SMART (Shuimu Otomatik Yeniden Yapılandırma Teknolojisi): Kriyo-elektron mikroskopi iş akışını kolaylaştırmak için entegre bir hesaplama platformu

Haibin Liu; Yangyu Wu; Wenpeng Zhang; Qining Liu; Huaican Xu; Zhenqian Guo; Fanhao Meng; Xinyu Men; Allen Chunlong Guo

doi:10.3791/71725

Yöntem makalesi

SMART (Shuimu Otomatik Yeniden Yapılandırma Teknolojisi): Kriyo-elektron mikroskopi iş akışını kolaylaştırmak için entegre bir hesaplama platformu

DOI:

10.3791/71725

⸱

16 Haziran 2026

Haibin Liu¹ , Yangyu Wu² , Wenpeng Zhang¹ , Qining Liu¹ , Huaican Xu¹ , Zhenqian Guo² , Fanhao Meng² , Xinyu Men² , Allen Chunlong Guo¹

¹Shuimu BioSciences Ltd., ²Cryo-EM Center, Shuimu BioSciences Ltd.

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, veri toplama, üç boyutlu yeniden yapılandırma ve atomik model yapımını tek bir tarayıcı tabanlı arayüzde bağlayan entegre bir yazılım platformu (SMART) kullanarak adım adım kriyo-elektron mikroskopi iş akışını gösterir. Örnek bir örnek olarak, insan TRPML1 yapısı 2.38 şçözünürlükte belirlenmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriyoelektron mikroskopisi (kriyo-EM) yapısal biyolojide merkezi bir araç haline gelmiştir, ancak mevcut iş akışları genellikle veri toplama, üç boyutlu (3D) yeniden yapılandırma ve atomik model oluşturma için birden fazla özel yazılım paketi gerektirir; bu da parçalanmış boru hatlarına ve sık sık manuel müdahaleye yol açar. Burada, üç modülü birleştiren entegre yazılım platformu olan SMART'ı (Shuimu Otomatik Yeniden Yapılandırma Teknolojisi) sunuyoruz; bu platform, otomatik veri toplama için DataSmart, görüntü işleme ve 3D yeniden yapılandırma için CryoSmart ve derin öğrenme tabanlı atomik model oluşturma için ModelSmart — birleşik bir tarayıcı erişimi arayüzünde birleştirilmektedir. Bu protokol, üç modülün tamamını çalıştırmak için adım adım talimatlar sağlar. İş akışı, otomatik örnek gezintisi ve veri toplama, hareket düzeltme, kontrast aktarım fonksiyonu (CTF) tahmini, parçacık seçme, iki boyutlu (2D) sınıflandırma, 3D iyileştirme, harita geliştirme ve atomik model üretimini kapsar. Örnek olarak, tam iş akışını uyguladığımız ve insan TRPML1'in yapısını belirlemek için uyguladık; bu kanal Ca²⁺ geçirgen lizozomal kasyon kanalı ve 0.143 kriterinde altın standart Fourier kabuk korelasyonu (FSC) ile 2.38 şküresel çözünürlük elde ettik. Bu çalışmada üç modülün tamamı (DataSmart, CryoSmart ve ModelSmart) aynı TRPML1 veri setine ardışık olarak uygulandı. Protokol, farklı seviyelerde kriyo-EM deneyimi olan kullanıcılar için erişilebilir olacak şekilde tasarlanmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Teknolojik Evrim ve Biyolojik Etki. Üç boyutlu protein yapısının belirlenmesi, moleküler biyolojide merkezi bir zorluk olmaya devam etmektedir; çünkü biyolojik fonksiyon, amino asit kalıntılarının mekansal düzeniyle karmaşık bir şekilde bağlantılıdır. Bu yapısal konfigürasyonların aydınlaştırılması, enzimatik mekanizmaların, ligand etkileşimlerinin ve hücresel sinyal yollarının atomik çözünürlükte çözülmesi için zorunludur. Bu zorunluluk, kriyo-EM'de dönüştürücü gelişmeleri sağladı ve bu teknik, yaygın olarak benimsenen yapısal biyoloji^tekniği ^1,2 olarak ortaya çıktı.

Kriyo-EM tek parçacık analizi (SPA), izole komplekslerin yüksek çözünürlüklü yapılarını çözerek çeşitli örnek tiplerinde biyolojik içgörüler elde etmek için güçlü bir yaklaşım^{olarak hizmet eder 3}. Bunlar arasında virüsler, zar proteinleri, helikal yapımlar ve yaklaşık 50 kDa'dan onlarca megadaltona kadar geniş moleküler boyutlar yelpazesini kapsayan diğer dinamik ve heterojen makromoleküler kompleksler bulunur.

Kriyo-EM SPA, biyolojik makromoleküllerin üç boyutlu (3D) mimarilerini çözmek için temel bir teknik olarak ortaya çıkmıştır; üç birbirine bağlı hesaplama aşamasını kapsar: veri edinimi, 3D yeniden yapılandırma ve atomik model oluşturma (Şekil 1).

Veri toplama sırasında, vitrifiye edilmiş örnekler düşük doz koşullarında görüntülenerek mikrograf filmleri oluşturulur ve neredeyse yerli hallerde binlerce parçacık projeksiyonu yakalanır. Bu ham veri setleri, daha sonra yinelemeli hizalama ve sınıflandırma algoritmalarıyla işlenir ve hacimsel yoğunluk haritaları yeniden oluşturulur. Son olarak, atomik modeller yoğunluğa uyacak şekilde oluşturulur ve geliştirilir, moleküler etkileşimler neredeyse atomik çözünürlükte aydınlanır.

