Kültürlenmiş Hücrelerden Fare Testisine Doğrudan Etkileşime Giren Proteinlerin Doğrulanabilir Tanımlanması İçin UV Tabanlı ChIRP Yöntemi

Özet

Doğrudan LNCRNA-protein etkileşimlerini tanımlamak için UV tabanlı bir ChIRP yöntemi.

Özet

Uzun süreli kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar), çeşitli biyolojik süreçlerin önemli düzenleyicileri olarak ortaya çıkmıştır. Ancak, çoğu lncRNA'nın işlevlerinin altında yatan moleküler mekanizmalar hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır. Özellikle RNA bağlayan proteinler (RBP) olmak üzere etkileşimli proteinlerin tanımlanması, lncRNA fonksiyonunu aydınlatmak için temel bir stratejidir. Mevcut yaklaşımlar arasında, RNA bağlayan proteinlerin (ChIRP) kapsamlı tanımlanması ve kütle spektrometrisi ile birleşmesi, basit prob tasarımı ve basit iş akışı sayesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Geleneksel ChIRP, hem doğrudan RNA-protein temaslarını hem de köprüleme faktörleriyle aracılık edilen dolaylı etkileşimleri yakalayan paraformaldehit (PFA) çapraz bağlanmasına dayanır. Buna karşılık, UV çapraz bağlama ve sıkı yıkama koşulları doğrudan RNA-protein etkileşimlerini tercihen korur. LNCRNA Tug1 model olarak kullanılarak, UV çapraz bağlama ve PFA çapraz bağlama ChIRP çerçevesinde kültürlenmiş hücrelerde karşılaştırıldı ve UV tabanlı ChIRP'nin doğrudan lncRNA-protein etkileşimlerini zenginleştirdiği gösterildi. Bu UV tabanlı iş akışı daha sonra fare testislerine genişletildi; dokular UV çapraz bağlanmadan önce tek hücreli süspansiyonlara ayrılarak Tug1 bağlayan proteinlerin doğal doku bağlamında tanımlanmasını mümkün kıldı. Hücre hattı kaynaklı interaktomlarla karşılaştırıldığında, hem paylaşılan hem de dokuya özgü interaktörler ortaya çıktı. İki ortak doğrudan etkileşim, gelişmiş çapraz bağlamalı immünopresipitasyon (eCLIP) ile bağımsız olarak doğrulandı. Bu UV tabanlı ChIRP yaklaşımı, RNA hedefiyle doğrudan etkileşimde bulunan proteinleri yakalamak (cPDiRT) olarak adlandırılır. Birlikte, cPDiRT hem kültürlenmiş hücrelerde hem de doğal dokularda lncRNA bağlayan proteinlerin tanımlanmasını sağlar. Doku ayrışması ve UV çapraz bağlanmasının birleşimi, çeşitli organ sistemleri arasında doğrudan lncRNA-protein etkileşimlerini incelemek için geniş kapsamlı bir strateji sunar.

Giriş

Son zamanlarda yapılan yüksek verimli transkriptomik çalışmalar, kromatin organizasyonundan^{hücresel sinyal 1,2'ye} kadar çeşitli biyolojik süreçlere katılan binlerce uzun kodlamayan RNA'yı (lncRNA) ortaya ^{çıkarmıştır.} Yaygın ifadelerine ve işlevsel önemlerine rağmen, çoğu lncRNA'nın moleküler mekanizmaları hâlâ zayıf tanımlanmıştır. Büyük bir engel, özellikle RNA bağlayan proteinlerin (RBP) fiziksel protein partnerlerinin tanımlanmasıdır3,4,5.

Mevcut RNA merkezli yöntemler öncelikle hem doğrudan hem de dolaylı RNA-protein etkileşimlerini yakalan kimyasal çapraz bağlamaya dayanır. Sonuç olarak, bu yaklaşımlar gerçek doğrudan temasları belirlemekten ziyade küresel interaktom haritalama için daha uygundur⁶. RNA bağlayan proteinlerin kapsamlı tanımlanması ve ardından kütle spektrometrisi (ChIRP-MS), basit prob tasarımı ve verimli iş akışı nedeniyle lncRNA-RBP etkileşimlerini haritalamak için yaygın kullanılan bir^{tekniktir 7,8}. Geleneksel ChIRP-MS, hem doğrudan RNA-protein temaslarını hem de köprüleme^{faktörleri 9,10} aracılığıyla dolaylı ilişkileri yakalayan paraformaldehit (PFA) çapraz bağlama kullanır.

