Kongsheng Zhenzhong Dan'ın Otizmle İlgili Yollarda Mekanizması: Ağ Farmakolojisi, Moleküler Bağlanma ve Deneysel Doğrulamaya Dayalı Bir Çalışma

Özet

Bu çalışma, ağ farmakolojisi, moleküler kenetlenme ve moleküler dinamik (MD) simülasyonlarını entegre ederek otizm spektrum bozukluğunda (ASD) Kongsheng Zhenzhong Dan'ın (KSZZD) temel aktif bileşenlerini ve terapötik hedeflerini aydınlatıyor, alanin taraması yoluyla ana bağlanma kalıntılarını belirliyor ve valproik asit kaynaklı ASD sıçan modelinde etkileri doğrulamaktadır.

Özet

Otizm spektrum bozukluğu (ASD), karmaşık bir nörogelişimsel bozukluktur ve patogenezi kronik nöroinflamasyonla yakından ilişkilidir. Klasik geleneksel Çin tıbbı (TCM) formülü olan Kongsheng Zhenzhong Dan (KSZZD), bildirilen nöroprotektif etkileri nedeniyle nörogelişimsel ve hafıza bozuklukları için kullanılır, ancak ASD'deki spesifik moleküler mekanizması belirsizdir. Bu çalışma, ağ farmakolojisi, moleküler kenetleme analizi ve MD simülasyonunu entegre ederek KSZZD'nin ASD için temel aktif bileşenlerini ve aday terapötik hedeflerini hem sistemik hem de atomik düzeyde sistematik olarak açıklamaktadır. Daha sonra, ana bağlanma kalıntıları alanin esnek tarama ile tanımlanır ve biyolojik etkiler valproik asit (VPA) kaynaklı ASD fare modeli kullanılarak değerlendirilir. Ağ farmakoloji analizi, KSZZD'nin önemli bir bileşeni olan kuversetinin, kısmen TNF-α aracılı inflamatuar sinyal yolunu düzenleyerek etkili olabileceğini ortaya koymuştur. Moleküler kenetlenme sonuçları, KSZZD'nin temel bileşenlerinin hedeflerine bağlanma enerjilerinin hepsinin -5.0 kcal/mol'den düşük olduğunu ve bunların arasında quercetinin TNF'ye en güçlü bağlanma eğilimini gösterdiğini (-8.52 kcal/mol) gösterdi. MD simülasyonu, quercetinin TNF-α'nin aktif cebine stabil bağlanmayı sürdürebileceğini gösterdi ve alanin taraması, GLU104 ve GLN102'yi kompleksin yapısal stabilitesini korumak için önemli amino asit kalıntıları olarak daha da belirledi. In vivo deneyler, quercetin müdahalesinin VPA kaynaklı ASD sıçanlarında lokomotor ve keşif davranışlarını anlamlı şekilde iyileştirdiğini ve serum ile beyin dokusunda TNF-α ekspresyon seviyelerini etkili şekilde azalttığını göstermiştir. Bu bulgular, quercetinin KSZZD'nin öngörülen etkilerine, en azından kısmen, TNF-α sinyal yolunun inhibisyonu yoluyla katkıda bulunabileceğini göstermektedir.

Giriş

Otizm Spektrum Bozukluğu (ASD), sosyal iletişimin bozulması, sınırlı ilgi alanları ve tekrarlayan stereotip davranışlarla karakterize edilen karmaşık bir nörogelişimsel^{bozukluktur 1}. ASD'nin patolojik mekanizması son derece karmaşıktır; genetik varyasyonlar, epigenetik düzenleme ve çevresel faktörlerin etkileşimini içerir; bu da nihayetinde sinaptik plastisitenin bozulmasına ve anormal sinirsel devre^{bağlantısına yol açar 2,3}. Merkezi sinir sistemindeki (MSS) kronik iltihaplanma, ASD'nin patogenezinde merkezi bir rol oynar ve nöroinflamasyonu hedefleyen müdahaleler umut vadeden tedavi stratejileri olarak ortaya çıkmıştır.

