçeklendirilmesi ve yeniden oluşturulmuş proton pompası sitokrom _{bo 3} oksidazın hem toplu oksijen tüketimi testleri hem de tek vezikül proton pompalama ölçümleriyle aktivite ölçümleri dahil olmak üzere ayrıntılı bir iş akışı sunuyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol sırasında oluşan tüm tehlikeli kimyasal atıklar, kurumsal ve yerel düzenlemelere uygun olarak bertaraf edilmelidir.

1. Bio-Beads SM-2 için Hazırlık

NOT: Bio-Beads SM-2, deterjan adsorpsiyonundan önce koruyucuları ve organik kirleticileri gidermek için metanol ile önceden yıkanır.

Filtre kağıdını temiz bir cam beğen veya şişe üzerine yerleştirilmiş cam huni içine yerleştirin.
Huniye en az 600 mg Bio-Beads SM-2 ekleyin (hem hibrit hem de polimer LUV'lar için 3 tekrar yapılması için yeterli).
NOT: Yeniden yapılandırılması için en az 90 mg Bio-Beads SM-2 gereklidir, bu da 4.4.1'de belirtildiği gibi. Daha fazla yeniden yapılandırma planlanırsa daha büyük bir miktar hazırlanabilir.
Boncukları saf metanolle üç kez yıkayın, her seferinde boncukları tamamen batıracak kadar hacim kullanın.
DIKKAT: Tüm metanolü işleme adımlarını kimyasal bir buhar davlumbazında yapın.
Boncukları hemen Milli-Q suyla üç kez yıkayarak kalan metanolü giderin.
NOT: Yıkama işlemi sırasında boncukların kurumasına izin vermeyin. Yıkama çözeltilerini çıkarırken, boncukların nemli kalmasını ve tamamen kurumasına izin verilmemesini sağlayın.
Yıkanmış boncukları uygun bir saklama kabına (örneğin, steril 50 mL polipropilen santrifüj tüpü veya sıkı kapalı cam şişe) aktarın, boncuklar tamamen suya batana kadar Milli-Q su ekleyin ve 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.

2. Membran proteinlerinin floresans etiketlenmesi

Protein seyreltme
1. Sitokrom bo₃ oksidazı, %0,05 n-dodesil β-D-maltozid (DDM) (w/v), pH 8,3 içeren 20 mM HEPES tamponu içinde 2,2 mg/mL olarak çözün. Bu pH, etkili etiketleme için yeterli protonlanmamış (reaktif) birincil aminler oranını sağlar.
  NOT: ATTO N-hidroksisuçsinimidil (NHS) boyalarıyla optimal etiketleme için, tampon pH'ı 8.3 ile 8.5 arasında tutun. Diğer boyalar için, önerilen etiketleme koşulları dahil olmak üzere üreticinin protein konjugasyonu talimatlarını takip edin.
Boya ekleme
1. Protein çözeltisine 2 mg/mL ile susuz DMSO'da çözünmüş amin-reaktif ATTO 643 N-hidroksisuçinimil (NHS) esterin sekiz kat molar fazlasını ekleyin.
  NOT: Diğer boyalar için, önerilen boya-protein azı dişi fazlalığı dahil olmak üzere protein konjugasyonu için üreticinin talimatlarına uyun.
2. Boyanın homojen dağılımını sağlamak için mikrosantrifüj tüpünü üç kez hafifçe karıştırın.
Kuluçka
1. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında (20–25 °C) hafif çalkalama (250 rpm) altında termomikserde, karanlıkta fotoağartmayı önlemek için kuluçka edin.
Bağlanmamış boyanın çıkarılması
1. Superdex 200 10/300 GL kolonunu (CV: 23.562 mL) en az 2 kolon hacmi (yaklaşık 48 mL) membran protein ülüsyon tamponu (20 mM HEPES, pH 7.5, 200 mM KCl, %0.05 DDM (w/v)) ile 0.3 mL/dakika akış hızında ÄKTA arıtma sistemi kullanılarak dengelendirin.
  NOT: Fazla floresan boyanın giderilmesi için, özellikle daha az hidrofilik boyalar için genellikle daha kısa jel filtrasyon kolonları (10–20 cm yatak uzunluğu) yeterlidir. Boya üreticisi, tuzdan arındırmanın Sephadex G-25 matrisi kullanılarak yapılmasını önerir. Bu çalışmada cihazın kullanılabilirliği nedeniyle Superdex 200 10/300 GL sütunu kullanıldı.
2. 1 mL kapiler döngü kullanarak etiketlenmiş proteinden 500 μL'ye kadar yükleyin ve aynı tamponla 0,3 mL/dakika hızla elüasyon yapın.
3. Protein için 280 nm ve ATTO 643 boyası için 643 nm absorbans ölçümleriyle elüsyonu izleyin.
4. 1.5 sütun hacminde 0.5 mL fraksiyonları toplayın. Hem protein hem de boya içeren fraksiyonları tespit edin. Yeterince yoğunlaşmışsa doğrudan kullanın veya Amicon santrifüj filtre üniteleriyle konsantre yapın. Amicon filtreleri kullanılarak santrasyon için, 30 kDa moleküler ağırlık kesimiyle santrifüj filtresi kullanın ve 14.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın.
Protein konsantrasyonu ve etiketleme derecesinin (DOL) belirlenmesi
1. Saflaştırılmış eşgenin emilimcilik spektrumlarını ölç.
2. Protein konsantrasyonunu ve enzim başına ortalama boya molekülü sayısını şu yöntemlerle hesaplayın:
  
  burada _{A max}, boya emilimi maksimumunda (λ_abs; ATTO 643, λ = 643 nm), A_{280 280} nm'de (proteinlerin emilimi maksimumu) absorbanstır, ε_prot ise denatüre edilmiş sitokrom bo₃ oksidazın azı dolar sönme katsayısıdır (184.720 M⁻¹cm⁻¹), ε_boya boyanın azı dişleri sönme katsayısıdır (150.000 M⁻¹cm⁻¹), CF₂₈₀ ise ATTO 643 absorbansı için 280 nm (0.04) düzeltme faktörüdür.