Buna karşılık, 254 nm'de UV çapraz bağlama kritik bir avantaj sunar. RNA ve proteinleri ancak sıfıra yakın mesafe temasında olduklarında (genellikle <1 Å)¹¹ kovalent olarak bağlar. Bu süreç, hidrojen bağlarını kararlı kovalent bağlara dönüştürür ve kovalent olmayan dolaylı etkileşimcileri ortadan kaldıran katı yüksek tuzlu yıkama koşullarını mümkün kılar. Sonuç olarak, UV tabanlı yaklaşımlar, kimyasal çapraz bağlama yöntemlerine göre doğrudan RNA-protein etkileşimleri için daha fazla özgüllük sağlar^12,13. Buna rağmen, UV tabanlı yaklaşımlar, doku kaynaklı lncRNA interaktomu çalışmalarında hâlâ yeterince kullanılmamaktadır; bunun büyük ölçüde çapraz bağlama verimliliği ve sınırlı UV nüfuzu endişeleri nedeniyle.

Fizyolojik olarak ilgili bir bağlamda doğrudan lncRNA-protein etkileşimlerini incelemek için, lncRNA Tug1 model sistemi olarak seçildi. Tug1 , ciddi nakavt fenotipi ve testisteki yüksek zenginleşme nedeniyle doku uyumlu doğrudan etkileşim iş akışını doğrulamak için ideal bir kıyastır. Tug1'in genetik ablasyonu tam erkek sterilliği, bozulmuş spermatogenezi ve anormal sperm morfolojisi ile^{sonuçlanır 14}. Ayrıca, Tug1 yüksek yağlı diyet farelerinde Sertoli hücre fonksiyonunu ve kan testis bariyer bütünlüğünü^{destekler 15}. Bu iyi bilinen fenotiplere rağmen, testis'te Tug1 fonksiyonunu aracı eden doğrudan protein partnerleri—yakın zamanda deneysel olarak profil edilmiş¹⁶ çok sayıda RBP ifade eden bir organ—henüz bilinmemektedir. Bu bilgi boşluğu, çoğu lncRNA-protein etkileşim haritalama yönteminin kültürlü hücre sistemleri için geliştirildiğini büyük ölçüde yansıtmaktadır.

Bu sınırlamayı gidermek için, ChIRP çerçevesi, PFA çapraz bağlamanın yerine UV çapraz bağlama ile değiştirilerek Tug1 ile doğrudan etkileşime giren proteinleri yakalamıştır. Aday etkileşimler, gelişmiş çapraz bağlamalı immünopresipitasyon ve ardından derin dizileme (eCLIP-seq) ile bağımsız olarak doğrulandı^. İş akışı, UV çapraz bağlamadan önce taze fare testis dokusunun tek hücrelere ayrılmasıyla doku uygulamalarına da genişletildi. Bu optimize edilmiş yaklaşım cPDiRT (RNA hedefiyle doğrudan etkileşime giren proteinleri yakalamak) olarak adlandırıldı.

fare testisinde cPDiRT'nin Tug1'e uygulanması, doğal doku bağlamında doğrudan etkileşim haritalamasını mümkün kılmıştır. Kültürlenmiş hücrelerde yapılan paralel deneyler, PFA tabanlı ve UV tabanlı etkileşim profillerinin yan yana karşılaştırılmasını sağladı. Bağımsız eCLIP doğrulamasıyla birleştiğinde, bu yaklaşım spermatogenez sırasında Tug1 fonksiyonuna katkıda bulunabilecek yüksek güvene sahip moleküler partner seti oluşturdu. Burada sunulan protokol, hem kültürlenen hücrelerde hem de doğal dokularda hedef lncRNA ile doğrudan etkileşime giren proteinlerin yakalanmasını sağlar. Testisteki Tug1'in doğrudan interaktomunu tanımlayarak, bu yöntem doğurganlık için temel bir lncRNA'nın mekanik çalışmalarını ilerletmiş ve üreme ve diğer karmaşık dokularda lncRNA-protein etkileşimlerinin incelenmesi için genelleştirilebilir bir platform sağlar.

Protokol

Tüm çözeltiler nükleaz içermemiş, proteazsız ultrasaf su ve reaktiflerle hazırlanmıştır. Tüm reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri, Nanjing Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış (Onay No.: IACUC-1812003-4) ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne (Ulusal Araştırma Konseyi, 8. baskı) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Erkek C57BL/6 fareleri (4 haftalık) 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü altında tutun ve yiyecek ile suya imkânsız erişim. İstatistiksel anlamlılığı elde etmek için gereken en az hayvanı kullanarak hayvan acısını en aza indirin. Onaylanmış kurumsal protokollere göre fareleri CO₂ inhalasyonu ve ardından servikal dislokasyon ile ötenazi yapın.