Kongsheng Zhenzhong Dan (KSZZD), klasik bir TCM formülü olarak, ilk olarak Essential Prescriptions Worth a Thousand Gold for Emergency (Acil Durumlar İçin Bin) adlı Temel Reçeteler kitabında kaydedilmiştir. Dört şifalı bitkiden oluşur: Kaplumbağa Karapısı, Os Draconis, Polygalae Radix ve Acori Tatarinowii Rizoma. KSZZD geleneksel olarak kalbi ve böbreği güçlendirmek, zihni sakinleştirmek ve ruhu stabilize etmek için kullanılır. Klinik olarak, zihinsel gelişimsel gecikme ve hafıza bozukluklarını tedavi etmek için yaygın olarak^{kullanılır 4}. Modern farmakolojik çalışmalar, KSZZD ve aktif bileşenlerinin nöroprotektif, anti-inflamatuar ve antioksidan etkiler uyguladığını ve nörogelişimsel bozukluk modellerinde öğrenme, hafıza ve kaygı benzeri davranışları iyileştirebileceğini^{göstermiştir.} Fitokimyasal analizimiz, quercetin ve diğer flavonoidlerin bu formülün temel aktif bileşenleri olduğunu, kan-beyin bariyerini aşarak önemli anti-inflamatuar aktivite gösterebileceğini^{ortaya koymuştur 6}. Ancak, bu aktif bileşenlerin ASD'de KSZZD'nin terapötik etkilerini nasıl aracılık ettiği mekanizması hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır.

Hesaplamalı biyolojinin hızla gelişmesiyle birlikte, ağ farmakolojisi, moleküler kenetlenme, moleküler dinamik simülasyonu ve kuantum kimyası hesaplaması gibi teknikler, geleneksel Çin tıbbının aktif bileşenleri ile hastalık hedefleri arasındaki etkileşimleri^{atomik seviyede} 7,8,9,10,11 aydınlatmak için güçlü araçlar sağlamıştır . Heterojen veri kaynaklarını entegre ederek, ağ farmakolojisi sistem biyolojisi açısından karmaşık, etkileşimli bir "bileşen-hedef-yolu" ağı oluşturulmasını sağlar ve böylece geleneksel Çin tıbbı müdahalesi için temel biyolojik düğümleri önceden tanımlar.

Bu temelde, moleküler kenetlenme bileşenler ile hedef proteinler arasındaki geometrik uyum ve enerji uyumunu simüle etmek ve bağlanma modlarını ve potansiyel aktivitelerini tahmin etmek için de kullanılabilir. Daha sonra, kompleksin sulu ve fizyolojik koşullarda yapısal dalgalanma ve bağlanma kararlılığını incelemek için moleküler dinamik (MD) simülasyonu yapılır. Alanin taraması ile birlikte, bağlanma afinitesini korumadan sorumlu çekirdek sıcak nokta kalıntılarını doğru şekilde konumlandırmak ve farmakoforun katkı ağırlığını amino asit seviyesinde netleştirmek için site yönlendirilmiş mutagenez simülasyonu uygulanır. Son olarak, iyi tasarlanmış farmakolojik deneylere dayalı doğrulama, geleneksel Çin tıp bileşiklerinin belirli hastalıklar üzerindeki terapötik etkilerinin altında yatan moleküler mekanizmayı etkili bir şekilde ortaya çıkarabilir.

Buna göre, bu çalışma öncelikle KSZZD'nin temel bileşenlerini ve hedeflerini ağ farmakolojisi yoluyla ASD tedavisinde taramayı hedeflemektedir. Daha sonra, moleküler kenetlenme, moleküler dinamik simülasyonu ve alanin esnek tarama ile birleşerek, karmaşık kararlılığı koruyan "sıcak nokta kalıntıları" belirlenecek ve quercetin ile TNF-α arasındaki dinamik etkileşim deseni değerlendirilecektir. Son olarak, hesaplamalı sonuçlar VPA kaynaklı bir ASD fare modelinde hayvan davranışı, beyin histopatolojisi ve inflamatuar faktör ifade seviyeleri değerlendirilerek deneysel olarak doğrulanacaktır. Bu çalışma, KSZZD'den türetilen bileşenlerin otizmle ilişkili inflamatuar yolları etkileyebileceği potansiyel mekanizmaları çok ölçekli bir perspektifle incelemeyi ve nörogelişimsel bozukluklarda geleneksel Çin tıbbı müdahalelerinin daha fazla araştırılması için temel sağlamayı amaçlamaktadır.