Yukarıdaki analiz, kriyo-EM çıktısının sadece yapısal boru hattının başlangıç noktasını temsil ettiğini göstermektedir. Bu ham verileri yorumlanabilir atomik modellere dönüştürmek, uzmanlaşmış hesaplamalı yazılım araçları zinciri gerektirir. Bu nedenle, yazılım ham veriyi atomik modellere dönüştüren kritik köprü görevi görür.

Parçalanmış kriyo-EM Yazılım Ekosistemi: Güncel Araçlar ve Sınırlamalar. Modern kriyo-EM iş akışları, her biri ayrı aşamaları ele alan özel yazılım araçlarının bir parçasına dayanır:

Veri Toplama. Leginon ^4,5, SerialEM⁶, UCSFImage4⁷, TFS EPU ^8,9, Gatan Latitude, JEOL JADAS¹⁰ ve Auto-EMation ¹¹ dahil olmak üzere birçok kriyo-EM veri toplama yazılımı paketi kamuya açık olsa da—bu araçlar ağırlıklı olarak ham film verisi üretir ve sınırlı alınım sonrası işleme yetenekleri sunar. Parametre ayarlama, şablon özelleştirme gibi kritik iş akışı adımları hâlâ emek yoğun manuel işlemler gerektirir ve genellikle veri seti başına çok fazla parametre gerektirir. Uzman müdahalesine olan bu bağımlılık, özellikle yüksek verimli senaryolarda tekrarlanabilirlik zorlukları ve iş akışı verimsizlikleri yaratır.

3D Yeniden İnşaat. Kriyo-EM, biyolojik makromoleküllerin neredeyse atomik çözünürlüğünü sağlayan 3D yeniden yapılandırma yazılımında önemli gelişmelere tanık olmuştur. En yaygın kullanılan araçlar arasında RELION, cryoSPARC ve EMAN2 bulunur ve her biri kendine özgü avantajlar ve sınırlamalar sunar. RELION, yineleyici iyileştirme için Bayes yaklaşımını kullanır, heterojen veri setlerini işlemede ve yüksek çözünürlüklü yeniden yapılandırmalar elde etmede üstün^{başarılıdır 12}. Ancak, hesaplama yoğunluğu ve dik öğrenme eğrisi genellikle uzman müdahalesini gerektirir. cryoSPARC, GPU hızlandırma ve derin öğrenme teknolojisini kullanarak işlem süresini önemli ölçüde azaltıyor ve kullanıcı dostu¹³. EMAN2, parçacık seçme ve 3D yeniden yapılandırma için kapsamlı bir paket sunar ancak kapsamlı manuel ayar gerektirir ve gerçek zamanlı geri bildirim yeteneklerinden^{yoksundur 14}. Bu araçlar 3B yeniden yapılandırmanın belirli yönlerinde üstün olsa da, tek bir fonksiyonel işlevsel kalıyor ve üst akış veri toplama veya aşağı akış atomik modelleme ile entegrasyondan yoksundur. Örneğin, RELION ve cryoSPARC, mikroskop kontrol yazılımından manuel veri transferi gerektirir, bu da verimsizlikler ve potansiyel hatalar yaratır. Ayrıca, bu araçların hiçbiri veri toplama sırasında gerçek zamanlı kalite değerlendirmesi veya atomik model oluşturmaya sorunsuz geçiş sağlamaz; bu da parçalı iş akışlarına yol açarak veri verimliliği ve tekrarlanabilirliği engeller.

Kriyo-EM tabanlı yapısal belirlemede son hesaplama aşaması, moleküler koordinatların yeniden inşa edilen yoğunluk haritalarına yinelemeli olarak yerleştirilerek atom düzeyindeki etkileşimleri aydınlatmasıdır.

Geleneksel model oluşturma yaklaşımları, elektrostatik potansiyeller, van der Waals etkileşimleri ve kovalent bağ geometrisi kısıtlamalarını içeren fizik temelli enerji minimizasyon algoritmaları kullansa da—ancak ilk model yerleştirme, yoğunluk yorumu ve stereokimyasal doğrulama için manuel müdahaleye büyük ölçüde bağımlı^{olmaya devam ediyor 15,16,17,18}. Uzman küratörlüğe olan bu bağımlılık, yalnızca verimliliği sınırlamakla kalmaz, aynı zamanda yoğunluk özelliklerinin belirsiz olduğu düşük çözünürlüklü rejimlerde (< 4 Å) öznel önyargılar da getirir.

Bu kısıtlamaları aşmak için, derin öğrenme (DL) tabanlı metodolojiler, özelliklerin çıkarılması, model başlatılması ve iyileştirmesini otomatikleştirmek için sinir ağlarını kullanarak dönüştürücü çözümler olarak ortaya çıkmıştır. Bu yaklaşımlar, gürültülü veya eksik yoğunluk haritalarını işlemede performansın arttığını gösterirken, manuel müdahaleyi önemli ölçüde azaltmaktadır; bu, son benchmarklarda geleneksel boru hatlarına kıyasla kullanıcıya bağlı adımlarda %40–60 azalma^{göstermektedir} 19,20,21,22.