1. Tamponları hazırlayın

1. Hücre lizis tamponu hazırlanır
   1. 50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 10 mM EDTA ve %1 SDS içeren hücre lizyis tamponu hazırlanın.
   2. Kullanımdan hemen önce 1 mM PMSF, proteaz inhibitörü kokteyli ve özel RNase inhibitörü ekleyin.
      DIKKAT: SDS, cilt ve göz tahriş edicidir. Toz veya aerosol solumaktan kaçının. PMSF son derece toksiktir, kolinesteraz inhibitörü olarak görev yapar ve sulu çözeltide kararsızdır. PMSF'yi hemen kullanmadan önce hazırlayın. Bu reaktiflerle ilgilenirken eldiven ve güvenlik gözlüğü takın. PMSF'yi kimyasal bir buhar davlumbazında kullanın.
2. Hibritleşme tamponu hazırlanır
   1. 750 mM NaCl, %1 SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 mM EDTA ve %15 formamid içeren hibritizasyon tamponu hazırlanır.
   2. Kullanımdan hemen önce 1 mM PMSF, proteaz inhibitörü kokteyli ve özel RNase inhibitörü ekleyin.
      NOT: Formamid'i 4 °C'de, ışıktan korunarak saklayın.
      DIKKAT: Formamid teratojen ve üreme tehlikesidir. Formamid'i kimyasal bir buhar kapüşonunda eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takarak kullanın. Solumaktan ve cilt temasından kaçının.
3. Yıkama tamponu hazırlan
   1. 50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 M NaCl, 1 mM EDTA, %1 NP-40, %0.1 SDS ve %0.5 sodyum deoksikolat içeren yıkama tamponu hazırlayın.
   2. Depolama sırasında yıkama tamponunu ışıktan koruyun.
4. Proteinaz K (PK) tamponu hazırlanın
   1. 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 mM EDTA ve %0.5 SDS içeren PK tamponu hazırlayın.
   2. Kullanımdan hemen önce %5'lik nihai konsantrasyona proteinaz K ekleyin.

2. Probları tasarlayıp hazırlayın

1. Antisens probları tasarla
   1. 18 singlemoleculefish.com numaralı çevrimiçi prob tasarımcısı ile antisens oligonukleotid probları tasarlayın.
2. Biyotinile problar elde edin
   1. 3'-BiotinTEG modifikasyonu içeren antisens DNA problarını sıralayın.
3. Prob havuzunu hazırla
   1. Her probu ayrı ayrı 100 μM'e kadar seyreltin.
   2. Tüm probların eşit hacimlerini karıştırarak bir prob havuzu oluşturulur. Nihai birleşik oligonukleotid konsantrasyonunu 100 μM olarak korumak.
   3. Prob havuzunu -20 °C'de sakla.
      NOT: Önerilen prob tasarım parametreleri şunlardır: (i) hedef RNA'nın her 100 bp'sine bir sonda, (ii) hedef GC içeriği %45, (iii) sonda uzunluğu 20 nt ve (iv) problar arasında 60–80 nt aralık.
      NOT: RNA, prob tasarımcısının kabul ettiği boyut sınırını aşarsa, diziyi tasarımdan önce daha küçük segmentlere bölür. Tekrarlayan bölgeler ve geniş dizi homolojisine sahip bölgeler hariç tutulur.

