Yöntem makalesi

Postoperatif Kognitif Disfonksiyonu Modellemek İçin Yaşlı C57BL/6J Farelerde L5 Lumbar Laminektomi

4 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71733

⸱

22 Eylül 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacology, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, lokomotor bozulmayı minimize ederek postoperatif bilişsel disfonksiyon modeli oluşturmak amacıyla yaşlı C57BL/6J farelerde standartlaştırılmış bir L5 lomber laminektomiyi tanımlamakta ve böylece perioperatif nörobilişsel bozuklukların davranışsal, histolojik ve mekanistik çalışmalarını desteklemektedir.

Özet

Postoperatif kognitif disfonksiyon (POCD), cerrahi işlem ve anestezi sonrası, özellikle yaşlı yetişkinlerde görülen yaygın bir nörolojik komplikasyondur ve iyileşmenin gecikmesi, hastanede yatış süresinin uzaması ve yaşam kalitesinin düşmesi ile ilişkilidir. Ortopedik ve spinal prosedürler, nispeten yüksek POCD riski ile bağlantılıdır; ancak spinal cerrahinin perioperatif özelliklerini yakından yansıtan preklinik modeller sınırlı kalmaktadır. Laparotomi ve tibial fraktür dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan modeller, kognitif davranışsal sonuçların yorumlanmasını karmaşıklaştırabilen kalıcı lokomotor bozukluklara ve uzun süreli periferik inflamasyona yol açabilir. Bu protokol, 18 aylık erkek C57BL/6J farelerinde sevofluran anestezisi altında L5 lomber laminektomi kullanılarak POCD'yi modellemek için standartlaştırılmış, düşük maliyetli bir protokol tanımlamaktadır. İşlem, rutin cerrahi aletler kullanılarak gerçekleştirilir ve kalıcı motor defisitleri minimize ederken kontrollü bir cerrahi yaralanma oluşturur. Kognitif fonksiyonlar; yeni nesne tanıma testi, yeni kollu Y-labirenti ve Barnes labirenti kullanılarak değerlendirilirken, hipokampal nöronal hasar ve nöroinflamatuar değişiklikler sırasıyla Nissl boyama ve Iba1 immünofloresansı ile değerlendirilir. Temsili sonuçlar; cerrahi sonrası korunmuş lokomotor aktiviteyi, bozulmuş kognitif performansı, azalmış hipokampal nöronal bütünlüğü ve artmış hipokampal nöroinflamasyonu göstermektedir. Bu standartlaştırılmış ve erişilebilir model, omurga cerrahisi ile ilişkili kognitif disfonksiyonun altında yatan mekanizmaları araştırmak ve aday perioperatif nöroprotektif müdahaleleri değerlendirmek için klinik olarak ilgili bir platform sağlamaktadır.

Giriş

Postoperatif bilişsel disfonksiyon (POCD), anestezi ve cerrahi sonrası öğrenme ve hafıza, dikkat, işlem hızı ve yürütücü işlevlerde meydana gelen bir gerileme olarak tanımlanır1; ağırlıklı olarak yaşlı hastaları etkileyen bu durumun bildirilen insidansının, cerrahi bağlama ve hasta popülasyonuna göre değişiklik gösterdiği görülmektedir2,3. POCD'nin, elektif ortopedik cerrahi geçiren yaşlı yetişkinler arasında sıklıkla meydana geldiği bildirilmiştir4. Klinik olarak POCD, cerrahi sonrası haftalarca veya aylarca sürebilir ve uzamış hastaneye yatış süresi ile artan mortalite ile ilişkilendirilmiştir5,6,7. Dünya genelinde devam eden nüfus yaşlanması ve artan cerrahi işlem hacmiyle birlikte POCD, önemli bir halk sağlığı ve perioperatif bakım sorunu haline gelmiştir.

Patofizyolojik olarak POCD, cerrahi travma ve anestezik maruziyet tarafından tetiklenen multifaktöriyel bir sendrom olarak kabul edilmektedir; nöroinflamasyon, oksidatif stres, otofaji disregülasyonu ve sinaptik disfonksiyon, hipokampus gibi bilişle ilgili bölgelerdeki nöronal disfonksiyonun temelinde yatan önerilen mekanizmalar arasındadır8. Bu mekanizmaları incelemek ve aday müdahaleleri değerlendirmek için bir dizi preklinik POCD paradigması geliştirilmiştir. Preklinik paradigmalar arasında sadece anestezi uygulanan modeller, abdominal cerrahi tabanlı modeller ve tibial kırık gibi ortopedik yaralanma modelleri yer almaktadır9. Bu modeller alanı geliştirmiş olsa da, omurga cerrahisiyle ilgili perioperatif özellikleri tam olarak yansıtmayabilirler ve bazıları, bilişsel okumaları ve mekanistik yorumlamayı karmaşıklaştıran kalıcı lokomotor defisitler ile uzamış doku inflamasyonu gibi karışık değişkenler ortaya çıkarabilir.

Mevcut cerrahi stratejiler arasından, standardize edilmiş ve omurga ile ilgili bir cerrahi bağlamda erken dönem postoperatif bilişsel bozukluğu incelemek için L5 lomber laminektomi modelini seçtik. Bu prosedür, inhalasyon anestezisi altında kontrollü ve lokalize bir cerrahi travma sağlayarak, belirgin bir lokomotor bozukluğa yol açmadan postoperatif nöroenflamatuar yanıtların ve bilişsel disfonksiyonun araştırılmasına olanak tanır. Temel operatif adımların geliştirilmesiyle bu protokol, omurga cerrahisiyle ilişkili bilişsel bozukluğun araştırılması ve perioperatif nöroprotektif stratejilerin değerlendirilmesi için standardize, pratik ve maliyet etkili bir yöntem sunmaktadır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Zhejiang Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (Etik onay numarası: ZJU20260153).