3. Büyük unilamellar veziküllerin (LUV) hazırlanması

İnce polimer veya polimer/lipid filminin hazırlanması
1. Kloroform:metanolde (2:1, v/v) çözünmüş polimer, lipid ve floresan boya çözeltilerini, Tablo 1'de listelenen bileşimlere göre temiz cam şişeye dönüştürmek için solvent dirençli uçlu pozitif yer değiştirme pipetleri veya gaz geçirmez cam şırıngalar kullanın.
  DIKKAT: Tüm solvent kullanımını koruyucu eldiven ve koruyucu gözlük takarak buhar kaputu altında yapın.
2. Çözeltiyi iyice karıştırın; şişe dik tutularak homojenliği sağlanır.
  DIKKAT: Girdap hızını dikkatlice ayarlayın ki sıvı şişeden ellerinize sıçrama veya fışkırmasın.
3. Organik çözücüleri duman başlıkta hafif bir azot akışı altında yaklaşık 1 saat buharlaştırın, ta ki şişe duvarında eşit bir ince bir film oluşana kadar (Şekil 1).
  NOT: Azot akışını sıvının sıçramadan nazikçe hareket etmesi için ayarlayın; Çok yüksek bir akış düzensiz film oluşumuna neden olabilir. 5–10 dakika sonra, vezikül karışımının tam kuruması ve şişe tabanı boyunca eşit şekilde yayılmasını sağlamak için akış biraz artırılabilir.
Film rehidrasyonu
1. Kurutulmuş filmi 1 mL rehidrasyon tamponu (1 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM sukroz) ile yeniden hidratlayın, böylece nihai amfifil konsantrasyonu 5 mg/mL elde edilir (polimersomlar için 1,67 mM, hibrit veziküller için 2,14 mM denk gelir). Polimerzomlar yeniden yapılandırılıyorsa, rehidrasyon tamponu %0,1 sodyum kolat ile takviye edilsin.
  DIKKAT: Sodyum kolat hafif bir tahriş edicidir. Uzun süreli cilt temasından ve pudra solumaktan kaçının. Üreticinin güvenlik veri formuna (SDS) göre tutuyor.
2. Filmin tamamen ayrılıp askıya alınmasına kadar güçlü bir girdap devam eder ve çok lamellar veziküller (MLV) oluşturur.
Donma–erime döngüleri (sadece hibrit veziküller)
1. Hibrit MLV süspansiyonlarını beş donma–erime döngüsüne şu şekilde tabi tutuyor: örnekleri sıvı azotta 1 dakika dondurun, 35 °C su banyosunda tamamen eriyene kadar eritin ve 2500–3000 rpm'de 30 saniye boyunca bir tüp silkeleyici ile girdabda kalın. Bu işlemi toplamda beş döngü boyunca tekrarlayın.
  NOT: Saf polimersomlar için bu adımı atlayın.
  DIKKAT: Sıvı azot (−196 °C) şiddetli kriyojenik yanıklara neden olabilir. İyi havalandırılan bir alanda uygun PPE (kriyojenik eldivenler, güvenlik gözlüğü ve laboratuvar önlüğü) giyerek tutun. Cilt ve gözlerle temas kurmaktan kaçının.
Ekstrüzyon
1. Vezikül süspansiyonunu, 100 nm gözenek boyutunda polikarbonat membranla donatılmış bir mini ekstrudere aktarın.
2. Süspansiyonu 21 kez ekstrüze ederek boyut homojen LUV'lar elde edilir.
  NOT: Son ekstrüzyon adımının LUV süspansiyonunu enjektörde ilk yükleme şırıngasının tersi olarak bıraktığından emin olun. Bu, nihai numunenin daha büyük veziküller veya membrandan tam geçmemiş olabilecek kalıntı malzemelerle kontaminasyonunu en aza indirir.
Depolama
1. LUV süspansiyonunu 4 °C'de saklayıp bir hafta içinde kullanarak vezikül boyut dağılımını koruyabilir ve sukroz içeren tamponda toplanmayı veya mikrobiyal büyümeyi önler.
2. Kullanmadan önce, LUV süspansiyonunu girdabla nazikçe homojenleştirin.

4. Zar proteininin LUV'lara yeniden yapılandırılması

Veziküllerin deterjanla ön muamelesi
1. 200 μL LUV 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın (Şekil 1). Hibrit LUV kullanıyorsanız, %0,1 (w/v) deterjan konsantrasyonu elde etmek için %20 (w/v) sodyum kolat 1 μL ekleyin. Polimer LUV kullanılıyorsa, sodyum kolat zaten mevcut olduğu için ek deterjana gerek yoktur.
  NOT: Deterjan stokunu deneylerde kullanılan aynı tamponda hazırlayın, veziküllerle uyumluluk sağlansın.
2. Mikrosantrifüj tüpünü hafifçe üç kez hafifçe vurarak nazikçe karıştırın. Yoğun çaltlaşma veya girdap oluşmaktan kaçının; bunlar köpük oluşturabilir ve hava kabarcıkları oluşturabilir.
Deterjanla işlenmiş veziküllere proteinin tanıtımı
1. Deterjanla dengesizleştirilmiş veziküllere sitokrom bo₃ oksidaz (aktivite ölçümleri için) veya sitokrom bo₃ oksidaz–ATTO 643 (floresans görüntüleme için) ekleyerek aşağıdaki nihai protein konsantrasyonlarını elde edinin: polimersomlar için LUV deneyleri için 0,556 μM ve GUV deneyleri için 1,112 μM; hibrit veziküller için LUV deneyleri için 0,714 μM, GUV deneyleri için ise 1,428 μM.
  NOT: Bu konsantrasyonlar, LUV'lar için protein-polimer azı dişleri oranı 1:3.000, GUV'lar için ise 1:1.500 olarak karşılık gelir.
2. Proteini yavaşça ekleyin, nazikçe karıştırarak çözeltiye eşit şekilde dağıtmak ve yerel aşırı yoğunluğu önlemek amacıyla.
  NOT: Protein stoklarındaki konsantrasyon farklılıkları nedeniyle eklenen protein hacmi fraksiyonlar arasında değişebilir.
Protein–deterjan–polimer komplekslerinin montajı
1. Karışımı 4 °C'de hafif bir çalkalama (400 rpm) ile termomikserde 30 dakika kuluçka edin; böylece deterjan çıkarılmadan önce karışım protein–deterjan-polimer yığımları oluşmasını sağlar.
Deterjan çıkarımı
1. Deterjanı sıralı olarak Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad) ekleyerek çıkarın. Depolama çözeltisinden 30 mg Bio-Beads çıkarın, nemli kalmasını (ıslak ama fazla sıvı olmadan) emin olun. Boncukları numuneye ekleyin ve termomikserde 600 rpm'de hafif çalkalayarak 4 °C'de 30 dakika kuluçka yapın. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın, toplamda 90 mg Bio-Beads ve toplam kuluçka süresi 1,5 saat olur.
  NOT: Sadece tamamen nemlendirilmiş biyo-boncuklar kullanın. Kuru boncukları, Bio-Beads stok tüpünün duvarlarına yapışan boncukları veya yüzeyde yüzen boncukları aktarmayın. Eğer boncuklar, eklemeden sonra sıvı seviyesinin üzerinde yeniden yapılandırma reaksiyon tüpünün duvarına yapışırsa, tüpü kısa süreliğine santrifüjle (örneğin, tezgah üstü minisantrifüjde 3–5 saniye) ve inkubasyondan önce alt kısımda boncuklar toplanacaktır.
2. Bio-Beads'i 2.000 × g seviyesinde 2 dakika boyunca bir tezgah üstü mini santrifüj kullanarak pellet yapın. Boncuk pelletini rahatsız etmeden üst yüzeyi dikkatlice toplayın.
  NOT: Santrifüjasyona alternatif olarak, boncukların yerçekimiyle yaklaşık 5 dakika çökmesine izin verin, ardından süpernatantı dikkatlice çıkarın.
Depolama
1. Yeniden oluşturulmuş _bo 3-LUV'ları 4 °C'de saklayıp aynı gün protein aktivite ölçümleri için kullanın.

5. Dinamik ışık saçılması (DLS) ile LUV'lerin boyutu ve dağılımı

DLS ölçümleri için LUV'lerin yüklenmesi
1. 45 μL seyreltilmemiş LUV veya proteo-LUV süspansiyonunu temiz bir kuvars küvetine aktarın. Cuvette'in toz, parmak izi veya diğer kalıntılardan arınmış olduğundan emin olun, böylece ışık saçma artefaktları en aza indirilebilir.
  NOT: Hava kabarcıklarını oluşturmaktan kaçının, çünkü bunlar DLS ölçümlerini etkileyebilir. Kabarcıkları önlemek için, örneği küvet duvarı boyunca yavaşça pipetleyin ve son damlayı kuvvetle dışarı atmayın. Küçük baloncuklar oluşursa, ölçümden önce yükselip dağılmasına izin verin.
LUV boyutu ve dağılımın DLS ile belirlenmesi
1. Hidrodinamik çapı ve polidispersite indeksini (PDI) 633 nm helyum-neon lazeri ile donatılmış bir DLS cihazı ve sabit 173° açıda geri saçılma algısı ile ölçün.
2. Tekrarlanabilirliği sağlamak için her örnek başına en az üç bağımsız ölçüm yapın.
3. Verileri genel amaçlı (normal dağılım) modeli kullanarak analiz ederek ortalama boyut ve PDI elde edin.