3. Hücre toplama, doku ayrıştırma ve UV çapraz bağlama gerçekleştirin

1. UV kullanmayan kontrolleri hazırla
   1. Kontrol örneklerini deneysel örneklerle paralel olarak hazırlayın.
   2. Kontrol örneklerinden UV-çapraz bağlama adımını çıkarın.
   3. Sonikasyon, RNA-Protein pull-down, RNA ekstraksiyonu ve protein ekstraksiyonu dahil olmak üzere sonraki tüm prosedürleri her iki grup için de aynı şekilde gerçekleştirin.
      NOT: UV bağımlı RNA-protein etkileşimlerini spesifik olmayan arka plan bağlanmasından ayırt etmek için no-UV kontrolünü kullanın.
2. Hücreleri toplap UV çapraz bağlama gerçekleştirin
   1. Yıkama kültürlü hücreler
      1. Hücreleri üç kez PBS ile yıkarak kalıntı kültür ortamını çıkarın.
   2. Çapraz bağlantı hücreleri
      1. 3 mL PBS'yi 15 cm'lik bir kültür kabına eşit şekilde dağıtın.
      2. Hücreleri 254 nm UV çapraz bağlayıcıda 4000 mJ/^cm2 dozda ışınlayın.
   3. Çapraz bağlı hücreleri topla
      1. Çapraz bağlamadan sonra hücreleri PBS'de toplayın.
      2. Süspansiyonu santrifüj edin ve üst kısımları atın.
      3. Pelleti tartın ve her örnek için minimum 500 mg pellet kütlesi olduğunu doğrulayın.
3. Testis dokusunu ayırın ve UV çapraz bağlama yapın
   1. Testisleri hazırlayın
      1. Testisleri kapsül edin.
      2. Mendiliyi DMEM ile iki kez yıkayın.
   2. Kollajenaz sindirimi yapın
      1. 1 mg/mL kollagenaz IV içeren DMEM'de dokuyu 37 °C'de 5–15 dakika boyunca inkübe edin.
      2. Seminifer tübülüler serbest bırakılana kadar sindirime devam edin.
         NOT: Sindirim süresi 15 dakikayı geçmesin.
   3. Seminifer tübülleri yıkayın
      1. Süspansiyonu 1000 × g'de 4 °C'de 1 dakika boyunca santrifüj yapın.
      2. Üst yüzeyi çıkarın.
      3. Pelleti 5–10 mL DMEM ile yıkayın.
      4. Aynı koşullarda tekrar santrifüj yapın.
   4. Tripsin sindirimi yapın
      1. Pelleti %0,25 tripsin ile 1 mg/mL DNaz I içeren bir şekilde yeniden askıya alın.
      2. 37 °C'de 5–15 dakika kuluçka yapın.
         NOT: Sindirim süresi 15 dakikayı geçmesin.
   5. Enzimatik sindirimi durdurun
      1. Eşit miktarda DMEM ve %10 FBS ile takviye olun.
   6. Tek hücreli bir süspansiyon üretin
      1. Süspansiyonu 70 μm hücre süzgeciyle filtreleyin.
   7. Yıkama hücreleri
      1. Santrifüj hücreleri 2000 × g sıcaklığında 5 dakika boyunca 4 °C'de kalın.
      2. Üst yüzeyi at.
      3. Pelleti 5–10 mL PBS ile yıkayın.
      4. Aynı koşullarda tekrar santrifüj yapın.
   8. Çapraz bağlantılı testis hücreleri
      1. PBS'de tek hücreli askıya alma tekrar askıya alın.
      2. Süspansiyonu 15 cm'lik bir kültür kabına eşit şekilde dağıtın.
      3. Hücreleri 254 nm UV çapraz bağlayıcıda 4000 mJ/^cm2 dozda ışınlayın.
   9. Çapraz bağlı hücreleri topla
      1. UV dışı kontroller için ışını atlayın.
      2. PBS'de hücreleri toplayın.
      3. Süspansiyonu santrifüj edin ve üst kısımları atın.
      4. Pelleti tartın ve her örnek için minimum 500 mg pellet kütlesi olduğunu doğrulayın.
         NOT: Yaklaşık 500 mg hücre pelleti elde etmek için gereken fare sayısı yaşa ve doku verimine bağlıdır. Bu çalışmada yaklaşık 10–12 adet dört haftalık fare kullanıldı.

4. Sonication yapın

1. Lizatları hazırlayın
   1. Hücre pelletlerini hücre lizin tamponunda 1 mL tampon başına 100 mg pellet oranında yeniden askıya alın.
   2. Homojen bir süspansiyon elde etmek için iyice karıştırın.
2. Sonicate örnekleri
   1. Sonikat, su banyosu sonikatörü veya odaklanmış ultrasonikatör kullanarak lizat yapar.
   2. Lizat görsel olarak netleşene kadar sonikasyona devam edin.
      NOT: Agaroz jel elektroforezi ile DNA parçalanmasını doğrulayın. Sonikasyona devam edin, çoğu DNA parçası 1 kb ile 2 kb arasında olana kadar.