1. Ameliyat öncesi hazırlık

  1. Deney hayvanları, grup tahsisi, analjezi ve körleme
    1. 30–34 g ağırlığında, 18 aylık erkek C57BL/6J fareler kullanın. Fareleri, yiyecek ve suya serbest erişimleri olacak şekilde 12 saatlik ışık/karanlık döngüsü altında barındırın.
    2. Cerrahi işlemden önce farelerin konaklama koşullarına en az 7 gün boyunca alışmasına izin verin. Alışma sürecinden sonra fareleri rastgele L5 laminektomi grubuna veya kontrol grubuna ayırın.
    3. Deneysel prosedürlerden önce her fareye kodlanmış bir kimlik numarası atayın. Davranışsal değerlendirmelerin tedaviye kör şekilde yapılabilmesi için grup tahsis kodunu saklayın.
    4. L5 laminektomi grubundaki fareleri sevofluran anestezisine ve ardından L5 lomber laminektomiye tabi tutun. Kontrol grubundaki fareleri sevofluran anestezisine, cerrahi alan hazırlığına veya cerrahi müdahaleye maruz bırakmayın.
    5. Her iki gruptaki farelere 2 mg/kg dozunda meloksikamı deri altına uygulayın. İlk dozu L5 laminektomi grubunda anestezi indüksiyonundan sonra, kontrol grubunda ise cerrahinin bitişine karşılık gelen zaman noktasında uygulayın.
    6. Her iki gruptaki farelere 48 saat boyunca her 24 saatte bir 2 mg/kg meloksikamı deri altına uygulayın. Deneysel süreç boyunca her iki grubu aynı koşullar altında barındırın, taşıyın ve izleyin.
    7. Tüm davranışsal değerlendirmeleri her iki grup için aynı deney takvimine göre gerçekleştirin. Davranışsal değerlendirmeleri yapan araştırmacının grup tahsisine karşı kör kaldığından emin olun.
  2. Tüm cerrahi aletleri sterilize edin ve cerrahi çalışma alanını dezenfekte edin. Anestezi sırasında vücut sıcaklığını korumak için bir ısıtma pedini önceden ısıtın. Perioperatif uygulama için meloksikamı hazırlayın.
  3. Gaz anestezi cihazını açın ve fareyi bir indüksiyon haznesine yerleştirin. 1 L/dak oksijen akış hızıyla 3–5 dakika boyunca %3–5 sevofluran ile genel anesteziyi indükleyin.
  4. Anestezize edilmiş fareyi cerrahi platforma aktarın. Anesteziyi, bir anestezi maskesi aracılığıyla 0,5–0,8 L/dak oksijen akış hızında %1,5–3 sevofluran ile sürdürün. 2 mg/kg meloksikamı deri altına uygulayın. Sevofluran indüksiyonunun başlangıcından itibaren ölçülen toplam anestezi süresi yaklaşık 4 saattir. Stabil bir cerrahi anestezi planı sürdürmek için sevofluran konsantrasyonunu gerektiği gibi ayarlayın.
  5. Fareyi, lomber omurga yukarı bakacak şekilde yüzüstü konumlandırın. Hayvanı sabitlemek ve L5 cerrahi alanına engelsiz erişim sağlamak için ön üyeleri bantla nazikçe sabitleyin.
  6. Pedal çekilme refleksinin yokluğunu doğrulayarak anestezinin yeterli derinlikte olduğunu konfirme edin. Korneanın kurumasını önlemek için oftalmik pomad uygulayın.
  7. Küçük hayvan tüy düzeltici kullanarak lomber orta hat bölgesindeki (yaklaşık L3–S1) tüyleri temizleyin. Açığa çıkan cildi önce %75 etanol, ardından povidon-iyot ile dezenfekte edin; aseptik koşulları sağlamak için işlemi 2–3 kez tekrarlayın.

2. L5 lomber laminektomi cerrahisi

NOT: Mevcut protokolde, tüm cerrahi adımlar bir stereomikroskop veya büyüteçli gözlük olmadan, doğrudan görselleştirme altında gerçekleştirilmiştir.

  1. Anestezi altındaki fareyi, önceden ısıtılmış cerrahi platform üzerine yüzüstü (prone) pozisyonda yerleştirin. Vücudu stabilize etmek ve lomber bölgeyi tamamen açığa çıkarmak için ön uzuvları bantla sabitleyin (Şekil 1).
  2. Yüzeyel işaretleri kullanarak L5 vertebra seviyesini belirleyin. Bilateral iliak crestleri palpe edin ve en yüksek noktalarını birleştiren hayali bir transvers hat çizin.
  3. Transvers hattı, L5–L6 intervertebral boşluk için yaklaşık bir işaret olarak kullanın. L5 lamina'yı hedeflemek için planlanan cilt insizyonunu bu hattın hafifçe kranialine merkezleyin.
  4. Cerrahi alanı dezenfekte edin. L4–L6 bölgesini açığa çıkarmak için önceden belirlenmiş L5 seviyesi üzerinden yaklaşık 1,5–2,0 cm uzunluğunda midline longitudinal bir cilt insizyonu yapın.
  5. Cilt kenarlarını steril forsepslerle retraksiyonla açın. Dorsal fasyayı açığa çıkarın ve midline fasyal raphe'yi belirleyin.
  6. Omurgayı açığa çıkardıktan sonra vertebra seviyesini doğrulayın. Lumbosakral bileşkeyi ve en kaudal lomber vertebrayı belirleyin.
  7. C57BL/6 fareler tipik olarak altı lomber vertebraya sahip olduğu için, L6'nın hemen kranialindeki vertebrayı L5 olarak belirleyin. Lumbosakral bileşkeyden kraniale doğru iki vertebra sayarak seviyeyi doğrulayın.
  8. Midline fasyal raphe boyunca küçük bir açıklık oluşturun. Paraspinal kasları doğrudan görselleştirme altında bilateral olarak retraksiyonla açın.
  9. Alttaki lamina'yı açığa çıkarmak için L5 spinöz proçese komşu kasları ayırın . Açığa çıkarma işlemini, üç spinöz proçes de net bir şekilde görünene kadar kraniale L4 spinöz proçese ve kaudale L6 spinöz proçese doğru genişletin.
  10. Pamuklu çubuklar veya ince forsepsler kullanarak öncelikle küt, kemiğe komşu diseksiyon gerçekleştirin. Keskin diseksiyonu yalnızca fasyal adezyonları serbest bırakmak ve kanamayı minimize etmek için gerekli olduğunda kullanın.
  11. L5 lamina'yı ve L5–L6 interlaminar boşluğu tamamen açığa çıkarmak için pamuklu çubuklarla lateral retraksiyonu sürdürün. Devam etmeden önce vertebra seviyesini yeniden doğrulayın.
  12. L5 spinöz proçesi forsepsle nazikçe kavrayın ve L5–L6 interlaminar boşluğu genişletmek için spinöz proçesi ve komşu lomber omurgayı cerrahi platforma göre yaklaşık 30°'lik bir açıyla kaldırın.
  13. Oftalmik makasların kapalı uçlarını, doğrudan görselleştirme altında L5–L6 interlaminar boşluğa yerleştirin. Makası, L5 lamina'nın kaudal kenarının hemen altındaki sığ bir düzlem boyunca ilerletin.
  14. İlk kemik açıklığını oluşturmak için makası hafifçe açın. Laminar kenarlar boyunca sırayla küçük kemik fragmanlarını kaldırarak laminektomi penceresini genişletin. Kemik çıkarma işlemini dorsal L5 lamina ile sınırlayın ve kemik pencerenin lateralde bilateral faset eklemlere uzanmasını önleyin.
  15. Dural yaralanmaları önlemek için aşırı yerleştirme derinliğinden ve aşırı kesme kuvvetinden kaçının.
  16. Dura mater kemik penceresinden net bir şekilde görünene kadar lamina'yı basamaklı bir şekilde çıkarmaya devam edin.
  17. Cerrahi alanı dikkatlice inceleyin. Aktif kanama olmadığını doğrulayın ve dura materin bütünlüğünü koruduğunu teyit edin.
  18. Cerrahi alanı ılık steril salin ile irige edin. Nazik kompresyon uygulayarak hemostaz sağlayın.
  19. Yarayı katmanlar halinde kapatın. Cildi 6-0 naylon sütürlerle kapatın ve insizyon bölgesini dezenfekte edin.
  20. Yara kapatıldıktan sonra, toplam anestezi süresi yaklaşık 4 h olana kadar sevofluran anestezisine devam edin. Ardından sevofluran uygulamasına son verin ve postoperatif bakıma geçin.

3. Ameliyat sonrası bakım

  1. Laminektomi grubundaki cerrahinin sona erdiği zaman noktasına denk gelecek şekilde, kontrol grubundaki farelere 2 mg/kg dozunda meloksikam deri altı olarak uygulayın. Laminektomi grubundaki her bir fareyi sıcaklık kontrollü bir ısıtma pedine yerleştirin ve fare yeniden bilincini kazanana, stabil spontan solunum ve motor aktivite sergileyene kadar vücut sıcaklığını koruyun.
  2. Anestezi sonrası tam iyileşme gerçekleştiğinde, laminektomi grubundaki her bir fareyi kendi kafesine geri koyun. Ardından, normal ambulasyon gözlemlenene kadar hayvanı izleyin. Her iki gruptaki farelere, 48 saat boyunca her 24 saatte bir 2 mg/kg dozunda meloksikam deri altı olarak uygulayın.
  3. Cerrahi kesiyi ve dikiş bütünlüğünü ameliyat sonrası 3. güne kadar günlük olarak kontrol edin. Gerekirse fareyi yeniden anestezi altına alın ve gevşemiş veya kopmuş dikişleri değiştirin.
  4. Kesiyi şişlik, kanama, akıntı veya lokal inflamasyon belirtileri açısından günlük olarak inceleyin.
  5. Ameliyat sonrası dönem boyunca vücut ağırlığını, temizlenme davranışını, spontan aktiviteyi, yiyecek ve su alımını izleyin.
  6. Aşağıdaki önceden tanımlanmış insani sonlandırma kriterlerinden herhangi biri karşılandığında, planlanan deneysel bitiş noktasından önce fareyi insani yöntemlerle ötenazi yapın: ameliyat öncesi vücut ağırlığının ≥%20 kaybı; 24 saat boyunca tam anoreksi veya 3 ardışık gün boyunca yiyecek alımının normal miktarın %50'sinin altında olması; anesteziden iyileşme sonrası 24 saat boyunca devam eden ayağa kalkamama veya yiyecek ve suya erişimde belirgin isteksizlik; veya 37 °C'nin altındaki vücut sıcaklığı ile birlikte seyreden belirgin depresyonla karakterize moribund durum.

4. POCD'nin davranışsal değerlendirmesi

  1. Açık Alan testi (Lokomotor kontrol; ameliyat sonrası 3. gün)
    1. Açık alan testini, 20 lux aydınlatma seviyesi altında, duvarları 40 cm yüksekliğinde olan 45 cm × 45 cm'lik bir arenada gerçekleştirin. Video kamerasını, tüm test alanı görüş alanı içerisinde kalacak şekilde arenanın merkezinin hemen üzerine yerleştirin.
    2. Fareyi arenanın merkezine yerleştirin ve yerleştirmeden hemen sonra video takibini başlatın. Farenin 5 dk boyunca serbestçe keşfetmesine izin verin. 5 dakikalık oturumun tamamını analiz edin ve video takip sistemini kullanarak toplam katedilen mesafeyi ve ortalama hareket hızını hesaplayın.
  2. Yürüyüş analizi
    1. Ameliyat sonrası 3. günde, otomatik bir yürüyüş analizi sistemi kullanarak yürüyüş analizini gerçekleştirin.
    2. Her bir fareyi yürüyüş yolunun bir ucuna yerleştirin ve yol boyunca serbestçe ilerlemesine izin verin. Hareket sırasındaki pati izlerini, yürüyüş analizi sistemine entegre edilmiş yüksek hızlı kamera ile kaydedin.
    3. Her fare için yürüyüş denemelerini kaydedin ve sonraki analizler için yürüyüş yolu boyunca kesintisiz ileri hareket içeren üç geçerli deneme toplayın.
    4. Kaydedilen pati izi verilerini yürüyüş analizi yazılımını kullanarak analiz edin. Otomatik olarak tanımlanan pati izlerini gözden geçirin ve yürüyüş parametrelerini çıkarmadan önce gerektiğinde sağ ön pati, sol ön pati, sağ arka pati ve sol arka pati sınıflandırmasını manuel olarak düzeltin.
    5. Adım uzunluğu, duruş süresi, salınım hızı ve iz alanını nicelendirin ve istatistiksel analiz için her farenin üç geçerli denemesinden ortalama değeri hesaplayın.
  3. Barnes labirenti (Uzamsal öğrenme ve bellek; ameliyat sonrası 4–6. günler)
    ​NOT: Barnes labirenti testini, ameliyat sonrası 4. günden başlayarak üç ardışık gün boyunca günde bir kez gerçekleştirin. Sirkadiyen değişkenliği minimize etmek için testleri her gün aynı zaman aralığında yapın.
    1. Kaçış kutusunu belirlenen hedef deliğin altına yerleştirin. Deney boyunca aynı hedef konumunu koruyun.
    2. Her denemeye başlamak için fareyi labirentin merkezine yerleştirin. Fareye kaçış kutusunu araması için 3 dk'ya kadar süre tanıyın. Fare kaçış kutusuna girdiğinde denemeyi sonlandırın.
    3. Fare 3 dk içinde kaçış kutusunu bulamazsa, onu nazikçe hedef deliğe yönlendirin. Görev öğrenimini pekiştirmek için farenin kısa bir süre kaçış kutusunda kalmasına izin verin.
    4. Kaçış gecikmesini ve kat edilen mesafeyi video takip sistemini kullanarak kaydedin. Farenin 3 dk içinde kaçış kutusuna giremediği denemeler için 180 s kaçış gecikmesi atayın. İstatistiksel analize yalnızca 3. gündeki son oturumda kaydedilen kaçış gecikmesini ve kat edilen mesafeyi dahil edin.
  4. Yeni nesne tanıma (Tanıma belleği; ameliyat sonrası 3–4. günler)
    ​NOT: Açık alan testi için açıklanan arenayı ve video takip sistemini kullanın. Yeni nesne tanıma eğitiminden önce fareleri test arenasına alıştırmak için ameliyat sonrası 3. gündeki açık alan oturumunu kullanın.
    1. Eğitim oturumu sırasında arenanın simetrik konumlarına iki özdeş silindirik nesne yerleştirin. Farenin 5 dk boyunca serbestçe keşfetmesine izin verin.
    2. 1 sa'atlik bir tutma aralığının ardından, tanıdık silindirik nesnelerden birini yeni, küp şeklinde bir nesne ile değiştirin. Potansiyel yan tercihi minimize etmek için yeni nesnenin konumunu fareler arasında dengeleyin. Farenin 5 dk boyunca keşfetmesine izin verin.
    3. Tanıdık ve yeni nesneler için keşif süresini video takip sistemini kullanarak kaydedin. Analize yalnızca toplam nesne keşif süresi en az 3 s olan fareleri dahil edin.
    4. Tercih indeksini (PI) şu şekilde hesaplayın:
      figure-protocol-1
      Tnovel ve Tfamiliar değerlerini, test oturumu sırasında sırasıyla yeni ve tanıdık nesneleri keşfederek geçirilen süreler olarak tanımlayın.
  5. Yeni kollu Y-labirent (Uzamsal tanıma belleği; ameliyat sonrası 5. gün)
    1. Testi, 120° açıyla ayrılmış üç özdeş koldan oluşan Y şeklinde bir labirentte gerçekleştirin. Bir kolu opak bir kapı ile rastgele kapatın ve bu kolu yeni kol olarak belirleyin.
    2. Açık olan iki koldan birini rastgele başlangıç kolu olarak seçin. Kalan açık kolu tanıdık kol olarak belirleyin. Fareyi başlangıç kolunun ucuna yerleştirin ve erişilebilir iki kolu 5 dk boyunca serbestçe keşfetmesine izin verin.
    3. 1 sa'atlik denemeler arası aralıktan sonra, opak kapıyı kaldırın ve fareyi aynı başlangıç kolunun ucuna geri getirin.
    4. Fareye üç kolu da 5 dk boyunca serbestçe keşfetmesine izin verin.
    5. Bir kol girişini, takip edilen gövde merkezinin merkezi bölgeden önceden tanımlanmış bir kol bölgesine girmesi olarak tanımlayın. Giriş sayısını ve her kolda geçirilen süreyi video takip sistemini kullanarak kaydedin.
    6. Zaman tabanlı yeni kol tercih indeksini şu şekilde hesaplayın:
      figure-protocol-2
      Tnovel, Tstart ve Tfamiliar değerlerini sırasıyla yeni, başlangıç ve tanıdık kollarda geçirilen süreler olarak tanımlayın.
    7. Giriş tabanlı tercih indeksini şu şekilde hesaplayın:
      figure-protocol-3
      Enovel değerini yeni kola yapılan giriş sayısı, Etotal değerini ise test denemesi sırasında üç kolun tamamına yapılan toplam giriş sayısı olarak tanımlayın.

5. Doku işleme, Nissl boyama ve immünofloresan boyama

  1. Doku işlemleri
    1. Belirlenen deneysel bitiş noktasında, fareyi 2 L/min oksijen akış hızıyla %3 sevofloran ile derin anesteziye alın.
    2. Anestezinin yeterli derinlikte olduğunu pedal çekilme refleksinin yokluğu ile doğrulayın. Derin anesteziyi sürdürürken ve kardiyak arrest gerçekleşmeden önce, intravasküler kanı uzaklaştırmak için 20 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile transkardiyak perfüzyon gerçekleştirin.
    3. Fareyi derhal 20 mL %4 paraformaldehit (PFA) ile perfüze edin.
    4. Tüm beyni dikkatlice disseke edin. Postfiksasyon için beyni 4 °C'de 24 saat boyunca %4 PFA içinde bekletin.
    5. Doku tamamen dibe çökecek kadar %30 sakkarozda bekletin.
    6. Beyni optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömün.
    7. Gömülmüş dokuyu hızla dondurun ve kriyoseksiyon işlemine kadar −80 °C'de saklayın.
  2. Nissl boyama
    1. 16 µm kriyoseksiyonları oda sıcaklığına getirin. Lamları 20 dakika boyunca havada kurutun.
    2. Lamları 2 dakika boyunca PBS ile durulayın.
      NOT: Boyama öncesinde doku kesitlerinin lamlara sıkıca tutunduğundan emin olun.
    3. Kesitlerin tamamını toluidine blue boyama çözeltisi ile kaplayın. 55 °C'de 30 dakika inkübe edin.
      NOT: Aşırı boyanmayı önlemek için 16 µm kesitler için boyama süresini ampirik olarak optimize edin.
    4. Lamları distile su ile 10–30 saniye boyunca kısa süreli durulayın.
    5. Kesitleri sırasıyla %95, %85 ve %75 etanolde 2'şer dakika diferansiye edin.
      NOT: Boyama yoğunluğunu optimize etmek için gerekirse diferansiyasyon süresini ayarlayın.
    6. Lamları taze ksilen ile iki kez 5'er dakika boyunca berraklaştırın.
      NOT: Tüm ksilen adımlarını kimyasal çeker ocak altında gerçekleştirin.
    7. Kesitleri nötral balsam ile monte edin. Her kesitin üzerine nazikçe bir lamel yerleştirin.
    8. Boyanmış kesitleri 20× objektifli bir ışık mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Koronal hipokampal kesitteki karakteristik kompakt piramidal hücre tabakasına dayanarak CA1 bölgesini belirleyin. Her fare için bir koronal kesiti analiz edin ve her hipokampal hemisferin CA1 bölgesinden üst üste binmeyen iki alan görüntüleyin.
    9. Görüntü analiz yazılımındaki hücre sayma eklentisini kullanarak morfolojik olarak sağlam Nissl-pozitif nöronları ve Nissl cisimciklerini manuel olarak sayın. Sağlam nöronları; sağlam bir soma, görünür bir nukleolü olan yuvarlak bir çekirdek ve bol sitoplazmik Nissl maddesi ile tanımlayın; Nissl cisimciklerini ise nöronal sitoplazma içindeki yoğun bazofilik granüler veya kümelenmiş yapılar olarak tanımlayın.
    10. Hayvan başına tek bir değer elde etmek için analiz edilen tüm alanlardan alınan değerlerin ortalamasını alın. Sayımları yapan gözlemcinin grup dağılımına karşı kör olduğundan emin olun.
  3. Iba1 immünofloresan boyama
    1. Boyama öncesinde beyin kesitlerinin oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.
    2. Lamları sodyum sitrat antijen geri kazanım çözeltisine daldırın ve 80 °C'lik su banyosunda 25 dakika boyunca antijen geri kazanımı gerçekleştirin. Antijen geri kazanımından sonra, lamların ve antijen geri kazanım çözeltisinin oda sıcaklığına doğal olarak soğumasını bekleyin.
    3. Kesitleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez 3'er dakika yıkayın.
    4. Kesitleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde %0,2 Triton X-100 ile permeabilize edin, ardından PBS ile üç kez 3'er dakika yıkayın.
    5. Kesitleri nemlendirilmiş bir bölmede oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içinde %3 sığır serum albümini (BSA) ile inkübe ederek spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin.
    6. Kesitleri PBS ile üç kez 3'er dakika yıkayın.
    7. İyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekül 1'e (Iba1; 1:100) karşı birincil antikoru bloklama çözeltisinde (PBS içinde %3 BSA) seyreltin ve kesitleri seyreltilmiş birincil antikor ile nemlendirilmiş bir bölmede 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.
    8. Kesitleri PBS ile üç kez 3'er dakika yıkayın.
    9. Kesitleri karanlıkta oda sıcaklığında 90 dakika boyunca 488-konjuge keçi anti-tavşan IgG (H+L) (1:1000) ile inkübe edin.
    10. Kesitleri karanlıkta PBS ile üç kez 3'er dakika yıkayın.
    11. Çekirdekleri karanlıkta 5 dakika boyunca DAPI (1:8000) ile karşı boyayın.
    12. Kesitleri karanlıkta PBS ile üç kez 3'er dakika yıkayın.
    13. Kesitleri antifade montaj medyumu ile monte edin, lamel uygulayın ve görüntülemeye kadar kesitleri ışıktan koruyun.
    14. 20× objektifli konfokal floresan mikroskobu kullanarak hipokampal CA1 bölgesinin floresan görüntülerini edinin. Kantitatif karşılaştırmalara dahil edilen tüm kesitler için aynı görüntüleme ayarlarını kullanın. Her fare için bir koronal kesiti analiz edin ve her hipokampal hemisferin CA1 bölgesinden üst üste binmeyen iki alan görüntüleyin.
    15. Tüm görüntülerde aynı eşik ayarlarıyla hipokampal CA1 bölgesindeki Iba1 ortalama floresan yoğunluğunu nicelleştirin. Hayvan başına tek bir değer elde etmek için tüm alanlardan gelen değerlerin ortalamasını alın.

6. İstatistiksel analiz

  1. Tüm istatistiksel analizleri istatistiksel analiz yazılımı kullanarak gerçekleştirin. Verileri ortalama olarak sunun ± standart sapma (SD).
  2. Veri normalliğini Shapiro–Wilk testi ile değerlendirin. Varyansların eşitliğini F testi ile değerlendirin.
  3. Varyans varsayımı karşılandığında, kontrol ve L5 laminektomi gruplarını eşleştirilmemiş iki kuyruklu Student t-testi kullanarak karşılaştırın. Varyans varsayımı karşılanmadığında Welch t-testini kullanın.
  4. n'yi her bir analizde yer alan hayvan sayısı olarak tanımlayın. a'yı değerlendirin P değer < 0,05 istatistiksel olarak anlamlıdır.

Sonuçlar

Tüm fareler planlanan deneysel bitiş noktasına kadar hayatta kalmış, hiçbiri önceden tanımlanmış insani bitiş noktası kriterlerini karşılamamış ve tamamı final analizlerine dahil edilmiştir. Motor fonksiyonlar, ameliyat sonrası 3. günde açık alan ve yürüyüş analizleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Açık alan testinde kat edilen toplam mesafe ve ortalama hız gruplar arasında farklılık göstermemiş olup, bu durum karşılaştırılabilir spontan lokomotor aktiviteyi göstermiştir (Şekil 2A). Yürüyüş analizi de benzer şekilde adım uzunluğu, duruş süresi, salınım hızı veya ayak izi alanı açısından gruplar arasında anlamlı bir fark göstermemiştir (Şekil 2B). Birlikte değerlendirildiğinde, bu bulgular L5 laminektomi prosedürünün, sonraki bilişsel-davranışsal performans farklarını açıklayacak düzeyde belirgin bir motor bozulmaya yol açmadığını göstermektedir.

Kognitif performans; yeni nesne tanıma (NOR) testi, yeni kollu Y-labirenti ve Barnes labirenti kullanılarak değerlendirilmiştir. NOR testinde, L5 laminektomi grubu kontrol grubuna kıyasla anlamlı derecede daha düşük bir yeni nesne tercih indeksi (PI) göstermiştir (Şekil 3A). Yeni kollu Y-labirentinde, L5 laminektomi grubu hem yeni kolda geçirilen süre hem de yeni kola giriş sayısı için anlamlı derecede daha düşük PI'ler sergilemiştir (Şekil 3B). Barnes labirenti testinin 3. gününde, L5 laminektomi grubu daha uzun kaçış latansı ve daha fazla katedilen mesafe göstermiştir (Şekil 3C). Birlikte değerlendirildiğinde, bu davranışsal bulgular L5 laminektomi sonrası postoperatif kognitif performansın bozulduğunu göstermektedir.

Hipokampal CA1 bölgesinde, L5 laminektomi grubu, kontrol grubuna göre anlamlı derecede daha az Nissl-pozitif nöron ve anlamlı derecede daha az Nissl cisimciği göstermiştir; bu durum nöronal yapısal hasara işaret etmektedir (Şekil 4A, B). Ayrıca, Iba1 ortalama floresan yoğunluğu, artmış mikroglial aktivasyonla uyumlu olarak L5 laminektomi grubunda anlamlı derecede artmıştır (Şekil 4C, D).

figure-results-1
Şekil 1: Farelerde ameliyat sonrası bilişsel disfonksiyon (POCD) modellemesi için L5 lomber laminektomi prosedürü. (A) L5 lamina üzerindeki cerrahi hedef ve komşu vertebral seviyeleri (L4–L6) kapsayan ekspozisyon alanının gösterimi. (B) L5 lomber laminektomi prosedürünün temel adımlarını gösteren intraoperatif görüntüler. (a) Tıraş sonrası spinal orta hattın belirlendiği lomber bölge; oklar planlanan cilt insizyonunun yönünü göstermektedir. (b) Lomber omurga üzerinde orta hat cilt insizyonu. (c) Spinöz prosesleri açığa çıkarmak ve L5 lamina bölgesini tamamen görünür kılmak için paraspinal kasların aşamalı olarak ayrılmasıyla fasyanın insizyonu ve L5 spinöz proses ile lamina çevresindeki dokunun daha fazla temizlenmesi. (d) L5 lamina çıkarıldıktan sonra L5 laminektomi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: L5 lomber laminektomi sonrası lokomotor aktivite ve yürüyüş değerlendirmesi. (A) Toplam katedilen mesafeyi ve ortalama hızı gösteren açık alan testi (n = 10). (B) Adım uzunluğu, duruş süresi, salınım hızı ve basma alanını gösteren yürüyüş analizi (n = 6). Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. İstatistiksel anlamlılık ns (anlamlı değil) olarak belirtilmiştir. Kısaltmalar: Control = kontrol grubu; Laminectomy = L5 laminektomi grubu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: L5 lomber laminektomi sonrası bilişsel davranışsal değerlendirmeler. (A) Yeni nesne tanıma testi (n = 10). (B) Yeni kol Y-labirenti testi (n = 10). (C) Barnes labirenti testi (n = 10). Veriler ortalama ± SD olarak verilmiştir. İstatistiki anlamlılık *P < 0.05, **P < 0.01 ve ***P < 0.001 olarak belirtilmiştir. Kısaltmalar: Control = kontrol grubu; Laminectomy = L5 laminektomi grubu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: L5 lomber laminektomi sonrası hipokampal CA1 bölgesinin histolojik değerlendirmesi. (A) Hipokampal CA1 bölgesindeki Nissl boyamasının temsili görüntüleri. (B) Nissl-pozitif nöronların (sol) ve Nissl cisimciklerinin (sağ) kantifikasyonu (n = 5). (C) Hipokampal CA1 bölgesindeki Iba1 immünofloresansının temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 µm. (D) Iba1 ortalama floresans yoğunluğunun kantifikasyonu (n = 6). Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. İstatistiksel anlamlılık **P < 0.01 ve ***P < 0.001 olarak belirtilmiştir. Kısaltmalar: Control = kontrol grubu; Laminectomy = L5 laminektomi grubu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Omurga cerrahisi geçiren yaşlı yetişkinlerde ameliyat sonrası kognitif disfonksiyon rapor edilmiştir10. Deneysel kanıtlar, yaşlanmanın cerrahiyle ilişkili kognitif bozulmaya ve nöroinflamatuar yanıtlara karşı duyarlılığı artırdığını göstermektedir11,12. Mevcut protokol, erken dönem ameliyat sonrası kognitif bozulmayı modellemek için yaşlı farelerde yaklaşık 4 s sevofluran anestezisini L5 laminektomisi ile birleştirmektedir. Bu protokolün temel metodolojik değeri, omurga cerrahisi sonrası davranışsal ve hipokampal histolojik değişiklikleri araştırmak için pratik ve erişilebilir bir prosedür sunmasıdır.

Preklinik POCD modelleri; sadece anestezi maruziyeti, abdominal cerrahi ve ortopedik yaralanma paradigmalarını içerir13. Sadece anestezi içeren paradigmalar, cerrahi travma olmaksızın anestetik etkilerin değerlendirilmesine olanak tanır14, ancak anestezi ve doku hasarının birleşik maruziyetini yeniden üretmezler. Abdominal cerrahi ve tibial kırık modelleri cerrahi yaralanmayı kapsar ve cerrahi ile ilişkili bilişsel bozuklukların araştırılması için kullanılmıştır15,16. Ancak, bunların operasyon bölgeleri ve doku hasarı paternleri spinal prosedurlerinkinden farklıdır. Cerrahi travmanın türü ve yoğunluğu postoperatif bilişsel sonuçları ve merkezi enflamatuar yanıtları etkileyebileceğinden9, preklinik bir model seçilirken cerrahi bağlam göz önünde bulundurulmalıdır. Bu nedenle, mevcut L5 laminektomi protokolü, yaşlı farelerde erken postoperatif bilişsel bozukluğu incelemek için omurga cerrahisi ile ilişkili deneysel bir paradigma sunmaktadır.

Bu protokoldeki temel teknik zorluk, dural yaralanmadan kaçınarak durayı net bir şekilde ortaya çıkarmak için L5 lamina bölgesinden yeterli kemiğin uzaklaştırılmasıdır. Doğrudan görselleştirme altında gerçekleştirilen bir laminektomi sırasında; enstrüman derinliğinin, kesme kuvvetinin ve oftalmik makasların yerleştirme açısının dikkatli bir şekilde kontrol edilmesi gerekir. Kemik, lamina kenarları boyunca küçük ve kontrollü kesiler yapılarak aşamalı olarak uzaklaştırılmalıdır. L5 spinöz çıkıntısının pensle kavranması ve operasyon yapılan lomber segmentin cerrahi platforma göre yaklaşık 30°'lik bir açıyla yükseltilmesi, L5–L6 interlaminar boşluğu genişletir. Bu manevra, makas uçlarının kemik kenarının altına sığ bir şekilde yerleştirilmesine izin verir ve dural temas riskini azaltır. Yetersiz kemik uzaklaştırma cerrahi görünürlüğü kısıtlayabilirken, aşırı agresif kesme veya aşırı yerleştirme derinliği dural yaralanmaya neden olabilir. Kontrol edilemeyen kanama operasyon alanını kapatabilir, postoperatif iyileşmeyi bozabilir ve davranışsal sonuçlarda değişkenliği artırabilir. İnterlaminar boşluk makas uçlarının güvenli bir şekilde yerleştirilmesi için yetersiz olduğunda, yerleştirme derinliğini artırmak yerine operasyon yapılan lomber segmentin konumu ve yükseltme açısı yeniden ayarlanmalıdır. Kanama operasyon alanını kapatırsa, yeterli görselleştirme sağlanana kadar kemik uzaklaştırma işlemi durdurulmalı ve ardından kalan kemikler kademeli olarak uzaklaştırılmalıdır.

Paraspinal kas ayrılması ve L5 laminektomi, geçici postoperatif ağrıya katkıda bulunabilir ve farelerde deneysel laminektomi sonrası mekanik hipersensitivite belgelenmiştir17. Meloksikam, önceden tanımlanmış bir analjezik rejime göre uygulanmıştır. Farelerde postoperatif ağrıyla ilişkili yüz ifadelerinin yaklaşık 36–48 sa boyunca devam ettiği bildirilmiştir18. 48 saatlik analjezik rejim, bu erken postoperatif dönemi kapsamak amacıyla planlanmış ve hemen sonrası oluşan postoperatif ağrının potansiyel etkisini azaltmak için kognitif davranışsal testlere analjezik rejimin tamamlanmasının ardından, postoperatif 3. günde başlanmıştır. Açık alan testi, spontane lokomotor aktiviteyi değerlendirmek ve azalmış lokomosyonun kognitif-davranışsal performansı etkileyip etkilemediğini belirlemek için deneysel POCD çalışmalarında kullanılmıştır19,20. Buna göre, kognitif değerlendirmeden önce, postoperatif 3. günde açık alan testi ve yürüyüş analizi gerçekleştirilmiştir. Açık alan lokomotor aktivitesinde veya yürüyüş parametrelerinde gruplar arasında anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir; bu durum, sonraki kognitif-davranışsal farkların öncelikle belirgin bir motor bozulma ile açıklanmasının düşük bir olasılık olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, spontane postoperatif ağrı ve yara rahatsızlığı doğrudan değerlendirilmediğinden, bunların davranışsal performans üzerindeki kalıntı etkileri tamamen göz ardı edilemez. Gelecekteki çalışmalar, spontane postoperatif ağrının doğrudan değerlendirmelerini içerebilir.

Genel olarak bu protokol, yaşlı farelerde L5 laminektomi sonrası erken postoperatif bilişsel bozulmayı araştırmak için pratik bir deneysel yaklaşım sunmaktadır. Omurga cerrahisine bağlı bilişsel bozulmanın davranışsal sonuçlarını ve altında yatan mekanizmaları incelemenin yanı sıra, postoperatif bilişsel bozulmayı önlemeyi veya azaltmayı amaçlayan müdahaleleri değerlendirmek için kullanılabilir. Daha geniş kohortlarda ve bağımsız laboratuvarlarda yapılacak doğrulamalar, modelin stabilitesini ve tekrarlanabilirliğini daha da pekiştirecektir.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedirler.

Teşekkürler

Teknik destekleri için Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi temel tesis platformundan Sanhua Fang'e, Zhejiang Üniversitesi hayvan merkezinden Yanhong Chen ve Xuliang Zhang'a teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki fonlar tarafından desteklenmiştir: Çin Ulusal Doğal Bilimler Vakfı (Nos. 82575196, 82074535 ve U23A20508).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
erkek C57BL/6J farelerSuzhou Industrial Park Ai'er Maite Technology Co., Ltd.SYXK2023-0005Hayvan modeli
ANY-maze Video Takip YazılımıStoelting Co., ABD6000Davranışsal video takibi ve analizi
Eritromisin oftalmik pomadBeijing Twinluck Pharmaceutical Co,. Ltd.H11021270Göz kuruluğunu önleme
Hassas pensetNAÇevrilecek metin sağlanmamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni giriniz.Cildi tıraş edin
Isıtma pediYOKNASıcaklık kontrollü
Iba1/AIF-1 (E4O4W) Tavşan Monoklonal AntikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi17198Iba1 immünofloresan boyama
İnhalasyon anestezi ekipmanıRWD Life Science Co., Ltd.R581SAnestezi
MGT-PRAnhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., ÇinLütfen çevirilecek kaynak metni sağlayın. Kaynak metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz tüm akademik ve bilimsel kriterlere uygun olarak profesyonel Türkçe çevirisini gerçekleştireceğim.Yürüyüş analizi
Mikro Oftalmik makaslarNAYOKKemik uzaklaştırma
Nissl boyama solüsyonuHaoke Biotechnology Co., Ltd.HK2033Nissl boyaması
MakasShang Shou Jin Zhong Cerrahi Aletleri Jiangsu ITD.,CorpY00030Cilt insizyonu
SevofluranShanghai Hengrui Pharmaceutical Co,. Ltd.25062331Anestezi
Tek Kullanımlık Cerrahi ÖrtüJiangxi Zhizheng Medical Equipment Co., Ltd.20212140221Cerrahi operasyon platformu
Küçük hayvan tüy düzelticiYiwu Leiben Trading Co., Ltd.Lütfen çevirmek istediğiniz metni sağlayın.Tüylerin temizlenmesi
İplikli Cerrahi Sütür İğneleriShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LTD.F603Cilt dikişi
Veet tüy alma kremiRECKITT BENCKISER (India) LtdGirdi sağlanmamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni giriniz.Tüy alma

Kaynaklar

  1. Zhao Q, Wan H, Pan H, Xu Y. Postoperative cognitive dysfunction-current research progress. Front Behav Neurosci. 2024;18:1328790.
  2. Kong H, Xu LM, Wang DX. Perioperative neurocognitive disorders: A narrative review focusing on diagnosis, prevention, and treatment. CNS Neurosci Ther. 2022;28(8):1147-1167.
  3. Monk TG, et al. Predictors of cognitive dysfunction after major noncardiac surgery. Anesthesiology. 2008;108(1):18-30.
  4. Li X, et al. Risk factors for postoperative cognitive decline after orthopedic surgery in elderly Chinese patients: A retrospective cohort study. Clin Interv Aging. 2024;19:491-502.
  5. Krenk L, et al. Cognitive dysfunction after fast-track hip and knee replacement. Anesth Analg. 2014;118(5):1034-1040.
  6. Yang X, et al. Identification of individuals at risk for postoperative cognitive dysfunction (POCD). Ther Adv Neurol Disord. 2022;15:17562864221114356.
  7. Suraarunsumrit P, et al. Outcomes associated with postoperative cognitive dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Age Ageing. 2024;53(7):afae160.
  8. Lin X, et al. The potential mechanism of postoperative cognitive dysfunction in older people. Exp Gerontol. 2020;130:110791.
  9. Lu B, et al. Effects of different types of non-cardiac surgical trauma on hippocampus-dependent memory and neuroinflammation. Front Behav Neurosci. 2022;16:950093.
  10. Park S, et al. Preoperative mild cognitive impairment as a risk factor of postoperative cognitive dysfunction in elderly patients undergoing spine surgery. Front Aging Neurosci. 2024;16:1292942.
  11. Xu Z, et al. Age-dependent postoperative cognitive impairment and Alzheimer-related neuropathology in mice. Sci Rep. 2014;4:3766.
  12. Zhang ZJ, et al. Aging alters Hv1-mediated microglial polarization and enhances neuroinflammation after peripheral surgery. CNS Neurosci Ther. 2020;26(3):374-384.
  13. Eckenhoff RG, et al. Perioperative neurocognitive disorder: State of the preclinical science. Anesthesiology. 2020;132(1):55-68.
  14. Guo LY, et al. Cognitive deficits after general anaesthesia in animal models: A scoping review. Br J Anaesth. 2023;130(2):e351-e360.
  15. Qiu LL, et al. NADPH oxidase 2-derived reactive oxygen species in the hippocampus might contribute to microglial activation in postoperative cognitive dysfunction in aged mice. Brain Behav Immun. 2016;51:109-118.
  16. Cibelli M, et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 2010;68(3):360-368.
  17. Yamamoto S, et al. Intraoperative spinal cord stimulation mitigates central sensitization after spine surgery in mice. Spine (Phila Pa 1976). 2023;48(11):E169-E176.
  18. Matsumiya LC, et al. Using the mouse grimace scale to reevaluate the efficacy of postoperative analgesics in laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2012;51(1):42-49.
  19. Sun L, et al. Activation of cannabinoid receptor type 2 attenuates surgery-induced cognitive impairment in mice through anti-inflammatory activity. J Neuroinflammation. 2017;14(1):138.
  20. Zhan G, et al. Anesthesia and surgery induce cognitive dysfunction in elderly male mice: The role of gut microbiota. Aging (Albany NY). 2019;11(6):1778-1790.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Omurga Cerrahisi ModeliSevofluran AnestezisiKognitif Fonksiyon TestiHipokampal Nöronal HasarNöroinflamatuar DeğişikliklerNissl BoyamaIba1 İmmünofloresans

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.