Ancak, bu yöntemler genellikle 3D yeniden yapılandırma yazılımından yoğunluk haritalarının dışa aktarılmasını ve bunların model oluşturma sistemlerine aktarılmasını gerektirir. İçe aktarmadan önce, yoğunluk haritalarını optimize etmek için genellikle üçüncü taraf araçları içeren ek ön işleme adımları gerekebilir. Bu parçalanmış iş akışı, tekrarlayan veri transferleri ve format dönüşümleri gerektiriyor, bu da verimsizliklere yol açıyor. Ayrıca, ilk model oluşturma sonuçları tatmin edici değilse, araştırmacılar yeniden hesaplama için yeniden yapılandırma aşamasına dönmeli ve ardından bir tur model oluşturma ve doğrulama sürecine devam etmelidir. Bu tür yinelemeli döngüler, kriyo-EM yapısal belirleme boru hatlarının verimliliğini ve operasyonel verimliliğini önemli ölçüde engeller.

1.3 SMART: Uçtan uca kriyo-EM için entegre bir çözüm

Kriyo-EM SPA'daki önemli gelişmelere rağmen, tam entegre hesaplamalı çözümlerin eksikliği, yüksek verimli yapısal biyoloji potansiyelini engellemeye devam etmektedir. Mevcut yazılım paketleri, veri toplama veya 3D yeniden yapılandırma gibi izole iş akışı bileşenlerini otomatikleştirmede üstün olsa da, ham mikrograf toplama, yoğunluk haritası iyileştirme ve atomik model oluşturma arasındaki kritik boşlukları kapatamıyor. Bu parçalanma, manuel veri transferi, format dönüşümleri ve gereksiz parametre ayarlamasını gerektirir; bu da veri seti ölçeğiyle birleşen verimsizliklere yol açar.

Bu sınırlamaları gidermek için, tüm kriyo-EM SPA boru hattını bütün, yapay zeka destekli bir iş akışına dönüştüren entegre bir hesaplama platformu olan Entegre kriyo-EM iş akışı platformunu sunuyoruz. Entegre platform üç temel modülü entegre eder: DataSmart (otomatik veri alımı), CryoSmart (hibrit sinir ağı destekli 3D yeniden yapılandırma) ve ModelSmart (derin öğrenme tabanlı atomik modelleme).

Platformun üç hesaplama modülü, standart bir veri akışı aracılığıyla birbirine bağlanır ve bir modülden çıkan çıktının, sonraki işlem adımlarında parametre ayarlamalarını yönlendirebileceği akıcı bir veri akışını sağlar. Bu entegrasyon, geleneksel kriyo-EM iş akışlarında gereken manuel adımların ve veri transferlerinin sayısını azaltmayı amaçlar; böylece yapısal biyoloji laboratuvarları için erişilebilirlik ve verimliliği potansiyel olarak artırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan TRPML1 proteini için protein ekspresyonunda kullanılan Expi293F hücre hattı, Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd.'den (Katalog numarası: SC0236058) satın alınmıştır. Hücre hattının kimliği, Kısa Tandem Tekrarı (STR) profilleme (Ek Dosya 1) ile doğru şekilde doğrulandı.

Etik Açıklama
Bu çalışma, insan katılımcıları, hayvanlar veya doğrudan insan veya hayvanlardan alınan örnekleri içermemiştir. İnsan TRPML1 proteini, rekombinant ekspresyonla üretildi ve in vitro saflaştırıldı. Rekombinant protein ifadesi için kullanılan Expi293F hücre hattı, ticari olarak mevcut ve ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattıdır. Sonuç olarak, kurumsal etik onay ve yazılı bilgilendirilmiş onay gerekmiyordu.

NOT: Entegre kriyo-EM iş akışı platformu üç temel modüle ayrılmıştır: otomatik veri edinme modülü, hibrit sinir ağı destekli 3D yeniden yapılandırma modülü ve derin öğrenme tabanlı atom modelleme modülü; veriler bu yazılım bileşenleri arasında iletişim arayüzü olarak hizmet vermektedir; Şekil 2'de gösterilmiştir. Entegre kriyo-EM iş akışı platform sistemi, kullanıcıların tüm işlemleri web arayüzü üzerinden gerçekleştirmesini sağlayan Tarayıcı-Sunucu (B/S) mimarisini benimser; böylece kullanılabilirlik ve operasyonel erişilebilirlik sağlar.

1. Otomatik Veri Toplama

NOT: Entegre kriyo-EM iş akışı platformu üç temel modülden oluşur: otomatik veri toplama modülü, hibrit sinir ağı destekli 3D yeniden yapılandırma modülü ve derin öğrenme tabanlı atom modelleme modülü. Veri, bu yazılım bileşenleri arasında iletişim arayüzü olarak hizmet verir (Şekil 2). Sistem, web arayüzü üzerinden tüm işlemleri mümkün kılan bir Tarayıcı-Sunucu (B/S) mimarisi kullanır.