6. LUV'lerin oksijen tüketimi analizi

Sıcaklık kurulumu
1. Clark tipi oksijen elektrot sisteminin ölçüm odasını 22 °C'ye ayarlayın ve sistemin dengelenmesine izin verin.
Buffer eklenmesi
1. Ölçüm odasına 1 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM sukroz tamponu ekleyerek toplam hacmi 1.000 μL olur. Tampon hacmini örnek tipine göre ayarlayın: polimer _bo 3-LUV'lar için 942,9 μL ve hibrit _bo 3-LUV'lar için 953,7 μL.
  NOT: Kalan hacim, nihai ölçüm hacmine ulaşmak için LUV'lar ve DTT/Q₁ karışımı tarafından işgal edilecektir.
LUV'lerin eklenmesi
1. Ölçüm odasına iki_3-LUV ekleyin ve manyetik karıştırıcı ile 100 devir/dakika ve 22 °C'de nazik karıştırmaya başlayın. Bo 3-LUV'ların hacmini yaklaşık 27 nM teorik bo₃ oksidaz konsantrasyonuna ulaşmak için ayarlayın: polimer bo 3-LUV'lar için 48,6 μL ve hibrit _{bo 3-LUV'lar} için 37,8 μL.
  NOT: Negatif kontrol için, bo 3-LUV'ları aynı lipid/polimer bileşimi ve konsantrasyona sahip eşdeğer hacimde proteinsiz LUV'larla değiştirin. Sonraki tüm adımlar aynı kalır.
Temel ölçüm
1. Oksijen konsantrasyonunun stabil olmasına izin verin ve 22 °C'de sabit karıştırma altında 3 dakika boyunca ölçümün ki stabil bir baz çizgisi elde edin.
İngulayıcı/kinon karışımının hazırlanması
1. DTT/Q₁ karışımını kullanımdan hemen önce taze hazırlayın; 9.6 μL 1 M DTT'yi Milli-Q suda, 0.6 μL 80 mM ubiquinone-1 (Q₁) ile DMSO'da karıştırın, ardından homojenliği sağlamak için iyice girdabla karıştırın.
Enzim aktivasyonu
1. Bo ₃ oksidazı, ölçüm odasına taze hazırlanmış DTT/Q₁ karışımından 8,5 μL eklenerek aktive edilir; böylece nihai konsantrasyonlar 8 mM DTT ve 40 μM Q₁ olur.
Çoğaltmalar
1. Tekrarlanabilirliği sağlamak için her örneği üç kez ölçün.
Veri analizi
1. Oksijen konsantrasyonunu zamanla karşılaştırın. Eğrinin doğrusal kısmının eğimini belirleyin; bu da oksijen tüketim oranına karşılık gelir.
Raporlama
1. Oksijen tüketim oranını üç ölçümün ortalaması olarak, standart sapma ile bildirin.

7. Protein-fonksiyonel GUV'ların hazırlanması

ITO kaplı cam slaytların plazma temizliği
1. İndiyüm kalay oksit (ITO) kaplı cam slaytları plazma temizleyiciye iletken (ITO kaplamalı) tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Plazma, onları yüksek güç ayarında ("HI") (230 V, maksimum RF gücü 18 W) ve yaklaşık 0,5 mbar basınçta 1 dakika boyunca temizler.
  NOT: Başarılı plazma ateşlenmesi, odanın içinde pembe/mor bir parıltının ortaya çıkmasıyla görsel olarak doğrulanabilir.
Proteo-LUV'ların kısmi susuzluğu
1. 20 μL proteinsiz LUV'ları, yeniden oluşturulmuş bo₃ oksidaz-ATTO 643 içeren 20 μL proteo-LUV ile karıştırın. Homojen karışımı sağlamak için nazikçe girdabla yapın.
2. Ortaya çıkan 5 mg/mL LUV/proteo-LUV süspansiyonunun yedi 2 μL damlasını elektroformasyon için kullanılan her slaytın iletken (ITO kaplı) yüzeyine bırakın (Şekil 2A). Damlacıkları 160,6 mm² yüzey boyunca eşit şekilde dağıtın, böylece film oluşmasını sağlamak için ayrı tutulur.
  NOT: Diğer polimer sistemlerde LUV konsantrasyonu ve damla hacmi optimizasyon gerektirebilir (tipik aralık: 5–100 mg/mL LUV; 0.2–2 μL damlacıklar).
3. Damlacıkların oda sıcaklığında (∼22 °C) ve ∼20% nemde yaklaşık 40 dakika veya damlanın çevresinde beyaz bir halka oluşana kadar kısmen kurutmasına izin verin (Şekil 2B).
  NOT: Susuzluk ortam nemine bağlıdır. Göreceli nem %40'ın üzerindeyse, dehidrasyon süresi gerektiğinde uzatılır (20 dakikaya kadar). Sabit bir zamana değil, damlanın çevresinde beyaz bir halkanın görünümüne göre uç noktayı belirleyin. Tutarlı çevresel koşullarda (sıcaklık ve nem), gerekli dehidrasyon süresi tekrarlanabilir. Aşırı kurumadan kaçının; bu tamamen düz, eşit beyaz damlacıklar olarak görülür, çünkü bu protein çökelmesine neden olabilir.
Elektroformasyon odasının montajı
1. Elektroformasyon odası, doldurma ve toplama sırasında tamponun eklenip çıkarılmasına olanak tanıyan 1,81 mm kalınlığında bir silikon ara parça ile birbirine yerleştirilerek (kaplı yanlar içe bakan) iki ITO kaplamalı slayt ile birleştirin.
2. Odayı rehidrasyon tamponu ile doldurun (1 mM Tris-HCl, pH 7.5; 200 mM sakaroz).
  pH hassasiyetli deneyler için, tampona 10 μM piranin (8-hidroksipiren-1,3,6-trisülfonik asit trisodyum tuzu, HPTS) eklenin.
Elektroformasyon
1. Aşağıdaki programı kullanarak sinüzoidal alternatif elektrik alanı uygulanır: 50 Hz, 50, 100, 200, 300, 500, 700 ve 900 mV, her biri 6 dakika süre; 50 Hz, 1.1 V'da 2 saat için.
  NOT: Daha büyük proteo-GUV'ların oluşumunu teşvik etmek için bu adım 12 saat ve ayrılma aşaması için 2 V'da 30 dakika boyunca 4 Hz'e kadar uzatılabilir. Tamponda 10 μM piranin bulunduğunda, ilk iki voltaj artırma adımında frekansı 500 Hz'e çıkarın.
GUV Koleksiyonu
1. Hazneyi cımbızla dikkatlice açın ve mekanik stresi en aza indirmek için FineTip Ultra-Micro Pastette pipetleri (veya eşdeğer düşük kesme transfer pipetleri) ile GUV'ları toplayın.
  NOT: 200 μL'nin altındaki standart düşük hacimli pipet uçlarını kullanmaktan kaçının, çünkü bunlar daha büyük GUV'ları patlatabilir. Alternatif olarak, standart uçlar açılışı genişletmek ve toplama sırasında kesmeyi azaltmak için kesilebilir.
Depolama
1. Proteo-GUV'ları 4 °C'de depolayın ve protein aktivitesini korumak için 48 saat içinde kullanın.
  NOT: Aktivite kaybı oranı, yeniden oluşturulmuş membran proteininin türü ve stabilitesi ile zarın bileşimine bağlıdır.

