Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Dentin Diski Kullanılarak Dikey İstiflenmiş Bir Dentin-Pulpa Kompleksi Organ-on-a-Chip Cihazının Fabrikasyonu

110 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71713

⸱

14 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

Bu makalede

Özet

İnsan dentin diski ve fotolitografi ile üretilmiş mikrokanallar içeren, dikey olarak istiflenmiş bir dentin-pulpa kompleksi organ-on-a-chip cihazının fabrikasyonunu ve montajını, ardından dental pulpa kök hücre ekimini ve kültürünü tanımlamak için.

Özet

Hayvan modelleri ve statik hücre kültürleri dahil olmak üzere diş araştırmalarında kullanılan geleneksel preklinik modeller, dentin-pulpa arayüzünün fizyolojik koşullarını yeniden oluşturma ve dental biyomateryallere verilen insan biyolojik yanıtlarını öngörme konusunda önemli kısıtlamalar sunmaktadır. Organ-on-a-chip (OoC) teknolojisi, kontrollü mikroakışkan sistemler içerisinde dokuya özgü mikroortamların yeniden oluşturulmasına olanak tanıyarak alternatif bir yaklaşım sağlamaktadır. Bu makale, üç katmanlı bir polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan platformu içerisinde insan dentin diskini barındıran bir dentin-pulpa kompleksi OoC cihazının üretimi ve montajı için adım adım bir protokol tanımlamaktadır. Protokol; dentin disk hazırlığı, fotolitografi kullanılarak mikroyapılı kalıpların üretimi, PDMS dökümü ve kürlenmesi, plazma destekli katman yapıştırma, cihaz montajı, sızıntı testi ve statik kültür koşulları altında dental pulpa kök hücre ekimini içermektedir. PDMS katman kalınlığının kontrolü, plazma yüzey işlemi ve sızıntıyı minimize etmek için dentin diskinin cihaz içine entegrasyonu dahil olmak üzere, cihaz performansını etkileyen kritik üretim parametreleri tartışılmıştır. Cihaz içindeki hücre yapışması ve canlılığı, taramalı elektron mikroskobu ve konfokal canlı/ölü boyama kullanılarak değerlendirilmiştir. Temsili sonuçlar, dentin diskinin mikroakışkan düzeneğe başarılı bir şekilde entegre edildiğini, sızıntısız koşulların korunduğunu ve canlı dental pulpa kök hücrelerinin dentin yüzeyine yapıştığını göstermektedir. Bu protokol, dental biyomateryallere ve mikroortamsal uyarılara verilen hücresel yanıtları araştıran gelecek çalışmalara destek olabilecek bir dentin-pulpa kompleksi OoC platformunun üretimi için tekrarlanabilir bir yaklaşım sunmaktadır.

Giriş

Hayvan deneyleri, patolojik ve fizyolojik süreçlerin anlaşılmasının ilerletilmesinde uzun süredir araç teşkil etmekte olup, ilaç geliştirmenin erken aşamalarında merkezi bir rol oynamıştır1. 20. yüzyıl boyunca insan yaşam süresi önemli ölçüde artmıştır ve bu iyileşmenin ne ölçüde yalnızca hayvan araştırmalarına dayandırılabileceğini kesin olarak belirlemek mümkün olmasa da, birçok güncel tıbbi tedavinin hayvan modelleri kullanılarak geliştirildiği veya doğrulandığı yaygın olarak kabul edilmektedir2. Poliomyelit, kızamık ve hepatit B'ye karşı aşıların geliştirilmesi, penisilinin güvenlilik ve etkililiğinin değerlendirilmesi ve insülin üretimi bu konudaki dikkat çekici örnekler arasındadır. Diş ve biyomalzeme araştırmaları alanında bu modeller; çürük sürecinin, dentin-pulpa kompleksinin biyolojisinin ve rejenerasyonunun, ayrıca periodontal dokuların fizyopatolojisinin araştırılması için kritik öneme sahip olmuştur3,4.

Bu metodolojilerin yaygın kullanımına rağmen, mevcut ilaç geliştirme süreci, birçok ilaç adayının preklinik laboratuvar ortamlarında ve hayvan modellerinde etkinlik ve güvenlik göstermesine rağmen klinik deneyler sırasında başarısız olmasıyla yüksek başarısızlık oranları sergilemeye devam etmektedir5. Bu tutarsızlık, türler arasındaki anatomik, genetik ve fizyolojik farklılıklar nedeniyle hayvan modellerinin translasyonel öngörülebilirliğini sınırlayabilen türler arası farklarla ilişkilendirilmiştir6. Ayrıca, yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi zaman alıcı ve maliyetli olmaya devam etmektedir7. Dahası, geleneksel in vitro modeller ağırlıklı olarak fizyolojik olmayan plastik substratlar üzerinde basitleştirilmiş iki boyutlu (2D) monokatman kültürleri kullanmakta olup, insan ağız boşluğunda mevcut olan biyokimyasal ve fiziksel ipuçlarını, hücre-hücre etkileşimlerini ve hücre dışı matris (ECM) sinyallenmesini yeniden oluşturmakta yetersiz kalmaktadır8,9. 2D modeller belirli deneysel avantajlar sunsa da, biyofilmler, biyomateryaller, dentin ve pulpa hücreleri gibi birden fazla bileşen arasında eş zamanlı olarak meydana gelen karmaşık etkileşimleri doğası gereği taklit edemezler10. Sonuç olarak, insan biyolojik yanıtlarını daha doğru bir şekilde yeniden üretebilen alternatif deneysel platformların geliştirilmesine yönelik ilgi artmaktadır. 2022 yılında, FDA Modernizasyon Yasası 2.0, ilaç onay sürecindeki zorunlu hayvan deneyi gerekliliğini kaldırmış ve preklinik araştırmalarda organ-on-a-chip (OoC) teknolojileri dahil olmak üzere alternatif platformların potansiyel kullanımını tanımıştır11.

Bir OoC, belirli bir organın veya doku bileşeninin yapısını, işlevini ve mikroortamını taklit etmek için tasarlanmış mikroakışkan bir cihazdır12. Bu cihazlar, hücrelerin doğal olarak maruz kaldığı fizyolojik mikroortamın temel yönlerini yeniden oluşturan, mühendislik ürünü mikrokanallar içinde kültüre edilmiş canlı hücreler ve dokularla doldurulur. Yapısal taklidin ötesinde, mikrokanallar hücresel ortam üzerinde spatiotemporal kontrol sağlar ve dokuya özgü işlevlerin sürdürülmesini destekler; böylece geleneksel kültür sistemlerinden daha yakın bir şekilde in vivo fizyolojiyi yansıtabilen deneysel koşullar sunar12. Özellikle, OoC cihazlarındaki mikrokanallar, yerleşik hücreler üzerinde kayma stresine neden olan kültür ortamının kontrollü akışını kolaylaştırır13. Bu mekanik uyaranlar; adezyon, proliferasyon, migrasyon, gen ekspresyonu ve hücre-hücre etkileşimleri dahil olmak üzere hücresel yanıtları etkiler14,15. Ayrıca, sürekli ortam akışı, besin tedariki ve metabolik atık ürünlerin uzaklaştırılması yoluyla mikroortamın korunmasına katkıda bulunur16. Dahası, geleneksel 2D kültürlerle karşılaştırıldığında, bazı OoC platformlarının üç boyutlu (3D) on-chip modellerde hücre içi reaktif oksijen türleri ve hücre canlılığı dahil olmak üzere oksidatif stresle ilişkili okumaların daha iyi kontrol edilmesini desteklediği bildirilmiştir17. Bu nedenle OoC sistemleri; doku fizyolojisini, biyomalzeme etkileşimlerini ve hastalık süreçlerini kontrollü deneysel koşullar altında incelemek için gelecek vaat eden platformlar olarak ortaya çıkmıştır18. Dental araştırmalarda OoC teknolojisi, giderek daha karmaşık oral doku arayüzlerini modellemek için aşamalı olarak uygulanmıştır19. İlk tooth-on-a-chip platformları biyomalzeme-dentin-pulpa arayüzünü taklit etmiştir20; daha gelişmiş versiyonlar ise pulpa-dentin kompleksinin yapısal ve fonksiyonel karmaşıklığını daha sadık bir şekilde yeniden oluşturmak için vaskülarizasyon ve trigeminal innervasyonu dahil etmiştir21. Pulpanın ötesinde, olgunlaşmamış kök kanallarının 3D modelleri, endodontik irigasyon maddelerinin ve apikal papilladan alınan kök hücrelerdeki anjiyojenik tomurcuklanmanın değerlendirilmesine olanak sağlamıştır22,23. Periodontal düzeyde, gum-on-a-chip platformları konakçı-mikrop etkileşimlerini araştırmak ve probiyotiklerin terapötik ajanlar olarak immünomodülatör potansiyelini değerlendirmek için kullanılmıştır24; periodontal ligament-on-chip cihazları ise interstisyel sıvı akışının vasküler ağ oluşumunu ve periodontal ligament kök hücre sferoitlerinin osteojenik diferansiyasyonunu nasıl modüle ettiğini göstermiştir25,26. Bu modelleri tamamlayan özel oral mucosa-on-a-chip ve dental implant-on-a-chip sistemleri, fizyolojik olarak ilgili koşullar altında konakçı-malzeme etkileşimlerini ve dental monomerlerin sitotoksisitesini karakterize ederek dental mikroakışkan araştırmaların kapsamını daha da genişletmiştir27,28.

OoC sistemleri diş, ağız ve kraniofasiyal araştırmalarda giderek daha fazla uygulanmaya başlasa da, üretim iş akışlarının standartlaştırılması ve tekrarlanabilirliğine yönelik çabalar önemini korumaktadır. Literatürde, farklı cihaz konfigürasyonlarını ve deneysel uygulamaları gösteren çeşitli diş-çip-üstünde (tooth-on-a-chip) modelleri rapor edilmiştir20,29,30,31. Ancak cihaz mimarisindeki, üretim yöntemlerindeki, dentin entegrasyonundaki varyasyonlar ve deneysel parametrelerin raporlanma şekli, tekrarlanabilirliği ve çalışmalar arasındaki doğrudan karşılaştırmayı sınırlayabilir. Özellikle mikrokanal geometrisindeki, dentin entegrasyon stratejilerindeki ve üretim yaklaşımlarındaki farklılıklar, cihaz içindeki biyolojik ve mekanik mikroçevreyi etkileyebilir. Rapor edilen bazı modeller, dentin-pulpa arayüzünün özelliklerini yeniden oluşturmak için dentin içermekteyken20,29,30, diğerleri alternatif konfigürasyonlar kullanmaktadır31. Ayrıca, fotolitografi, lazer kesim, mikrofrezeleme ve 3D baskı gibi üretim yöntemlerinin her biri, hedeflenen cihaz tasarımına ve uygulamasına bağlı olarak belirli avantajlar ve kısıtlamalar sunar. Dahası, biyolojik faydanın kritik bir belirleyicisi, cihazın mimari yönelimdir; özellikle kanalların ve dentin diliminin yatay mı yoksa dikey bir konfigürasyonda mı düzenlendiğidir19,32. Yan yana düzenlenen bölmelerin bulunduğu yatay istifleme konfigürasyonları, lateral bölmelendirmeyi ve hücrelerin gerçek zamanlı görüntülenmesini kolaylaştırarak, periodontal kompleks gibi doğası gereği lateral uzaysal organizasyona sahip dokuların modellenmesi için özellikle uygundur24,32. Bununla birlikte, bölmelerin lateral düzenlemesi, kavite ile pulpa arasındaki dentin bariyerinin in vivo yönelimini sadık bir şekilde yansıtmadığı için, bu tasarım biyomalzeme-dentin-pulpa kompleksi gibi dik biyolojik arayüzleri yeniden oluşturma kapasitesi bakımından doğası gereği sınırlıdır20,32. Dikey istifleme konfigürasyonları, iki bölmeyi yerli bir dentin dilimiyle ayrılarak y-ekseni boyunca üst üste getirerek bu sınırlamaları giderir; bu sayede sağlam dentin üzerinden moleküler transportun eş zamanlı olarak kantifikasyonu ve çıkış ortamında ölçülen pulpa hücresi yanıtlarının gerçek zamanlı izlenmesi mümkün olur30. Ancak, bu yönelimin bilinen bir sınırlaması, dentin-hücre arayüzünün kesit görüntülemesi ile ilgilidir; çünkü dentin-hücre arayüzünün aynı odak düzleminde kesit görüntülerinin alınması, hücrelerin ve hücre dışı matrislerin lateral olarak düzenlendiği yatay istifleme konfigürasyonlarına göre teknik olarak daha zorlayıcıdır. Literatürde çok sayıda dentin-pulpa kompleksi çip-üstünde modeli rapor edilmiş olsa da, çoğu bölmelerin aynı düzlemde yan yana düzenlendiği yatay istifleme konfigürasyonunu benimsemiştir10,20,21,29; dikey istifleme konfigürasyonu içinde yerli bir dentin dilimi kullananların sayısı ise nispeten azdır30. Yine de, bu modellerdeki üretim yaklaşımları ve raporlama parametrelerindeki varyasyonlar, tekrarlanabilirliği ve çalışmalar arası karşılaştırmaları sınırlamaya devam etmektedir33. Mevcut makale, dikey istiflenmiş bir diş-çip-üstünde cihazı için ayrıntılı bir üretim protokolü sunarak metodolojik tekrarlanabilirliği artırmayı ve böylece platformun diş araştırma topluluğu tarafından daha yaygın benimsenmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Bu makale, fotolitografi ile üretilmiş bir kalıp kullanılarak imal edilen üç katmanlı bir polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan platform içinde insan dentin diskini içeren, dikey istiflenmiş bir dentin-pulpa kompleksi OoC cihazının adım adım fabrikasyon ve montaj protokolünü açıklamaktadır. Protokol ayrıca, statik koşullar altında cihaz içindeki dental pulpa kök hücre ekimini ve kültürünü de tanımlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çalışma, Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak yürütülmüş ve insan örneklerini içeren çalışmalar için Universidad de La Frontera Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Dentin diskinin elde edilmesi

NOT: Protokole başlamadan önce cihaz tasarımını hazırlayın (Şekil 1A–1C).

  1. Dişlerin toplanması ve saklanması
    1. Bilgilendirilmiş hasta onamı aldıktan sonra sağlıklı insan azı veya küçük azı dişlerini toplayın.
    2. Dentinle ilgili dehidrasyonu ve protein denatürasyonunu önlemek için tüm örnekleri 4°C'de %0,5'lik kloramin çözeltisinde muhafaza edin.
    3. Saklama süresince kloramin çözeltisini haftada bir kez değiştirin.
  2. Dentin disklerin hazırlanması
    1. Her bir dişi, 350.000 rpm hızında çalışan ve silindirik elmas frez (1 mm çap; 100–150 µm tane boyutu) ile donatılmış yüksek hızlı bir angldruva kullanarak kronun orta üçte birlik kısmından yatay olarak kesin.
    2. Kesim işlemini yaklaşık 50 mL/dk hızında sürekli su irrigasyonu altında gerçekleştirin.
    3. Pulpa odasından ve oklüzal oluk ve fissürlerde bulunan mine tabakasından kaçınmak için kesiti kronun orta üçte birlik kısmına konumlandırarak, ağırlıklı olarak dentin dokusundan oluşan bir disk elde edin.
      UYARI: Diş kesim işlemini sürekli irrigasyon altında gerçekleştirin ve eldiven, maske ile koruyucu gözlük dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu donanım kullanın.
  3. Dentin disklerin bitim işlemleri
    1. Sırasıyla azalan tane boyutuna sahip bitim diskleri kullanarak dentin diski cilalayın.
    2. Yaklaşık 0,8 mm (±± 0,3 mm) son dentin kalınlığına ve yaklaşık 5 mm × 5 mm (±± 0,3 mm) lateral boyutlara ulaşana kadar cilalama işlemine devam edin (Şekil 1D).
  4. Dentin disklerin saklanması
    1. Hazırlanan dentin diskleri, OoC cihaz montajına kadar 4°C'de %0,5'lik kloramin çözeltisinde saklayın.

Mikroakışkan cihaz montaj diyagramı; cımbızlar, delme aleti ve sıvı kanallama ile fabrikasyon aşamaları.
Şekil 1: Dentin-pulpa kompleksi çip-üzerinde-organ (OoC) cihazının tasarım ve fabrikasyon iş akışı. (A) Cihazın üç katmanlı mimarisini gösteren üç boyutlu tasarımı. (B) Temel boyutlarla birlikte cihaz tasarımının üstten görünümü. (C) Üç katmanlı cihaz konfigürasyonunun yan görünümü. (D) Yaklaşık 0,8 mm kalınlıkta ve yaklaşık 5 mm × 5 mm yan boyutlarda hazırlanan temsili dentin diski. (E) Fotolitografi ile üretilen ve üst ile alt polidimetilsiloksan (PDMS) katmanlarının dökümü için kullanılan silikon ana kalıp. (F) Termal polimerizasyon sonrası kürlenmiş PDMS katmanının silikon kalıptan çıkarılması. (G) Katman yapıştırma öncesi PDMS yüzeyinin plazma işlemi. (H) Plazma bağlama ile monte edilen ve dentin arayüzünü içeren nihai üç katmanlı dentin-pulpa kompleksi OoC cihazı. (I) Sızıntı testi için borulara bağlanan ve mikroakışkan deneyler için hazırlanan monte edilmiş cihaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Dentin-pulpa kompleksi OoC cihazının üretimi

  1. Çalışma alanının ve malzemelerin hazırlanması
    1. Malzeme ve ekipmanların hazırlanması
      1. Cihaz imalatına başlamadan önce Malzemeler Tablosu'nda listelenen tüm malzeme ve ekipmanları hazırlayın.
      2. Cihaz montajından önce biyopsi pançlarını hazırlayın.
      3. Tüm imalat prosedürlerini temiz, tozsuz bir ortamda gerçekleştirin.
      4. Cihaz imalatı ve montajı boyunca eldiven, koruyucu gözlük ve uygun kişisel koruyucu donanım kullanın.
        NOT: Protokole başlamadan önce fotolitografi ile üretilen kalıbı hazırlayın (Şekil 1E).
  2. Mikroyapılı kalıbın imalatı
    1. Silikon gofretin hazırlanması
      1. Kalıbı 4 inçlik, tek tarafı parlatılmış bir silikon gofret (N-tipi, As-katkılı, CZ büyüme yöntemi, <100> oryantasyon, 500 ±± 25 µm kalınlık, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, özdirenç 0.001–0.005 Ω·cm) üzerinde üretin.
      2. Gofreti sırasıyla aseton, izopropanol ve ultra saf suda, ultrasonikasyon altında her biri 10 dk boyunca temizleyin.
      3. Gofreti basınçlı hava ile kurulayın.
      4. Kalıntı nemi gidermek için gofreti bir sıcak plaka üzerinde 200°C'de 10 dk boyunca ısıtın.
      5. Gofretin oda sıcaklığına (RT; 20°C–25°C) soğumasını bekleyin.
    2. Yüzey aktivasyonu ve fotorezist kaplama
      1. Silikon gofret yüzeyini, 7. seviyede hava plazması ile 120 sn boyunca çalışan bir vakum plazma temizleyici kullanarak aktive edin.
      2. GM 1060 epoksi bazlı negatif fotorezisti, 300 rpm'de 10 sn boyunca spin kaplama (döndürerek kaplama) yöntemiyle uygulayın.
      3. 200 rpm/s ivmelenme kullanarak spin kaplamaya 565 rpm'de 100 sn ve 965 rpm'de 1 sn boyunca devam edin.
      4. Kaplanan gofretin 10 dk boyunca dinlenmesini sağlayın.
      5. 65°C'de 10 dk boyunca ön pişirme (pre-bake) işlemi gerçekleştirin.
      6. Ön pişirme işlemini 95°C'de 1 saat boyunca sürdürün.
      7. Gofretin RT'ye soğumasını bekleyin.
    3. Pozlama ve geliştirme
      1. Fotorezisti, doğrudan lazer litografi sistemi kullanarak 1.950 mJ/cm2 dozunda pozlayın.
      2. 65°C'de 10 dk boyunca son pişirme (post-bake) işlemi gerçekleştirin.
      3. Son pişirme işlemini 95°C'de 30 dk boyunca sürdürün.
      4. Gofretin RT'ye soğumasını bekleyin.
      5. Gofretin 10 dk boyunca dinlenmesini sağlayın.
      6. Deseni PGMEA içerisinde 4 dk boyunca geliştirin.
      7. Kalıntı fotorezist kalmışsa geliştirmeyi 30 saniyelik aralıklarla uzatın.
      8. Geliştirmeyi izopropanol ile durulayarak durdurun.
      9. Gofreti basınçlı hava kullanarak kurulayın.
    4. Sert pişirme (Hard bake)
      1. 135°C'de 2 saat boyunca sert pişirme işlemi gerçekleştirin.
      2. 1 mm genişliğinde ve 50 µm yüksekliğinde mikrokanallar içeren mikroyapılı bir ana kalıp elde edin.
  3. PDMS karışımının hazırlanması ve gaz giderme
    1. PDMS karışımının hazırlanması
      1. PDMS bazını ve kürleme ajanını 10:1 ağırlık oranında karıştırın.
      2. Karışımı plastik bir beher içinde cam bir çubukla yaklaşık 5 dk boyunca manuel olarak karıştırın.
      3. Karıştırma sırasında yavaş ve sürekli dairesel hareketleri sürdürün.
        NOT: Karıştırma sırasında hava kabarcığı oluşmasından kaçının.
    2. Gaz giderme (Degassing)
      1. PDMS karışımını bir vakum pompasına bağlı vakum desikatörüne yerleştirin.
      2. Karışımı yaklaşık 700 mmHg basınçta 5 dk boyunca gazdan arındırın.
      3. Yüzey kabarcıklarının patlamasına izin vermek için vakumu kısa süreliğine kesin.
      4. Vakumu yeniden uygulayın.
      5. Görünür kabarcık kalmayana kadar döngüyü tekrarlayın.
        NOT: Toplam gaz giderme süresi tipik olarak yaklaşık 30 dk'dır.
  4. PDMS'in kalıp üzerine dökümü
    1. Kalıbın hazırlanması
      1. Kalıbı düz bir yüzeye yerleştirin.
      2. Kalıbı basınçlı hava kullanarak temizleyin.
      3. Desenli yüzeyle doğrudan temastan kaçının.
      4. Kalıbın toz ve kontaminantlardan arınmış olduğunu doğrulayın.
    2. PDMS'in dağıtılması
      1. Dentin gömme tabakasını oluşturmak için dentin diskinin etrafına yaklaşık 8 g PDMS dağıtın.
      2. PDMS yüksekliğini dentin disk kalınlığına (0.8 ±± 0.3 mm) uyacak şekilde ayarlayın.
      3. PDMS'in dentin yüzeyini kapatmasını önleyin.
      4. Her bir mikrokanal tabakasını oluşturmak için kalıp ünitesi başına yaklaşık 0.26 g PDMS dağıtın.
      5. Mikroyapıların dolumunu kolaylaştırmak için kalıba hafifçe vurun veya vibrasyon uygulayın.
      6. PDMS'in en küçük özelliklere yerleşmesini bekleyin.
      7. PDMS yüzeyine temas etmeden kalıbı bir kapak veya düz bir örtü ile kapatın.
        NOT: Dentin gömme tabakası yaklaşık 0.8 mm kalınlığında ve her bir mikrokanal tabakası yaklaşık 0.4 mm kalınlığındadır; bu da toplamda yaklaşık 1.6 mm cihaz kalınlığı sağlar.
        NOT: Konfokal görüntüleme planlandığında, tabaka kalınlığını konfokal objektifin çalışma mesafesine göre ayarlayın.
  5. Kürleme
    1. Kalıpları 50°C'deki bir fırına yerleştirin.
    2. PDMS'i 4 saat boyunca kürleyin.
  6. PDMS tabakalarının çıkarılması
    1. Kürlenmiş PDMS'in çıkarılması
      1. Kürlenmiş PDMS tabakalarını dikkatlice kalıptan soyun (Şekil 1F).
      2. Mikroyapılara zarar vermemek için PDMS tabakalarını dikkatli bir şekilde taşıyın.
  7. PDMS tabakalarının yapıştırılması ve giriş-çıkış portlarının imalatı
    1. Giriş ve çıkış portlarının imalatı
      1. 1 mm'lik bir biyopsi pançı kullanarak belirlenen giriş ve çıkış konumlarında perforasyonlar oluşturun.
      2. Panç işlemi sırasında mikrokanal tarafının yukarı baktığından emin olun.
        NOT: Yapısal hasarı önlemek için PDMS tabakasını bir kesme matı üzerine yerleştirin.
      3. Üst tabakada, üst mikrokanala karşılık gelen iki perforasyon oluşturun.
    2. PDMS tabakalarının temizlenmesi
      1. PDMS tabakalarını izopropil alkol veya etanol kullanarak temizleyin.
      2. Kalıntı toz partiküllerini steril yapışkan bant kullanarak temizleyin.
      3. Montajdan önce tüm yapıştırma yüzeylerinin kontaminantlardan arınmış olduğunu doğrulayın.
    3. PDMS yüzeylerinin plazma aktivasyonu
      1. Üst ve orta PDMS tabakalarını plazma işlemi için konumlandırın (Şekil 1G).
      2. Yüzeyleri, çalışma gazı olarak ortam havası kullanan ve yaklaşık 25 W'da çalışan el tipi bir korona plazma cihazı ile aktive edin.
      3. Plazma kaynağı ile PDMS yüzeyi arasında yaklaşık 1 mm'lik bir çalışma mesafesi koruyun.
        DİKKAT: Plazma işlemini uygun havalandırma altında gerçekleştirin ve plazma tarafından üretilen ozona doğrudan maruz kalmaktan kaçının.
      4. Plazma işlem cihazını çalıştırın ve 5 sn boyunca stabilize olmasını bekleyin.
      5. İşlemden önce homojen bir plazma demeti oluştuğunu doğrulayın.
      6. Üst PDMS tabakasını, yaklaşık 5 mm/s hızla sürekli ileri-geri hareketle 10 sn boyunca işleyin.
      7. Orta PDMS tabakasını, aynı hareket ve mesafe ile 10 sn boyunca işleyin.
      8. Yapıştırmadan hemen önce üst tabakaya ek olarak 1 sn plazma işlemi uygulayın.
    4. Üst ve orta tabakaların yapıştırılması
      1. Plazma işleminden hemen sonra üst mikrokanalı dentin disk ile hizalayın.
      2. Üst ve orta tabakaları birbirine yapıştırın.
      3. Yapıştırılmış düzeneği 75°C'deki bir fırında 5 dk boyunca bekletin.
      4. İnkübasyon sırasında bağı güçlendirin.
        NOT: Dentin disk ve mikrokanal çıplak gözle görülebilir ve ek hizalama araçlarına gerek kalmadan hizalanabilir.
    5. Alt mikrokanal portlarının imalatı
      1. Yapıştırılmış üst ve orta tabakalardan geçerek, alt mikrokanala karşılık gelen iki perforasyon açın.
      2. Hizalamayı sağlamak için panç işlemini her iki tabakadan aynı anda gerçekleştirin.
        NOT: Bu prosedür, üst tabakada dört perforasyon ve orta tabakada iki perforasyon oluşturur.
      3. Panç işleminden önce yapıştırılmış düzeneği sağlam bir kesme matına yerleştirin.
      4. Tek bir hareketle istikrarlı bir aşağı yönlü basınç uygulayın.
        NOT: Delaminasyon riskini minimize etmek için rotasyonel veya yanal kuvvetlerden kaçının.
      5. Perforasyon bölgelerindeki kalıntıları, izopropil alkol ile nemlendirilmiş tüy bırakmayan steril gazlı bez kullanarak temizleyin.
      6. Perforasyonları ve çevreleyen yapışmış alanları yeterli ışık altında inceleyin.
      7. Devam etmeden önce delaminasyon, yırtılma veya eksik perforasyon olmadığını doğrulayın.
    6. Alt tabakanın yapıştırılması
      1. Alt tabakaya Adım 2.7.4'te açıklandığı gibi plazma işlemi uygulayın.
      2. Alt mikrokanalın giriş ve çıkış portlarını, üst ve orta tabakalardaki perforasyonlar ile hizalayın.
      3. Cihaz montajını tamamlamak için alt tabakayı yapıştırın.
        NOT: Hizalamayı kolaylaştırmak için yapıştırmadan önce alt tabakanın dış yüzeyine giriş ve çıkış konumlarını işaretleyin.
        NOT: Literatürde bildirildiği üzere36, plazma odaları plazma kalemlerine göre daha güçlü yapışma sağlayabilir.
        NOT: Tamamlanan cihaz, bir dentin arayüzü içeren üç tabakalı bir mikroakışkan platformdan oluşur (Şekil 1H). Alt dentin yüzeyi modelin pulpa tarafını, üst dentin yüzeyi ise dental biyomalzemeler veya bakteriyel preparatlar için koronal tarafı temsil eder.
  8. Mikroakışkan cihazın sızdırmazlık testi
    1. Montajı tamamlanmış cihazın incelenmesi
      1. Montajı tamamlanmış cihazı hizalama hataları açısından inceleyin.
      2. Düzeneği eksik yapışma ve görünür sızıntılar açısından inceleyin.
    2. Sızdırmazlık testi
      1. Giriş portlarına 19G Luer-lock iğneler bağlayın (Şekil 1E).
      2. İğneleri mikroakışkan pompa hortumlarına bağlayın.
      3. Hava sızdırmaz bir uyum elde etmek için iğne göbeklerini pançla açılmış portlara hafifçe bastırın.
      4. 10 µL/min akış hızında steril PBS veya kültür ortamı enjekte edin.
      5. Sıvı akışını en az 5 dk boyunca sürdürün.
      6. Akış sırasında tüm yapışmış arayüzleri, kanal kenarlarını ve dentin disk sınırlarını inceleyin.
      7. Enjeksiyon sırasında ve sonrasında cihazı yeterli ışık altında gözlemleyin.
      8. Sıvı birikimi, ıslaklık veya damlacık oluşumu olmadığını doğrulayın.
      9. Sızıntı tespit edilmezse cihazı sızdırmaz olarak sınıflandırın.
      10. Sızıntı gösteren cihazları atın.
        NOT: Hücre ekimi veya deneysel kullanımdan önce üretilen her cihazda sızdırmazlık testi gerçekleştirin.
  9. Mikroakışkan cihazın sterilizasyonu ve saklanması
    1. Sterilizasyon
      1. Montajı tamamlanmış cihazın üst yüzeyini, bir laminar akış kabini içinde 30 dk boyunca UV ışığına (254 nm) maruz bırakın.
      2. Alt yüzeyi ek olarak 30 dk boyunca UV ışığına maruz bırakın.
      3. Mikrokanalları 20 dk boyunca %70 etanol ile yıkayın.
      4. Kalıntı etanolü gidermek için mikrokanalları steril PBS ile üç kez yıkayın.
    2. Saklama
      1. Sterilize edilmiş cihazı hücre kültürü deneyleri için hemen kullanın.
      2. Alternatif olarak, cihazı kullanıma kadar steril bir kap içinde, steril PBS'e daldırılmış halde 4°C'de saklayın.
        ​DİKKAT: Cihaz montajından sonra kloramin veya diğer dezenfektan solüsyonları kullanmayın; çünkü PDMS bu bileşikleri absorbe edebilir ve hücre canlılığını tehlikeye atabilir.