5. RNA-protein pull-down yapın

1. Giriş örnekleri topla
   1. Giriş kontrolleri için lizat alikotlarını kaldırın.
   2. RNA analizi için yaklaşık 10 μL, protein analizi için ise 10 μL ayırın.
   3. Hibridizasyon ve yıkama işlemleri sırasında giriş örneklerini 37 °C'de tutun.
2. Preclear lizatlar
   1. Her numuneye 30 μL önceden yıkanmış manyetik boncuk ekleyin.
   2. Örnekleri 37 °C'de 30 dakika boyunca hibritizasyon fırınında nazikçe karıştırarak kuluçka edin.
      NOT: Manyetik boncukları kullanmadan önce yıkayın. Boncuk aliquotlarını manyetik bir standa 1 dakika veya çözelti berrak hale gelene kadar koyun. Depolama çözümünü tamamen çıkarın. Boncukları 500 μL hücre lizin tamponu ile iki kez yıkayın.
3. Ön temizleme boncuklarını çıkarın
   1. Örnekleri manyetik bir standa yerleştirin.
   2. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.
   3. Kalan boncukların tamamen çıkarılmasını sağlamak için transferi bir kez tekrarlayın.
4. Hibridize problar
   1. Her numuneye iki hacim hibridizasyon tamponu ekleyin.
   2. Probları 1 mL lizat başına 100 μM sonda stoku oranında 1 μL ekleyin (Ek Tablo 1).
5. Kuluçka hibridizasyon reaksiyonları
   1. Örnekleri hibritizasyon fırınında 12–16 saat boyunca uçtan uca dönerek 37 °C'de kuluçka edin.
6. Yakalama boncuklarını hazırlayın
   1. Hibridizasyon bitmeden hemen önce hücre lizis tamponu ile 100 μL manyetik boncukları üç kez yıkayın.
   2. Son yıkamadan sonra tüm kalan tamponu çıkarın.
7. Yakalama sonda-bağlı kompleksler
   1. Kısa bir süreliğine santrifüj hibritleşme reaksiyonları.
   2. Yıkanmış boncukları 1 mL hibritize örnekle yeniden askıya alın.
8. Kompleksleri boncuklara bağlama
   1. Boncuk süspansiyonunu orijinal tüpe geri döndürün.
   2. 37 °C'de 30–40 dakika karıştırarak kuluçka yapın.
9. Recover boncuklar
   1. Kısa süreliğine santrifüj örnekleri.
   2. Tüpleri manyetik bir standa 1–2 dakika veya çözelti berrak hale gelene kadar yerleştirin.
   3. Üst yüzeyi at.
   4. Kalan sıvıyı pipet ucu ile çıkarın.
      NOT: Sıvı çıkarımı sırasında manyetik boncuk peletini rahatsız etmekten kaçının.
10. Wash tarafından ele geçirilen kompleksler
    1. 1 mL yıkama tamponu ekleyin.
    2. Boncukları 37 °C'de sürekli karıştırarak 5 dakika yıkayın.
    3. Yıkama prosedürünü beş kez tekrarlayın.
       NOT: Yıkama tamponu, kovalent olmayan protein-protein ve protein-RNA etkileşimlerini bozan ve kovalent UV kaynaklı çapraz bağlantıları koruyan 1 M NaCl içerir. Bu katı koşullar, dolaylı etkileşimli aktörleri ve spesifik olmayan arka planı ortadan kaldırır, böylece doğrudan protein partnerleri^{zenginleştirilir 19}.
11. RNA analizi için yedek materyal
    1. Yıkanmış boncukların %1–%10'unu RNA analizi için taze bir tüpe aktarın.
    2. Kalan boncukları hemen protein çıkarımı için kullanın veya -80 °C'de saklayın.
       NOT: Gerekirse protokolü burada duraklat. Boncuk örnekleri protein çıkarımı yapılana kadar -80 °C sıcaklıkta saklayın.
12. Elut proteinleri
    1. Boncuklara SDS örnek tamponu ekleyin.
    2. Örnekleri 95 °C'de 30 dakika boyunca kaynatarak proteinleri elütasyon ve çapraz bağlantıları tersine çevirin.
    3. Kütle spektrometrisi analizine geçin.

6. RNA çıkarma

1. Sindirim proteinleri
   1. Boncukla bağlı RNA örneklerini 100 μL PK tamponunda yeniden askıya alın.
   2. RNA giriş örneklerini PK tamponu kullanarak son hacmi 100 μL'ye ayarlayın.
2. Proteinaz K ile kuluçka
   1. Örnekleri 50 °C'de 45 dakika boyunca sürekli karıştırarak kuluçka yapın.
3. Proteinaz K'yı inaktive et
   1. 95 °C'de 10 dakika boyunca ısı örnekleri alın.
4. TRIzol reaktifini ekleyin
   1. Her numuneye 500 μL TRIzol reaktifi ekleyin.
   2. Vortex'i iyice kontrol edin.
   3. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
      DIKKAT: TRIzol reaktifi fenol ve guanidin tiyosiyanatı içerir. Reaktifi kimyasal bir buhar kapasonu içinde eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takarak kullanın. Solumaktan ve cilt temasından kaçının. Cilt teması olursa, hemen sabun ve suyla yıkayın.
5. Faz ayrımı gerçekleştirin
   1. Her numuneye 100 μL kloroform ekleyin.
   2. Vortex'i iyice kontrol edin.
   3. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
6. Sulu fazın geri kazanılması
   1. Santrifüj örnekleri 4 °C'de 15 dakika boyunca alın.
   2. Üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarın.
7. RNA'yı arıtma sütunlarına bağlama
   1. Sulu faza eşit hacimde %100 etanol ekleyin.
   2. İyice karıştırın.
   3. Örnekleri RNA arıtma kolonlarına yükleyin.
8. RNA'yı Saflaştır
   1. Üreticinin talimatlarına göre RNA temizliği yapın.
   2. 30 μL nükleazsız suda RNA'yı elütle edin.
9. qRT-PCR ile RNA zenginleştirmesini doğrulayın
   1. Her reaksiyonda 1 μL elutlenmiş RNA kullanılarak nicel ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) uygulanır.
   2. Hedef RNA zenginleşmesini kontrol sistemine göre değerlendirin.