Proje Başlatma
1. Otomatik veri edinme modülü yazılım platformunda yeni bir proje oluşturun.
2. İsterseniz son bir projeden yapılandırma ayarlarını devralma seçeneğini seçin. Elektron mikroskop kurulumunda kalıtsal parametreleri yeniden kullanın, yeni bir konfigürasyon oluşturmak yerine.
Işin Kayması Denetimi
NOT: Iletim elektron mikroskobu (TEM) kontrol yazılımında ışın kaydırma ayarını gerçekleştirin.
1. Düşük Büyütme Kontrolü (Atlas ve GridSquare)
  1. Screening modülünü açın. Atlas ve GridSquare büyütmelerinde görüntü edinin.
  2. Görüntülerin doğru şekilde aydınlatıldığından ve ışın kaymasından arınmış olduğundan emin olun. Görüntü merkezinin ızgara çubuklarının üzerinde konumlanmadığından emin olun.
2. Veri Toplama Büyütme Kontrolü
  1. Veri toplama büyütmesinde (örneğin, 60K veya 100K) görüntüler alın. Kiriş hizasını değerlendirin.
  2. Görüntü alınmasında başarısız olursa veya önemli bir ışın kayması gözlemlenirse, ilerlemeden önce ışın kaymasını düzeltin.
3. Delik Ötantrik Büyütme Kontrolü
  1. Delik/ötantrik büyütmede (genellikle 8K) görüntü alın. Işin kaymasını aydınlatma noktası ortalanana kadar ayarlayın; eğer ışın ortalanmamışsa.
  2. Diyafram pozisyonunu değiştirmeyin. Diyafram boyutunun veri alımı sırasında kullanılan açıklıkla eşleşip eşleşmediğini doğrulayın.
Z-Yükseklik Ayarı
1. Oto-Ötantrik Ayarlama
  1. Tarama sayfasına gidin. Aşamayı delik/ötantrik yükseklik büyütmesinde temiz bir karbon film alanına taşıyın. Auto-Eucentric modülünü AutoFunction sayfasında açın.
  2. Başlat'a tıklayın. Geri bildirim için log panelini takip edin. Başka bir alana geçin ve işlem başarısız olursa işlemi tekrarlayın.
2. Otomatik Odak Ayarı
  1. AutoFocus modülünü AutoFunction sayfasında açın. Başlat'a tıklayın.
  2. Günlük mesajlarını inceleyin. Parametreleri belirtildiği gibi ayarlayın veya otomatik odaklama başarısız olursa Bölüm 1.3.1'i tekrarlayın.
Büyütme Hizalama Kontrolü
1. Hizalama Denetimi
  1. Veri büyütmesinde ayırt edilebilir bir özelliği bulun ve bir görüntü alın. Delik/EucentricHeight büyütmesinde bir görüntü alın.
  2. Her iki görselin merkezi bölgelerini karşılaştırın. Data ile Hole büyütmeleri arasında hizalanma fark edilirse kalibrasyona geçin.
  3. Data ve Hole büyütmeleri hizalanmışsa Hole ve GridSquare büyütmeleri arasındaki hizalanmayı inceleyin. Tüm büyütme seviyeleri hizalanmışsa kalibrasyon olmadan devam edin.
2. Büyütme Kayması Kalibrasyonu
  1. Kalibrasyon sayfasına gidin. Büyütme Kaydırma modülünü açın. Veri büyütme veya en düşük hizalanmış büyütme ile başlayın.
  2. Belirgin bir özellik içeren yüksek büyütmeli bir görüntü edinin. Karşılık gelen düşük büyütmeli bir görüntü alın. İki görüntü arasındaki kaymayı değerlendirin.
  3. Düşük büyütmeli görseldeki özellik merkezine karşılık gelen konuma sağ tıklayın. Buradan Taşın'ı seçin. Yüksek büyütme görüntüsünü tekrar alın ve hizalanmayı doğrulayın.
  4. Gerekirse ayarlamayı tekrarlayın. Hizalama sağlandıktan sonra bir sonraki büyütme çiftine geçmek için Yanki'ye tıklayın. Kalan tüm yanlış hizalanmış büyütme çiftleri için kalibrasyon prosedürünü tekrarlayın.
Veri Toplama Hazırlıkları
1. Atlas edinimi, kare seçimi, kare görüntüleme ve delik seçimi gerçekleştirin
  1. Atlas modülünü açın. Tüm 81 karoyu almak için karo alanını boş bırakın veya elde edilecek istediğiniz taşı sayısını girin.
  2. Square Selection arayüzüne gidin. Uygun kareleri seçmek için sağ tıklayın.
  3. Delik Seçimi sayfasına gidin. Hepsini Hazırla'a tıklayın. Görüntü alınana kadar log penceresini izleyin.
  4. Görüntü listesinden yakalanan bir kare görüntü seçin. Delikler açıkça görünürken otomatik delik seçimi yapmak için Delik Bul fonksiyonunu kullanın.
    DIKKAT: Kalın buz veya yüzey kirliliği olan ızgaralarda otomatik delik tespiti başarısız olabilir. Tespit edilen delikleri satın almadan önce görsel olarak doğrulayın ve otomatik algılama güvenilmediğinde yarı otomatik delik seçimi yöntemini kullanın.
  5. Kalın buz veya kirlenme güvenilir otomatik seçimi engellediğinde Tohum Tabanlı Seçim fonksiyonunu kullanın (Şekil 3).
    1. Merkezi bir delik seçin. Dik açı oluşturan iki bitişik delik seçin.
    2. İkinci ve üçüncü deliklerin belirlediği yönler boyunca iki uzak delik seçin.
    3. Gönder tuşuna tıklayın. Başka bir kare işlenirken Hepsini Hareket Et. Beş tohum deliğinden birini açık bir deliğe sürükleyin. Gönder tuşuna tıklayın.
2. Şablon Tanımı
  1. Şablon Tanımı sayfasına gidin. Bir görüntü almak için Edin'e tıklayın. Görüntünün tam bir delik içerdiğinden emin olun.
  2. Hedef alana sağ tıklayın ve tam bir delik görünmüyorsa MoveStageTo seçin. Şablon görselini tekrar edinin. İlgili işaretleyicileri sürükleerek görüntüleme ve otomatik odak konumunu belirleyin.
  3. Delik başına kaç kare sayısını girin. İstenen defocus değerini girin (örneğin, −1.5 μm). Tüm satın alma parametrelerini doğrulayın (Şekil 4).
Işın Kayması Yeniden Kontrolü
1. Tüm hazırlık prosedürlerini tamamladıktan sonra Bölüm 1.2'yi tekrarlayın.
Astigmatizma ve Koma Düzeltmesi
1. Astigmatizma Düzeltmesi
  1. Sahneyi temiz bir karbon film alanına taşıyın. Yüksekliği AutoFocus ile istenen defocus değerine ayarlayın (örneğin, −1.5 μm). AutoFunction sayfasında Autostigmate modülünü açın.
  2. Başlat'a tıklayın. Log panelinde Ctffind çıktısını izleyin. Astigmatizma ve çözünürlük-uyum değerlerini gözden geçirin. Astigmatizma yüksek kalıyorsa işlemi farklı bölgede tekrarlayın.
2. Koma Düzeltmesi
  1. Birden fazla denemeden sonra Autostigmate sonuçları optimal kalmıyorsa Autocoma modülünü açın. Başlat'a tıklayın.
Otomatik Veri Toplama
1. Otomatik Toplama sayfasına gidin. Başlat'a tıklayın. Sistemin AutoEmission ve AutoZLP kalibrasyonlarını otomatik olarak yapmasına izin verin.
2. Tarama, Veri Toplama ve Hazırlık ayarlarında tanımlanan parametreler kullanılarak veri edinin. Otomatik tahsilat sürecini izleyin (Şekil 5).
  DURAKLATMA NOKTASI: Veri toplama tamamlandıktan sonra, elde edilen film yığınları depolanabilir ve protokol görüntü işleme aşamasında daha sonraki aşamada devam edebilir, bu da sonraki sonuçları etkilemez.
Anında Uzaktan İzleme
1. Toplama ilerlemesini uzaktan izleme modülü kullanarak izleyin. MotionCor2²³ kullanılarak oluşturulan gerçek zamanlı hareket düzeltme sonuçlarını inceleyin. Gerçek zamanlı astigmatizma ve defokus ölçümlerini gözden geçirin.
2. İzleme URL'sini yetkili kullanıcılarla paylaşın. Bir bilgisayar veya mobil cihazdan toplanma durumu ve veri kalitesi bilgisine erişin. Uzaktan izleme işlevselliğine Şekil 6'daki bir örneği inceleyin.