Protokol

Ağ farmakolojisi analizi

"Otizm" anahtar kelimesi olarak GeneCards veritabanında (https://www.genecards.org/) otizmle ilgili hedefler^12,13,14 aramalarında kullanılmıştır. Veritabanlarından alınan hedefler, tekrarlanan girişler kaldırıldıktan sonra birleştirildi. Veritabanı tahminleriyle yakalanmayan aktif bileşenlerin bilinen hedefleri, literatür raporlarına dayanarak^{desteklenmiştir 15}. Hastalık hedefleri ve ilaç bileşenlerinin potansiyel hedefleri, UniProt protein veritabanı (https://www.uniprot.org/) kullanılarak Gen Sembollerine eşit şekilde standartlaştırıldı ve bu iki hedef seti KSZZD'nin otizm¹⁶ için potansiyel terapötik hedeflerini belirlemek üzere haritalandı.

Geleneksel Çin Tıp Sistemleri Farmakoloji Veritabanı ve Analiz Platformu (TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php temelinde, KSZZD'deki potansiyel biyoaktif bileşikler ve ilgili hedefler, ağızdan biyolojik kullanılabilirlik (OB ≥ 0.30) ve ilaç benzerliği indeksi (DL ≥ 0.18) kriterlerine göre ^elenirdi17. Bileşiklerin SMILES tanımlayıcıları PubChem veritabanından (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) alındı ve Swiss Target Prediction (http://swisstargetprediction.ch/) TCMSP platformunda yer almayan potansiyel hedefleri incelemek için daha fazla^{kullanıldı.} Daha sonra, HERB veritabanı (http://herb.ac.cn) Lipinski Beş Kuralı uyarınca ek tarama için kullanıldı ve kriterler şu şekildeydi: moleküler ağırlık (MW ≤ 500 Da), oktanol-su bölme katsayısı (AlogP ≤ 5), hidrojen bağ bağışçı sayısı (Hdon ≤ 5), hidrojen bağ alıcılarının sayısı (Hacc ≤ 10) ve dönebilir bağ sayısı (RBN ≤ 10). Daha sonra, hedef taraması BATMAN-TCM veritabanı (http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/) kullanılarak şu kriterlerle gerçekleştirildi: skor kesme (≥0.84), ilaç kullanılabilirliği puanı (≥0.10) ve P değeri (≤0.05). Son olarak, UniProt veritabanı (https://www.uniprot.org) seçilen hedef isimleri standart Gen Sembollerine dönüştürmek için kullanıldı.

İlaç hedefleri ile otizm hedefleri arasında örtüşen hedefler, çevrimiçi Draw Venn Diyagramı aracı (http://bioinformatics.psb.ugent.be) kullanılarak belirlendi. Bu örtüşen hedefler, protein-protein etkileşimi (PPI) ağı oluşturmak için STRING veritabanına (https://string-db.org/) aktarıldı¹⁹. Tür Homo sapiens olarak ayarlandı ve 0.40'ın altında güven puanı olan protein-protein etkileşimleri filtrelendi. Ortaya çıkan ağ, görsel analiz¹⁶ için Cytoscape 3.10.0 yazılımına aktarıldı; burada ilaçlar, bileşikler ve hedefler sırasıyla kırmızı elmaslar, mavi daireler ve yeşil üçgenlerle temsil edildi ve kenar ağırlıkları düğümlerin derecelik merkeziyetini yansıtıyordu. CytoNCA eklentisi daha sonra derece merkeziyet değerlerini hesaplamak, çekirdek bileşikleri sıralamak ve ana çekirdek bileşikleri tanımlamak için kullanıldı. Hedef genlerin biyoinformatik zenginleştirme analizi, Metascape platform²⁰ kullanılarak gerçekleştirildi; GO analizi (biyolojik süreç, BP; moleküler fonksiyon, MF; hücresel bileşen, CC) ve KEGG yol analizi dahildir.

Moleküler kenetleme

Yukarıda tanımlanan otizmle ilgili reseptör proteinleri, kenetlenmeden önce eksik kalıntılar onarılır, protonasyon durumu optimize edilir ve reseptör yapısal bütünlüğünü korumak için kristal su molekülleri çıkarılır. CDOCKER^{modülü 21'deki} yarı esnek kenetlenme yöntemi daha sonra kullanıldı. Ko-kristal ligandın 10 şiçindeki rekıntılar aktif cep olarak tanımlandı ve ligand-reseptör bağlanması bu bölgede simüle edildi.