7. LC-MS/MS analizi yapın

1. SDS-PAGE ile ayrı proteinler
   1. 5.12. adımda elde edilen proteinleri 4× LDS örnek tamponuyla karıştırın.
   2. Proteinleri %4–%12 Bis-Tris jelinde ayırın.
   3. Jeli gümüş boyama kitiyle boyayın.
   4. Tüm protein yolunu tek bir bant olarak çıkarın.
2. Tüketim jel parçaları
   1. Protein bandını temiz bir bistüriyle çıkarın.
   2. Fazla jel miktarını en aza indirin.
   3. Jeli yaklaşık 1 mm³ parçaya kesin.
   4. Jel parçalarını 0.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
3. Destain jel parçaları
   1. 100 μL detamine çözeltisi ekleyin.
   2. 10 dakika girdabında kaldı.
   3. Santrifüj 14.000 × g'de 1 dakika boyunca kullanın.
   4. Üst yüzeyi çıkarın.
   5. Jel parçaları şeffaf olana kadar damar işlemi tekrarlanın.
4. Proteinleri indirgeme
   1. 100 μL indirgeme çözeltisi ekleyin.
   2. 56 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
   3. Numuneleri oda sıcaklığına soğutun.
   4. Kısa bir süreliğine santrifüj yapın ve süpernatantı çıkarın.
5. Alkilat proteinler
   1. 100 μL alkilasyon çözeltisi ekleyin.
   2. Oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika kuluçka yapın.
   3. Üst yüzeyi çıkarın.
   4. Jel parçalarını 100 μL sindirim tamponu ile 5 dakika boyunca yıkayın.
6. Sindirim proteinleri
   1. Jel parçalarını tamamen kaplaması için yeterli tripsin çözeltisi ekleyin.
   2. 37 °C'de 16–18 saat kuluçka yapın.
7. Ekstrakt peptitleri
   1. 30 μL ekstraksiyon çözeltisi ekleyin.
   2. 15 dakika sonikasyon yapın ya da 30 dakika vortex yapın.
   3. Santrifüj 14.000 × g'de 1 dakika boyunca kullanın.
   4. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.
   5. Ekstraksiyon işlemini iki kez tekrarlayın.
   6. Tüm ekstraktları bir arada topla.
   7. Kuru biriktirilmiş ekstraktları yaklaşık 1 saat vakum konsansantatörlerinde biriktirin.
8. StageTip kullanarak peptitleri temizleyin
   1. Kurutulmuş peptitleri %0,1 formik asit (FA) içeren 20 μL içinde yeniden süzülür.
   2. Örnekleri bir C18 StageTip'e yükleyin.
   3. Santrifüj 1.000 × g'de 2 dakika boyunca koyun.
   4. StageTip'i %0,1 FA içeren 20 μL ile yıkayın.
   5. 20 μL %60 asetonitril/%0.1 FA içeren peptitleri bir LC-MS şişesine elüte edin.
   6. Eluate'yi kurut.
   7. 10 μL oranında %0,1 FA içinde peptitleri yeniden süspansiyona alın.
      NOT: Gerekirse protokolü burada duraklat. LC-MS/MS analizinden önce saflaştırılmış peptitleri -80 °C'de saklayın.
9. LC-MS/MS verilerini edinin
   1. Peptitleri %0,1 formik asitte yeniden yapılandırın.
   2. 75 μm × 250 mm C18 analitik kolonunda 300 nL/dakika akış hızında ayrı peptitler.
   3. Aşağıdaki çözücü B gradyanını (asetonitrildə %0,1 formik asit uygulan):
      0–40 dakika içinde %2–25 B
      %25–%40 B 40–48 dakika
      %40–%99 B 50–57 dakika
      %99 B'de 3 dakika tutun
   4. Kütle spektrometresini veriye bağlı alım modunda çalıştırın.
   5. 70.000 çözünürlükte 350–1200 m/z aralığında tam taramalı MS spektrumları alın.
   6. 17.500 çözünürlükte on beş ardışık yüksek enerjili çarpışmasal ayrışma (HCD) MS/MS taraması alın.
   7. Her taramada bir mikrotarama kaydedin.
   8. Dinamik dışlama süresini 30 saniyeye ayarlayın.
10. Süreç kütle spektrometrisi verileri
    1. MaxQuant (v2.1.0.0) kullanarak ham veri işleyin.
    2. UniProt'tan indirilen fare protein dizilerine karşı spektrumları ara.
    3. Sindirim enzimi olarak tripsini belirtin.
    4. En fazla iki kaçırılmış dekolte izin verin.
    5. Metionin oksidasyonunu değişken bir modifikasyon olarak belirtin.
    6. Sistein karbamidometilasyonunu sabit bir modifikasyon olarak belirtin.
    7. Öncül ve parça kütle toleranslarını sırasıyla 15 ppm ve 20 ppm olarak ayarlayın.
    8. Hem peptid hem de protein seviyelerinde sahte keşif oranını %1 oranında kontrol edin.
    9. iBAQ tabanlı etiketsiz nicelendirme kullanarak protein bolluğunu tahmin edin.