2. Üç Boyutlu Yeniden İnşaya

NOT: Daha önce elde edilen görüntü veri setlerinden üç boyutlu yeniden yapılandırma yapmak için 3D yeniden yapılandırma modülünü kullanın. İş akışı proje oluşturma, mikrograf ithalatı, kontrast aktarım fonksiyonu (CTF) tahmini, parçacık seçme, parçacık çıkarma, 2B sınıflandırma, ilk model üretimi ve 3D iyileştirmeyi içerir (Şekil 7).

Proje Oluşturma
1. 3D yeniden yapılandırma modülü ana sayfasına gidin. Proje yönetimi sayfasını açmak için Projeler'e tıklayın. YENİ PROJEYE tıklayın.
2. Proje adını girin ve depolama yerini belirtin. PROJE OLUŞTUR tuşuna tıklayın. Yeni oluşturulan projenin yanındaki Aç seçeneğine tıklayın. Yeni bir deney oluşturmak için YENİ Deney'e tıklayın.
  NOT: Bir proje, genel bir veri işleme oturumunu temsil ederken, deney bir proje içindeki bireysel işleme iş akışını temsil eder. Tek bir projede birden fazla deney oluşturulabilir.
Dosyaları İçe Aktarma
1. Yeni İş seçeneğine tıklayın. İçe aktarma seçeneğini seçin ve Oluştur'a tıklayın. Uygun dosya türünü seçin. Veri edinimi sırasında oluşturulan .mrc dosyalarını içe aktarın. Piksel boyutu, hızlandırma voltajı ve CPU sayısını girin. Kuyruk işi tuşuna tıklayın.
  NOT: Çalışan bir işi sonlandırmak için Öldür, ardından Temizle'e tıklayarak işi Bina durumuna döndürün. Tamamlanmış veya sıraya giren işler için İş durumunu sıfırlamak için Temizle'e tıklayın.
CTF Tahmini
1. Yeni İş seçeneğine tıklayın. CTF Tahmini'ni seçin ve Oluştur'a tıklayın.
  NOT: 3D yeniden yapılandırma modülü birden fazla CTF tahmin algoritmasını destekler. Bu protokol CTFFIND4 kullanır.
2. Pozlamalar için Bağlantı butonuna tıklayın. İthal mikrografları seçin. Genlik kontrastını 0.1, minimum uyum çözünürlüğü 30 Å, maksimum uyum çözünürlüğü 4 Å, minimum defocus arama değeri 5.000 Å, maksimum defocus arama değeri 50.000 şve defocus arama adım boyutu 500 şolarak ayarlan.
3. Kuyruk işi tuşuna tıklayın.
Manuel Parçacık Seçme
1. Yeni İş seçeneğine tıklayın. Particle Picking'i seçin, ardından Blob Picker'ı seçin. Oluştur düğmesine tıklayın. Mikrograflar (Pozlamalar) için Bağ butonuna tıklayın.
2. İthal mikrografları seçin. Gerekli parametreleri girin. Kuyruk işi tuşuna tıklayın. 3–4 temsilci mikrografı inceleyin. Sol fare düğmesiyle parçacıkları seçin.
3. Sağ fare tuşu ile parçacıkları seçimden çıkarın. Seçilen parçacıklardan parçacık çapı aralığını belirleyin. Tıklama Tamamlandı! Parçacıkları çıkar.
  NOT: Parçacıkları en az üç mikrograftan ölçün.
Blob Picker
1. Yeni İş seçeneğine tıklayın. Particle Picking'i seçin, ardından Blob Picker'ı seçin. Oluştur düğmesine tıklayın. Mikrograflar (Pozlama) girişini bağlayın.
2. İthal mikrografları seçin. Gerekli parametreleri girin. Kuyruk işi tuşuna tıklayın.
Parçacık Seçimlerini İnceleme
1. Yeni İş seçeneğine tıklayın. Parçacık Seçimlerini İncelet. Oluştur düğmesine tıklayın. Mikrograflar (Pozlama) girişini bağlayın. Parçacık girişini bağlayın.
2. İlgili dosyaları seçin. Gerekli parametreleri girin. Kuyruk işi tuşuna tıklayın. İş tamamlandıktan sonra 3–4 temsilci görüntüyü inceleyin.
3. Doğru parçacık seçimini doğrulayın. Tıklama Tamamlandı! Çıkış Konumları.
Mikrograflardan Parçacıkları Çıkar