8. Protein-fonksiyonel GUV'ların mikroskopisi

Mikroskop kurulumu
1. Konfokal mikroskobu aç. Leica sistemi kullanıyorsanız, LAS X yazılımını başlatın. Diğer mikroskop markaları için üreticinin önerdiği satın alma yazılımını kullanın.
2. 63× yağ batdırma hedefi (NA 1.40) seçin; gerekirse GUV boyutuna bağlı olarak daha yüksek veya daha düşük büyütme ayarlayabilirsiniz.
3. Floroforlara karşılık gelen iki görüntüleme kanalını açın: Rhodamine Red (membran) ve ATTO 643 (yeniden oluşturulmuş protein).
  NOT: Kısmen örtüşen spektrumlara sahip floroforlar için, spektral çapraz konuşmayı en aza indirmek için uygun lazer çizgileri ve dar algılama pencereleri seçin. Sinyalin sızmasını önlemek ve doğru floresans ölçüsünü sağlamak için her kanalı sıralı olarak alın.
GUV'lerin sedimentasyonu
1. Temiz No. 1.5 cam kaplama (0.17 mm kalınlığında) üzerine pres-to-con silikon izolatör yerleştirin.
  NOT: Dik (ters olmayan) mikroskoplar için daha kalın cam slaytlar kullanılabilir.
2. 60 μL tampon (1 mM Tris-HCl, pH 7.5; 200 mM glikoz) aralığın ortasına pipet yapın.
3. Tamponun üstüne nazikçe 20 μL GUV süspansiyonu ekleyin.
4. Buharlaşmadan kaçınmak için hemen ikinci bir cam kapak sürgüsünü kullanarak kamerayı kapatın.
5. GUV'ların görüntülemeden önce ~5 dakika boyunca tortu birikmesine izin verin.
Görüntü edinimi
1. GUV'ların kesitlerini yakalamak için odanın altına odaklanın.
2. Temsilci bir popülasyon (~100 GUV) elde etmek için sistematik olarak üst soldan alt-sağ köşeye ("yılan" deseni) tarama yaparak odadaki farklı GUV'ların görüntülerini elde edinin. Tarama sırasında karşılaşılan tüm vezikülleri, boyut veya floresans yoğunluğu ne olursa olsun, ön seçim olmadan görüntüleyin; böylece seçim yanlılığını önler ve tekrarlanabilirlik sağlansın.
  NOT: Aynı GUV'nin tekrar görüntülenmesinden kaçının, böylece foto ağartmayı önleyin.
Görüntü analizi
1. Yeniden oluşturulmuş ATTO 643 etiketli proteinin floresans yoğunluğunu, bireysel GUV'ların membranı boyunca bir poliline çizerek niceliklerini ölçebilirsiniz. LAS X yazılımını kullanırken, Nicify → Line Profile seçin, ardından poliline aracını seçip her GUV'nin membranını takip edin. Ortalama floresans yoğunluğunu elde etmek için İstatistikleri açın ve ortalama değeri kaydedin. Sadece temiz, unilamellar GUV'ları analiz edin; çoklu vezikülleri ve agregat vezikülleri analizden hariç tutun.
  NOT: Ölçümler farklı günlerde alınırsa, floresan yoğunlukları lazer gücüne normalize edilmeli ve aynı görüntüleme ayarlarında (dalga boyu ve nominal güç) ölçülmelidir. Günlük lazer çıkışındaki değişimleri hesaba katmak için aşağıdaki normalleştirme uygulanır: , burada F_a.u. rastgele birimlerle ölçülen floresans yoğunluğudur, P_referansı referans gününde ölçülen lazer gücü ve alınma gününde ölçülen lazer gücüdür. Bu düzeltme, lazer gücü ile floresans yoğunluğu arasında doymayan aydınlatma koşullarında doğrusal bir ilişki varsayar. Mevcut çalışmada, tüm görüntüler aynı günde alındığı için normalizasyon gerekmemiştir.
2. Flüoresans yoğunluğunu ortalama 100 GUV olarak ve karşılık gelen standart sapma olarak bildirin.

9. Proteo-GUV'larda proton pompalama analizi

Mikroskop kurulumu
1. Konfokal mikroskobu açın ve uygun satın alma yazılımını (örneğin, Leica sistemleri için LAS X) başlatın.
2. 63× yağ daldırma hedefi (NA 1.40) seçin. GUV boyutuna bağlı olarak gerekirse daha yüksek veya daha düşük büyütme ayarlayın.
3. Floroforlara karşılık gelen üç görüntüleme kanalını yapılandırın. Rhodamine Red (membran belirteci) için 561 nm uyarılma ve 570–620 nm emisyon aralığı kullanın. Piranin (kapsüllenmiş pH-hassas boya) için, 448 nm ve 405 nm uyarımlar kullanın ve 499–551 nm aralığında emisyon toplayın.
  NOT: Eğer 458 nm lazer varsa, 448 nm yerine onu kullanarak deprotonlanmış (temel) piranin formunu uyarın.
4. Piksel doygunluğunu önlemek ve fotoağartmayı en aza indirmek için lazer gücünü ve dedektör kazancını ayarlayın. Deney boyunca satın alma ayarlarını sabit tutun.
GUV'lerin sedimentasyonu
1. 8 delikli bir slaytın bir kuyusuna 280 μL tampon (1 mM Tris-HCl, pH 7.5; 200 mM glikoz) ekleyin (toplam kuyu hacmi: ~874 μL).
  NOT: 200 μL'nin altındakı hacimler buharlaşmayı ve pH kaymasını artırdığı için 200 μL'den az kullanmayın. Dökülmeleri önlemek ve pipetlemenin rahat olmasını sağlamak için 400 μL'yi aşmayın. Farklı bir kamera formatı kullanıyorsanız, ses seviyesini buna göre ayarlayın. Ters mikroskoplar için, #1.5H kapak kalınlığına uygun odalı slaytlar kullanın.
2. Hava kabarcıkları oluşmadan tamponun üstüne nazikçe 20 μL bo_3-GUV süspansiyonu ekleyin.
  NOT: Negatif kontrol için, bo 3-GUV süspansiyonunu, aynı lipid/polimer bileşimine sahip, aynı koşullarda hazırlanıp tortulmuş proteinsiz GUV'lardan eşdeğer hacimde (20 μL) ile değiştirin. Bu kontrol, DTT ve Q_1'in piranin floresans oranı üzerindeki ve bo₃ oksidaz aktivitesinden bağımsız spesifik olmayan etkilerini açıklar.
3. GUV'ların yaklaşık 5 dakika boyunca tortulmasına izin verin, görüntülemeden önce.
Temel satın alma
1. GUV'ların çöktüğü odanın alt düzlemine odaklanın.
2. Görüş alanında 3–6 GUV elde etmek için yakınlaştırmayı ayarlayın.
3. Aktivasyondan önce tüm kanallarda 5 dakika boyunca başlangıç floresansını kaydedin.
Proton pompalamanın aktivasyonu
1. Kullanımdan hemen önce 4.8 μL 1 M DTT ile 0.3 μL 80 mM Q₁ DMSO'da karıştırarak taze DTT–Q₁ karışımı hazırlayın, ardından vorteksle iyice karıştırın.
2. Pipet ucunu tampona sokmadan çözeltinin yüzeyine nazikçe 2,6 μL DTT–Q₁ karışımı ekleyerek sitokrom bo₃ oksidazı aktive edin; böylece yaklaşık 8 mM DTT ve 40 μM Q₁ nihai konsantrasyonları oluşur.
3. Sürekli alım altında intraveziküler piranin floresansını 30 dakika boyunca izleyin.
İntraveziküler piranin floresansının analizi
1. Her GUV için, vezikül lümeninde bir ilgi alanı (ROI) tanımlayın. LAS X yazılımında, Quantify → Stack Profile'a gidin, Draw Ellipse'i seçin ve her GUV içinde dairesel bir yatırım getirisi oluşturun.
2. Her iki uyarılma dalga boyunda (448 nm ve 405 nm) ortalama floresans yoğunluğunu 499–551 nm arasında belirlemek için, yazılımda İstatistik'i açın ve ortalama değeri kaydedin.
3. Floresans oranını R = I₄₄₈/I₄₀₅ olarak hesaplayın.
4. Oranı zaman içinde çizerek intraveziküler pH değişiminin kinetik izlerini elde edin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E. coli sitokrom bo₃ oksidaz, plazmid pETcyo'dan E. coli suşu C43 (DE3) ΔcyoABCDE'de eksprese edildi ve daha önce tarif edildiği^{gibi saflaştırıldı 29}. Arıtılmış bo₃ oksidaz, doğrudan yeniden yapılandırılma ve aktivite ölçümleri için kullanıldı ya da ATTO 643 (bu çalışma) veya diğer ATTO^boyaları ^1,15 gibi floresan boyalarla etiketlendi. ATTO 643 gibi yüksek hidrofilik boyalar için, bağlanmamış boyanın etiketlenmiş proteinden verimli ayrılmasını sağlamak amacıyla 30 cm uzunluğunda bir kolon kullanılmıştır (Şekil 3A). Soğurma spektrumlarından hesaplanan etiketleme derecesi (DOL), kullanılan ATTO boyasına bağlı olarak genellikle enzim başına 1.1–1.3 boya molekülü arasında değişirdi. ATTO 643 ile etiketlenmiş bo₃ oksidaz için DOL 1.16 idi (Şekil 3B).