8. Gen Ontolojisi zenginleştirme analizi yapın

1. Fonksiyonel zenginleştirmeyi analiz et
   1. ClusterProfiler R paketi (v4.6.0) kullanılarak Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizi yapın.
   2. Referans açıklama kaynağı olarak GO veritabanını (v2024-09-20) kullanın.
   3. Benjamini-Hochberg düzeltmesini birden fazla test için uygulayın.
   4. İstatistiksel anlamlılığı 0.05 < ayarlanmış P değeri (FDR) olarak tanımlayın.

9. eCLIP-seq doğrulaması gerçekleştirin

1. eCLIP örneklerini hazırlayın
   1. Daha önce açıklandığı gibi gelişmiş çapraz bağlamalı immünopresipitasyon (eCLIP)^{gerçekleştirin 17}.
   2. PABPC1 ve CCT3'ün immünopresipitasyonu için UV çapraz bağlantılı hücre örnekleri hazırlamak.
   3. eCLIP lizin tamponu kullanarak liz örnekleri alın.
2. İmmünopresipitat RNA-protein kompleksleri
   1. Her numuneye 10 μg antikor ekleyin.
   2. Manyetik boncuklarda RNA-protein komplekslerini yakalayın.
   3. İmmünopresipitasyondan önce giriş örnekleri toplayın.
3. RNA kütüphanelerini hazırla
   1. Proteine bağlı RNA'ları defosforilet.
   2. Geri kazanılan RNA'ya 3'lik bir RNA adaptörü bağlanın.
   3. İmmünopresipitli ve giriş örneklerini sıkı koşullar altında yıkayın.
   4. Boncukları kaynatarak kompleksleri elüte edin.
   5. Örnekleri %4–%12 Bis-Tris gradyan jelinde çöz.
   6. Ayrılmış kompleksleri nitroselüloz membranına aktarın.
4. RNA geri kazan
   1. Boyut uyumu olan bir zar bölgesini çıkarın.
   2. Proteinleri üre ve proteinaz K kullanarak sindirin.
   3. Zardan RNA'yı geri almak.
5. Dizileme kütüphaneleri oluşturun
   1. Geri alınan RNA'yı cDNA'ya ters transkribe eder.
   2. CDNA'yı ekzonükleaz I ve karides alkali fosfataz karışımı kullanarak saflaştırın.
   3. T4 RNA ligaz kullanarak cDNA'nın 3' ucuna bir DNA adaptörü bağlayın.
   4. Yüksek isabetli bir DNA polimeraz kullanarak kütüphaneleri güçlendirin.
   5. %3 düşük erime noktasına sahip agaroz jel üzerinde ayrı amplifikasyonlu kütüphaneler.
   6. Boyut seçilmiş kütüphaneleri jel çıkarma kiti kullanarak arındırın.
   7. Illumina platformunda dizis kütüphaneleri.
6. eCLIP-seq verilerini analiz et
   1. ENCODE eCLIP pipeline²⁰ kullanarak dizileme verilerini analiz edin.
   2. Cutadapt (v1.14) kullanarak trim adaptörleri ve 3' adaptör dimerler.
   3. STAR (v2.7.6a) kullanarak okumaları UCSC tekrarlayan elemanlara hizalayın.
   4. Tekrarlayan öğelere okuma eşlemesini kaldırın.
   5. Kalan okumaları mm10 referans genomuna (GENCODE vM23) hizalayın.
   6. PCR kopyalarını kaldırın.
   7. CLIPPER kullanarak zenginleştirilmiş bağlanma noktalarını belirleyin.
   8. Önemli zirveler, katlama zenginleştirmesi 8 ≥ ve P ≤ 0.001 olarak ayarlanmış zirveler olarak tanımlanır.
   9. Tekrarlanabilir zirveleri 0.01 olarak tekrarlanabilir keşf oranı (IDR) eşiği kullanarak tanımlayın.

Sonuçlar

Tug1 bağlayan proteinleri tanımlamak için, UV çapraz bağlama ChIRP iş akışına dahil edilmiş ve cPDiRT (Şekil 1) olarak adlandırılmış bir yöntem oluşturulmuştur. Geleneksel ChIRP ilk olarak GC2 hücrelerinde Tug1 etkileşimli proteinleri zenginleştirmek için uygulanmıştır (Şekil 2A, B). Kütle spektrometrisi analizi, negatif kontrole göre zenginleştirilmiş 190'dan fazla proteini tespit etti (