Kenetlenme sonuçları, CDOCKER Etkileşim Enerjisi temel indeks olarak değerlendirildi; düşük enerji değerleri ligand ile reseptör arasında daha kararlı tahmin edilen bağlanmayı gösteriyordu. Kenetlenme modunun güvenilirliği, çekirdek bileşenin mekansal bağlanma konformasyonu ile aktif cepteki ko-kristal ligandın yapısı karşılaştırılarak değerlendirildi. Optimal bağlanma enerjisine ve en güçlü etkileşime sahip kompleks, sonraki moleküler dinamik simülasyonu için ilk konformasyon olarak seçildi.

Moleküler dinamik simülasyonu

Moleküler kenetlenme bulgularına dayanarak, quercetin kompleksi ile TNF-α arasındaki bağlanma mekanizmasını incelemek için moleküler dinamik simülasyonu gerçekleştirildi. Bu yaklaşım, moleküler hareket ve etkileşimleri atomik düzeyde simüle eder ve proteinlerde, ligandlarda ve çevredeki dinamik değişiklikleri analiz eder; böylece moleküler konformasyon değişimi, bağlanma kararlılığı ve protein-ligand dinamikleri hakkında bilgi sağlar. Reseptör-ligand kompleksi, tam çözüm sağlamak ve sınır etkilerini azaltmak için kompleks ile sistem sınırı arasında en az 12 ştampon mesafesi olan TIP3P su modeli kullanılarak çözüldü. İyonik konsantrasyon 0.154 M olarak ayarlandı ve sistem yükünü nötralize etmek için Na⁺ ve Cl⁻ iyonları eklendi. Simülasyon doğruluğunu artırmak için, bağlanmamış moleküller arası etkileşimleri ve bağlanma modlarını etkili şekilde tanımlayan ve özellikle protein-ligand kompleksi çalışmaları için uygun olan Amber14SB protein kuvvet^{alanı 22} benimsenmiştir²³.

İlk enerji en aza indirme için, en dik iniş yöntemi 5000 adım boyunca uygulandı; makul olmayan temaslar ve yüksek enerji konformasyonları ortadan kaldırıldı; kuvvet alanı parametrelerinin gevşemesini sağlamak için 10 kJ/mol/nm yakınsama eşiği kullanıldı. Daha sonra termodinamik durumu daha optimize etmek ve sistem kararlılığını sağlamak için 2.000 adım boyunca konjuge gradyan^{yöntemi çalıştırıldı 24}.

Denge sırasında NVT topluluk simülasyonu ilk olarak 100 ps için 2 fs zaman adımıyla gerçekleştirildi. Sistem, başlangıç yapının etkisini azaltmak ve termodinamik dengeye ulaşmak için kademeli olarak 300 K'ya kadar ısıtıldı. Grup daha sonra NPT'ye geçti ve yoğunluk ile basıncı stabilize etmek için 1 bar sabit basınçta ek 100 ps dengeleme yapıldı. Bu aşama, üretim^{simülasyonu 25'ten} önce sistemi stabil bir termodinamik duruma getirmek için kullanıldı. Resmi moleküler dinamik simülasyonu 20 ns boyunca gerçekleştirildi; sıcaklık 300 K, basınç 1 bar ve zaman adımı 2 fs olarak tutuldu. Yörünge her 10 ps kaydedildi. Simülasyonun kararlılığı ve doğruluğunu sağlamak için, sıcaklık, basınç ve hacim gibi fiziksel parametreler düzenli olarak izlenerek beklenen aralıklar içinde kaldıklarını doğruladı.

Alanin esnek tarama

Moleküler dinamik simülasyonundan elde edilen kararlı konformasyona dayanarak, ligand bağlanma arayüzünün 3 şyarıçapındaki tüm amino asit kalıntıları üzerinde alanin taraması yapıldı. Bu işlemde, hedef kalıntıları sistematik olarak alanin ile değiştirilir, böylece yan zincir kısaltılır, ana zincir konformasyonu korunur ve yan zincir aracılı spesifik etkileşimler ortadan kaldırılır. Her kalıntının bağlanma afinitesine katkı ağırlığı, vahşi tip ve mutant kompleksler arasındaki bağlanma serbest enerjisindeki değişim hesaplanarak nicelendirildi. Geleneksel statik modellerin aksine, bu çalışma mutasyon bölgesinin çevresindeki çevrenin yapısal gevşeme geçirmesine ve bağlanma arayüzünün dinamik yanındakı tepkini daha gerçekçi şekilde simüle etmesine olanak tanıyan yan zincir esnek gevşemasyon mekanizması tanıttı. Bu analiz, karmaşık stabiliteyi koruyan aday sıcak nokta kalıntılarını belirlemeyi amaçladı ve otizmle ilişkili proteinleri hedefleyen kurşun bileşik optimizasyonu için enerjik bir parmak izi sağladı.