Protein yeniden yapılandırılması için, LUV'lar önce ince film rehidrasyonu ile hazırlanır, ardından donma-erime döngüleri ve ekstrüzyon uygulanarak eşit vezikül boyutları elde edilir. Polimersomlar için rehidrasyon tamponu deterjanla desteklendi. Vezikül boyut dağılımları, yeniden yapılanmadan önce dinamik ışık saçılmasıyla analiz edildi (Şekil 4, Tablo 2). Hem hibrit hem de polimer LUV'lar genellikle dar boyut dağılımlarıyla ortalama 85–95 nm çapları sergilerdi (PDI < 0.2). PDMS-g-PEO bazlı veziküllerin, ekstrüzyon membranının nominal gözenek boyutundan biraz daha küçük olması beklenmektedir. Tipik polimersomlar oldukça uniform boyutlar sergilerken, PDI değerleri 0.1'in altında olurken, hibrit veziküller bazen 0.1'in üzerinde ama sürekli olarak 0.2'nin altında olan makul derecede tekdüze popülasyonlar oluşturmuştur.

Daha sonra zar proteini bo₃ oksidaz, deterjan (bu çalışmada sodyum kolat) varlığında LUV'lara eklenmiştir. Deterjan daha sonra Bio-Beads kullanılarak çıkarıldı. Yeniden yapılandırıldıktan sonra, polimersom boyutu yalnızca hafifçe arttı (Şekil 4A), hibrit vezikül boyutu ise değişmeden kaldı (Şekil 4B). Her iki sistemde de PDI'da küçük bir artış gözlemlenmiştir (Tablo 2). Bu tür küçük boyut değişiklikleri beklenir; çünkü deterjan aracılı çözünürme ve çıkarma membrandaki polimer zincirlerini yeniden düzenleyebilir. Protein aktivitesi, proteinin fonksiyonel aktivitesini koruyup korumadığını gösteren oksijen tüketimi ölçülmesiyle değerlendirildi (Şekil 5A). Proteinsiz LUV negatif kontrolünde oksijen tüketiminin olmaması, gözlemlenen sinyalin özellikle bo₃ oksidaz aktivitesinden kaynaklandığını doğrular. Burada kullanılan konsantrasyonlarda sodyum kolat aracılı yeniden yapılanma ile, hibrit veziküllerde protein aktivitesi genellikle polimersomlara göre biraz daha yüksekti (Şekil 5B). Protein aktivitesinde bazı farklılıklar arıtma partileri arasında ve hatta aynı partideki fraksiyonlar arasında gözlemlendi. Bu nedenle, farklı membran sistemleri arasında protein aktivitesinin karşılaştırılması gibi karşılaştırmalı çalışmalar için, tutarlılığı sağlamak için aynı saflaştırılmış protein oranı kullanılmalıdır.

Protein-fonksiyonel PDMS-g-PEO ve PDMS-g-PEO/soya PC GUV'ları üretmek için füzyon-elektroformasyon yaklaşımı kullanıldı. Bu yöntemde, proteo-LUV'lar proteinsiz LUV'larla karıştırılır ve ITO kaplı cam slaytlara yerleştirilir, ardından vezikül füzyonu ve polimer/protein veya polimer/lipid/protein filmi oluşumunu teşvik etmek için kısmi dehidrasyon uygulanır. Yetersiz dehidrasyon düşük proteo-GUV verimine, daha küçük GUV boyutuna ve füzyon olmayan (proteo-)LUV'ların bulunmasına yol açtı.

Etiketlenmiş protein olan bo₃ oksidaz–ATTO 643'ün membrana başarılı bir şekilde dahil edilmesi, GUV'ların sükroz/glukoz yoğunluk gradyanında sedimentasyonu sonrası konfokal mikroskopi ile doğrulandı (Şekil 6A, B). Membranla ilişkili floresansın basit bir çizgi profiliyle nicelendirilmesi, ölçülen yoğunluğun çizginin çekildiği açıya bağlı olması nedeniyle önyargılı olabilir. Bu etkiyi en aza indirmek için, floresans yoğunluğu her GUV'nin tüm membran konturu boyunca çizilen bir poliline kullanılarak değerlendirildi.

Vezikül boyutu ile protein dahil edilmesi arasındaki olası korelasyonları değerlendirmek için GUV çapı paralel olarak analiz edildi (Şekil 6C, D). Daha büyük GUV'lar (20 μm'nin üzerinde) genellikle küçük veziküllere kıyasla daha düşük membranla ilişkili protein floresansı gösterir. Bu gözlem, füzyon–elektroformasyon mekanizmasına bağlanabilir: küçük veziküller daha erken oluşur ve proteinleri daha verimli bir şekilde dahil edebilir; daha büyük veziküller ise sonraki füzyon olayları ve membran büyümesinden oluşur; bu da potansiyel olarak protein açısından zayıf malzemeyle seyreltmeye yol açar.

Genel protein katılımı esas olarak LUV'lara yeniden yapılandırılmanın erken aşamasında, özellikle deterjan türü, konsantrasyon ve eklenme aşamasına göre belirlenir. Polimer LUV'larda, önceden oluşturulmuş veziküllere deterjan eklendiğinde, vezikül oluşumu sırasında (rehidrasyon aşaması) eklenmeye kıyasla biraz daha düşük inkorporasyon gözlemlenmiş, bu da floresans yoğunlukları sırasıyla 18,9 ± 3,9 a.u. ve 20.6 ± 3.7 a.u. olarak elde edilmiştir (Şekil 6C, D, solda). Hibrit sistemlerde, vezikül oluşumundan sonra deterjan eklendiğinde, deterjan konsantrasyonu önemli bir rol oynar: sodyum kolatın %0,015'ten %0,1'e yükseltilmesi protein katılımında belirgin bir artışa yol açmıştır (22,1 ± 5,2 a.u. vs. 26,2 ± 5,0 a.u., Şekil 6C, D, sağda). Polimer ve hibrit sistemler karşılaştırıldığında, hibrit GUV'lerde genellikle bo₃ oksidazın biraz daha yüksek membran dahil edilmesi gözlemlenmiştir. Bunun nedeni muhtemelen polimer-lipid arayüzlerinde bulunan paketleme kusurlarının varlığıdır; bu kusurlar, deterjan kaynaklı kusurlara ek olarak, membran proteinleri için uygun yerleştirme noktaları sağlar.