Tartışma

cPDiRT, paraformaldehit (PFA) çapraz bağlamasını UV çapraz bağlama ile değiştirerek doğrudan lncRNA-protein etkileşimlerini seçici olarak yakalayan modifiye edilmiş bir ChIRP tabanlı protokol olarak geliştirilmiştir. Taze testis dokusunun tek hücrelere enzimatik ayrışmasını UV çapraz bağlama ile birleştirerek, doğrudan etkileşim haritalama, kültürlenmiş hücre hatlarından doğal dokulara genişletildi. Kültürlenmiş hücrelerde yapılan paralel deneyler, PFA tabanlı ve UV tabanlı yaklaşımların...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Gibco	25200056	doku ayrışması ve tek hücreli süspansiyon hazırlığı için
100% Ethanol	Sigma-Aldrich	459844	RNA temizleme için
AffinityScript Reverse Transcriptase	Agilent	600107	eCLIP cDNA sentezi için
Anti-CCT3 Antikoru	Abcam	Ab225878	eCLIP için antikor
Anti-PABPC1 Antikoru	Abcam	Ab312314	eCLIP için antikor
Kloroform	Sigma-Aldrich	C2432	RNA ekstraksiyonu için
Kolagenaz Tip IV	Sigma-Aldrich	C5138	testis dokusunun enzimatik ayrışması için
Defosforilasyon reaktifleri (T4 PNK)	New England Biolabs	M0201S	eCLIP RNA defosforilasyonu için
DMEM Yüksek Glukozlu Medium	Gibco	11965092	hücre kültürü ve doku ayrışması tamponu için
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Manyetik Boncuklar	Thermo Fisher Scientific	65001	biyotinleştirilmiş prob-RNA-protein komplekslerinin yakalama için
DynaMag-15 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12301D	manyetik boncuk ayrımı için
DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D	manyetik boncuk ayrımı için
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	lizis ve yıkama tamponlarında iki değerlikli katyonları şelatlamak için
Eksonükleaz I	New England Biolabs	M0293S	eCLIP cDNA saflaştırması için
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099141C	tripsin sindirimini durdurmak için
Formamid	Thermo Fisher Scientific	AM9342	hibridizasyon tamponu hazırlığı için
Hibridizasyon Fırını	TUOHE	LF-I	prob hibridizasyonu ve boncuk yıkama için
Düşük Erime Sıcaklığı Agaroz	Sigma-Aldrich	A9414	eCLIP kütüphane boyutu seçimi için
MinElute Jel Ekstraksiyon Kiti	Qiagen	28604	eCLIP kütüphane boyutu seçimi için
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	RNA saflaştırması için
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	yüksek tuzlu yıkama tamponu hazırlığı için
Nükleofil Membran	GE Healthcare / Amersham	10600002	eCLIP western blot transferi için
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85125	yıkama tamponu deterjanı için
Nükleaz ve proteaz içermeyen su	Thermo Fisher Scientific	10977035	nüklez içermeyen çözeltilerin hazırlanması için
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Jel	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX	eCLIP boyut seçimi için
NuPAGE Bis-Tris Hazır Jel	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX	SDS-PAGE protein ayrımı için
PBS (pH 7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010023	hücre yıkama ve yeniden süspansiyon için
Fenilmetil sülfonil florür (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	hücre lizis tamponu için serin proteaz inhibitörü; kullanımdan önce taze eklenir
Proteaz İnhibitör Kokteyli	Roche	4693132001	hücre lizis tamponu için geniş spektrumlu proteaz inhibitörü; kullanımdan önce taze eklenir
Proteinaz K	Sigma-Aldrich	P4850	RNA ekstraksiyonunda protein sindirimi için
qRT-PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	11704044	RNA zenginleştirmeyi doğrulamak için kuantitatif RT-PCR için
RNase/Proteas-Ücretsiz DNase I Çözeltisi	Thermo Fisher Scientific	EN0521	doku ayrışması için
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	RNA saflaştırması için
SDS-PAGE Numune Yükleme Tamponu	Beyotime	P0286	protein numune hazırlığı için
Istakoz Alkaline Fosfataz	New England Biolabs	M0371S	eCLIP cDNA saflaştırması için
Gümüş Leke Kiti	Beyotime	P00175	SDS-PAGE jelleri içinde proteinleri görselleştirmek için
Sodyum Deoksikolat	Sigma-Aldrich	D6750	yıkama tamponu deterjanı için
Sodyum dodesil sülfat (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	hücre lizisi ve protein denatürasyonu için
Superase-in RNase İnhibitörü	Thermo Fisher Scientific	AM2694	özel RNase inhibitörü; kullanımdan önce taze eklenir
T4 RNA Ligaz	New England Biolabs	M0204	eCLIP adaptör ligasyonu için
Tris–HCl (pH 7.0)	Sigma-Aldrich	T5941	lizis, hibridizasyon ve yıkama tamponlarının hazırlanması için
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026CN	RNA ekstraksiyonu için
Ultrasonik hücre kırıcı	ATPIO	ATPIO-650D	hücre lizisi ve DNA parçalanması için
Ultraviyole Çapraz Bağlayıcı	Analytik Jena	UVP CL-1000	RNA-protein etkileşimlerinin UV çapraz bağlanması için
üre	Sigma-Aldrich	U5128	membran üzerinde eCLIP protein bozunması için