Hayvan deneyleri

Deneysel hayvanlar

Aynı koşullarda doğup büyümüş sağlıklı SPF dereceli Sprague-Dawley (SD) sıçanları (üç erkek ve üç dişi, 3 aylık), seçildi. Oda sıcaklığı 18–22 °C arasında kontrol edildi, göreli nem %60–%70 arasında tutuldu ve ışık döngüsü 12 saat: 12 saat (ışık: karanlık) olarak kaydedildi. Tüm hayvan deney operasyonları, Zunyi İlk Halk Hastanesi'nin Deneysel Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No.: LunShen (2025)-2-362).

Hayvan çiftleşmesi, gebelik tanımı ve gruplama

Tüm fareler, satın alındıktan sonra 1 hafta boyunca SPF ortamında uyarlanabilir şekilde beslendi. Her öğleden sonra saat 18:00'de bir dişi fare ve bir erkek fare kafeste tutulurdu. Vajinal tıkaç muayenesi ertesi sabah saat 8:00'de (kafesle tutulduktan 12 saat sonra) yapıldı. Vajinal tıkaç varlığı başarılı bir çiftleşme olarak kabul edildi ve aynı gün gebelik günü 0.5 (GD0.5) olarak belirlendi. Hamile fareler ayrı kafeslerde bireysel olarak tutulurdu. Hamile farelerin vücut ağırlığı günlük olarak ölçülüp kaydedildi. Hamile farelerin vücut ağırlığı sürekli olarak artıyor, ortalama günlük alım 2–5 g olup, toplam vücut ağırlığı doğumdan önce yaklaşık %30 artıyordu. Yaklaşık 10 günlük gebelikten sonra, tipik armut şeklinde asimetrik bir karın şişliği görülmeye başladı ve palpasyonla sert fetüs kütleleri hissedilebiliyordu; bu, obezite kaynaklı uniform ve yumuşak karın çevresinden ayırt ediliyordu.

Model oluşturma ve kontrol grubu kurulumu:

Model grubu için, iki hamile fare rastgele seçildi ve gebelik gününde (GD12.5) bir kez intraperitoneal olarak VPA çözeltisi (600 mg/kg) enjekte edildi (GD12.5). VPA, gebelik gününde 12.5 mg dozda 600 mg/kg dozda tek intraperitoneal enjeksiyonla uygulandı. Bu rejim, Schneider ve^{Przewłocki 26'nın} temel çalışmalarına dayanarak seçilmiştir; bu çalışmalar, bu belirli gebelik döneminde VPA maruziyetinin insan ASD'nin hem nöroanatomik hem de davranışsal özelliklerini özetlediğini ortaya koymuştur. Bu protokol o zamandan beri standart model haline gelmiş ve yakın zamanda aynı parametreler²⁷ kullanılarak yapılan farmakolojik çalışmalarda tutarlı olarak doğrulanmıştır. Boş kontrol grubu için, bir hamile fare seçildi ve aynı zaman noktasında %0,9 normal salin eşit hacimle intraperitoneal enjekte edildi. Hamile fareler doğal yollarla doğum yaptı ve yavrunun doğum günü doğum günü doğum sonrası 0 (PND0) olarak kaydedildi. Tüm yavru fareler sütten kesilip PND21'de cinsiyete göre ayrı tutuldu.

Yavruların gruplanması ve müdahalesi

PND28'de, VPA'ya maruz kalmış hamile sıçanların yavrularından (model grubunda 6, quercetin müdahale grubunda 6) yavrularından 12 erkek yavru rastgele seçildi ve normal tuzlu saynelle maruz kalmış hamile sıçanların yavrularından (boş grupta 6) 6 erkek yavru rastgele seçildi. Her gruptaki yavrular arasında vücut ağırlığında önemli bir fark olmadığından emin edildi. Normal salin ile tedavi edilen hamile sıçanlardan doğan çocuklar boş gruba, VPA ile tedavi edilen hamile sıçanlardan doğanlar model gruba ve VPA ile tedavi edilen hamile farelerden doğanlar quercetin müdahale grubuna atandı.

PND28'den itibaren 4 hafta boyunca sürekli müdahale yapıldı. Quercetin müdahale grubu için, quercetin süspansiyonu her gün sabit bir zamanda 100 mg/kg dozda intragastrical olarak uygulandı. Bu doz, aşağıdaki entegre kanıtlara dayanarak seçildi: (i) önceki doz aralığına dayalı bir çalışma, LPS kaynaklı nöroinflamasyon fare modelinde anksiyete benzeri davranışları hafifletmek ve pro-inflamatuar sitokinleri azaltmak için en uygun doz olarak 100 mg/kg olduğunu^{belirlemiştir;} (ii) 50 mg/kg versetin, prenatal VPA kaynaklı otizm sıçan modelinde sosyal etkileşim eksikliklerini ve oksidatif beyin hasarını önlediği^{gösterilmiştir 29}; ve (iii) oral quercetin, propionik asit kaynaklı otizm sıçan^{modeli 30'da} beyin TNF-α seviyelerini azalttığı ve otistik benzeri davranışları iyileştirdiği yakın zamanda gösterilmiştir. Bu bağımsız doğrulamalar, mevcut doğum sonrası VPA kaynaklı ASD modelinde TNF-α aracılı inflamatuar yolun sağlam katılımını sağlamak için 100 mg/kg seçimini desteklemektedir. Blank ve model gruplar için, her gün %0,5 CMC-Na normal tuzlu su çözeltisi eşit hacimde intragastristik olarak uygulandı. Tüm hayvanlar müdahale döneminde ücretsiz yiyecek ve suya erişebiliyordu ve vücut ağırlıkları her hafta ölçülerek uygulama hacmi vücut ağırlıklarına göre ayarlandı.

Açık alan testi

4 haftalık müdahaleden (yaklaşık PND56) sonra, spontan aktivite ve anksiyete seviyeleri değerlendirilmek için açık alan testi yapıldı. Açık alan testi (OFT), deneysel hayvanlarda kaygıya bağlı davranışların değerlendirilmesi için klasik bir davranışsal deneydir. Ölçülen göstergeler, açık bir ortamda sıçanların kendiliğinden hareket etme yeteneği ve açık alanın ortasında geçirilen zamandı. OFT fareler için olan cihazı 30 cm yükseklikte, 50 cm uzunluğunda ve alt kısmında 50 cm genişlikte, iç duvarları beyazdı ve yapay olarak 16 küçük ızgaraya ayrılmıştı; iç alanda 4, dış alanda ise 12 ızgara bulunuyordu. Deney alanı, deney sonuçlarının doğruluğunu etkileyebilecek ses uyarımından kaçınmak için sessiz tutuldu. Her fare kutunun dibinin ortasına yerleştirildi ve video kaydı ile zamanlama aynı anda gerçekleştirildi. Kamera görüş alanı tüm açık alanı kapsıyor ve farelerin kendiliğinden hareketini ve ızgaralar arasındaki geçiş sayısını kaydediyordu. Her test 5 dakika sürdü, ardından video kaydı durduruldu. Açık kutunun iç duvarı ve altı, bir hayvanın bıraktığı dışkı ve vücut kokusunun diğer hayvanın test sonuçlarını etkilemesini önlemek için %75 alkolle silindi. Sıçanlar değiştirildikten sonra tüm sıçanlar testi tamamlayana kadar işlem tekrarlandı.

Patolojik tespit yöntemi

%4 paraformaldehit ile fiksasyondan sonra, beyin dokusu tamamen otomatik bir dehidratör kullanılarak gradyan dehidrasyonuna maruz kaldı: %75 etanol 2 saat, %85 etanol 1 saat, %95 etanol 1 saat ve mutlak etanol I-IV her biri 20 dakika kullanıldı. Daha sonra dokular 25 dakika boyunca temizleyici madde I ve 30 dakika temizleyici madde II ile temizlendi, ardından parafin gömülmesi yapıldı. 5 μm kalınlığındaki kesitler, her biri 30 dakika boyunca I ve II ile mum giderme çözeltisi ile mumdan arındırılmış ve gradyan etanolle yeniden hidretlenmiştir. Bölümler 5–10 dakika boyunca hematoksilinle boyandı, 3 saniye boyunca hidroklorik asit alkolle farklılaştı ve maviye dönmek için alkali suyla karşı boyandı. Daha sonra 3 dakika boyunca alkolle çözünür eozin ile karşı boyanmış, gradyan etanolle kurutulmuş, temizlenmiş, nötr montaj malzemesiyle örtülen ve mikroskop altında gözlemlenmiştir.

Serum ve beyin dokusunda TNF-α seviyelerinin tespiti

Son uygulamadan sonra, farelerden abdominal aort kanı toplandı ve 4 °C'de 3.000 r/dakika ile 15 dakika boyunca santrifüj edildi ve serum süpernatantı alındı. Bu arada, hipokampal ve kortikal dokular diseksiyona geçirildi ve mekanik homojenleştirme için 1:9 oranında önceden soğutulmuş PBS eklendi. Homojenat daha sonra 4 °C'de 12.000 r/dakika hızla santrifüjlenerek süpernatantı toplamak için 20 dakika sürdü. BCA yöntemi, doku proteinlerinin nicelenmesi için kullanıldı. ELISA kiti talimatlarına uygun olarak, test edilecek örnekler ve biyotinile edilmiş antikorlar sırayla mikroplakaya eklendi. İnkubasyon ve yıkamadan sonra avidin-peroksidaz kompleksi eklenip kuluçka yapıldı. Bir başka yıkamadan sonra, renk gelişimi için substrat çözeltisi eklendi, reaksiyon stop çözeltisi ile sonlandırıldı ve mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm emilimcilik ölçüldü. Serumdaki (pg/mL) ve beyin dokusunda (pg/mg prot) TNF-α konsantrasyonları standart eğri kullanılarak hesaplandı.

İstatistiksel analiz

Microsoft Excel'deki RANDBETWEEN fonksiyonu, fareleri rastgele yapmak ve fare tahsisi için rastgele sayılar oluşturmak için kullanıldı. Bu çalışmadaki tüm deneysel veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analizden önce, her grubun verileri üzerinde normallik testi (Shapiro-Wilk testi) ve varyans homojenliği testi (Levene testi) önce yapıldı. Normal dağılım ve varyans homojenliğine uygun veriler için, tek yönlü varyans analizi (tek yönlü ANOVA) kullanıldı. Fark istatistiksel olarak anlamlıysa, LSD yöntemi çoklu karşılaştırmalar için daha fazla kullanıldı. *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Sonuçlar

Otizm tedavisinde KSZZD üzerine ağ farmakolojisi çalışmasının sonuçlarının analizi

GeneCards veritabanından toplam 15.770 otizmle ilgili hedef alındı. İlgi puanı 4.21 ≥ olan hedefler otizm için potansiyel hedef olarak seçildi ve 1014 hastalık hedefi ortaya çıktı. KSZZD'nin 827 hedefi, 1.014 otizm hedefiyle kesiştirildi ve 125 ortak hedef elde edildi. Görselleştirme, SRplot^{platformu 31} (https://www.bioinformatics.com.cn/...

Tartışma

Kritik bir soru, neden diğer temel bileşenler yerine quercetin'in deneysel doğrulama için seçildiği ve KSZZD'nin bütünsel etkilerini temsil edip edemeyeceğidir. Bu seçim, aşağıdaki yakınsal kanıt çizgilerine dayandı: (i) prenatal VPA kaynaklı bir fare modelinde, quercetin sosyal etkileşim eksikliklerini ve oksidatif beyin hasarını önemli ölçüde^{önledi 29}; (ii) propionik asit kaynaklı otizm modelinde, oral quercetin beyin TNF-α seviyelerini azalttı ve otistik benzer...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.5% CMC-Na normal saline solution	Elde belirtilmemiş	Belirtilmemiş	Boş/model grupları ve quercetin süspansiyonu için kullanılan araç.
0.9% normal saline	Elde belirtilmemiş	Belirtilmemiş	Boş kontrol maternal enjeksiyonları için araç.
PBS içindeki %4 Paraformaldehit	Thermo Scientific Chemicals	J61899.AK	Beyin dokusunun fiksasyonu için kullanılır.
%75 alkol	Elde belirtilmemiş	Belirtilmemiş	Açık alan cihazının hayvanlar arasında temizlenmesi için kullanılır.
Mutlak etanol	Elde belirtilmemiş	Belirtilmemiş	Katılaştırma öncesi doku kurutma için kullanılır.
Alkalin su	Elde belirtilmemiş	Belirtilmemiş	Hematoksilin boyamalı kesitleri maviye çevirmek için kullanılır.
Amber14SB protein kuvvet alanı	Elde belirtilmemiş	Uygulanmaz	Moleküler dinamik simülasyonlar için kullanılan protein kuvvet alanı.
BATMAN-TCM veritabanı	Elde belirtilmemiş	Uygulanmaz	Online hedef tarama veritabanı: http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Doku homojenatlarının protein tayini için kullanılır.
Mavileme reaktifi	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7301	Hematoksilin boyama sonrası çekirdeklerin mavilenmesi için kullanılır.
CDOCKER modülü	Elde belirtilmemiş	Uygulanmaz	Moleküler dokunma için kullanılan yarı esnek dokunma modülü.
Temizleme / mumlama çözeltisi	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	Clear-Rite 3, 6901	Histoloji iş akışlarında temizleme ve deparafinleme için kullanılabilir.
CytoNCA eklentisi	Elde belirtilmemiş	Uygulanmaz	Derece merkeziyet analizi için kullanılan Cytoscape eklentisi.
Cytoscape yazılımı	Elde belirtilmemiş	Sürüm 3.10.0	Ağ görselleştirme ve protein-protein etkileşim analizi için kullanılır.
Discovery Studio yazılımı	Elde belirtilmemiş	Sürümler 2019 ve 2021	Reseptör ön işleme, dokunma ve alanin taraması için kullanılır.
Draw Venn Diagram çevrimiçi aracı	Elde belirtilmemiş	Uygulanmaz	Venn diyagramları için çevrimiçi araç: http://bioinformatics.psb.ugent.be
Eozin-Y (alkolik)	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7111	H&E boyamada sitoplazmik karşı boyama için kullanılır.
Tam otomatik dehidratör	Elde belirtilmemiş	Belirtilmemiş	Fiksasyonlu beyin dokusunun gradyan dehidrasyonu için kullanılır.
GeneCards veritabanı	Elde belirtilmemiş	Uygulanmaz	Otizmle ilgili hedefleri almak için kullanılan çevrimiçi veritabanı: https://www.genecards.org/
GraphPad Prism yazılımı	Elde belirtilmemiş	Sürüm 9.5	İstatistiksel analiz ve grafik oluşturma için kullanılır.
Hematoksilin boyama çözeltisi	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7211	H&E boyamada nükleer boyama için kullanılır.
HERB veritabanı	Elde belirtilmemiş	Uygulanmaz	Tamlayıcı bileşik taraması için kullanılan çevrimiçi veritabanı: http://herb.ac.cn
Hidroklorik asit alkol	Elde belirtilmemiş	Belirtilmemiş	H&E boyama sırasında farklılaştırma için kullanılır.
Metascape platformu	Elde belirtilmemiş	Uygulanmaz	GO ve KEGG zenginleştirme analizi için kullanılan çevrimiçi platform.
Mikroplate okuyucu	Thermo Scientific	Multiskan FC, 51119000	450 nm'de absorbans okunması için kullanılır.
Mikroskop	Elde belirtilmemiş	Belirtilmemiş	H&E boyamalı beyin kesitlerini gözlemlemek için kullanılır.
Microsoft Excel yazılımı	Microsoft	Belirtilmemiş	RANDBETWEEN fonksiyonu ile sıçanları rastgele seçmek için kullanılır.
Montaj ortamı	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	4111	Boyalı kesitlerin kapaklanması ve kalıcı montajı için kullanılır.
Açık alan test cihazı	Elde belirtilmemiş	Belirtilmemiş	Davranış testi için kullanılan 50 cm x 50 cm x 30 cm kutu.
Parafin	Elde belirtilmemiş	Belirtilmemiş	Beyin dokusunun parafinle kaplanması için kullanılır.
Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4	Gibco	10010023	Doku homojenizasyonu için soğutulmuş tampon olarak kullanılır.
PLIP etkileşim parmak izi	Elde belirtilmemiş	Uygulanmaz	Protein-ligand etkileşim parmak izi analizi için kullanılır.
PubChem veritabanı	Elde belirtilmemiş	Uygulanmaz	SMILES tanımlayıcılarını almak için kullanılan çevrimiçi veritabanı: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
Quercetin	Elde belirtilmemiş	Belirtilmemiş	100 mg/kg/gün dozda sonda ile verilir.
Rat TNF-α ELISA Kit	Invitrogen	ERA56RB	Serum ve doku homojenatı TNF-α tayini için uygundur.
Soğutmalı santrifüj	Thermo Scientific	Sorvall ST 16R, 75004383	Serum ve doku homojenatı santrifüjlendirme için kullanılır.
Schrödinger Suite yazılımı	Schrödinger, LLC	Sürüm 2024	Moleküler dinamik simülasyon sisteminin oluşturulması için