3. Dental pulp kök hücre adezyonunun ve canlılığının değerlendirilmesi

  1. Dentin yüzeyinin ön koşullandırılması
    1. Cihazın içine %10 EDTA enjekte edin.
    2. EDTA çözeltisi ile dentin yüzeyi arasındaki teması 15 dk boyunca sürdürün.
    3. Mikrokanal içindeki sıvı hareketini korumak için her 3 dk'da bir 0.5 mL EDTA enjekte edin.
    4. Dentin diski ultrapure su ile üç kez yıkayın.
    5. Her yıkama işlemini 5 dk boyunca sürdürün.
      NOT: EDTA işlemi smear tabakasını uzaklaştırır ve dentin matriks proteinlerini açığa çıkarır.
      DİKKAT: Cilt ve göz irritasyonunu önlemek için EDTA çözeltilerini eldiven ve koruyucu gözlük kullanarak tutun.
  2. Dental pulpa kök hücrelerinin ekilmesi
    1. Dental pulpa kök hücrelerinin ekspansiyonu
      1. Dental pulpa kök hücrelerini bir T75 flask'a flask başına 1 × 106 hücre yoğunluğunda ekleyin.
      2. Hücreleri, yaklaşık %80 konfluens seviyesine ulaşana kadar 37°C ve %5 CO2 ortamında inkübe edin.
      3. Hücreleri tripsin kullanarak ayırın.
      4. Tripsini komple kültür medyumu ile nötralize edin.
      5. Hücre pelletini elde etmek için hücre süspansiyonunu santrifüjleyin.
      6. Hücre canlılığını trypan blue kullanarak değerlendirin.
      7. Canlılığı ≥%90 olan hücre süspansiyonlarını kullanın.
    2. Hücre süspansiyonunun hazırlanması
      1. 37°C'de önceden ısıtılmış bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
      2. Hücre konsantrasyonunu komple kültür medyumunda 100,000 hücre/mL olacak şekilde ayarlayın.
      3. 1–2 mL'lik bir final süspansiyon hacmi hazırlayın.
        NOT: Bu çalışmada pasaj 5'teki hücreler kullanılmıştır.
    3. Hücre ekimi
      1. Hücre süspansiyonunu alt mikrokanalın giriş portuna enjekte edin.
      2. Hücre ekiminden sonra cihazı ters çevirin
        NOT: Cihazın ters çevrilmesi, hücrelerin dentin yüzeyine doğru çökelmesini teşvik eder ve hücre adezyonunu artırır.
    4. İnkübasyon
      1. Ters çevrilmiş cihazı bir Petri kabının içine yerleştirin.
      2. Buharlaşmayı en aza indirmek için Petri kabına 1 mL kültür medyumu ekleyin.
      3. Cihazı 37°C ve %5 CO2 ortamında 24 sa boyunca inkübe edin.
      4. İnkübasyon süresi boyunca statik kültür koşullarını koruyun.
        NOT: Bu çalışmada dinamik akış doğrulaması yapılmamıştır.
        NOT: Mevcut protokol, başlangıç cihaz doğrulaması ve hücre adezyon değerlendirmesi için statik kültür koşullarını tanımlamaktadır.
    5. Başlangıç cihaz doğrulaması
      1. Hücre adezyonunu taramalı elektron mikroskobu kullanarak değerlendirin.
      2. Analizden önce cihazı sökerek dentin diski geri alın.
  3. Taramalı elektron mikroskobu için numunelerin hazırlanması
    1. Numunenin geri alınması ve yıkanması
      1. 24 sa'lik inkübasyonun ardından cihazı sökün.
      2. Dentin diski geri alın ve bir kültür plağına veya Petri kabına aktarın.
      3. Hücre ekilmiş dentin yüzeyini yukarı bakacak şekilde konumlandırın.
      4. Dentin diski 1 mL PBS kullanarak iki kez yıkayın.
    2. Fiksasyon
      1. 0.1 M Sorensen fosfat tamponunda %2.5'lik 2 mL glutaraldehit ekleyin.
      2. Numuneyi oda sıcaklığında (RT) 30 dk boyunca inkübe edin.
        DİKKAT: Glutaraldehit toksiktir ve cilt, gözler ile solunum yollarında irritasyona neden olabilir. Fiksasyon prosedürlerini uygun kişisel koruyucu ekipman giyerek kimyasal çeker ocak içinde gerçekleştirin.
    3. Fiksasyon sonrası yıkama
      1. Glutaraldehit çözeltisini uzaklaştırın.
      2. Dentin diski oda sıcaklığında (RT) ultrapure distile su ile üç kez yıkayın.
    4. SEM analizi
      1. Numuneleri çevresel taramalı elektron mikroskobu kullanarak analiz edin.
      2. Mikroskobu düşük vakum koşullarında (25 Pa) çalıştırın.
      3. 10.0 kV hızlandırma voltajı ve 7.0 mm çalışma mesafesi kullanın.
      4. Geri saçılan elektron 3D tespit modunu (BSE-3D) kullanarak görüntüler elde edin.
      5. ×200 büyütmede görüntüler yakalayın (Şekil 2A).
  4. Konfokal mikroskopi ile hücre canlılığının değerlendirilmesi
    1. Numune hazırlama
      1. Hücreleri Adım 3.2'de açıklandığı gibi ekin ve kültüre edin.
      2. Cihazı 37°C ve %5 CO2 ortamında 24 sa boyunca inkübe edin.
      3. Cihazı sökün ve dentin yüzeyini açığa çıkarın.
      4. Dentin diski, Ca2+ ve Mg2+ ile desteklenmiş, önceden ısıtılmış HBSS+/+ içeren bir kuyulu plağa aktarın.
    2. Numune yıkama
      1. Dentin diski HBSS+/+ ile iki kez yıkayın.
      2. Boyama işleminden önce kalıntı serum ve fenol kırmızısını uzaklaştırın.
        NOT: Kalıntı serum ve fenol kırmızısı arka plan otofloresansını artırabilir.
    3. Canlı hücre boyama
      1. HBSS+/+ içerisinde 2 µM konsantrasyonda taze bir Calcein AM çalışma çözeltisi hazırlayın.
      2. Dentin yüzeyini tamamen kaplayacak miktarda boyama çözeltisi ekleyin.
      3. Numuneyi 37°C'de, karanlıkta 20 dk boyunca inkübe edin.
      4. İnkübasyondan sonra boyama çözeltisini uzaklaştırın.
    4. Ölü hücre boyama
      1. Propidium Iodide çalışma çözeltisi (HBSS+/+ içerisinde 1–2 µg/mL) ekleyin.
      2. Numuneyi 37°C'de, karanlıkta 5–8 dk boyunca inkübe edin.
      3. İnkübasyon süresinin 10 dk'yı geçmesine izin vermeyin.
      4. Numuneyi HBSS+/+ ile iki kez yıkayın.
      5. Numuneyi görüntüleme anına kadar tampon çözelti içinde tutun.
    5. Konfokal mikroskopi görüntüleme
      1. Konfokal görüntüleri boyamadan sonraki 30 dk içinde elde edin.
      2. Görüntüleri sırasıyla yeşil ve kırmızı kanallarda alın.
      3. Canlı hücre görüntüleme için λex 490 nm ve λem 515 nm kullanın.
      4. Ölü hücre görüntüleme için λex 535 nm ve λem 617 nm kullanın.
        ​NOT: Floresan boyama çözeltilerini ve boyanmış numuneleri inkübasyon ve görüntüleme prosedürleri sırasında ışık maruziyetinden koruyun (Şekil 2B).

Elektron mikroskobu ve floresan mikroskobu karşılaştırması, hücresel yapı analizi.
Şekil 2: Dentin-pulpa kompleksi OoC cihazı içerisinde dental pulpa kök hücre yapışmasının ve canlılığının temsili değerlendirmesi. (A) OoC cihazı içerisinde 24 saatlik statik kültür sonrası dentin yüzeyindeki yapışmış dental pulpa kök hücrelerini (beyaz yıldız) gösteren taramalı elektron mikroskobu görüntüsü. 24 saatlik kültür sonrası, yapışmış hücreler mikrokanala maruz kalan dentin yüzeyinin %54,35 ± 0,92'sini kaplamıştır. PDMS ile kaplı dentin bölgesinde (siyah yıldız) hücre gözlenmemiştir, bu durum cihaz katmanları arasında etkili sızdırmazlık olduğunu göstermektedir. Ölçek çubuğu = 200 µm. (B) 24 saatlik statik kültür sonrası yeşil renge boyanmış canlı ve dentin yüzeyine yapışmış dental pulpa kök hücrelerini (beyaz oklar) gösteren konfokal mikroskopi görüntüsü. Kırmızı renge boyanmış canlı olmayan hücreler de gözlenmektedir (mavi oklar). Ölçek çubuğu = 50 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Diş-on-a-chip cihazının başarılı üretimi; dentin disk hazırlığı (Şekil 1D), fotolitografi tabanlı kalıbın üretimi (Şekil 1E), kürlenmiş PDMS katmanlarının çıkarılması (Şekil 1F), yapıştırma öncesi plazma aktivasyonu (Şekil 1G), nihai cihazın montajı (Şekil 1H) ve cihazın mikroakışkan düzeneğe bağlanmasını (Şekil 1I) içeren,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, dentin ve dental pulpa kök hücrelerini içeren dikey istiflenmiş bir diş-çip (tooth-on-a-chip) cihazının üretimi için adım adım bir protokol tanımlamakta ve statik kültür koşulları altında cihaz içindeki temsili hücre yapışmasını ve canlılığını göstermektedir. Protokol, dentin arayüzünün in vitro çalışmaları için uygun bir dentin-pulpa kompleksi OoC platformunun üretimi ve montajı içinle tekrarlanabilir bir iş akışı sağlamak amacıyla geliştirilmiştir. Böyle bir iş akışının oluşturulması özellikle önemlidir; çü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, herhangi bir rakip finansal çıkarı olmadığını ve beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması bulunmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Universidad de La Frontera, Dirección de Investigación bünyesindeki DIM24-0004 ve PP24-0031 projeleri; FONDECYT Regular No. 1260116 ve Şili Ulusal Araştırma ve Geliştirme Ajansı (ANID) bünyesindeki FONDECYT de Iniciación No. 11230701 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Biyolojik ve kimyasal malzemeler
AsetonExpertQSOLV 8Silikon gofre temizliği
Alpha MEM kültür ortamıCytivaSH30265.02Dental pulpa kök hücre kültür ortamı
Kloramin (%0,5)Merck7080-50-4Dentin diskleri için saklama solüsyonu
Dental pulpa kök hücreleriUygulanamazUygulanamazPrimer hücre kültürü. Bkz. Adımlar 3.2.1 ve 3.2.2
EDTA (%10)WinklerN2222158ESürme tabakasının uzaklaştırılması
Epoksi bazlı negatif fotoresistGersteltecGM1060Fotolitografi kalıp üretimi
0,1 M Sorensen’s fosfat tamponunda glutaraldehit (%2,5)Sigma-Aldrich210908-06SEM fiksasyonu
Sağlıklı insan dişleri (molar veya premolar)UygulanamazUygulanamazİnsan örneği
İzopropanolExpertQSOLV 16Gofre temizliği, geliştirme durdurma ve PDMS temizliği
LIVE/DEAD Canlılık KitiSigma-Aldrich451Floresan canlılık boyaması. 
PBS (fosfat tamponlu salin)Corning46-013-CMYıkama ve sızıntı testi
PDMS baz ve kürleme ajanı (polidimetilsiloksan)DowSylgard 184Cihaz üretimi
PGMEASigma Aldrich484431Fotoresist geliştirme
Tripan mavisiSigma Aldrich T8154-100mlHücre canlılığı değerlendirmesi
TripsinCorning25-053-CIHücre ayırma
Ultrapure suCytivaSH30529.01Yıkama solüsyonu
Sarf malzemeleri ve laboratuvar gereçleri
19G şırınga iğneleriVmaticVCB19050Cihazın mikropompaya veya şırıngaya bağlanması
Biyopsi pançı (çap: 1 mm)Harris UnicoreWHAWB100073Giriş ve çıkış portu üretimi
Kesme matıNicecoolUygulanamazPançlama sırasında yüzey koruması
Dental bitirme diskleri (ör. Sof-Lex)3MSof-LexDentin cilalama
Dişi Luer-tırtıklı adaptörlerRunze FluidicsRH-M016Tüp bağlantısı
Cam veya plastik karıştırma çubuğuDuranUygulanamazPDMS karıştırma
Hipodermik şırıngalarCranberrypc-12246Hücre ekimi ve sızıntı testi
Havsız steril gazlı bezLindersonUygulanamazPanç kalıntılarının temizlenmesi
Erkek Luer adaptörlerRunze FluidicsRH-G016Tüp bağlantısı
Karıştırma kabıDuranUygulanamazPDMS hazırlama
Petri kabı (140 mm × 20 mm)Deltalab2000219Hücre kültürü/inkübasyon
Politetrafloroetilen tabanCCTValUygulanamazAra dentin tabakası üretimi
Silikon gofreJiaozuo Commercial FineWinUygulanamazKalıp üretimi
Silikon tüpRunze Fluidics96421Akışkan bağlantısı
T75 flaskCorning 353136Dental pulpa kök hücre genişletme
Çok kuyucuklu plakaSPL Life Sciences30006Konfokal boyama ve görüntüleme hazırlığı
Ekipman ve enstrümanlar
Hava kurutucuMETALPLANTITAN-040Sıkıştırılmış hava kurutma
Sıkıştırılmış hava kaynağıSCHULZCSD-18.1Kalıp ve yüzey temizliği
Konfokal mikroskopOlympusUygulanamazModel: FV1000
Direkt lazer litografi sistemiHeidelberguPG 101Fotoresist pozlama
Çevresel taramalı elektron mikroskobuHitachiUygulanamazModel: Quanta 400 
Yüksek hızlı angldruvaNakanishiUygulanamazModel: Pana-max2
Isıtıcı tablaLabTechEH20A PlusGofre pişirme ve fotoresist pişirme
Laminar akış kabiniBioBaseBBS8V1708313DCihaz sterilizasyonu
Mikroakışkan pompaNew EraUygulanamazModel: 1002X-ES. 10 µL/dakika hızında sızıntı testi
Mikroyapılı kalıp (fotolitografi ile üretilmiştir)CCTValUygulanamazKalıp üretim özellikleri için Bkz. Adım 2.2
Fırın veya inkübatörMemmertUN11050°C'de PDMS kürleme ve 75°C'de bağ konsolidasyonu
Vakumlu Plazma Temizleme KabiniFari PlasmaGD-5Gofre plazma aktivasyonu
El tipi Korona Plazma Aurora Pro ScientificAPS-CD-20ACPDMS plazma aktivasyonu
Ultrasonik temizleyiciElma SonicS 10 (H)Gofre temizliği
Vakum kabini veya desikatör (250 mm)WinglassUygulanamazPDMS gaz giderme
Vakum pompasıROCKER300PDMS gaz giderme

Kaynaklar

  1. Schlüter KD. The use of animals in physiological science: the past, the present, and the future. Pflugers Arch. 2024;476(11):1653-63.
  2. Robinson NB, et al. The current state of animal models in research: a review. Int J Surg. 2019;72:9-13.
  3. Nakashima M, et al. Animal models for stem cell-based pulp regeneration: foundation for human clinical applications. Tissue Eng Part B Rev. 2019;25(2):100-13.
  4. Ribeiro AB, et al. Short-term effect of ligature-induced periodontitis on cardiovascular variability and inflammatory response in spontaneously hypertensive rats. BMC Oral Health. 2021;21(1):515.
  5. IQVIA Institute. Global trends in R&D 2022. IQVIA Institute; 2021.
  6. Loewa A, Feng JJ, Hedtrich S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 2023;1:1-15.
  7. Paul SM, et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(3):203-14.
  8. Rosa V, et al. A critical analysis of research methods and biological experimental models to study pulp regeneration. Int Endod J. 2022;55(Suppl 2):446-55.
  9. França CM, et al. The tooth on-a-chip: a microphysiologic model system mimicking the biologic interface of the tooth with biomaterials. Lab Chip. 2020;20(2):405-13.
  10. Zhang H, et al. Research and development of microenvironment's influence on stem cells from the apical papilla: construction of novel research microdevices, tooth-on-a-chip. Biomed Microdevices. 2024;26(3):33.
  11. Han JJ. FDA Modernization Act 2.0 allows for alternatives to animal testing. Artif Organs. 2023;47(3):449-50.
  12. Leung C, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2:33.
  13. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006;442:368-73.
  14. Belin S, Zuloaga KL, Poitelon Y. Influence of mechanical stimuli on Schwann cell biology. Front Cell Neurosci. 2017;11:347.
  15. Jansen KA, et al. A guide to mechanobiology: where biology and physics meet. Biochim Biophys Acta. 2015;1853(11):3043-52.
  16. Atif AR, et al. A microfluidics-based method for culturing osteoblasts on biomimetic hydroxyapatite. Acta Biomater. 2021;127:327-37.
  17. Soragni C, et al. A versatile multiplexed assay to quantify intracellular ROS and cell viability in 3D on-a-chip models. Redox Biol. 2022;57:102488.
  18. Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23(8):467-91.
  19. Huang C, et al. The application of organs-on-a-chip in dental, oral, and craniofacial research. J Dent Res. 2023;102(4):364-75.
  20. Rodrigues NS, et al. Biomaterial and biofilm interactions with the pulp-dentin complex-on-a-chip. J Dent Res. 2021;100(10):1136-43.
  21. Cordiale A, et al. An innovative "tooth-on-chip" microfluidic device emulating the structure and physiology of the dental pulp tissue. Adv Healthc Mater. 2025. doi:10.1002/adhm.202502080.
  22. Sanz-Serrano D, Mercade M, Ventura F, Sánchez-de-Diego C. Engineering a microphysiological model for regenerative endodontic studies. Biology. 2024;13(4):221.
  23. Qi Y, et al. Fabrication of tapered fluidic microchannels conducive to angiogenic sprouting within gelatin methacryloyl hydrogels. J Endod. 2021;47(1):52-61.
  24. Hu Q, et al. Gum-on-a-chip exploring host-microbe interactions: periodontal disease modeling and drug discovery. J Tissue Eng. 2025;16:20417314251314356.
  25. Svanberg S, et al. "Periodontal ligament-on-chip" as a novel tool for studies on the physiology and pathology of periodontal tissues. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303942.
  26. Mishra A, et al. Fluid flow-induced modulation of viability and osteodifferentiation of periodontal ligament stem cell spheroids-on-chip. Biomater Sci. 2023;11(22):7432-44.
  27. Rahimi C, et al. Oral mucosa-on-a-chip to assess layer-specific responses to bacteria and dental materials. Biomicrofluidics. 2018;12(5):054106.
  28. Dhall A, et al. A dental implant-on-a-chip for 3D modeling of host-material-pathogen interactions and therapeutic testing platforms. Lab Chip. 2022;22(24):4905-16.
  29. Franca CM, et al. In vitro models of biocompatibility testing for restorative dental materials: from 2D cultures to organs-on-a-chip. Acta Biomater. 2022;150:58-66.
  30. Hu S, et al. Characterization of silver diamine fluoride cytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip and gingival equivalents. Dent Mater. 2022;38(8):1385-94.
  31. Niu L, et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(9):4844-51.
  32. Sriram G, Makkar H. Microfluidic organ-on-chip systems for periodontal research: advances and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 2025;12:1490453.
  33. Pierfelice TV, et al. A systematic review on organ-on-a-chip in PDMS or hydrogel in dentistry: an update of the literature. Gels. 2024;10(2):102.
  34. Baeza-Fernández J, Bucchi C. Organ-on-a-chip devices to simulate the dentin-pulp complex: a qualitative systematic review. Ann Biomed Eng. 2026. doi:10.1007/s10439-026-04058-0.
  35. Arola D, et al. Transition behavior in fatigue of human dentin: structure and anisotropy. Biomaterials. 2007;28(26):3867-75.
  36. Kratz SRA, et al. A compression transmission device for the evaluation of bonding strength of biocompatible microfluidic and biochip materials and systems. Sci Rep. 2020;10(1):1400.
  37. Carvalho V, et al. 3D printing techniques and their applications to organ-on-a-chip platforms: a systematic review. Sensors (Basel). 2021;21(9):3304.
  38. LeGoff L, Lecuit T. Mechanical forces and growth in animal tissues. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;8(3):a019232.
  39. Akimoto S, et al. Laminar shear stress inhibits vascular endothelial cell proliferation by inducing cyclin-dependent kinase inhibitor p21(Sdi1/Cip1/Waf1). Circ Res. 2000;86(2):185-90.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

ip zerinde OrganMikroak kan CihazPDMS D k mFotolitografiPlazma Y zey lemiDental Pulpa K k H creleriH cre AdezyonuKonfokal Mikroskopi

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.