2 saat ikinci elektroformasyon adımı kullanıldığında, bo₃ oksidaz fonksiyonelleştirilmiş GUV'ların ortalama çapı yaklaşık 14–15 μm (polimer GUV'lar için 13,5 ± 3,7 μm ve hibrit GUV'lar için 15,4 ± 6,3 μm) idi, ancak dikkat çekici şekilde daha büyük veziküller de bulunuyordu (Şekil 6C, D). İkinci elektroformasyon aşamasının süresinin 12 saate kadar artırılması, GUV boyutu ^1,27'de genel bir artışa yol açtı.

Füzyon–elektroformasyon protokolü ayrıca, elektroformasyon sırasında boya rehidrasyon tamponuna eklenerek pH-duyarlı boyalar (örneğin piranin) gibi suya çözünen türlerin kapsüllenmesini sağlar (Şekil 7A). GUV boyutu genellikle suda çözünemeyen boyaların varlığında veziküller oluştuğunda azalır. Bu etkiyi telafi etmek için, ilk elektroformasyon adımlarında frekans 50–500 Hz'den yükseltilmelidir.

Piranin gibi orantımetrik pH-duyarlı boyanın kapsüllenmesi, proton pompalamasının tek vezikül izlenmesini sağlar ve proton pompalarının yönü hakkında içgörü sağlar. Vezikül lümeninin asitleşmesi, 448 nm ve 405 nm hassasiyetlerde uyarılan piraninin floresans oranı azalır. Bu oran, piraninin protonlaşma durumunu yansıtır ve dolayısıyla pH ile korelasyondur. Orantımetrik ölçümler avantajlıdır, çünkü boya kapsülleme verimliliği ve fotobeyazlama değişikliklerine karşı büyük ölçüde duyarsızdırlar. Proton pompalama aktivitesine bir örnek, Şekil 7B'de gösterilmiştir; burada elektron donörü DTT ve elektron aracı Q₁ eklendikten sonra yeniden oluşturulmuş bo₃ oksidaza sahip hibrit GUV'larda intraveziküler piranin floresans oranında (I₄₄₈/I₄₀₅) bir azalma gözlemlenmiştir. Floresans oranı aktivasyondan yaklaşık 1 dakika sonra keskin bir şekilde azalmaya başlar ve yaklaşık 1 dakika boyunca hızla azalmaya devam eder, ardından sonraki ~18 dakika boyunca yavaşlar. Bu davranış, bo₃ oksidaz moleküllerinin çoğunun GUV'ların iç kısmına doğru proton pompalamasının gerçekleştiği şekilde yönlendirildiğini gösterir. Aynı koşullara maruz kalan proteinsiz GUV'lar, floresans oranında daha küçük bir azalma gösterdi; bu da negatif kontrol olarak hizmet etti ve bo 3-GUV'larda gözlemlenen daha büyük azalmanın, DTT ve Q_1'in piranin floresans oranı üzerindeki spesifik olmayan etkilerinden ziyade özellikle bo₃ oksidaz proton pompalama aktivitesinden kaynaklandığını doğruladı.

figure-results-1
Şekil 1. Büyük unilamellar vezikül (LUV) hazırlanmasının şematik temsili, membran proteini sitokrom bo₃ oksidazın LUV'lara yeniden yapılandırılması ve füzyon-elektroformasyon yaklaşımıyla bo₃oksidaz-fonksiyonelleştirilmiş dev unilameller veziküllerin (GUV) oluşumu. LUV'lar, ince film rehidrasyonu, donma-erime döngüleri ve 100 nm gözenek boyutunda bir membrandan ekstrüzyon yoluyla hazırlanır. Sitokrom bo₃ oksidazın yeniden yapılandırılması, deterjan varlığında yapılır ve bu deterjan daha sonra Bio-Beads kullanılarak çıkarılır. bo 3-GUV'lar, bo 3-LUV'ların indium kalay oksit (ITO) kaplı cam kaydıraklara biriktirilmesiyle oluşturulur; ardından elektrik akımı varlığında kısmi dehidrasyon ve yeniden hidrasyon yapılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2. Susuz bırakışla birleşmiş büyük unilamellar vezikül (LUV) filminin oluşumu. Indium kalay oksit (ITO) kaplı cam slaytlara yedi 2-μL karışık proteo-LUV ve LUV damlacıkları biriktirildi: (A) biriktirildikten hemen sonra ve (B) kısmi dehidrasyondan sonra. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3. Sitokrom bo₃ oksidazın floresan etiketlenmesi. (A) Superdex 200 10/300 GL kolonunda saflaştırılmış bo₃ oksidaz-ATTO 643'ün kromatogramı (elusyon profili). Gri ile vurgulanan fraksiyonlar toplanır ve ardından konsantre edilir. (B) Konsantre bo₃ oksidaz-ATTO 643'ün absorbans spektrumları, zirveleri 280 nm (protein), 400 nm ( bo₃ oksidazdaki heme kofaktorlarının soret bandı) ve 643 nm (boya) seviyelerinde görülür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4. Protein yeniden yapılandırılmasından önce ve sonra büyük unilamellar veziküllerin (LUV) boyut dağılımları: (A) poli(dimetilsiloksan)-greft-poli (etilen oksit) (PDMS-g-PEO) polimeri ve (B) PDMS-g-PEO/soya fosfatidilkolin (PC) hibrit vezikülleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5. Büyük unilamellar veziküllerde (LUV) yeniden oluşturulan bo₃ oksidazla oksijen tüketimi. (A) Ditiothreitol (DTT) ve ubiquinone-1 (Q₁) eklenmesiyle yeniden oluşturulmuş sitokrom bo₃ oksidazın aktivasyonu sonrası zaman içinde oksijen konsantrasyonunun temsil izi. Yeşil iz, proteinle yeniden oluşturulmuş LUV'lara, gri iz ise negatif kontrol (proteinsiz LUV'lar) ile karşılık gelir. (B) Poli(dimetilsiloksan)-greft-poli (etilen oksit) (PDMS-g-PEO) ve PDMS-g-PEO/soya fosfatidilkolin (PC) LUV'larında yeniden oluşturulmuş bo₃ oksidazın oksijen tüketimi oranları (OCR). Çubuklar, üç bağımsız ölçümün (n = 3) ortalama ± standart sapmasını (SD) temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6. Floresan olarak işaretlenmiş bo₃ oksidazın dev unilameller veziküllere (GUV) yerleştirilmesi. (A) poli(dimetilsiloksan)-greft-poli(etilen oksit) (PDMS-g-PEO) ve (B) PDMS-g-PEO/soya fosfatidilkolin (PC) GUV'larının (fosfatidilistanolamin-Rho, kırmızı ile etiketlenmiş membranlar) temsil eden mikrografları, yeniden oluşturulmuş sitokrom bo₃ oksidaz-ATTO 643 (magenta) içerir. Farklı yeniden yapılandırma koşulları için GUV boyutuna (N = 100) bağlı olarak bo₃ oksidaz-ATTO 643 floresan yoğunluğunun nicelendirilmesi: (C) önceden oluşturulmuş polimer büyük unilameller veziküllere (LUV) %0,2 sodyum kolat (SC) ve önceden oluşturulmuş hibrit LUV'lara %0,015 SC eklenmesi; (D) polimer LUV'lar, %0,1 SC varlığında oluşmuş ve oluştudan sonra %0,1 SC ile işlenmiş hibrit LUV'lar. Değerler, bireysel GUV'ların floresans yoğunluğunu temsil eder (N = 100 her koşul). Ortalama ± standart sapma (SD) değerleri metinde bildirilmiştir. Karşılaştırmalar betimleyicidir; resmi istatistiksel test yapılmadı. A.U. (keyfi birimler). Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7. Bo₃ oksidaz ile proton pompalama, dev unilamellar veziküllerde (GUV) yeniden oluşturulmuştur. (A) Poli(dimetilsiloksan)-greft-poli (etilen oksit) (PDMS-g-PEO)/soya fosfatidilkolin (PC) GUV'larının temsil floresan mikrografı, membranları %0,05 mol fosfatideletanolamin-Rodamin (PE-Rho, kırmızı) ile etiketlenmiş, yeniden oluşturulmuş sitokrom bo₃ oksidaz ve kapsüllenmiş pH-duyarlı boya piranin (405 ve 448 nm; mavi ve yeşil kanallar) içerir, cam slaytla biriktirilmiştir. (B) Yeniden yapılandırılmış bo₃ oksidaz içeren PDMS-g-PEO/soya PC GUV'larında ditiothreitol (DTT) ve ubiquinone-1 (Q₁) ile aktivasyon sırasında intraveziküler piranin floresans oranındaki değişim. Yeşil iz, proteinle yeniden oluşturulmuş GUV'lara, gri iz ise negatif kontrole (proteinsiz GUV'lar) karşılık gelir. İz, ortalama ± standart sapmayı (SD) temsil eder (n = 3 vezikül). Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