1. Yeni İş seçeneğine tıklayın. Mikrograflardan alıntı seç. Oluştur düğmesine tıklayın. Mikrograflar (Pozlama) girişini bağlayın. Parçacık girişini bağlayın. İlgili dosyaları seçin.
2. Ekstraksiyon kutusu boyutunu parçacık çapının 2–3 katı olarak ayarlayın. TRPML1 için 400 piksellik bir çıkarma kutusu kullanın. Fourier ürün boyutunu ekstraksiyon kutusunun dörtte biri ila yarısı olarak ayarlayın.
3. TRPML1 için 100 piksellik Fourier kırpım boyutu kullanın. Kuyruk işi tuşuna tıklayın.
  NOT: Fourier ürün boyutunun küçültülmesi, GPU hesaplama talebini azaltır.
İki Boyutlu Sınıflandırma
1. Yeni İş seçeneğine tıklayın. 2B Sınıflandırmayı seçin. Oluştur düğmesine tıklayın. Parçacık girişini bağlayın.
2. Parçacık yığınını içe aktarın. Gerekli parametreleri girin. Kuyruk işi tuşuna tıklayın.
  NOT: 50–200 sınıf seçin. Daha küçük veri setleri için daha az, daha büyük veri setleri için daha fazla sınıf kullanın.
Seçilmiş İki Boyutlu Sınıflar
1. Yeni İş seçeneğine tıklayın. 2D sınıfları seç. Oluştur düğmesine tıklayın. Parçacık girişini bağlayın. Şablon girişini bağlayın.
2. Gerekli dosyaları içe aktarın. Kuyruk işi tuşuna tıklayın. İş bekleme durumuna geçene kadar bekle. Beklemeye tıklayın.
3. Net ve iyi tanımlanmış 2D sınıflar seçin. Bitti.
İlk Model Üretimi
1. Yeni İş seçeneğine tıklayın. Abinit Rekonstrüksiyonunu seçin. Parçacık girişini bağlayın. Seçilen parçacıkları içe aktarın.
2. İlk sınıf sayısını girin. Simetri parametresi ortaya çıkıyor. Kuyruk işi tuşuna tıklayın.
Heterojen Geliştirme
NOT: Heterojen örnekler için heterojen iyileştirme, homojen örnekler için homojen iyileştirme kullanın.
1. Yeni İş seçeneğine tıklayın. Heterojen bir iyileştirme işi oluşturun. Parçacık girişini bağlayın. Volume girişini bağlayın.
2. İlgili dosyaları seçin. Geliştirme parametrelerini girin. Uygun simetriyi belirtin (örneğin, C1). Kuyruk işi tuşuna tıklayın.
Homojen Geliştirme
1. Yeni İş seçeneğine tıklayın. Homojen bir iyileştirme işi oluşturun. Parçacık girişini bağlayın. Volume girişini bağlayın.
2. Maske girişini isteğe bağlı olarak bağlayabilirsiniz. Önceki iyileştirme aşamasından parçacık yığını ve en iyi performans veren hacim sınıfını içe aktarın. Gerekli parametreleri girin.
3. Uygun simetri belirtin (örneğin, O veya C1). Kuyruk işi tuşuna tıklayın. İş tamamlandıktan sonra Çıktı seçeneğine tıklayın. Tarayıcı arayüzünde yeniden oluşturulan yoğunluk haritasını inceleyin (Şekil 8).
Harita Geliştirme
NOT: Map Enhancer DeepEMhancer²⁴ kullanıyor. Mümkün olduğunca yarım haritalar kullanın. Post-translasyonel modifikasyonlar ve ligand molekülleri DeepEMhancer eğitim setine dahil edilmemiş ve doğru şekilde geliştirilemeyebilir. Map Enhancer , yerel keskinleştirme, otomatik maskeleme ve gürültü giderme işlemlerini gerçekleştirir.
1. Yeni İş seçeneğine tıklayın. Bir Harita Güçlendirici işi oluşturun. Homojen Geliştirme sırasında üretilen Hacmi ithal edin.
2. İlgili Maske'yi içe aktarın. Gerekirse harita dosyalarını Map Data Path seçeneğiyle içe aktarın. İşi yürüt.

3. Derin Öğrenme Temelli Atomik Modelleme

NOT: Derin öğrenme tabanlı atom modelleme modülü, daha önce geliştirilen SMARTFold framework^25'e dayanır ve kriyo-EM yoğunluk haritalarından proteinler ve nükleik asitler (RNA/DNA) için atomik model oluşturmayı destekler.

Derin öğrenme tabanlı atom modelleme modülü başlatın
1. Derin öğrenme tabanlı atomik modelleme modülü sistemine giriş yapın. Görev gönderme arayüzünü açın. Sol panele kriyo-EM yoğunluk haritasını yükleyin.
2. Gerekli giriş parametrelerini girin. Modelleme görevini gönderin.
Cryo-EM yoğunluk haritasını yükleyin
1. Yoğunluk haritasını .mrc, .ccp4 veya .map formatında yükleyin. Dosya boyutunun 100 MB'dan küçük olduğundan emin olun.
  NOT: Yoğunluk haritası 100 MB'yi azarsa, yüklemeden önce dosya boyutunu küçültün.
  1. UCSF ChimeraX²⁶ ile yoğunluk haritasını ilgi alanına kırpın: volume zone komutu ile kırpın. Haritayı daha büyük bir piksel boyutuna yeniden örnekleyin.
  2. Çözücü bölgeleri çıkarmak için yumuşak bir maske uygulayın.
    NOT: Yüklemeden önce yoğunluk haritasını inceleyin; böylece model performansı optimal olur ve işlem hatası riskini azaltır.
Yoğunluk Haritasını İncelin ve Hazırlayın
1. Yoğunluk haritası kırpımı gerçekleştirin. Bu için gereksiz bölgeleri kaldırmak için yoğunluk haritasını kırın. Kırpılmış haritanın yalnızca model oluşturma için gereken bölgeyi içerdiğinden emin olun.
  NOT: Kırpma, dosya boyutunu azaltır ve model üretimi sırasında bellek taşmasını önlemeye yardımcı olur.
2. Sonra Mirror Inversion için kontrol et.Yoğunluk haritasını olası ayna ters çevirmesi için inceleyin. Haritadaki α-sarmal bölgeleri inceleyin. α-helislerin sağ el konfigürasyonu sergilediğini ve saat yönünün tersine yukarı doğru spiral olarak döndüğünü doğrulayın. Eğer aynalı bir yapı tespit edilirse, yoğunluk haritasını çevirin.
Dizis Dosyasını Yükle
1. İlgili dizi dosyasını yükleyin. Alternatif olarak, diziyi manuel olarak girin. Rekonstrüksiyona dahil edilen tüm protein veya nükleik asit dizilerini sağla.
2. Uygunsa heteromerik veya homomerik dizi bilgisini belirtin. İsterseniz protein adını girin (isteğe bağlı adım).
Harita çözünürlüğünü belirtin. Kriyo-EM yoğunluk haritasının bildirilen çözünürlüğü devreye giriyor. Hesaplama Bölümünü seçin. Model üretimi için kullanılacak GPU hesaplama düğümünü seçin.
CPU Kaynaklarını belirtmek için, tahsis edilecek CPU sayısını girin. Sekiz CPU'yu aşmayın. Tüm yüklenen dosyaları ve parametreleri gözden geçirin. Model üretimini başlatmak için GÖNDER tuşuna tıklayın.
Tahmin Edilen Atom Modelini İnceleme
1. İş tamamlandıktan sonra etkileşimli görselleştirme penceresini açın. Yapısal özellikleri incelemek için modeli döndürün. Yerel ve küresel yapısal detayları incelemek için yakınlaştırıp uzaklaştırın.
2. Modeli birden fazla yönden inceleyin. Model kalitesini, mekansal konformasyonu ve atom düzeyindeki özellikleri değerlendirin. Oluşturulan modeli aşağı akış analizi ve doğrulama için kullanın.
3. Görselleştirme arayüzüne örnek olarak Şekil 9'a bakınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TRPML1, mukolipin-1 (MCOLN1) olarak da bilinir, iyonik homeostazı sürdürmek, veziküler trafiği düzenlemek ve memeli hücrelerinde otofajiyi desteklemek için gerekli bir lizozomal katyon^kanalıdır ^27,28. TRPML1'in genetik mutasyonlar nedeniyle işlev bozukluğu, anormal nörogelişim, retina dejenerasyonu ve demir eksikliği anemisi ile karakterize edilen şiddetli nörodejeneratif lizozomal depo bozukluğu olan mukolipidoz tip IV ile doğrudan ^<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojik makromoleküllerin kriyo-elektron mikroskopisi (kriyo-EM) ile yapısal belirlenmesi, doğası gereği uzun süren, çok aşamalı bir iş akışını içerir ve hesaplama araçlarının sıkı entegrasyonunu ve uzman müdahalesine dayanmayı gerektirir. Entegre platform, veri toplama, 3D yeniden yapılandırma ve atom modellemesini tek, dikey entegre bir çerçevede birleştirerek bu zorluğu ele alıyor—daha akıcı kriyo-EM iş akışlarına doğru bir adım. Yapay zeka odaklı algoritmaları boru hattına (örneğin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Shuimu BioSciences tarafından finanse edildi ve desteklendi; ayrıca çalışmanın tasarımı, yürütülmesi, veri yorumu ile makalenin incelenmesi ve nihai onayına katkıda bulundu. Tüm yazarlar Shuimu BioSciences çalışanıdır ve başka çıkar çatışması ilan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Temsil veri seti için verdiği tavsiyeler için kriyo-EM Center Shuimu BioSciences'tan Dr. Jing Li'ye teşekkür ederiz. Shuimu BioSciences Protein ve Kristalografi Bölümü'nden Dr. Yujie Liu'ya hTRPML1 protein örneğini sağladığı için teşekkür ederiz. Tsinghua Üniversitesi Yaşam Bilimleri Fakültesi'nden Doçent Qiangfeng Zhang, Dr. Kui Xu, Doçent Xueming Li ve Mühendis Bo Shen'e, ayrıca Çin Bilimler Akademisi Biyofizik Enstitüsü'nden Profesör Xinzheng Zhang ve Dr. Chunling Wu'ya, Entegre kriyo-EM iş akışı platformunun geliştirilmesi sırasında gösterdikleri değerli destek ve rehberlik için minnettarlık takdir ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CryoSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	SMART platformın 3D rekonstrüksiyon modülü; hibrit sinir ağı etkin
Cryo-electron microscope	Shuimu BioSciences Ltd.	SHUIMU TOTEM 300S	Veri toplama için kullanılır; enerji filtresi ile donatılmıştır
DataSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	SMART platformun otomatik veri toplama modülü
DeepEMhancer	Open source	V0.17	Cryo-EM hacim son işleme için derin öğrenme tabanlı; CryoSmart Map Enhancer içinde entegre
Direct electron detector	Gatan	GATAN K3 (6k x 4k)	Film kaydı için kullanılan kamera
Grid	Quantifoil	Au R1.2,1.3	Cryo-EM örnek ızgarası
ModelSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	SMART platformun derin öğrenme tabanlı atomik modelleme modülü; SMARTFold çerçevesini genişletir
SMART Platform	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Entegre cryo-EM platformu; Tarayıcı-Sunucu (B/S) mimarisi; DataSmart, CryoSmart ve ModelSmart modüllerini içerir
TEM control software	Shuimu BioSciences Ltd.	V1.0	Yük kaydırma ayarı için elektron mikroskobu kontrol yazılımı
Topaz	Open source	V 2.5	Derin öğrenme tabanlı parçacık seçme aracı; CryoSmart içinde eklenti olarak entegre
TRPML1 protein sample	Shuimu Biosciences Ltd.	SMPP-0053	İnsan TRPML1 (mucolipin-1); Protein ve Kristallografi Bölümü tarafından şirket içinde hazırlanmıştır
Vitrification device	Thermo Fisher Scientific	Vitrobot Mark IV	Cryo-EM örnek hazırlaması için
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Genel amaçlı görüntüleme, analiz ve daha fazlası için yazılım

SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology)	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Entegre cryo-EM iş akışı platformu
SMARTFold	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	ModelSmart'ın altında yatan derin öğrenme çerçevesi
Leginon	National Resource for Automated Molecular Microscopy (NRAMM)	RRID:SCR_016731	Otomatik cryo-EM veri toplama yazılımı
SerialEM	University of Colorado	RRID:SCR_017293	Otomatik TEM/cryo-EM toplama yazılımı
EPU	Thermo Fisher Scientific	N/A	Otomatik cryo-EM veri toplama yazılımı
EPU Multigrid	Thermo Fisher Scientific	N/A	Çoklu ızgara otomatik cryo-EM toplama
Gatan Latitude	Gatan Inc.	N/A	Elektron mikroskobu toplama yazılımı
JADAS	JEOL Ltd.	N/A	Otomatik cryo-EM toplama sistemi
Auto-EMation	Tsinghua University	N/A	Otomatik cryo-EM toplama yazılımı
RELION	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016274	Bayesian cryo-EM rekonstrüksiyon yazılımı
cryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	RRID:SCR_016501	Cryo-EM görüntü işleme ve rekonstrüksiyonu
EMAN2	Baylor College of Medicine	RRID:SCR_017270	Cryo-EM görüntü işleme paketi
CTFFIND4	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016732	CTF tahmin yazılımı
Gctf	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016500	GPU hızlandırılmış CTF tahmini
MotionCor2	Howard Hughes Medical Institute / UCSF	RRID:SCR_016499	Hareket düzeltme yazılımı
DeepEMhancer	Spanish National Center for Biotechnology (CNB-CSIC)	RRID:SCR_021214	Derin öğrenme cryo-EM harita iyileştirmesi
Topaz	University of California Berkeley	RRID:SCR_018037	Derin öğrenme parçacık seçimi
UCSF ChimeraX	University of California San Francisco	RRID:SCR_015872	Moleküler görselleştirme yazılımı
CTFFIND4	Grigorieff Lab	RRID:SCR_016732	CryoSmart iş akışında kullanılan CTF uyum
EMDB-8840	Electron Microscopy Data Bank	Accession: EMD-8840	İnsan TRPML1 referans haritası
EMPIAR-10204	Electron Microscopy Public Image Archive	Accession: EMPIAR-10204	β-galactosidase kıyaslama veri seti
Transmission Electron Microscope (TEM)	Not specified	N/A	Cryo-EM veri toplama için kullanılır
FEI Tecnai Electron Microscope	FEI (now Thermo Fisher Scientific)	Not specified	Alıntılanan iş akışında belirtilmiştir
Energy Filter	Not specified	N/A	Otomatik toplama sırasında kullanılır
GPU Computing Node	Not specified	N/A	ModelSmart hesaplamaları için kullanılır

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Yap sal Biyoloji Otomatik Veri Toplama G r nt leme 3B Rekonstr ksiyon Atomik Model Olu turma Derin renme Modelleri Partik l Se me 2B S n fland rma Hareket D zeltme

SMART (Shuimu Otomatik Yeniden Yapılandırma Teknolojisi): Kriyo-elektron mikroskopi iş akışını kolaylaştırmak için entegre bir hesaplama platformu

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler