Yöntem makalesi

İnsan Dentin Diski Kullanılarak Dikey İstiflenmiş Bir Dentin-Pulpa Kompleksi Organ-on-a-Chip Cihazının Fabrikasyonu

DOI:

10.3791/71713

⸱

14 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan dentin diski ve fotolitografi ile üretilmiş mikrokanallar içeren, dikey olarak istiflenmiş bir dentin-pulpa kompleksi organ-on-a-chip cihazının fabrikasyonunu ve montajını, ardından dental pulpa kök hücre ekimini ve kültürünü tanımlamak için.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan modelleri ve statik hücre kültürleri dahil olmak üzere diş araştırmalarında kullanılan geleneksel preklinik modeller, dentin-pulpa arayüzünün fizyolojik koşullarını yeniden oluşturma ve dental biyomateryallere verilen insan biyolojik yanıtlarını öngörme konusunda önemli kısıtlamalar sunmaktadır. Organ-on-a-chip (OoC) teknolojisi, kontrollü mikroakışkan sistemler içerisinde dokuya özgü mikroortamların yeniden oluşturulmasına olanak tanıyarak alternatif bir yaklaşım sağlamaktadır. Bu makale, üç katmanlı bir polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan platformu içerisinde insan dentin diskini barındıran bir dentin-pulpa kompleksi OoC cihazının üretimi ve montajı için adım adım bir protokol tanımlamaktadır. Protokol; dentin disk hazırlığı, fotolitografi kullanılarak mikroyapılı kalıpların üretimi, PDMS dökümü ve kürlenmesi, plazma destekli katman yapıştırma, cihaz montajı, sızıntı testi ve statik kültür koşulları altında dental pulpa kök hücre ekimini içermektedir. PDMS katman kalınlığının kontrolü, plazma yüzey işlemi ve sızıntıyı minimize etmek için dentin diskinin cihaz içine entegrasyonu dahil olmak üzere, cihaz performansını etkileyen kritik üretim parametreleri tartışılmıştır. Cihaz içindeki hücre yapışması ve canlılığı, taramalı elektron mikroskobu ve konfokal canlı/ölü boyama kullanılarak değerlendirilmiştir. Temsili sonuçlar, dentin diskinin mikroakışkan düzeneğe başarılı bir şekilde entegre edildiğini, sızıntısız koşulların korunduğunu ve canlı dental pulpa kök hücrelerinin dentin yüzeyine yapıştığını göstermektedir. Bu protokol, dental biyomateryallere ve mikroortamsal uyarılara verilen hücresel yanıtları araştıran gelecek çalışmalara destek olabilecek bir dentin-pulpa kompleksi OoC platformunun üretimi için tekrarlanabilir bir yaklaşım sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan deneyleri, patolojik ve fizyolojik süreçlerin anlaşılmasının ilerletilmesinde uzun süredir araç teşkil etmekte olup, ilaç geliştirmenin erken aşamalarında merkezi bir rol oynamıştır1. 20. yüzyıl boyunca insan yaşam süresi önemli ölçüde artmıştır ve bu iyileşmenin ne ölçüde yalnızca hayvan araştırmalarına dayandırılabileceğini kesin olarak belirlemek mümkün olmasa da, birçok güncel tıbbi tedavinin hayvan modelleri kullanılarak geliştirildiği veya doğrulandığı yaygın olarak kabul edilmektedir2. Poliomyelit, kızamık ve hepatit B'ye karşı aşıların geliştirilmesi, penisilinin güvenlilik ve etkililiğinin değerlendirilmesi ve insülin üretimi bu konudaki dikkat çekici örnekler arasındadır. Diş ve biyomalzeme araştırmaları alanında bu modeller; çürük sürecinin, dentin-pulpa kompleksinin biyolojisinin ve rejenerasyonunun, ayrıca periodontal dokuların fizyopatolojisinin araştırılması için kritik öneme sahip olmuştur3,4.

Bu metodolojilerin yaygın kullanımına rağmen, mevcut ilaç geliştirme süreci, birçok ilaç adayının preklinik laboratuvar ortamlarında ve hayvan modellerinde etkinlik ve güvenlik göstermesine rağmen klinik deneyler sırasında başarısız olmasıyla yüksek başarısızlık oranları sergilemeye devam etmektedir5. Bu tutarsızlık, türler arasındaki anatomik, genetik ve fizyolojik farklılıklar nedeniyle hayvan modellerinin translasyonel öngörülebilirliğini sınırlayabilen türler arası farklarla ilişkilendirilmiştir6. Ayrıca, yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi zaman alıcı ve maliyetli olmaya devam etmektedir7. Dahası, geleneksel in vitro modeller ağırlıklı olarak fizyolojik olmayan plastik substratlar üzerinde basitleştirilmiş iki boyutlu (2D) monokatman kültürleri kullanmakta olup, insan ağız boşluğunda mevcut olan biyokimyasal ve fiziksel ipuçlarını, hücre-hücre etkileşimlerini ve hücre dışı matris (ECM) sinyallenmesini yeniden oluşturmakta yetersiz kalmaktadır8,9. 2D modeller belirli deneysel avantajlar sunsa da, biyofilmler, biyomateryaller, dentin ve pulpa hücreleri gibi birden fazla bileşen arasında eş zamanlı olarak meydana gelen karmaşık etkileşimleri doğası gereği taklit edemezler10. Sonuç olarak, insan biyolojik yanıtlarını daha doğru bir şekilde yeniden üretebilen alternatif deneysel platformların geliştirilmesine yönelik ilgi artmaktadır. 2022 yılında, FDA Modernizasyon Yasası 2.0, ilaç onay sürecindeki zorunlu hayvan deneyi gerekliliğini kaldırmış ve preklinik araştırmalarda organ-on-a-chip (OoC) teknolojileri dahil olmak üzere alternatif platformların potansiyel kullanımını tanımıştır11.

Bir OoC, belirli bir organın veya doku bileşeninin yapısını, işlevini ve mikroortamını taklit etmek için tasarlanmış mikroakışkan bir cihazdır12. Bu cihazlar, hücrelerin doğal olarak maruz kaldığı fizyolojik mikroortamın temel yönlerini yeniden oluşturan, mühendislik ürünü mikrokanallar içinde kültüre edilmiş canlı hücreler ve dokularla doldurulur. Yapısal taklidin ötesinde, mikrokanallar hücresel ortam üzerinde spatiotemporal kontrol sağlar ve dokuya özgü işlevlerin sürdürülmesini destekler; böylece geleneksel kültür sistemlerinden daha yakın bir şekilde in vivo fizyolojiyi yansıtabilen deneysel koşullar sunar12. Özellikle, OoC cihazlarındaki mikrokanallar, yerleşik hücreler üzerinde kayma stresine neden olan kültür ortamının kontrollü akışını kolaylaştırır13. Bu mekanik uyaranlar; adezyon, proliferasyon, migrasyon, gen ekspresyonu ve hücre-hücre etkileşimleri dahil olmak üzere hücresel yanıtları etkiler14,15. Ayrıca, sürekli ortam akışı, besin tedariki ve metabolik atık ürünlerin uzaklaştırılması yoluyla mikroortamın korunmasına katkıda bulunur16. Dahası, geleneksel 2D kültürlerle karşılaştırıldığında, bazı OoC platformlarının üç boyutlu (3D) on-chip modellerde hücre içi reaktif oksijen türleri ve hücre canlılığı dahil olmak üzere oksidatif stresle ilişkili okumaların daha iyi kontrol edilmesini desteklediği bildirilmiştir17. Bu nedenle OoC sistemleri; doku fizyolojisini, biyomalzeme etkileşimlerini ve hastalık süreçlerini kontrollü deneysel koşullar altında incelemek için gelecek vaat eden platformlar olarak ortaya çıkmıştır18. Dental araştırmalarda OoC teknolojisi, giderek daha karmaşık oral doku arayüzlerini modellemek için aşamalı olarak uygulanmıştır19. İlk tooth-on-a-chip platformları biyomalzeme-dentin-pulpa arayüzünü taklit etmiştir20; daha gelişmiş versiyonlar ise pulpa-dentin kompleksinin yapısal ve fonksiyonel karmaşıklığını daha sadık bir şekilde yeniden oluşturmak için vaskülarizasyon ve trigeminal innervasyonu dahil etmiştir21. Pulpanın ötesinde, olgunlaşmamış kök kanallarının 3D modelleri, endodontik irigasyon maddelerinin ve apikal papilladan alınan kök hücrelerdeki anjiyojenik tomurcuklanmanın değerlendirilmesine olanak sağlamıştır22,23. Periodontal düzeyde, gum-on-a-chip platformları konakçı-mikrop etkileşimlerini araştırmak ve probiyotiklerin terapötik ajanlar olarak immünomodülatör potansiyelini değerlendirmek için kullanılmıştır24; periodontal ligament-on-chip cihazları ise interstisyel sıvı akışının vasküler ağ oluşumunu ve periodontal ligament kök hücre sferoitlerinin osteojenik diferansiyasyonunu nasıl modüle ettiğini göstermiştir25,26. Bu modelleri tamamlayan özel oral mucosa-on-a-chip ve dental implant-on-a-chip sistemleri, fizyolojik olarak ilgili koşullar altında konakçı-malzeme etkileşimlerini ve dental monomerlerin sitotoksisitesini karakterize ederek dental mikroakışkan araştırmaların kapsamını daha da genişletmiştir27,28.

OoC sistemleri diş, ağız ve kraniofasiyal araştırmalarda giderek daha fazla uygulanmaya başlasa da, üretim iş akışlarının standartlaştırılması ve tekrarlanabilirliğine yönelik çabalar önemini korumaktadır. Literatürde, farklı cihaz konfigürasyonlarını ve deneysel uygulamaları gösteren çeşitli diş-çip-üstünde (tooth-on-a-chip) modelleri rapor edilmiştir20,29,30,31. Ancak cihaz mimarisindeki, üretim yöntemlerindeki, dentin entegrasyonundaki varyasyonlar ve deneysel parametrelerin raporlanma şekli, tekrarlanabilirliği ve çalışmalar arasındaki doğrudan karşılaştırmayı sınırlayabilir. Özellikle mikrokanal geometrisindeki, dentin entegrasyon stratejilerindeki ve üretim yaklaşımlarındaki farklılıklar, cihaz içindeki biyolojik ve mekanik mikroçevreyi etkileyebilir. Rapor edilen bazı modeller, dentin-pulpa arayüzünün özelliklerini yeniden oluşturmak için dentin içermekteyken20,29,30, diğerleri alternatif konfigürasyonlar kullanmaktadır31. Ayrıca, fotolitografi, lazer kesim, mikrofrezeleme ve 3D baskı gibi üretim yöntemlerinin her biri, hedeflenen cihaz tasarımına ve uygulamasına bağlı olarak belirli avantajlar ve kısıtlamalar sunar. Dahası, biyolojik faydanın kritik bir belirleyicisi, cihazın mimari yönelimdir; özellikle kanalların ve dentin diliminin yatay mı yoksa dikey bir konfigürasyonda mı düzenlendiğidir19,32. Yan yana düzenlenen bölmelerin bulunduğu yatay istifleme konfigürasyonları, lateral bölmelendirmeyi ve hücrelerin gerçek zamanlı görüntülenmesini kolaylaştırarak, periodontal kompleks gibi doğası gereği lateral uzaysal organizasyona sahip dokuların modellenmesi için özellikle uygundur24,32. Bununla birlikte, bölmelerin lateral düzenlemesi, kavite ile pulpa arasındaki dentin bariyerinin in vivo yönelimini sadık bir şekilde yansıtmadığı için, bu tasarım biyomalzeme-dentin-pulpa kompleksi gibi dik biyolojik arayüzleri yeniden oluşturma kapasitesi bakımından doğası gereği sınırlıdır20,32. Dikey istifleme konfigürasyonları, iki bölmeyi yerli bir dentin dilimiyle ayrılarak y-ekseni boyunca üst üste getirerek bu sınırlamaları giderir; bu sayede sağlam dentin üzerinden moleküler transportun eş zamanlı olarak kantifikasyonu ve çıkış ortamında ölçülen pulpa hücresi yanıtlarının gerçek zamanlı izlenmesi mümkün olur30. Ancak, bu yönelimin bilinen bir sınırlaması, dentin-hücre arayüzünün kesit görüntülemesi ile ilgilidir; çünkü dentin-hücre arayüzünün aynı odak düzleminde kesit görüntülerinin alınması, hücrelerin ve hücre dışı matrislerin lateral olarak düzenlendiği yatay istifleme konfigürasyonlarına göre teknik olarak daha zorlayıcıdır. Literatürde çok sayıda dentin-pulpa kompleksi çip-üstünde modeli rapor edilmiş olsa da, çoğu bölmelerin aynı düzlemde yan yana düzenlendiği yatay istifleme konfigürasyonunu benimsemiştir10,20,21,29; dikey istifleme konfigürasyonu içinde yerli bir dentin dilimi kullananların sayısı ise nispeten azdır30. Yine de, bu modellerdeki üretim yaklaşımları ve raporlama parametrelerindeki varyasyonlar, tekrarlanabilirliği ve çalışmalar arası karşılaştırmaları sınırlamaya devam etmektedir33. Mevcut makale, dikey istiflenmiş bir diş-çip-üstünde cihazı için ayrıntılı bir üretim protokolü sunarak metodolojik tekrarlanabilirliği artırmayı ve böylece platformun diş araştırma topluluğu tarafından daha yaygın benimsenmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Bu makale, fotolitografi ile üretilmiş bir kalıp kullanılarak imal edilen üç katmanlı bir polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan platform içinde insan dentin diskini içeren, dikey istiflenmiş bir dentin-pulpa kompleksi OoC cihazının adım adım fabrikasyon ve montaj protokolünü açıklamaktadır. Protokol ayrıca, statik koşullar altında cihaz içindeki dental pulpa kök hücre ekimini ve kültürünü de tanımlamaktadır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak yürütülmüş ve insan örneklerini içeren çalışmalar için Universidad de La Frontera Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Dentin diskinin elde edilmesi

NOT: Protokole başlamadan önce cihaz tasarımını hazırlayın (Şekil 1A–1C).

  1. Dişlerin toplanması ve saklanması
    1. Bilgilendirilmiş hasta onamı alındıktan sonra sağlıklı insan azı veya küçük azı dişlerini toplayın.
    2. Dentinde dehidrasyonu ve protein denatürasyonunu önlemek için tüm örnekleri 4°C'de %0,5'lik kloramin çözeltisi içinde muhafaza edin.
    3. Saklama sırasında kloramin çözeltisini haftada bir kez değiştirin.
  2. Dentin disklerin hazırlanması
    1. Her bir dişi, 350.000 rpm hızında çalışan ve silindirik elmas frez (1 mm çap; 100–150 µm grit boyutu) ile donatılmış yüksek hızlı bir karşıt açı sayesinde kronun orta üçte birlik kısmından yatay olarak kesin.
    2. Kesme işlemini yaklaşık 50 mL/dk hızında sürekli su irrigasyonu altında gerçekleştirin.
    3. Pulpa odasından ve oklüzal oluklar ile fissürlerde bulunan mine tabakasından kaçınmak için kesiti kronun orta üçte birlik kısmına konumlandırın; böylece ağırlıklı olarak dentin dokusundan oluşan bir disk elde edin.
      UYARI: Diş kesme işlemini sürekli irrigasyon altında gerçekleştirin ve eldiven, maske ve koruyucu gözlük dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
  3. Dentin disklerin bitim işlemleri
    1. Dentin diski, ardışık olarak azalan grit boyutuna sahip bitirme diskleri kullanarak cilalayın.
    2. Yaklaşık 0,8 mm (±± 0,3 mm) nihai dentin kalınlığına ve yaklaşık 5 mm × 5 mm (±± 0,3 mm) lateral boyutlara ulaşana kadar cilalamaya devam edin (Şekil 1D).
  4. Dentin disklerin saklanması
    1. Hazırlanan dentin diskleri, OoC cihaz montajına kadar 4°C'de %0,5'lik kloramin çözeltisi içinde saklayın.

figure-protocol-1
Şekil 1: Dentin-pulpa kompleksi çip-üzerinde-organ (OoC) cihazının tasarım ve üretim iş akışı. (A) Üç katmanlı mimariyi gösteren cihazın üç boyutlu tasarımı. (B) Ana boyutlarıyla cihaz tasarımının üstten görünümü. (C) Üç katmanlı cihaz konfigürasyonunun yan görünümü. (D) Yaklaşık 0.8 mm kalınlığında ve yaklaşık 5 mm × 5 mm yan boyutlarında hazırlanmış temsili dentin diski. (E) Fotolitografi ile üretilen ve üst ve alt polidimetilsiloksan (PDMS) katmanlarının dökümünde kullanılan silikon ana kalıp. (F) Termal polimerizasyon sonrası kürlenmiş bir PDMS katmanının silikon kalıptan çıkarılması. (G) Katman yapıştırma öncesi PDMS yüzeyinin plazma işlemi. (H) Plazma yapıştırma ile monte edilen ve dentin arayüzünü içeren nihai üç katmanlı dentin-pulpa kompleksi OoC cihazı. (I) Sızıntı testi ve mikroakışkan deney hazırlıkları için borulara bağlanan monte edilmiş cihaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Dentin-pulpa kompleksi OoC cihazının hazırlanması

  1. Çalışma alanının ve malzemelerin hazırlanması
    1. Malzeme ve ekipmanların hazırlanması
      1. Cihaz fabrikasyonuna başlamadan önce Malzemeler Tablosu'nda listelenen tüm malzeme ve ekipmanları hazırlayın.
      2. Cihaz montajından önce biyopsi pançlarını hazırlayın.
      3. Tüm fabrikasyon işlemlerini temiz, tozsuz bir ortamda gerçekleştirin.
      4. Cihaz fabrikasyonu ve montajı boyunca eldiven, koruyucu gözlük ve uygun kişisel koruyucu donanım kullanın.
        NOT: Protokole başlamadan önce fotolitografi ile üretilen kalıbı hazırlayın (Şekil 1E).
  2. Mikroyapılı kalıbın fabrikasyonu
    1. Silikon wafer'ın hazırlanması
      1. Kalıbı 4 inçlik, tek yüzü parlatılmış bir silikon wafer (N-tipi, As-katkılı, CZ büyüme yöntemi, <100> yönelimi, 500 ±± 25 µm kalınlık, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, özdirenç 0.001–0.005 Ω·cm) üzerinde hazırlayın.
      2. Wafer'ı sırasıyla aseton, izopropanol ve ultra saf suda, ultrasonikasyon altında her biri 10 dk boyunca temizleyin.
      3. Wafer'ı basınçlı hava ile kurutun.
      4. Kalıntı nemi gidermek için wafer'ı bir sıcak plaka üzerinde 200°C'de 10 dk boyunca pişirin.
      5. Wafer'ın oda sıcaklığına (RT; 20°C–25°C) soğumasını bekleyin.
    2. Yüzey aktivasyonu ve fotoresist kaplama
      1. Silikon wafer yüzeyini, seviye 7'de hava plazması ile 120 sn boyunca çalışan bir vakumlu plazma temizleyici kullanarak aktive edin.
      2. GM 1060 epoksi bazlı negatif fotoresisti, 300 rpm'de 10 sn boyunca spin kaplama yöntemiyle uygulayın.
      3. Spin kaplamaya 200 rpm/s ivme kullanarak 565 rpm'de 100 sn ve 965 rpm'de 1 sn boyunca devam edin.
      4. Kaplanmış wafer'ın 10 dk boyunca dinlenmesini sağlayın.
      5. 65°C'de 10 dk boyunca ön pişirme (pre-bake) yapın.
      6. Ön pişirmeye 95°C'de 1 sa boyunca devam edin.
      7. Wafer'ın RT'ye soğumasını bekleyin.
    3. Pozlama ve geliştirme
      1. Fotoresisti, doğrudan lazer litografi sistemi kullanarak 1,950 mJ/cm2 dozunda pozlayın.
      2. 65°C'de 10 dk boyunca son pişirme (post-bake) yapın.
      3. Son pişirmeye 95°C'de 30 dk boyunca devam edin.
      4. Wafer'ın RT'ye soğumasını bekleyin.
      5. Wafer'ın 10 dk boyunca dinlenmesini sağlayın.
      6. Deseni PGMEA içinde 4 dk boyunca geliştirin.
      7. Kalıntı fotoresist kalmışsa, geliştirmeyi 30 sn'lik aralıklarla uzatın.
      8. Geliştirmeyi izopropanol ile durulayarak durdurun.
      9. Wafer'ı basınçlı hava kullanarak kurutun.
    4. Sert pişirme (Hard bake)
      1. 135°C'de 2 sa boyunca sert pişirme yapın.
      2. Genişliği 1 mm ve yüksekliği 50 µm olan mikrokanallar içeren mikroyapılı bir ana kalıp elde edin.
  3. PDMS karışımının hazırlanması ve gazının alınması
    1. PDMS karışımının hazırlanması
      1. PDMS bazını ve kürleme ajanını 10:1 ağırlık oranında karıştırın.
      2. Karışımı plastik bir beher içinde cam bir çubukla yaklaşık 5 dk boyunca manuel olarak karıştırın.
      3. Karıştırma sırasında yavaş ve sürekli dairesel hareketler yapın.
        NOT: Karıştırma sırasında hava kabarcığı oluşmasını önleyin.
    2. Gaz giderme (Degassing)
      1. PDMS karışımını vakum pompasına bağlı bir vakum desikatörüne yerleştirin.
      2. Karışımın gazını yaklaşık 700 mmHg'de 5 dk boyunca alın.
      3. Yüzeydeki kabarcıkların patlamasını sağlamak için vakumu kısa süreliğine serbest bırakın.
      4. Vakumu tekrar uygulayın.
      5. Görünür kabarcık kalmayana kadar döngüyü tekrarlayın.
        NOT: Toplam gaz giderme süresi tipik olarak yaklaşık 30 dk'dır.
  4. PDMS'in kalıba dökümü
    1. Kalıbın hazırlanması
      1. Kalıbı düz bir yüzeye yerleştirin.
      2. Kalıbı basınçlı hava kullanarak temizleyin.
      3. Desenli yüzeyle doğrudan temastan kaçının.
      4. Kalıbın toz ve kontaminanlardan arındırıldığını doğrulayın.
    2. PDMS'in dağıtılması
      1. Dentin gömme tabakasını oluşturmak için dentin diskinin etrafına yaklaşık 8 g PDMS dağıtın.
      2. PDMS yüksekliğini dentin disk kalınlığına (0.8 ±± 0.3 mm) uygun şekilde ayarlayın.
      3. PDMS'in dentin yüzeyini örtmesini engelleyin.
      4. Her bir mikrokanal tabakasını oluşturmak için kalıp ünitesi başına yaklaşık 0.26 g PDMS dağıtın.
      5. Mikroyapıların dolmasını kolaylaştırmak için kalıba hafifçe vurun veya titreşim uygulayın.
      6. PDMS'in en küçük detaylara yerleşmesini bekleyin.
      7. Kalıbı, PDMS yüzeyine temas etmeden bir kapak veya düz bir örtü ile kapatın.
        NOT: Dentin gömme tabakası yaklaşık 0.8 mm kalınlığında ve her bir mikrokanal tabakası yaklaşık 0.4 mm kalınlığındadır, bu da toplamda yaklaşık 1.6 mm cihaz kalınlığı sağlar.
        NOT: Konfokal görüntüleme planlandığında, tabaka kalınlığını konfokal objektifin çalışma mesafesine göre ayarlayın.
  5. Kürleme
    1. Kalıpları 50°C'deki bir fırına yerleştirin.
    2. PDMS'i 4 sa boyunca kürleyin.
  6. PDMS tabakalarının çıkarılması
    1. Kürlenmiş PDMS'in çıkarılması
      1. Kürlenmiş PDMS tabakalarını dikkatlice kalıptan soyun (Şekil 1F).
      2. Mikroyapılara zarar vermemek için PDMS tabakalarını dikkatli bir şekilde tutun.
  7. PDMS tabakalarının yapıştırılması ve giriş-çıkış portlarının fabrikasyonu
    1. Giriş ve çıkış portlarının fabrikasyonu
      1. 1 mm'lik bir biyopsi pançı kullanarak belirlenen giriş ve çıkış konumlarında perforasyonlar oluşturun.
      2. Pançlama sırasında mikrokanal tarafının yukarı bakmasını sağlayın.
        NOT: Yapısal hasarı önlemek için PDMS tabakasını bir kesme matı üzerine yerleştirin.
      3. Üst tabakada, üst mikrokanala karşılık gelen iki perforasyon oluşturun.
    2. PDMS tabakalarının temizlenmesi
      1. PDMS tabakalarını izopropil alkol veya etanol kullanarak temizleyin.
      2. Kalıntı toz partiküllerini steril yapışkan bant kullanarak temizleyin.
      3. Montajdan önce tüm yapıştırma yüzeylerinin kontaminanlardan arındırıldığını doğrulayın.
    3. PDMS yüzeylerinin plazma aktivasyonu
      1. Üst ve orta PDMS tabakalarını plazma işlemi için konumlandırın (Şekil 1G).
      2. Yüzeyleri, çalışma gazı olarak ortam havası ile yaklaşık 25 W'da çalışan el tipi bir korona plazma cihazı kullanarak aktive edin.
      3. Plazma kaynağı ile PDMS yüzeyi arasında yaklaşık 1 mm çalışma mesafesi bırakın.
        DİKKAT: Plazma işlemini uygun havalandırma altında gerçekleştirin ve plazma kaynaklı ozona doğrudan maruz kalmaktan kaçının.
      4. Plazma cihazını çalıştırın ve 5 sn boyunca stabilize olmasını bekleyin.
      5. İşlemden önce homojen bir plazma huzmesi oluştuğunu doğrulayın.
      6. Üst PDMS tabakasını, yaklaşık 5 mm/s hızla sürekli ileri-geri hareketler yaparak 10 sn boyunca işleyin.
      7. Orta PDMS tabakasını, aynı hareket ve mesafe ile 10 sn boyunca işleyin.
      8. Yapıştırmadan hemen önce üst tabakaya ek olarak 1 sn'lik plazma işlemi uygulayın.
    4. Üst ve orta tabakaların yapıştırılması
      1. Plazma işleminden hemen sonra üst mikrokanalı dentin disk ile hizalayın.
      2. Üst ve orta tabakaları birbirine yapıştırın.
      3. Yapıştırılmış düzeneği 75°C'deki bir fırında 5 dk boyunca tutun.
      4. İnkübasyon sırasında bağı güçlendirin.
        NOT: Dentin disk ve mikrokanal çıplak gözle görülebilir ve ek hizalama araçları olmadan hizalanabilir.
    5. Alt mikrokanal portlarının fabrikasyonu
      1. Yapıştırılmış üst ve orta tabakalar boyunca alt mikrokanala karşılık gelen iki perforasyon açın.
      2. Hizalamayı sağlamak için her iki tabakada pançlamayı eş zamanlı olarak gerçekleştirin.
        NOT: Bu işlem üst tabakada dört, orta tabakada ise iki perforasyon oluşturur.
      3. Pançlama öncesinde yapıştırılmış düzeneği sağlam bir kesme matı üzerine yerleştirin.
      4. Tek bir hareketle sabit bir aşağı yönlü basınç uygulayın.
        NOT: Delaminasyon riskini en aza indirmek için rotasyonel veya lateral kuvvetlerden kaçının.
      5. Perforasyon bölgelerindeki kalıntıları izopropil alkol ile nemlendirilmiş havsız steril gazlı bez kullanarak temizleyin.
      6. Perforasyonları ve çevreleyen yapışmış bölgeleri yeterli ışık altında inceleyin.
      7. Devam etmeden önce delaminasyon, yırtılma veya eksik perforasyon olmadığını doğrulayın.
    6. Alt tabakanın yapıştırılması
      1. Alt tabakayı Adım 2.7.4'te açıklandığı gibi plazma ile işleyin.
      2. Alt mikrokanalın giriş ve çıkış portlarını, üst ve orta tabakalardaki perforasyonlarla hizalayın.
      3. Cihaz montajını tamamlamak için alt tabakayı yapıştırın.
        NOT: Hizalamayı kolaylaştırmak için yapıştırmadan önce alt tabakanın dış yüzeyine giriş ve çıkış konumlarını işaretleyin.
        NOT: Literatürde bildirildiği üzere36, plazma odaları plazma kalemlerinden daha güçlü yapıştırma sağlayabilir.
        NOT: Tamamlanan cihaz, dentin arayüzü içeren üç tabakalı bir mikroakışkan platformdan oluşur (Şekil 1H). Alt dentin yüzeyi modelin pulpa tarafını, üst dentin yüzeyi ise dental biyomalzemeler veya bakteriyel preparatların maruz bırakılacağı koronal tarafı temsil eder.
  8. Mikroakışkan cihazın sızdırmazlık testi
    1. Montajı tamamlanmış cihazın incelenmesi
      1. Montajı tamamlanmış cihazı hizalama hataları açısından inceleyin.
      2. Düzeneği eksik yapışma ve görünür sızıntılar açısından inceleyin.
    2. Sızdırmazlık testi
      1. Giriş portlarına 19G Luer-lock iğneler bağlayın (Şekil 1E).
      2. İğneleri mikroakışkan pompa tüplerine bağlayın.
      3. Hava sızdırmaz bir uyum sağlamak için iğne göbeklerini nazikçe pançlanmış portlara bastırın.
      4. Steril PBS veya kültür ortamını 10 µL/min akış hızında enjekte edin.
      5. Sıvı akışını en az 5 dk boyunca sürdürün.
      6. Akış sırasında tüm yapışmış arayüzleri, kanal kenarlarını ve dentin disk sınırlarını inceleyin.
      7. Enjeksiyon sırasında ve sonrasında cihazı yeterli ışık altında gözlemleyin.
      8. Sıvı birikmesi, ıslaklık veya damlacık oluşumu olmadığını onaylayın.
      9. Sızıntı tespit edilmezse cihazı sızdırmaz olarak sınıflandırın.
      10. Sızıntı gösteren cihazları atın.
        NOT: Hücre ekimi veya deneysel kullanımdan önce üretilen her cihaz üzerinde sızdırmazlık testi gerçekleştirin.
  9. Mikroakışkan cihazın sterilizasyonu ve saklanması
    1. Sterilizasyon
      1. Montajı tamamlanmış cihazın üst yüzeyini bir laminar flow kabini içinde 30 dk boyunca UV ışığına (254 nm) maruz bırakın.
      2. Alt yüzeyi ek olarak 30 dk boyunca UV ışığına maruz bırakın.
      3. Mikrokanalları 20 dk boyunca %70 etanol ile yıkayın.
      4. Kalıntı etanolü gidermek için mikrokanalları steril PBS ile üç kez yıkayın.
    2. Saklama
      1. Sterilize edilmiş cihazı hücre kültürü deneyleri için hemen kullanın.
      2. Alternatif olarak, cihazı kullanım aşamasına kadar steril bir kap içinde, steril PBS'e daldırılmış halde 4°C'de saklayın.
        ​DİKKAT: Cihaz montajından sonra kloramin veya diğer dezenfektan çözeltileri kullanmayın; çünkü PDMS bu bileşikleri absorbe edebilir ve hücre canlılığını tehlikeye atabilir.

3. Dental pulpa kök hücre adezyonunun ve canlılığının değerlendirilmesi

  1. Dentin yüzeyinin ön işlemesi
    1. Cihaza %10 EDTA enjekte edin.
    2. EDTA solüsyonu ile dentin yüzeyi arasındaki teması 15 dk boyunca sürdürün.
    3. Mikrokanal içindeki sıvı hareketini korumak için her 3 dk'da bir 0,5 mL EDTA enjekte edin.
    4. Dentin diski ultrapure su ile üç kez yıkayın.
    5. Her yıkamayı 5 dk boyunca sürdürün.
      NOT: EDTA işlemi smear tabakasını uzaklaştırır ve dentin matrisi proteinlerini açığa çıkarır.
      DİKKAT: Cilt ve göz tahrişini önlemek için EDTA solüsyonlarını eldiven ve koruyucu gözlük kullanarak kullanın.
  2. Dental pulpa kök hücrelerinin ekimi
    1. Dental pulpa kök hücrelerinin genişletilmesi
      1. Dental pulpa kök hücrelerini bir T75 flaska flask başına 1 × 106 hücre yoğunluğunda ekleyin.
      2. Hücreleri 37°C ve %5 CO2 altında yaklaşık %80 konfluens seviyesine ulaşana kadar inkübe edin.
      3. Hücreleri tripsin kullanarak ayırın.
      4. Tripsini komple kültür ortamı kullanarak nötralize edin.
      5. Hücre peleti elde etmek için hücre süspansiyonunu santrifüjleyin.
      6. Hücre canlılığını trypan blue kullanarak değerlendirin.
      7. Canlılığı ≥%90 olan hücre süspansiyonlarını kullanın.
    2. Hücre süspansiyonunun hazırlanması
      1. 37°C'de önceden ısıtılmış bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
      2. Komple kültür ortamındaki hücre konsantrasyonunu 100.000 hücre/mL olacak şekilde ayarlayın.
      3. 1–2 mL nihai süspansiyon hacmi hazırlayın.
        NOT: Bu çalışmada pasaj 5'teki hücreler kullanılmıştır.
    3. Hücre ekimi
      1. Hücre süspansiyonunu alt mikrokanalın giriş portuna enjekte edin.
      2. Hücre ekiminden sonra cihazı ters çevirin
        NOT: Cihazın ters çevrilmesi, hücrelerin dentin yüzeyine doğru çökelmesini destekler ve hücre adezyonunu artırır.
    4. İnkübasyon
      1. Ters çevrilmiş cihazı bir Petri kabının içine yerleştirin.
      2. Buharlaşmayı en aza indirmek için Petri kabına 1 mL kültür ortamı ekleyin.
      3. Cihazı 37°C ve %5 CO2 altında 24 sa boyunca inkübe edin.
      4. İnkübasyon süresi boyunca statik kültür koşullarını sürdürün.
        NOT: Bu çalışmada dinamik akış doğrulaması yapılmamıştır.
        NOT: Mevcut protokol, başlangıç cihaz doğrulaması ve hücre adezyon değerlendirmesi için statik kültür koşullarını tanımlamaktadır.
    5. İlk cihaz doğrulaması
      1. Hücre adezyonunu taramalı elektron mikroskobu kullanarak değerlendirin.
      2. Analizden önce cihazı sökerek dentin diski geri alın.
  3. Taramalı elektron mikroskobu için örneklerin hazırlanması
    1. Örneklerin geri alınması ve yıkanması
      1. 24 saatlik inkübasyonun ardından cihazı sökün.
      2. Dentin diskini geri alın ve bir kültür plakasına veya Petri kabına transfer edin.
      3. Hücre ekilmiş dentin yüzeyi yukarı bakacak şekilde konumlandırın.
      4. Dentin diskini 1 mL PBS kullanarak iki kez yıkayın.
    2. Fiksasyon
      1. 0,1 M Sorensen fosfat tamponu içinde %2,5 glutaraldehitten 2 mL ekleyin.
      2. Örneği oda sıcaklığında (RT) 30 dk boyunca inkübe edin.
        DİKKAT: Glutaraldehit toksiktir; cilt, göz ve solunum yollarında tahrişe neden olabilir. Fiksasyon işlemlerini uygun kişisel koruyucu donanım giyerek kimyasal çeker ocak içinde gerçekleştirin.
    3. Fiksasyon sonrası yıkama
      1. Glutaraldehit solüsyonunu uzaklaştırın.
      2. Dentin diskini oda sıcaklığında (RT) ultrapure distile su ile üç kez yıkayın.
    4. SEM analizi
      1. Örnekleri çevresel taramalı elektron mikroskobu kullanarak analiz edin.
      2. Mikroskobu düşük vakum koşullarında (25 Pa) çalıştırın.
      3. 10,0 kV hızlandırma voltajı ve 7,0 mm çalışma mesafesi kullanın.
      4. Görüntüleri geri saçılan elektron 3D tespit modu (BSE-3D) kullanarak edinin.
      5. Görüntüleri ×200 büyütmede yakalayın (Şekil 2A).
  4. Konfokal mikroskopi ile hücre canlılığının değerlendirilmesi
    1. Örnek hazırlama
      1. Hücreleri Adım 3.2'de açıklandığı gibi ekin ve kültüre edin.
      2. Cihazı 37°C ve %5 CO2 altında 24 sa boyunca inkübe edin.
      3. Cihazı sökün ve dentin yüzeyini açığa çıkarın.
      4. Dentin diskini, Ca2+ ve Mg2+ ile takviye edilmiş önceden ısıtılmış HBSS+/+ içeren bir kuyucuk plakasına transfer edin.
    2. Örnek yıkama
      1. Dentin diskini HBSS+/+ ile iki kez yıkayın.
      2. Boyama işleminden önce kalıntı serum ve fenol kırmızısını uzaklaştırın.
        NOT: Kalıntı serum ve fenol kırmızısı arka plan otofloresansını artırabilir.
    3. Canlı hücre boyama
      1. HBSS+/+ içinde 2 µM konsantrasyonda taze bir Calcein AM çalışma solüsyonu hazırlayın.
      2. Dentin yüzeyini tamamen kaplayacak kadar boyama solüsyonu ekleyin.
      3. Örneği karanlıkta 37°C'de 20 dk boyunca inkübe edin.
      4. İnkübasyondan sonra boyama solüsyonunu uzaklaştırın.
    4. Ölü hücre boyama
      1. Propidium Iodide çalışma solüsyonu (HBSS+/+ içinde 1–2 µg/mL) ekleyin.
      2. Örneği karanlıkta 37°C'de 5–8 dk boyunca inkübe edin.
      3. İnkübasyon süresinin 10 dk'yı geçmemesine dikkat edin.
      4. Örneği HBSS+/+ ile iki kez yıkayın.
      5. Görüntüleme yapılana kadar örneği tampon içerisinde tutun.
    5. Konfokal mikroskopi görüntüleme
      1. Konfokal görüntüleri boyamadan sonraki 30 dk içinde edinin.
      2. Görüntüleri yeşil ve kırmızı kanallarda ardışık olarak edinin.
      3. Canlı hücre görüntüleme için λex 490 nm ve λem 515 nm kullanın.
      4. Ölü hücre görüntüleme için λex 535 nm ve λem 617 nm kullanın.
        ​NOT: Floresan boyama solüsyonlarını ve boyanmış örnekleri inkübasyon ve görüntüleme işlemleri sırasında ışık maruziyetinden koruyun (Şekil 2B).

figure-protocol-2
Şekil 2: Dentin-pulpa kompleksi OoC cihazı içerisinde dental pulpa kök hücre adezyonu ve canlılığının temsili değerlendirmesi. (A) OoC cihazı içerisinde 24 saatlik statik kültür sonrası dentin yüzeyine yapışmış dental pulpa kök hücrelerini (beyaz yıldız) gösteren taramalı elektron mikroskopi görüntüsü. 24 saatlik kültür sonrası, yapışık hücreler mikrokanala maruz kalan dentin yüzeyinin %54.35 ± 0.92'sini kaplamıştır. PDMS ile kaplı dentin bölgesinde (siyah yıldız) hücre gözlenmemiştir, bu da cihaz katmanları arasında etkili sızdırmazlık olduğunu göstermektedir. Ölçek çubuğu = 200 µm. (B) 24 saatlik statik kültür sonrası yeşil boyanmış canlı dental pulpa kök hücrelerinin dentin yüzeyine yapıştığını (beyaz oklar) gösteren konfokal mikroskopi görüntüsü. Kırmızı boyanmış canlı olmayan hücreler de gözlenmektedir (mavi oklar). Ölçek çubuğu = 50 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diş-çip cihazının başarılı bir şekilde üretimi; dentin disk hazırlama (Şekil 1D), fotolitografi türevli kalıbın üretimi (Şekil 1E), kürlenmiş PDMS katmanlarının çıkarılması (Şekil 1F), yapıştırma öncesi plazma aktivasyonu (Şekil 1G), nihai cihazın montajı (Şekil 1H) ve cihazın mikroakışkan düzeneğe bağlanmasını (Şekil 1I) içeren Şekil 1A–1I'de gösterilen iş akışı takip edilerek gerçekleştirilmiştir. Ortaya çıkan cihaz, dentin diskin orta katmana tamamen entegre edildiği ve üst ile alt mikrokanalların dentin yüzeyinin her iki yanına konumlandırıldığı üç katmanlı bir PDMS düzeneğinden oluşmaktadır (Şekil 1H).

Bu aşamada pozitif bir sonuç, görünür hava kabarcıklarının veya delaminasyonun olmaması ve giriş portlarından PBS veya kültür ortamı enjekte edildikten sonra sızıntısız sıvı geçişi ile karakterize edildi (Şekil 1I). Mikrokanal portlarının hizalanmaması, eksik plazma yapıştırması veya dentin-PDMS arayüzündeki sızıntılar, montajın başarısız olduğunu gösteriyordu ve fabrikasyon prosedürünün tekrarlanmasını gerektiriyordu.

Toplam 30 cihaz üretilmiş olup, bunlardan yaklaşık %20'si üretim veya test aşamasında başarısız olmuştur. Başarısızlıklar öncelikle, eksik plazma bağlanması nedeniyle mikrokanal sınırlarının dışına sıvı sızmasıyla ilişkilendirilmiş; daha küçük bir orandaki başarısızlık ise cihazın diğer bölgelerindeki tabaka ayrılmalarından kaynaklanmıştır. Dentin–PDMS arayüzündeki sızıntılara veya mikrokanal giriş ve çıkış portlarının hizalama hatalarına bağlı herhangi bir başarısızlık görülmemiştir.

24 saatlik statik kültürün ardından, başarılı hücre ekimi, dentin yüzeyinde fibroblastik morfoloji sergileyen adherent dental pulpa kök hücrelerinin varlığıyla doğrulanmıştır. Taramalı elektron mikroskobu, hem hücre adezyonunun hem de cihaz bütünlüğünün değerlendirilmesini sağlamıştır (Şekil 2A). Mevcut protokol kullanılarak, kültürün 24. saatinin sonunda adherent hücreler, mikrokanala maruz kalan dentin yüzeyinin %54.35 ± 0.92'sini kaplamıştır. Pozitif bir sonuç, adherent hücrelerin yalnızca mikrokanal alanı içerisinde bulunmasıyla kanıtlanmış, PDMS ile kaplı dentin yüzeyi ise hücre tutunmasından ari kalmıştır (Şekil 2A). Bu uzaysal dağılım, cihaz katmanları arasındaki sızdırmazlığın başarılı olduğunu ve cihaz montajının uygun şekilde gerçekleştirildiğini desteklemiştir. Aksine, hücrelerin mikrokanal sınırlarının ötesinde bulunması sızıntıya işaret eder ve negatif bir sonuç olarak değerlendirilmelidir.

Canlı/ölü boyama kullanılan konfokal mikroskopi, cihaz içindeki hücre canlılığının tahribatsız bir şekilde değerlendirilmesini sağlamıştır. Başarılı bir sonuç, yeşil floresans gösteren ve fibroblastik morfolojiye sahip canlı hücrelerin baskınlığı ve yalnızca ara sıra kırmızıya boyanmış canlı olmayan hücrelerin görülmesi ile karakterize edilmiştir (Şekil 2B). Buna karşın, canlı olmayan hücrelerin yüksek oranı, suboptimal dentin ön koşullandırmasına, yetersiz yıkamaya veya uygun olmayan kültür koşullarına işaret eder.

Protokol optimizasyonu sırasında, dentin diskini orta PDMS tabakası içinde konumlandırmak için önceden tanımlanmış bir girinti içeren sabit bir kalıbın kullanıldığı başlangıç bir üretim stratejisi değerlendirilmiştir (Şekil 3A). Bu yaklaşım, disk yerleşimini standartlaştırmayı ve disk–PDMS ara yüzeyindeki sızıntıları azaltmayı amaçlasa da uygulamada yetersiz olduğu görülmüştür. Dentin diski girintisine karşılık gelen bölgenin kürlenmiş PDMS tabakasından manuel olarak kesilmesi gerektiği için, disk kenarları ile kesilen PDMS kenarları arasında hassas bir uyum güvenilir bir şekilde sağlanamamış ve bu durum, üretilen cihazların yaklaşık %50'sinde sızıntıya neden olan ara yüzey boşluklarıyla sonuçlanmıştır (Şekil 3A).

figure-results-1
Şekil 3: Dentin-pulpa kompleksi OoC cihazının optimizasyonu sırasında belirlenen başarısız fabrikasyon yaklaşımlarını gösteren temsili görüntüler. (A) Standart dentin disk konumlandırması için tasarlanmış sabit girintiler içeren silikon kalıp (beyaz oklar). Manuel numune hazırlığından kaynaklanan dentin disk boyutlarındaki doğal değişkenlik nedeniyle, sabit kalıp geometrisine güvenilir bir adaptasyon sağlanamamış; bu durum fabrikasyon yapılan cihazların yaklaşık %50'sinde arayüz boşluklarına ve sızıntılara yol açmıştır. (B) Disk-PDMS arayüzüne sızdırmazlık malzemesi uygulamasının ardından dentin yüzeyinin taramalı elektron mikroskobu görüntüsü. Açıkta kalan dentin (siyah yıldız) ve sızdırmazlık malzemesi birikintileri (beyaz yıldız) belirtilmiştir. Sızdırmazlık malzemesinin dentin yüzeyine istenmeyen şekilde yayılması, hücre yapışmasını bozmuş ve hücre kolonizasyonu için mevcut olan yüzey alanını azaltmıştır. Ölçek çubuğu = 100 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu sınırlamayı gidermek için disk-PDMS ara yüzüne bir sızdırmazlık malzemesi uygulanmıştır. Ancak, taramalı elektron mikroskobuyla (Şekil 3B) gösterildiği üzere, sızdırmazlık malzemesinin dentin yüzeyine yayılması ve kaplanan bölgelerde hücre yapışmasını engellemesi nedeniyle bu yaklaşım ek bir dezavantaj ortaya çıkarmıştır. Bu suboptimal sonuçlar, başlangıçtaki üretim stratejisinin iki kritik sınırlamasını vurgulamıştır: manuel olarak kesilen PDMS oyuğu ile dentin disk arasındaki yetersiz adaptasyon ve sızdırmazlık malzemesiyle ilişkili azalan hücre yapışması.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, dentin ve dental pulpa kök hücrelerini içeren dikey istiflenmiş bir diş-çip (tooth-on-a-chip) cihazının üretimi için adım adım bir protokol tanımlamakta ve statik kültür koşulları altında cihaz içindeki temsili hücre yapışmasını ve canlılığını göstermektedir. Protokol, dentin arayüzünün in vitro çalışmaları için uygun bir dentin-pulpa kompleksi OoC platformunun üretimi ve montajı içinle tekrarlanabilir bir iş akışı sağlamak amacıyla geliştirilmiştir. Böyle bir iş akışının oluşturulması özellikle önemlidir; çünkü yakın tarihli sistematik incelememiz, dentin-pulpa kompleksi için mikroakışkan modeller alanının, cihaz mimarisinde ve malzemelerinde yüksek metodolojik heterojenite ile karakterize edilen ve mevcut diş-çip modellerinin tekrarlanabilirliğini ve standardizasyonunu ciddi şekilde tehlikeye atan gelişmekte olan bir aşamada olduğunu vurgulamıştır34. Bu çalışma, ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir protokol sunarak bu sınırlamaları gidermekte ve daha iyi tanımlanmış biyolojik modellerin geliştirilmesine katkıda bulunmaktadır. Ağız biyolojisine uygulanan OoC geliştirme sürecinin daha geniş bağlamında, França ve ark.15, dentin diskleri ve odontoblast benzeri hücreleri içeren mikroakışkan bir diş-çip modeli ile bu alana öncülük ederek, dentin-pulpa arayüzünün dinamik bir mikroakışkan ortamda yeniden oluşturulmasının ve dental materyallere karşı sitotoksik yanıtın değerlendirilmesinin fizibilitesini kanıtlamıştır. Bu çığır açan katkıdan bu yana, literatürde dental doku biyolojisinin, biyomalzeme etkileşimlerinin ve ağız mikrobiyolojisinin çeşitli yönlerini ele alan ve bu yaklaşımı aktif ve hızla genişleyen bir araştırma alanı olarak konumlandıran artan sayıda oral OoC platformu rapor edilmiştir34. Mevcut protokol, standart mikroakışkan yetkinliklerine sahip araştırma gruplarının erişebileceği dikey istiflenmiş bir diş-çip platformu için ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir üretim iş akışı sağlayarak bu alana katkıda bulunmaktadır.

Protokoldeki birkaç adım, cihazın başarılı bir şekilde üretilmesi ve performansı için kritiktir. Özellikle, PDMS'in kalıba dökülmesi, tekdüze katman kalınlığı ve uygun mikrokanal oluşumunu sağlamak için dikkatli bir kontrol gerektirir. PDMS katmanlarının kalınlığı, hedeflenen sonraki uygulamaya göre seçilmelidir. Örneğin, konfokal mikroskopi, dentin yüzeyine yapışmış hücrelerin optik görselleştirmesine izin vermek için yeterince ince PDMS katmanları gerektirir. Ancak, daha ince katmanların üretim ve montaj prosedürleri sırasında manipülasyonu daha zor olabilir. Sonuç olarak, PDMS kalınlığının optimizasyonu, görüntüleme erişilebilirliği ile cihaz üretimi sırasındaki pratik kullanım arasında önemli bir dengeyi temsil eder. Ayrıca, mevcut çalışmada, hücrelerin üzerindeki PDMS katmanının kalınlığı 0,4 mm olduğundan ve bu değer mevcut konfokal mikroskobun penetrasyon derinliğini (0,2 mm) aştığından, sağlam cihazların konfokal mikroskopisi mümkün olmamıştır. Bu nedenle konfokal görüntüleme, cihazin sökülmesi ve dentin yüzeyinin doğrudan açığa çıkarılmasının ardından gerçekleştirilmiştir. Ek olarak, dentinin doğal opaklığı, yüzeyine yapışmış hücrelerin doğrudan optik görselleştirmesini engellediği için bu cihazda floresan mikroskopi uygulanamamıştır.

Bu kısıtlama, özellikle hücreleri içeren mikrokanalın dentin diskinin altına konumlandırıldığı ve buna bağlı olarak optik erişimin hem üstteki PDMS tabakası hem de dentinin kendi opaklığı tarafından engellendiği dikey istiflenmiş OoC konfigürasyonları için geçerlidir. Mikrokanalların dentinin altında değil, yan tarafında paralel olarak ilerlediği ve böylece dentin opaklığı veya PDMS kalınlığından etkilenmeden hücre ekilmiş yüzeye doğrudan optik erişime izin verildiği yatay istiflenmiş çip tasarımlarında bu kısıtlama ile karşılaşılmaz. Bu nedenle, dikey ve yatay istifleme konfigürasyonları arasındaki seçim yapılırken sadece akışkan ve biyolojik gereksinimler değil, laboratuvarda mevcut olan görüntüleme yöntemleri de göz önünde bulundurulmalıdır. Bir OoC sisteminde, cihaz tasarımı önemli bir rol oynar ve mikroçevre in vivo koşullara mümkün olduğunca yakın tutulmalıdır. Çoğu doku gibi diş de mekanik uyarılara maruz kalır ve anizotropik davranış35 sergiler; yani özellikleri, uygulanan uyarının yönüne bağlı olarak değişir. Ayrıca, dentin ve odontoblastların dikey olarak düzenlendiği dentin-pulpa kompleksinin koronal kısmı ile odontoblastların dentine komşu olduğu lateral kısmı arasında; hücre sayısı, organizasyon ve dentinal tübül yönelimi açısından belirgin farklar içeren histolojik farklılıklar mevcuttur. Bu nedenle dikey istiflenmiş bir çip tasarımı, dentin-pulpa kompleksinin koronal kısmını etkileyen çürük lezyonlarının ve restoratif materyallerin daha sadık bir anatomik temsilini sunar.

Hassas plazma yüzey işlemi, cihaz montajının başarısı için temeldir ve çip üretimindeki temel zorluklardan biri olmaya devam etmektedir36. Bu çalışmada, üretilen cihazların %20'sinde delaminasyon meydana gelmiştir. Bu sonuç beklenmedik değildir; çünkü mevcut çalışmada kullanılan el tipi plazma kalemi ile gerçekleştirilen PDMS–PDMS bağlanması, atmosferik seviyelerin üzerindeki oksijen konsantrasyonlarına izin veren ve dolayısıyla bağlanma için daha fazla sayıda kovalent yüzey grubu üreten vakum tabanlı plazma oda sistemlerinden daha düşük konsantrasyonda reaktif oksijen türleri oluşturur36. Sonuç olarak, plazma kalemi kullanılarak elde edilen bağlanma kuvveti, özel bir plazma odası ile elde edilenden doğası gereği daha düşük ve daha az tekrarlanabilirdir; bu durum muhtemelen gözlemlenen delaminasyon oranına katkıda bulunmuştur. Dentin entegrasyon stratejisinin optimizasyonu, sızıntıyı minimize ederken dentin diski ile orta PDMS tabakası arasında yakın temas sağlamak için birden fazla üretim yinelemesi gerektirmiştir. İlk yaklaşım, dentin yerleşimi için orta tabaka içinde önceden tanımlanmış bir oyuk oluşturulmasını içeriyordu; ancak oyuğun manuel olarak kesilmesi, dentin diski ile PDMS kenarları arasında tutarlı bir adaptasyonu engellemiş, bu da kültür ortamı enjeksiyonu sırasında sızıntıya yol açmış ve genel üretim başarı oranının yaklaşık %50 olmasını sağlamıştır.

Daha sonra, dentin-PDMS ara yüzeyindeki sızdırmazlığı artırmak amacıyla bir protez yapıştırıcısı değerlendirilmiş, ancak taramalı elektron mikroskobu hücre yapışmasını engellediğini ve dentin yüzeyindeki hücrelerin görüntülenmesini azalttığını göstermiştir. Bu nedenle, nihai protokol, PDMS'nin numune etrafına dikkatlice dökülmesinden önce dentin diskin doğrudan kalıba yerleştirilmesiyle optimize edilmiş, böylece dentin diskin cihaz içindeki entegrasyonu iyileştirilmiş ve ek sızdırmazlık malzemelerine olan ihtiyaç azaltılmıştır. Bu yaklaşım, dentin disk kenarları ile çevreleyen PDMS arasında yakın ve uyumlu bir temas sağlayarak, dentin yüzeyine hücre yapışmasını engelleyebilecek ikincil sızdırmazlık ajanlarına ihtiyaç duymadan dentin-PDMS ara yüzeyindeki sızıntıyı etkili bir şekilde ortadan kaldırmıştır. Mevcut yöntemin bazı kısıtlamaları da göz önünde bulundurulmalıdır. Mikroakışkan cihazların üretimi kısmen manuel işlem prosedürlerine bağımlıdır ve bu durum cihazlar ile operatörler arasında değişkenliğe yol açabilir. Fotolitografi, mikrokanal geometrilerinin üretimi için yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik sağlasa da süreç, özel ekipman ve teknik uzmanlık gerektirebilir. Üç boyutlu yazdırma teknikleri dahil olmak üzere alternatif üretim yaklaşımları, bazı laboratuvarlar için cihaz prototiplemeyi ve erişilebilirliği kolaylaştırabilir; ancak yazdırma çözünürlüğü, kalıntı monomerler ve malzeme biyouyumluluğu gibi faktörlerin dikkatli bir şekilde optimize edilmesi gerekir37.

Besiyerinin sürekli sağlanması, hücrelere stabil bir ortam sunar ve onları atık birikiminden veya kalsiyum/fosfat dengesizliğinden korur16. Çeşitli çalışmalar, sabit akış tarafından indüklenen kayma stresinin, hücre davranışının temel belirleyicileri olan ve in vivo sinyalizasyona benzer mekanotransdüksiyon süreçlerini simüle edebildiğini38,39, hücre farklılaşmasına ve olgunlaşmasına katkıda bulunduğunu ve hücre morfolojisi, gen ekspresyonu ve fonksiyonunda önemli değişiklikler meydana getirdiğini göstermiştir39. Mevcut çalışma, cihazın üretimi ve ilk validasyonunu rapor ederek, statik kültür koşulları altında 24 sa sonra hücre adhezyonunu ve canlılığını kanıtlamaktadır; bu nedenle dinamik akışın etkileri değerlendirilmemiştir. Dinamik akış koşullarının uygulanması, gelecek araştırmalar için önemli bir yol teşkil etmekte olup sonraki incelemelerde ele alınacaktır. Sunulan protokol, üç katmanlı bir PDMS mikroakışkan platform içerisinde dentin içeren, dikey olarak istiflenmiş bir dentin-pulpa kompleksi OoC cihazının üretimi için tekrarlanabilir bir iş akışı sağlamaktadır. Modelin potansiyel uygulama alanları arasında dentin-biyomalzeme etkileşimlerinin incelenmesi, dental materyallere verilen hücresel yanıtlar ve kontrollü deneysel koşullar altında dentin-pulpa arayüzünün in vitro değerlendirmesi yer almaktadır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, herhangi bir rakip finansal çıkarı olmadığını ve beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması bulunmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Universidad de La Frontera, Dirección de Investigación bünyesindeki DIM24-0004 ve PP24-0031 projeleri; FONDECYT Regular No. 1260116 ve Şili Ulusal Araştırma ve Geliştirme Ajansı (ANID) bünyesindeki FONDECYT de Iniciación No. 11230701 tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Biyolojik ve kimyasal malzemeler
AsetonExpertQSOLV 8Silikon gofre temizliği
Alpha MEM kültür ortamıCytivaSH30265.02Dental pulpa kök hücre kültür ortamı
Kloramin (%0,5)Merck7080-50-4Dentin diskleri için saklama solüsyonu
Dental pulpa kök hücreleriUygulanamazUygulanamazPrimer hücre kültürü. Bkz. Adımlar 3.2.1 ve 3.2.2
EDTA (%10)WinklerN2222158ESürme tabakasının uzaklaştırılması
Epoksi bazlı negatif fotoresistGersteltecGM1060Fotolitografi kalıp üretimi
0,1 M Sorensen’s fosfat tamponunda glutaraldehit (%2,5)Sigma-Aldrich210908-06SEM fiksasyonu
Sağlıklı insan dişleri (molar veya premolar)UygulanamazUygulanamazİnsan örneği
İzopropanolExpertQSOLV 16Gofre temizliği, geliştirme durdurma ve PDMS temizliği
LIVE/DEAD Canlılık KitiSigma-Aldrich451Floresan canlılık boyaması. 
PBS (fosfat tamponlu salin)Corning46-013-CMYıkama ve sızıntı testi
PDMS baz ve kürleme ajanı (polidimetilsiloksan)DowSylgard 184Cihaz üretimi
PGMEASigma Aldrich484431Fotoresist geliştirme
Tripan mavisiSigma Aldrich T8154-100mlHücre canlılığı değerlendirmesi
TripsinCorning25-053-CIHücre ayırma
Ultrapure suCytivaSH30529.01Yıkama solüsyonu
Sarf malzemeleri ve laboratuvar gereçleri
19G şırınga iğneleriVmaticVCB19050Cihazın mikropompaya veya şırıngaya bağlanması
Biyopsi pançı (çap: 1 mm)Harris UnicoreWHAWB100073Giriş ve çıkış portu üretimi
Kesme matıNicecoolUygulanamazPançlama sırasında yüzey koruması
Dental bitirme diskleri (ör. Sof-Lex)3MSof-LexDentin cilalama
Dişi Luer-tırtıklı adaptörlerRunze FluidicsRH-M016Tüp bağlantısı
Cam veya plastik karıştırma çubuğuDuranUygulanamazPDMS karıştırma
Hipodermik şırıngalarCranberrypc-12246Hücre ekimi ve sızıntı testi
Havsız steril gazlı bezLindersonUygulanamazPanç kalıntılarının temizlenmesi
Erkek Luer adaptörlerRunze FluidicsRH-G016Tüp bağlantısı
Karıştırma kabıDuranUygulanamazPDMS hazırlama
Petri kabı (140 mm × 20 mm)Deltalab2000219Hücre kültürü/inkübasyon
Politetrafloroetilen tabanCCTValUygulanamazAra dentin tabakası üretimi
Silikon gofreJiaozuo Commercial FineWinUygulanamazKalıp üretimi
Silikon tüpRunze Fluidics96421Akışkan bağlantısı
T75 flaskCorning 353136Dental pulpa kök hücre genişletme
Çok kuyucuklu plakaSPL Life Sciences30006Konfokal boyama ve görüntüleme hazırlığı
Ekipman ve enstrümanlar
Hava kurutucuMETALPLANTITAN-040Sıkıştırılmış hava kurutma
Sıkıştırılmış hava kaynağıSCHULZCSD-18.1Kalıp ve yüzey temizliği
Konfokal mikroskopOlympusUygulanamazModel: FV1000
Direkt lazer litografi sistemiHeidelberguPG 101Fotoresist pozlama
Çevresel taramalı elektron mikroskobuHitachiUygulanamazModel: Quanta 400 
Yüksek hızlı angldruvaNakanishiUygulanamazModel: Pana-max2
Isıtıcı tablaLabTechEH20A PlusGofre pişirme ve fotoresist pişirme
Laminar akış kabiniBioBaseBBS8V1708313DCihaz sterilizasyonu
Mikroakışkan pompaNew EraUygulanamazModel: 1002X-ES. 10 µL/dakika hızında sızıntı testi
Mikroyapılı kalıp (fotolitografi ile üretilmiştir)CCTValUygulanamazKalıp üretim özellikleri için Bkz. Adım 2.2
Fırın veya inkübatörMemmertUN11050°C'de PDMS kürleme ve 75°C'de bağ konsolidasyonu
Vakumlu Plazma Temizleme KabiniFari PlasmaGD-5Gofre plazma aktivasyonu
El tipi Korona Plazma Aurora Pro ScientificAPS-CD-20ACPDMS plazma aktivasyonu
Ultrasonik temizleyiciElma SonicS 10 (H)Gofre temizliği
Vakum kabini veya desikatör (250 mm)WinglassUygulanamazPDMS gaz giderme
Vakum pompasıROCKER300PDMS gaz giderme

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schlüter KD. The use of animals in physiological science: the past, the present, and the future. Pflugers Arch. 2024;476(11):1653-63.
  2. Robinson NB, et al. The current state of animal models in research: a review. Int J Surg. 2019;72:9-13.
  3. Nakashima M, et al. Animal models for stem cell-based pulp regeneration: foundation for human clinical applications. Tissue Eng Part B Rev. 2019;25(2):100-13.
  4. Ribeiro AB, et al. Short-term effect of ligature-induced periodontitis on cardiovascular variability and inflammatory response in spontaneously hypertensive rats. BMC Oral Health. 2021;21(1):515.
  5. IQVIA Institute. Global trends in R&D 2022. IQVIA Institute; 2021.
  6. Loewa A, Feng JJ, Hedtrich S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 2023;1:1-15.
  7. Paul SM, et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(3):203-14.
  8. Rosa V, et al. A critical analysis of research methods and biological experimental models to study pulp regeneration. Int Endod J. 2022;55(Suppl 2):446-55.
  9. França CM, et al. The tooth on-a-chip: a microphysiologic model system mimicking the biologic interface of the tooth with biomaterials. Lab Chip. 2020;20(2):405-13.
  10. Zhang H, et al. Research and development of microenvironment's influence on stem cells from the apical papilla: construction of novel research microdevices, tooth-on-a-chip. Biomed Microdevices. 2024;26(3):33.
  11. Han JJ. FDA Modernization Act 2.0 allows for alternatives to animal testing. Artif Organs. 2023;47(3):449-50.
  12. Leung C, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2:33.
  13. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006;442:368-73.
  14. Belin S, Zuloaga KL, Poitelon Y. Influence of mechanical stimuli on Schwann cell biology. Front Cell Neurosci. 2017;11:347.
  15. Jansen KA, et al. A guide to mechanobiology: where biology and physics meet. Biochim Biophys Acta. 2015;1853(11):3043-52.
  16. Atif AR, et al. A microfluidics-based method for culturing osteoblasts on biomimetic hydroxyapatite. Acta Biomater. 2021;127:327-37.
  17. Soragni C, et al. A versatile multiplexed assay to quantify intracellular ROS and cell viability in 3D on-a-chip models. Redox Biol. 2022;57:102488.
  18. Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23(8):467-91.
  19. Huang C, et al. The application of organs-on-a-chip in dental, oral, and craniofacial research. J Dent Res. 2023;102(4):364-75.
  20. Rodrigues NS, et al. Biomaterial and biofilm interactions with the pulp-dentin complex-on-a-chip. J Dent Res. 2021;100(10):1136-43.
  21. Cordiale A, et al. An innovative "tooth-on-chip" microfluidic device emulating the structure and physiology of the dental pulp tissue. Adv Healthc Mater. 2025. doi:10.1002/adhm.202502080.
  22. Sanz-Serrano D, Mercade M, Ventura F, Sánchez-de-Diego C. Engineering a microphysiological model for regenerative endodontic studies. Biology. 2024;13(4):221.
  23. Qi Y, et al. Fabrication of tapered fluidic microchannels conducive to angiogenic sprouting within gelatin methacryloyl hydrogels. J Endod. 2021;47(1):52-61.
  24. Hu Q, et al. Gum-on-a-chip exploring host-microbe interactions: periodontal disease modeling and drug discovery. J Tissue Eng. 2025;16:20417314251314356.
  25. Svanberg S, et al. "Periodontal ligament-on-chip" as a novel tool for studies on the physiology and pathology of periodontal tissues. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303942.
  26. Mishra A, et al. Fluid flow-induced modulation of viability and osteodifferentiation of periodontal ligament stem cell spheroids-on-chip. Biomater Sci. 2023;11(22):7432-44.
  27. Rahimi C, et al. Oral mucosa-on-a-chip to assess layer-specific responses to bacteria and dental materials. Biomicrofluidics. 2018;12(5):054106.
  28. Dhall A, et al. A dental implant-on-a-chip for 3D modeling of host-material-pathogen interactions and therapeutic testing platforms. Lab Chip. 2022;22(24):4905-16.
  29. Franca CM, et al. In vitro models of biocompatibility testing for restorative dental materials: from 2D cultures to organs-on-a-chip. Acta Biomater. 2022;150:58-66.
  30. Hu S, et al. Characterization of silver diamine fluoride cytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip and gingival equivalents. Dent Mater. 2022;38(8):1385-94.
  31. Niu L, et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(9):4844-51.
  32. Sriram G, Makkar H. Microfluidic organ-on-chip systems for periodontal research: advances and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 2025;12:1490453.
  33. Pierfelice TV, et al. A systematic review on organ-on-a-chip in PDMS or hydrogel in dentistry: an update of the literature. Gels. 2024;10(2):102.
  34. Baeza-Fernández J, Bucchi C. Organ-on-a-chip devices to simulate the dentin-pulp complex: a qualitative systematic review. Ann Biomed Eng. 2026. doi:10.1007/s10439-026-04058-0.
  35. Arola D, et al. Transition behavior in fatigue of human dentin: structure and anisotropy. Biomaterials. 2007;28(26):3867-75.
  36. Kratz SRA, et al. A compression transmission device for the evaluation of bonding strength of biocompatible microfluidic and biochip materials and systems. Sci Rep. 2020;10(1):1400.
  37. Carvalho V, et al. 3D printing techniques and their applications to organ-on-a-chip platforms: a systematic review. Sensors (Basel). 2021;21(9):3304.
  38. LeGoff L, Lecuit T. Mechanical forces and growth in animal tissues. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;8(3):a019232.
  39. Akimoto S, et al. Laminar shear stress inhibits vascular endothelial cell proliferation by inducing cyclin-dependent kinase inhibitor p21(Sdi1/Cip1/Waf1). Circ Res. 2000;86(2):185-90.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ip zerinde OrganMikroak kan CihazPDMS D k mFotolitografiPlazma Y zey lemiDental Pulpa K k H creleriH cre AdezyonuKonfokal Mikroskopi
Video yakında

İlgili makaleler