	Bileşen	Stok	Miktar	Son zar bileşimi
Polimersomlar	PDMS-g-PEO kloroform:metanol içinde (2:1, v/v)	10 mg/mL	499.9 μL	99,95 mol%
Polimersomlar	Kloroformda PE-Rodamin	1 mg/mL	1.1 μL	%0,05 mol
Hibrit veziküller	PDMS-g-PEO kloroform:metanol içinde (2:1, v/v)	10 mg/mL	450.1 μL	%70 mol
	Kloroformda soya PC (%95)	10 mg/mL	49.8 μL	%29,95 mol
	Kloroformda PE-Rodamin	1 mg/mL	1.4 μL	%0,05 mol

Tablo 1: Büyük unilamellar vezikül (LUV) oluşumu için ince film hazırlamada kullanılan stok çözeltileri ve hacimleri. Stok konsantrasyonları mg/mL cinsinden verilmiştir. Hacimler, toplam 5 mg/mL amfifil konsantrasyonu olan bir film için hesaplanır. Son membran bileşimi mol cinsinden ifade edilir. PDMS-g-PEO: poli(dimetilsiloksan)-greft-poli (etilen oksit); PE-Rodamin: fosfatidiletanolamin-rodamin; soya PC: soya fosfatidilkolin; V/V: Hacim/Hacim.

	Yeniden yapılandırma şartı	Çapı (nm)	PDI
Polimersomlar	Yeniden Yapılanma Öncesi	84.34 ± 0.22	0.084
Polimersomlar	Yeniden yapılanma sonrası	100.73 ± 0.81	0.109
Hibritler	Yeniden Yapılanma Öncesi	89.21 ± 0.77	0.129
Hibritler	Yeniden yapılanma sonrası	85.01 ± 0.42	0.17

Tablo 2: Polimersomların (poli(dimetilsiloksane)-greft-poli (etilen oksit), PDMS-g-PEO) ve hibrit veziküllerin (PDMS-g-PEO/soya fosfatidilkolin (PC)) yeniden yapılandırılmadan önce ve sonra ortalama vezikül boyutu ve polidispersite indeksi (PDI). Veriler, üç bağımsız ölçümün ortalamasını temsil eder.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polimersomlar ve polimer/lipid hibrit veziküller, geleneksel lipid veziküllerine kıyasla gelişmiş kimyasal ve mekanik kararlılık sergiler; bu da ilaç dağıtımı ve biyosensörlemeden nano- ve mikroreaktörler ile yapay hücrelere kadar çeşitli uygulamalar için oldukça cazip hale gelir. Ancak, ayırt edici membran mimarisi ve biyofiziksel özellikleri, lipid vezikülleri için optimize edilmiş protokollerin polimer bazlı sistemlere doğrudan aktarılmasını^{sıklıkla engeller} 15,20,30. Burada sunulan protokol bu farklılıkları ele alır ve membran proteininin PDMS-g-PEO tabanlı polimer ve hibrit LUV'lara yeniden yapılandırılması için optimize edilmiş bir iş akışı sağlar; ardından füzyon-elektroformasyon yoluyla GUV'lere ölçeklendirilme yapılır.

Protokolteki kritik bir adım, dar ve tekrarlanabilir boyut dağılımına sahip LUV'lerin hazırlanmasıdır. Lipid filmlerinde olduğu gibi, PDMS-g-PEO filmleri sulu bir tampon ile yeniden hidratlandığında veziküllere kendiliğinden birleşir. Lipid sistemlerinin aksine, genellikle uni- ve multilamellar veziküllerin karışımını veren sistemlerin aksine, PDMS-g-PEO tercihen unilamellar^{yapılar 1} oluşturur ve genellikle lipid preparatlarında çok lamellarlığı azaltmak için kullanılan donma–erime döngülerine olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Ekstrüzyon, vezikül boyut dağılımını standartlaştırmak için yapılır. PDMS-g-PEO zarlarının lipid bilayer^1'e göre artan yumuşaklığı nedeniyle, daha düşük ekstrüzyon basınçları yeterlidir. Üretici tarafından önerilen 11 ekstrüzyon geçişi genellikle yeterli olsa da, geçiş sayısını artırmak genellikle daha dar bir boyut dağılımına ve daha iyi tekrarlanabilirliğe yol açar. Ancak, aşırı ekstrüzyon, membranın nominal gözenek boyutundan biraz daha küçük veziküller üretebilir. Tekrarlayan ekstrüzyon, malzeme kaybı nedeniyle vezikül verimini de azaltabilir; Daha önce, 100 nm membrandan 21 geçiş sonrası PDMS-g-PEO'nun yaklaşık %31'i ve PDMS-g-PEO/soya PC vezikül materyalinin %25'inin kaybolduğunu tespit^etmiştik. Bu nedenle, ekstrüzyon geçiş sayısı, boyut uniforması ile vezikül bütünlüğü ve verimliliği dengelemek için optimize edilmelidir.

Deterjan aracılı yeniden yapılandırma, başarının bir diğer önemli belirleyicisidir. Optimal deterjan türü ve konsantrasyonu hem spesifik membran proteinine hem de membran^{bileşimine (}^3,20) bağlıdır. Saf polimer zarlarda, doygunluk koşulları optimal olduğunda, film rehidrasyonu sırasında deterjan kullanmak, önceden şekillendirilmiş veziküllerin doygunlaşmasına göre daha yüksek yerleştirme verimliliği sağlar. PBD-b-PEO'dan oluşturulanlar gibi daha sert polimer zarlar, membran çözünürlüğü için çok daha yüksek deterjan konsantrasyonları^{gerektirir ve} polimere özgü optimizasyonun gerekliliğini vurgular. Başarılı yerleştirme, sadece deterjan miselleri veya lipid vezikülleriyle karşılaştırıldığında aktivite ölçümleriyle değil, aynı zamanda kriyo-TEM gibi yapısal analizlerle de doğrulanmalıdır; böylece yerleştirme derinliği ve hidrofobik^uyumsuzluğa membran uyumu 1. Protein yönelmesi de özellikle proton pompaları için aynı derecede kritiktir, çünkü fonksiyonel bir proton gradyanı çoğu pompanın eşit şekilde yönlendirilmesini gerektirir. İdeal olarak, pompalar protonları içe doğru taşımalı, böylece gradyan tüketen süreçlerle bağlantı sağlanmalıdır, örneğin ATP^sentezi ^3,15. Yönelim, örneğin vezikülün dışına maruz kalan boyaları seçici olarak söndürerek veya^{His-etiketleri 20'ye} bağlı floresan etiketlerin yerinden kaldırılarak protein etiketleri kullanılarak değerlendirilebilir. Bu yaklaşımlar protokol optimizasyonu için genel öneriler olarak sunulmakta olup, bu çalışmada uygulanmamıştır.

Proteo-LUV'lardan proteo-GUV'lara füzyon elektroformasyonu kullanılarak ölçeklendirme, biriktirme ve dehidrasyon parametrelerinin dikkatli kontrolünü gerektirir. LUV konsantrasyonu ve damla boyutu, nihai GUV verimi ve saflığını kritik şekilde etkiler. Aşırı yüksek LUV konsantrasyonları (≥10 mg/mL), nihai numunede erişmemiş LUV'ların kalmasına yol açarken, çok düşük konsantrasyonlar (<5 mg/mL) yetersiz birikmiş malzeme nedeniyle GUV verimini azaltır. Dehidrasyon tam değil, kısmi olmalıdır—bu, damlanın çevresinde tam beyaz damla yerine beyaz bir halka oluşmasıyla gösterilir—çünkü aşırı dehidrasyon, özellikle proton pompaları için zar protein aktivitesini bozabilir veya ortadan kaldırabilir. Bu nedenle, protein işlevselliğini koruyarak zarların füzyon için yeterince dengesizleştirilmesi için kontrollü nem ve sıcaklık gereklidir.

Yüksek protein yükleri GUV boyutunu azaltabilir, ancak bu etki, proteinsiz LUV'larla protein-fonksiyonel LUV'ların seyreltilmesiyle azaltılabilir. Bu şekilde, GUV zarlarındaki protein yoğunluğu, birikimden önce hassas şekilde modüle edilebilir. Örneğin, yüksek yüklü _bo 3-LUV'ları boş LUV'larla (1:10, v/v'ye kadar) karıştırıldığında, 5–30 μm çaplı ve ayarlanabilir protein içeriğine sahip GUV'lar üretir ve zar^{dağılımını 27} tutar. Bu strateji protein yoğunluğu açısından heterojen vezikül popülasyonları ortaya çıkarsa da, kalibrasyon prosedürleri^23,31 inkorporasyon seviyelerinin nicel olarak değerlendirilmesine olanak tanır. Önemli olarak, karıştırma yaklaşımı, GUV boyutu^27'de aşırı azalma olmadan daha yüksek toplam protein yüklemesini sağlar.

Yeniden oluşturulmuş proteinlerin fonksiyonel analizi, piranin gibi pH-duyarlı boyaların elektroformasyon tampponuna kapsüllenerek intraveziküler pH değişimlerini izlemek için yapılabilir. Güvenilir canlı görüntüleme için, veziküllerin tortulması veya hareketi engellemek için hareketsiz hale getirilmesi gerekir; bu da floresan sinyallerini bulanıklaştırır ve intraveziküler pH dinamiklerinin doğru nicelendirilmesini engeller. Biotinile lipidler ve streptavidin kaplı yüzeyler kullanılarak biotin–streptavidin bağlanması yoluyla^{immobilizasyon (32}) stabil bir bağlanma sağlar ancak membran bileşimini veya gerilimini değiştirebilir. Mikrofluidik tuzaklarda yarı immobilizasyon, ek membran bileşenlerinden kaçınan ve bozulmayı en aza indiren bir alternatif^sunar ^1,33. Dış boyanın tekrar tekrar edilen sedimentasyon ve tampon değişimiyle çıkarılmasından sonra toplu floresans ölçümleri mümkün olsa da, kalıntı membranla ilişkili boya okumayı engelleyebilir; bu nedenle, tek GUV'ların konfokal mikroskopisi genellikle tercih edilir.

Önceden oluşturulmuş GUV'lara doğrudan protein eklemeyi deneyen alternatif yaklaşımlara kıyasla, füzyon-elektroformasyon stratejisi, GUV'lara ölçeklenmeden önce LUV seviyesinde yeniden yapılandırma koşullarının bağımsız optimizasyonuna olanak tanır. Bu modüler iş akışı, özellikle geleneksel lipid tabanlı protokollere daha az uyum sağlayan polimer ve hibrit zarlar için tekrarlanabilirliği ve işlevsel verimi artırır. Yöntem, çoklu protein sistemleri¹⁵ dahil olmak üzere geniş bir membran^{proteini yelpazesiyle} uyumludur ve membran fonksiyonelleştirilmesini ve ek bileşenlerin birlikte kapsüllenmesini sağlar. Bu nedenle, kontrollü koşullarda polimer-protein etkileşimlerini araştırmak için dayanıklı yapay hücreler, mikroreaktörler ve model sistemleri inşa etmek için çok yönlü bir platform sağlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Dieter Schwarz Vakfı ve Max Planck Derneği iş birliği içinde desteklenen Max Planck Okulu Matter to Life kapsamında yürütülmüştür. Sitokrom bo₃ oksidazın izolasyonu ve saflaştırılması için Claudia Bednarz'a, vezikül hazırlama ve mikroskopi konusundaki yardımları için ise Anne Christin Weinrich'e minnettarız.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ÄKTA pure™ chromatography system	Cytiva	29018224
18:1 Liss Rhod PE	Avanti Research	810150
8 well chambered coverglass	Cellvis	C8-1.5H-N
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters	Sigma Aldrich	UFC5030
ATTO 643 NHS ester	ATTO-TEC	AD 643-31
Bio-Beads SM-2	Bio-Rad	1523920
Cholic acid-Na-salt (sodium cholate)	Serva	361-09-1
Coenzyme Q1	TargetMol	TGM-T19594
Confocal microscope STELLARIS 5	Leica Microsystems	603810
DTT (Dithiothreitol)	Merck	10197777001
Fine Tip Ultra Micro Pastette	Pastette	LW4243
HPTS (pyranine, 8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid, Trisodium Salt)	Sigma Aldrich	6358-69-6
ITO-coated glass slides (25×75×1.1 mm, ≤20 Ohm/sq.)	pgo	CEC020S
LAS X software	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Mini centrifuge MCF-2360	LMS	24572
Mini-extruder	Avanti Research	610000
Oxytherm+P system	Hansatech Instruments	/
Plasma cleaner (benchtop)	Harrick Plasma	PDC-32G-2
Polycarbonate membranes 0.1 μm	Avanti Research	610005
Press-to-seal silicone isolator (round, 20 mm diameter, 1 mm depth)	Grace Bio-Labs	41161502
Silicone spacers (round, 24.2 mm outer diameter, 14.3 mm inner diameter, 1.8 mm depth)			laboratory-made, cut from silicone sheet
Soy PC (95%)	Avanti Research	441601
Specord 50 PLUS spectrophotometer	Analytik Jena	823-0200P-3
Superdex 200 10/300 GL column (column L × I.D. 30 cm × 10 mm)	Cytiva	28-9909-44
Test tube shaker (2800 rpm)	IKA Lab Dancer	3365000
Thermomixer comfort 5355	Eppendorf	5355000.011
Xiameter OFX-5329 (PDMS-g-PEO; MW 3000)	Dow Corning	000000000004109892
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical	ZEN3600

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Biyokimya Say 234 Say 234 Polimerzomlar polimer lipid hibrit vezik lleri PDMS g PEO b y k unilamelar vezik ller LUV lar dev unilamelar vezik ller GUV lar membran proteini rekonstit syonu elektroformasyon

Membran Protein-Fonksiyonelleştirilmiş Polimer ve Polimer/Lipid Hibriti Büyük ve Devasa Unilamellar Veziküllerin Hazırlanması

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler