Bu protokol, kalsitonin gen ilişkili peptid (CGRP)/reseptör aktivite modifiye edici protein 1 (RAMP1) yolu üzerinden pulmoner Grup 2 doğal lenfoid hücrelerini (ILC2'ler) modüle ederek, Kechuanting Akupunktur Noktası Yapıştırma Tedavisinin (KAST) tip 2 hava yolu inflamasyonu üzerindeki terapötik mekanizmalarını değerlendirmek amacıyla bir ovalbumen (OVA)-indüklenmiş alerjik astım (AA) fare modelinin oluşturulmasını açıklamaktadır.
Araştırma makalesi
Kechuanting Akupunktur Noktası Yapıştırma Terapisi, ILC2 Sayısını Modüle Ederek Alerjik Astımlı Farelerde Tip 2 Hava Yolu Enflamasyonunu Hafifletir
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Kechuanting Akupunktur Noktası Yapıştırma Terapisi'nin (KAST), alerjik astımlı (AA) hastalarda hava yolu inflamasyonunu etkili bir şekilde iyileştirdiği gösterilmiştir; ancak, altında yatan mekanizmalar henüz aydınlatılmamıştır. Bu çalışma, KAST'nin bir AA fare modelindeki terapötik mekanizmalarını nöro-immün bir bakış açısıyla araştırmayı amaçlamıştır. Ovalbumin (OVA)-indüklü alerjik astım fare modeli oluşturulmuş ve farelere KAST uygulanmıştır. KAST'nin pulmoner Grup 2 doğal lenfoid hücreler (ILC2'ler) ve tip 2 hava yolu inflamasyonu üzerindeki etkileri; akış sitometrisi, hematoksilin-eozin (HE) boyama ve immünohistokimya kullanılarak değerlendirilmiştir. Akciğer dokularındaki kalsitonin gen ilişkili peptid (CGRP) protein seviyelerini belirlemek için Western blotting (WB) ve ELISA kullanılmıştır. CGRP/reseptör aktivite modifiye edici protein 1 (RAMP1) yolağının ILC2'ler ve tip 2 hava yolu inflamasyonu üzerindeki düzenleyici rolünü araştırmak için, alerjik astımlı farelere intranazal olarak CGRP veya CGRP reseptör inhibitörü BIBN-4096 uygulanmıştır. KAST, akciğer dokularındaki CGRP ekspresyonunun azalmasıyla birlikte, ILC2 sayısını azaltmış ve tip 2 hava yolu inflamasyonunu hafifletmiştir. İntranazal CGRP, akciğerlerdeki RAMP1+ILC2'leri ve toplam ILC2'leri artırarak tip 2 hava yolu inflamasyonunu şiddetlendirmiştir. Aksine, intranazal BIBN-4096 pulmoner ILC2'leri azaltmış ve tip 2 hava yolu inflamasyonunu hafifletmiştir. Farmakolojik inhibisyonla desteklendiği üzere, KAST alerjik astımda hava yolu inflamasyonunu azaltmakta olup, bu durum CGRP/RAMP1 yolağının downregülasyonu ve ardından pulmoner ILC2'lerin baskılanması ile yakından ilişkilidir.
Giriş
Alerjik astım (AA), Çin'deki tüm astım vakalarının %60–80'ini oluşturarak astımın en yaygın fenotipidir1. Yüksek prevalansı ve hastaların yaşam kalitesini ciddi şekilde bozan ve önemli ekonomik yüklere neden olan suboptimal hastalık kontrolü ile karakterizedir2,3,4,5. İnhale kortikosteroidler (ICS) klinik tedavinin temel taşı olmaya devam etse de6, bazı hastalar sınırlı yanıt göstermekte olup uzun süreli kullanım sıklıkla yan etkilerle ve hastalığın ilerlemesini durduramama durumuyla ilişkilendirilmektedir7. Bu nedenle, güvenli ve etkili yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi hem klinik hem de araştırma ortamlarında bir öncelik olmaya devam etmektedir. Geleneksel Çin tıbbına ait bir dış uygulama olan Kechuanting Akupunktura Yapıştırma Tedavisi (KAST), aktif bileşikleri transdermal olarak ileterek potansiyel olarak hepatik ilk geçiş etkisini önler ve sistemik yan etkileri minimize eder8,9. Klinik çalışmalar, KAST'ın astım semptomlarını hafifletebileceğini, pulmoner fonksiyonun bir kısmını geri kazandırabileceğini ve hastaların yaşam kalitesini artırabileceğini göstermiştir10,11,12. Eş zamanlı olarak, serum metabolomikleri, ağ farmakolojisi ve astım modelleri kullanılarak yapılan hayvan çalışmaları; KAST'ın, IgE, IL-4 ve IL-13 ekspresyonunun downregülasyonu da dahil olmak üzere, serum ve bronkoalveoler lavaj sıvısı (BALF) düzeylerindeki inflamatuar medyatörleri azaltarak hava yolu inflamasyonunu hafiflettiğini öne sürmektedir9,13,14. Toplu olarak bu bulgular, KAST'ın astımdaki terapötik etkinliği için destekleyici kanıtlar sunmaktadır. Ancak, kesin etki mekanizmaları henüz netlik kazanmamıştır.
AA nüksünü tetikleyen temel patolojik mekanizmalardan biri, grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin (ILC2'ler) kilit rol oynadığı tip 2 havayolu inflamasyonudur15. Alerjen stimülasyonu üzerine ILC2'ler, IL-5 ve IL-13 gibi sitokinler salgılayarak havayolu inflamasyonunu tetikler16,17. Çalışmalar, ILC2'lerin tüketilmesinin astımlı farelerde havayolu inflamasyonunu önemli ölçüde hafiflettiğini göstermiş ve hastalık progresyonundaki merkezi rollerini vurgulamıştır18. Özellikle ILC2'lerin aktivasyonu ve fonksiyonu birden fazla mekanizma tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmektedir ve nöro-immün etkileşimler son yıllarda giderek daha fazla dikkat çekmektedir. Ortaya çıkan kanıtlar, kalsitonin gen ilişkili peptidin (CGRP), ILC2'lerin yüzeyindeki reseptör aktivite düzenleyici protein 1'e (RAMP1) bağlanarak aktivasyonlarını ve ardından tip 2 sitokinlerin salınımını indükleyebildiğini, bunun da AA'da havayolu inflamasyonunu ağırlaştırdığını göstermektedir19,20,21. Mevcut çalışmada, yüksek kapasiteli RNA dizileme (RNA-seq) taramamız, CGRP'yi KAST müdahalesi tarafından yoğun şekilde modüle edilen kritik derecede duyarlı bir nöropeptid olarak tanımlamıştır. Bu nedenle, CGRP/RAMP1 yoluna odaklanarak, ILC2 aktivitesini modüle etme ve tip 2 havayolu inflamasyonunu hafifletmedeki potansiyel mekanizmalarını araştırmak için AA farelerinde KAST'ı bir müdahale olarak kullandık.
Protokol
Tüm hayvan prosedürleri, National Academies of Sciences tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol, Nanjing Çin Tıbbı Üniversitesi Bağlı Hastanesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (onay No. 2023DW-059-01). Bu çalışmada kullanılan tüm malzemelerin, reaktiflerin, araçların ve yazılımların kapsamlı bir listesi Malzemeler Tablosu'nda ayrıntılı olarak verilmiştir.
Deney hayvanları ve gruplandırma
Sağlıklı dişi BALB/c fareler (SPF sınıfı, 8–10 haftalık), Nanjing Çin Tıbbı Üniversitesi Deney Hayvanları Merkezi'nden (lisans No. SYXK (Su) 2018-0049) temin edildi. Hayvanlar, 24–26 °C sıcaklıkta, 12 saatlik ışık/karanlık döngüsü içeren standart koşullar altında barındırıldı. Steril yem ve suya ad libitum olarak erişim sağlandı, altlıklar düzenli olarak değiştirildi ve kafesler rutin olarak temizlendi. 7 günlük adaptasyon süresinin ardından fareler rastgele altı gruba ayrıldı (n = 7/grup): Normal grup, model grup, CGRP grubu, BIBN-4096 grubu, KAST grubu ve KAST + CGRP grubu. Hayvanlar, bilgisayar tarafından oluşturulan rastgele bir sayı tablosu kullanılarak gruplara atanmış oldu. Grup dağılımı, müdahaleler atanana kadar araştırmacılardan gizlendi. Doku kullanımını optimize etmek amacıyla, randomize edilmiş kohorttan (grup başına n = 7) alınan akciğer örnekleri sistematik olarak farklı işlem yollarına ayrıldı; spesifik histolojik ve moleküler analizler için kullanılan kesin analiz edilen örnek boyutları (n = 5, 4 veya 3), ilgili şekil alt yazılarında açıkça belirtilmiştir. Analiz dışı bırakılan herhangi bir veri bulunmamaktadır.
KAST formülasyonunun hazırlanması
Formülasyon, Nanjing Çin Tıbbı Üniversitesi Bağlı Hastanesi Eczacılık Bölümü tarafından hazırlanmıştır22. Dokuz geleneksel Çin tıbbi bitkisi kullanılmıştır: Semen Brassicae (2 kısım), Rhizoma Corydalis (2 kısım), sirke ile işlenmiş Radix Kansui (1 kısım), Asarum (1 kısım), Ephedra (1 kısım), Semen Lepidii (1 kısım), Karanfil (1 kısım), Tarçın kabuğu (1 kısım) ve Gleditsia sinensis (1 kısım). Her bir bitki ince toz haline getirilmiş ve 80 mesh'lik bir elekten geçirilmiştir. Her 100 g karışık toz için 70 mL taze zencefil suyu ve 30 mL sıvı parafin eklenmiş, iyice karıştırılmış ve 0,5 cm çapında 0,3 g ± %5'lik yamalar haline getirilmiştir. Özellikle, tüm bitkisel içerikler ve taze zencefil, Baş Eczacı Lin-gang Zhao tarafından onaylanmış ve kullanım öncesinde 4 °C'de, karanlık ve kuru bir ortamda saklanmıştır9. Müdahale tekrarlanabilirliğini ve partiler arası stabiliteyi garanti etmek için, ekibimizin oluşturduğu UPLC-Q-TOF-MS ve HPLC yöntemlerine dayalı titiz bir kalite kontrol standardı uygulanmış ve sinapine thiocyanate gibi temel aktif markerların tutarlı varlığı doğrulanmıştır23. Uygulamada, optimal transdermal iletimi sağlamak amacıyla 0,5 cm'lik yamalar, 2,5 cm × 5,5 cm boyutlarında tıbbi, nefes alabilen hipoalerjenik yapışkan bant kullanılarak sabitlenmiştir.
AA fare modelinin oluşturulması
AA modeli, literatürdeki yerleşik bir protokole uygun olarak OVA duyarlılığı ve intranazal challenge yöntemi kullanılarak oluşturulmuştur24. Normal grup hariç tüm fareler, 0. ve 12. günlerde 100 µg OVA ve 2 mg alüminyum hidroksit içeren 200 µL salinle intraperitonyal enjeksiyon yapılarak duyarlı hale getirilmiştir. 18. günden 23. güne kadar farelere, günde bir kez 50 µL salin içinde 50 µg OVA ile intranazal challenge uygulanmıştır. 24. günden 53. güne kadar, gün aşırı olarak intranazal OVA uygulanmıştır. 54. günde, fareler tartıldıktan sonra servikal dislokasyon yoluyla ötanazi gerçekleştirilmiş ve dokular toplanmıştır. Ardından, toplam akciğer ağırlığının vücut ağırlığına bölünmesiyle akciğer katsayısı belirlenmiştir.
Müdahaleler
40. ile 53. günler arasında, KAST grubu ve KAST + CGRP grubu farelerinin 3 cm × 6 cm'lik dorsal alanı tıraşlandı. Bilateral Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) ve Shenshu (BL23) akupunktur noktalarının üzerine yamalar uygulandı ve bu yamalar 14 gün boyunca günde bir kez 1,5 saat boyunca yapışkan bantla sabitlendi. CGRP ve KAST + CGRP gruplarındaki farelere, 40. günden 53. güne kadar gün aşırı olarak 10 µL Kalsitonin/CALCA çözeltisi (1 pg/µL) intranazal olarak verildi. BIBN-4096 grubundaki farelere, gün aşırı 10 µL BIBN-4096 çözeltisi (0,3 mg/mL, CGRP reseptör antagonisti) intranazal olarak uygulandı. Normal ve model grupları müdahale olmaksızın standart besleme ile beslendi. KAST, alerjik havayolu inflamasyonunun oluşumundan sonra (18. gündeki ilk OVAye maruziyetten 22 gün sonrası olan 40. günde başlayarak) 40. günden 53. güne kadar uygulandı. Bu nedenle, bu çalışmadaki KAST, profilaktik bir müdahaleden ziyade terapötik bir müdahale olarak uygulanmıştır.
Cilt hazırlığı için, belirlenen dorsal bölgedeki tüyler elektrikli tüy alma makinesi kullanılarak temizlendi. Akupunktur noktalarının lokalizasyonunda, Çin Akupunktur-Moksibüsyon Derneği tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları için Akupunktur Noktalarının Standart Adlandırması ve Lokalizasyonu - Bölüm 3: Fareler (T/CAAM 0002-2020) kılavuzuna kesin olarak bağlı kalındı. Bilateral dört çift dorsal bölge hassasiyetle işaretlendi ve şu şekilde tanımlandı: Feishu (BL13: 3. torakal vertebra spinöz çıkıntısının altındaki kaburgaların arası, posterior orta hattın 3 mm laterali), Geshu (BL17: 7. torakal vertebra spinöz çıkıntısının altı, orta hattın 3 mm laterali), Pishu (BL20: 12. torakal vertebra spinöz çıkıntısının altı, orta hattın 3 mm laterali) ve Shenshu (BL23: 2. lomber vertebra spinöz çıkıntısının altı, orta hattın 3 mm laterali). 1.5 h süren tutma süresi boyunca yamanın kaymasını veya ikincil cilt erozyonunu önlemek amacıyla, stabil bir yapışma sağlamak için 3M bant sıkıca sarıldı.
CGRP/CALCA (1 pg/µL, fare başına 10 µL) ve BIBN-4096 (0,3 mg/mL, fare başına 10 µL) dozları, yayınlanmış çalışmalara25 dayanarak seçilmiştir. Spesifik olarak, CGRP müdahalesi için, 1 mg BSA'nın 1 mL ddH2O içinde çözülmesiyle %0,1'lik bir BSA çözeltisi hazırlanmış ve final konsantrasyonun 1 mg/mL olması için vorteks uygulanmıştır. Rekonstitüsyon öncesinde, liyofilize Kalsitonin/CALCA protein tozu, 4 °C'de 30 s boyunca 12.000 × g hızında santrifüj edilmiştir. Ardından, 1 µg/µL'lik bir stok çözelti elde etmek için hazırlanan %0,1'lik BSA çözeltisinden 20 µL eklenmiştir. Protein rekonstitüsyonunun tam gerçekleşmesini sağlamak için vial nazikçe birkaç kez ters yüz edilmiş (vorteks uygulanmadan), birkaç saniye santrifüjle çöktürülmüş ve oda sıcaklığında birkaç dakika bekletilmiştir. Yönetilemeyecek kadar büyük bir tek aşamalı hacim oluşturmadan 1 pg/µL'lik çalışma çözeltisini hazırlamak için standart iki aşamalı seri dilüsyon uygulanmıştır: Öncelikle, 1 ng/µL'lik bir ara çözelti formüle etmek için 1 µg/µL'lik stok çözeltiden 1 µL, 999 µL steril salin içinde dilüye edilmiş ve ardından bu ara çözeltiden 1 µL, final 1 pg/µL'lik çalışma çözeltisini elde etmek için başka bir 999 µL steril salin ile karıştırılmıştır. Çalışma çözeltisi 4 °C'de tutulmuş, kalan alikotlar ise -20 °C'de 2-3 aya kadar saklanmıştır. BIBN-4096 grubu için, 3 mg/mL'lik bir stok çözelti elde etmek amacıyla 1 mg BIBN-4096 tozu, 333 µL ddH2O içinde çözülmüş, vial başına 50 µL'lik alikotlara ayrılmış ve -80 °C'de saklanmıştır. 0,3 mg/mL'lik çalışma çözeltisini hazırlamak için, stok çözeltinin her 50 µL'lik alikotu 450 µL steril salin ile iyice karıştırılmıştır. 40. günden 53. güne kadar, her bir fareye gün aşırı olarak, anestezi uygulanmadan nazikçe sabitlenmiş halde 10 µL hacminde 1 pg/µL CGRP çözeltisi veya 0,3 mg/mL BIBN-4096 çözeltisi intranazal olarak uygulanmıştır.
Sonuç ölçümleri ve tespit yöntemleri
Davranışsal testler
Son intranazal maruziyetin ardından 53. günde, burun kaşıma ve hapşırma epizotlarının frekansları bir dijital video sistemi kullanılarak 10 dakikalık bir süre boyunca izlendi ve kaydedildi. Videolardaki davranış frekansları, iki araştırmacı tarafından çift-kör yöntemle bağımsız olarak sayıldı. Sayımlar arasında önemli bir tutarsızlık olması durumunda, video üçüncü bir araştırmacı tarafından yeniden değerlendirildi ve istatistiksel analiz için nihai olarak en yüksek tutarlılığa sahip veriler seçildi.
Bronşiyal provokasyon testi
Son challenge sonrası 24 saat içerisinde, 0, 5, 10, 20 ve 40 mg/mL konsantrasyonlarda nebülize asetilkolin (ACh) kullanılarak (konsantrasyon başına 300 µL, 1 dk boyunca nebülize edilerek) hava yolu yanıtı değerlendirildi. Hava yolu daralmasını ampirik olarak belirtmek ve hava yolu hiperreaktivitesini (AHR) değerlendirmek için kullanılan boyutsuz bir indeks olan gelişmiş duraklama (Penh) değerleri, her nebülizasyondan sonra 5 dk boyunca non-invaziv tüm vücut pletismografisi kullanılarak kaydedildi. Fareler, kayıt öncesinde 10 dk boyunca hazneye alıştırıldı. Penh, ekspiratuar/inspiratuar süreyi ve pik akışları dengeleyen ampirik formüle göre, entegre manuel depolama/akış sistem yazılımı kullanılarak otomatik olarak hesaplandı.
Histopatoloji (HE boyama)
%4 paraformaldehit ile fikse edilen akciğer dokuları, dereceli bir alkol serisi ileydehidre edilmiş, ksilen ile şeffaflaştırılmış ve otomatik bir işlemci kullanılarak parafin bloklara gömülmüştür. Bloklar 4 µm kalınlığında kesilmiş, 42 °C'lik su banyosunda yüzdürülmüş ve cam slaytlara monte edilmiştir. Slaytlar 80 °C'de 2 saat boyunca fırınlanmış ve oda sıcaklığına soğutulmadan önce gece boyunca kurutulmuştur. Boyama için kesitler, ksilen ile deparafimize edilmiş (I ve II, her biri 20 dk), dereceli bir etanol serisi ile rehidre edilmiş (100% I/II ve 75%, her biri 5 dk) ve musluk suyu ile durulanmıştır. Slaytlar 3–5 dk boyunca hematoksilen ile boyanmış, %1'lik asit alkol ile diferansiye edilmiş ve bir maviye çevirme çözeltisinde mavileştirilmiştir. Yıkamanın ardından kesitler, %85 ve %95 etanol (her biri 5 dk) ileydehidre edilmiş ve 5 dk boyunca eozin ile karşı boyanmıştır. Son olarak slaytlar, mutlak etanolde (I, II ve III, her biri 5 dk)ydehidre edilmiş, ksilenle (I ve II, her biri 5 dk) şeffaflaştırılmış, nötr balsam ile kapatılmış ve havada kurutulmuştur. Görüntüler, bir ışık mikroskobu ve CaseViewer sistemi kullanılarak 200× büyütmede rastgele alanlardan yakalanmıştır. Akciğer inflamasyonu ve epitelyal kalınlaşma, 0–4 ölçeğinde körleme yöntemiyle derecelendirilmiştir: 0, inflamasyon yok; 1, nadir inflamatuar hücreler; 2, az sayıda (<3) inflamatuar odak; 3, çok sayıda (≥3) inflamatuar odak; 4, akciğer boyunca diffüz infiltrasyon. Epitelyal kalınlaşma şu şekilde skorlanmıştır: 0, normal; 1, belirgin kalınlaşma; 2, kısmi hava yolu kalınlaşması; 3, neredeyse tam tıkanma; 4, normal yapının kaybı. Her deney grubu için, ham histopatolojik skorları elde etmek amacıyla toplam 20 rastgele mikroskobik alan görüntülenmiş ve değerlendirilmiştir. Her dört alandan elde edilen veriler, tek bir bağımsız veri noktası oluşturmak için ortalaması alınmış ve istatistiksel analiz için grup başına n = 5 tekrar şeklinde nihai bir örneklem boyutu elde edilmiştir. Skorlama körleme yöntemiyle gerçekleştirilmiştir.
RNA-seq
Toplam RNA, üretici protokolüne uygun olarak TRIzol reaktifi kullanılarak fare akciğer dokularından ekstre edilmiştir. RNA saflığı, konsantrasyonu ve bütünlüğü, bir spektrofotometre ve mikroakışkan tabanlı bir platform kullanılarak değerlendirilmiştir. Transkriptom kütüphaneleri, ticari bir kütüphane hazırlama kiti kullanılarak oluşturulmuş ve 150 bp çift uçlu okumalar üretmek için yüksek kapasiteli bir dizileme platformunda dizilenmiştir. Ham veriler, temiz okumalar elde etmek amacıyla uygun filtreleme yazılımları ile kalite kontrolden geçirilmiş ve ekleme farkındalıklı (splice-aware) bir hizalama aracıyla referans genomla eşleştirilmiştir. Gen ekspresyon seviyeleri FPKM olarak hesaplanmış ve okuma sayıları bir okuma sayma aracıyla derlenmiştir. Diferansiyel ekspresyon analizi, eşik değerleri |log2 Fold Change| ≥ 1 ve düzeltilmiş p < 0,05 olarak belirlenmiş özel bir istatistik paketi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
ELISA
Taze fare akciğer dokuları hassas bir şekilde tartılmış ve 20 mg dokuya 200 µL tampon şeklinde kesin bir oranda PBS tamponunda homojenize edilmiştir. Protein süpernatanlarını toplamak için homojenatlar, 4 °C'de 10 dakika boyunca yaklaşık 13,400 × g hızında santrifüj edilmiştir. Normalizasyon için, süpernatanların ham protein içeriği BCA yöntemi kullanılarak kalibre edilmiştir. ELISA prosedürü, üretici protokolüne uygun olarak ticari kitler kullanılarak teknik üçte bir (triplicate) şeklinde gerçekleştirilmiştir. Kısaca, antikor kaplı 96 kuyucuklu plakalara 50 µL standart dilüsyon veya 50 µL ön seyreltilmiş örnek (5 katlık bir nihai dilüsyon elde etmek için 10 µL protein örneğinin 40 µL örnek dilüenti ile karıştırılmasıyla) eklenmiştir. Plakalar kapatılmış ve 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edilmiştir. 1:30 oranında seyreltilmiş yıkama tamponu ile beş kez yıkandıktan sonra, her kuyucuğa (boş kuyucuklar hariç) 50 µL enzim bağlı konjuge reaktif eklenmiş ve karışım 37 °C'de 30 dakika inkübe edilmiştir. Beş yıkama daha yapıldıktan sonra, her kuyucuğa 50 µL kromojen çözelti A ve 50 µL kromojen çözelti B eklenmiş ve plaka karanlıkta, 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edilmiştir. Reaksiyon, rengi maviden sarıya çeviren 50 µL durdurma çözeltisinin eklenmesiyle durdurulmuştur. Her kuyucuğun absorbsansı (OD değeri), 15 dakika içinde bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm'de ölçülmüştür. Dört parametreli lojistik veya doğrusal regresyon modeli (R2 > 0.99 olacak şekilde) kullanılarak standart eğriler çizilmiş ve akciğer dokusu homojenatlarındaki hedef protein konsantrasyonları bu eğriler üzerinden hesaplanmıştır.
Akış sitometrisi
Akciğer dokuları eksize edildi, kıyıldı ve %10 FBS, 50 µL Liberase TM ve 5 µL DNase I içeren 5 mL RPMI-1640 içerisinde, 37 °C'de 80 rpm çalkalama ile 45 dakika boyunca digere edildi. Digere edilen süspansiyon 400-mesh hücre süzgecinden geçirildi ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 × g hızında santrifüjlendi. Pelet, oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika boyunca 2 mL eritrosit lizis tamponunda resüspande edildi. Yıkama işleminden sonra hücreler, ölü hücrelerin dışlanması için 4 °C'de karanlıkta 20 dakika boyunca Ghost Dye Red 780 (örnek başına 1.25 µL) ile resüspande edildi ve boyandı. Yıkamanın ardından hücreler, 4 °C'de 10 dakika boyunca 10 µL FcR Bloklama Reaktifi ile bloklandı. Ardından hücreler, 4 °C'de 30 dakika boyunca şu florokrom-konjuge antikorlarla yüzey boyamasına tabi tutuldu: FITC anti-mouse CD45 (0.5 µL), PE anti-mouse/human KLRG1 (1.25 µL), BB700 rat anti-mouse CD90.2 (0.5 µL) ve anti-mouse CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) (her biri 0.5 µL) ve anti-mouse CD19 (2 µL) içeren biyotinize lineage karışımı. Yıkama sonrası hücreler, 4 °C'de 30 dakika boyunca Brilliant Violet 605 Streptavidin (2 µL) ile inkübe edildi. Veriler bir BD akım sitometre platformunda elde edildi ve FlowJo yazılımı kullanılarak analiz edildi. Floresans taşma kompanzasyon matrisleri, cihazın kalibre edilmiş veri toplama yazılımı tarafından otomatik olarak izlendi ve ayarlandı. Pulmoner ILC2'leri tanımlamak için kullanılan hiyerarşik gating stratejisi sırasıyla şu şekilde uygulandı: önce forward/side scatter (FSC-A/SSC-A) morfolojisi aracılığıyla toplam lenfositler izole edildi ve ardından singlet gating (FSC-H/FSC-A) yoluyla dublet ayrımı yapıldı. Canlı hücreler daha sonra ölü hücre dışlaması (Ghost Dye-) ile tanımlandı ve ardından CD45+ ve Lineage- popülasyonlarını seçmek için standart gate'ler aşamalı olarak uygulandı. Canlı CD45+ Lineage- gating penceresi içerisinde pulmoner ILC2'ler, CD90.2+ ve KLRG1+ kümelerinin ardışık pozitif kaskad gate'lerine dayanarak açıkça tanımlandı ve sayıldı.
İmmünofloresans (IF)
Dondurulmuş akciğer kesitleri oda sıcaklığında 15–30 dk boyunca çözülmüş ve OCT bileşiğini uzaklaştırmak için PBST (0.05% Tween-20 içeren PBS) ile her biri 6 dk sürecek şekilde üç kez yıkanmıştır. Fazla sıvı kurutulduktan sonra, bir immünohistokimya kalemi kullanılarak doku etrafına hidrofobik bir bariyer çizilmiştir. Kesitler, %0.3 Triton X-100 ve %5 keçi serumu içeren bir bloklama ve permeabilizasyon tamponunda 37 °C'de 100 dk boyunca inkübe edilmiş, ardından primer antikor ile 4 °C'de gece boyu (16–20 sa) inkübasyona bırakılmıştır. Ertesi gün, kesitler oda sıcaklığında 30 dk boyunca dengelenmiş, PBST ile üç kez yıkanmış ve türle eşleşmiş florofor-konjuge sekonder antikor ile 37 °C'de karanlıkta 60–90 dk boyunca inkübe edilmiştir. Üç ek PBST yıkamasının ardından, çekirdekler oda sıcaklığında karanlıkta 8 dk boyunca DAPI (PBS içinde 1:1 veya 2:1 oranında seyreltilmiş) ile karşıt boyanmıştır. Son PBST yıkama turundan (3 × 6 dk) sonra, kesitler anti-fade montaj medyumu ile kapatılmış, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için mühürlenmiş ve karanlıkta saklanmıştır. Görüntüler, konfokal mikroskop kullanılarak 400× büyütmede yakalanmıştır. Alan başına pozitif hücre sayısı Leica LAS X yazılımı kullanılarak manuel olarak sayılmıştır. Ham hücre sayılarını elde etmek için her deney grubu için toplam 15 rastgele mikroskobik alan görüntülenmiştir. Tek bir bağımsız veri noktası elde etmek için her üç alanın verilerinin ortalaması alınmış ve böylece istatistiksel analiz için grup başına n = 5 tekerrürden oluşan nihai bir örneklem büyüklüğüne ulaşılmıştır. Sayım işlemi körleme yöntemiyle gerçekleştirilmiştir.
İmmünohistokimya (IHC)
Parafin kesitler, üç kez değiştirilen ksilenle (her biri 15 dk) deparafine edildi, dereceli bir etanol serisiyle (iki kez %100, %85 ve %75; her biri 5 dk) yeniden hidrate edildi ve distile su ile durulandı. Antijen geri kazanımı, bir düdüklü tencere kullanılarak sitrat tamponunda (pH 6.0) gerçekleştirildi (kaynama sonrası yüksek basınçta 3 dk), ardından soğutma ve PBS'de (pH 7.4) üç kez 5 dakikalık yıkama yapıldı. Endojen peroksidaz, oda sıcaklığında karanlıkta 15 dk boyunca %3 H2O2 ile bloke edildi. Yıkamanın ardından kesitler, hidrofobik bir kalemle çevrelendi ve %3 keçi serumu ile 30 dk boyunca bloke edildi. Kesitler daha sonra, PBS içinde dilüe edilmiş primer antikorlarla (anti-IL-4 (1:400), anti-IL-5 (1:300) veya anti-IL-13 (1:150)) 4 °C'de gece boyunca inkübe edildi. Ertesi gün, kesitler yıkandı ve HRP-konjuge sekonder antikorlar (IL-4 için anti-mouse; IL-5 ve IL-13 için anti-rabbit) ile oda sıcaklığında 50 dk boyunca inkübe edildi. Sinyaller, mikroskobik kontrol altında taze hazırlanmış DAB çözeltisi kullanılarak görselleştirildi ve musluk suyu ile sonlandırıldı. Son olarak kesitler hematoksilin ile karşıt boyandı, diferansiye edildi, mavileştirildi, dereceli alkoller ve ksilen iley dehidrate edildi ve mikroskobik inceleme için nötral balsam ile lamella ile kapatıldı. Ortalama optik yoğunluk (IOD/Alan), bir görüntü analiz yazılım platformu kullanılarak 200× büyütmede nicelendirildi. Her deneysel grup için, ham değerleri elde etmek amacıyla toplam 15 rastgele mikroskobik alan görüntülendi. Her üç alanın verileri, tek bir bağımsız veri noktası elde etmek için ortalandı ve böylece istatistiksel analiz için grup başına n = 5 tekrardan oluşan nihai bir örneklem büyüklüğü sağlandı. Puanlama, iki kör gözlemci tarafından gerçekleştirildi.
Western blot (WB)
Numune hazırlığı için, fare akciğer dokuları (yaklaşık 30 mg) ince kıyılmış ve %1 proteaz/fosfataz inhibitör kokteyli ile desteklenmiş, önceden soğutulmuş 300 µL RIPA lizis tamponu içinde homogenize edilmiştir. Homojenizasyon, bir doku homojenizörü kullanılarak 60 Hz'de dört döngü boyunca (döngü başına 60 s) gerçekleştirilmiştir. Ardından, süpernatantı toplamak için lizatlar yaklaşık 13.400 × g hızında, 4 °C'de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Toplam protein konsantrasyonları, standart bir BCA protein analiz kiti aracılığıyla belirlenmiştir. Numuneler daha sonra normalize edilmiş, 4:1 hacim oranında 5x yükleme tamponu ile karıştırılmış ve 95 °C'de 7 dakika boyunca denatüre edilmiştir. SDS-PAGE için, protein numuneleri (hat başına 20 µg) önceden boyanmış bir protein moleküler ağırlık markeri ile birlikte yüklenmiş, 80 V sabit voltajda 20 dakika boyunca ayrıştırılmış ve ardından 120 V'a ayarlanarak 70 dakika boyunca işleme devam edilmiştir. Proteinler daha sonra bir buz banyosunda 300 mA sabit akımda 120 dakika boyunca 0,22 µm PVDF membranlara ıslak transfer edilmiştir. Membranlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBST içinde %5 BSA ile bloke edilmiş ve CGRP (1:500) ve GAPDH (1:2000) karşıt primer antikorlar ile 4 °C'de gece boyunca (18 saate kadar) inkübe edilmiştir. Üç kez TBST ile yıkama işleminden sonra (her biri 10 dakika), membranlar oda sıcaklığında 1–2 saat boyunca horseradish peroksidaz konjugeli sekonder antikorlar (1:10000) ile inkübe edilmiştir. Diğer üç yıkama işleminin ardından, protein bantları bir VILBER Fusion FX görüntüleme sistemi içinde geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) substrat kullanılarak görselleştirilmiştir. Bant yoğunlukları ImageJ 1.8 kullanılarak nicelendirilmiş ve hedef protein ekspresyonu GAPDH iç kontrolüne göre normalize edilmiştir.
İstatistiksel analiz
Tüm deneysel veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edilmiştir. Veri analizi ve istatistiksel çizimler, özel bir istatistik yazılım platformu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Gruplar arası karşılaştırmalar öncesinde, veri setleri sistematik olarak normallik testine tabi tutulmuştur. Homojen varyanslara sahip normal dağılımlı veriler için tek yönlü veya iki yönlü varyans analizi (ANOVA) uygulanmış, ardından çoklu ikili karşılaştırmalar için Tukey, Šídák, Holm-Šídák veya Fisher'ın LSD post hoc testleri yapılmıştır. Birden fazla grubun tek bir kontrol grubuyla karşılaştırıldığı durumlarda Dunnett testi uygulanmıştır. Heterojen varyanslara sahip veri setleri için Brown-Forsythe ANOVA kullanılmış, ardından Dunnett's T3 post-hoc testi uygulanmıştır. Normalliğe uygun olmayan veri setleri için nonparametrik Kruskal-Wallis testi kullanılmış, ardından çoklu karşılaştırmalar için Dunn's post hoc testi yapılmıştır. P değeri < 0.05, istatistiksel olarak anlamlı farkları belirtmek için temel alınmıştır. Farklı anlamlılık düzeyleri dinamik olarak *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 ve ****p < 0.0001 şeklinde belirtilmiştir. Histolojik skorlama, akış sitometrisi analizi ve görüntü kantifikasyonu dahil olmak üzere tüm deneysel sonuç değerlendirmeleri tamamen körleme yöntemiyle yürütülmüştür.
Sonuçlar
KAST, pulmoner ILC2'leri azaltır ve tip 2 havayolu inflamasyonunu hafifletir
KAST'nin terapötik etkilerini araştırmak için, OVA ile indüklenmiş bir AA fare modeli oluşturulmuş ve Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) ve Shenshu (BL23) akupunktur noktalarına yamalar uygulanarak tedavi edilmiştir (Şekil 1A). Modelleme sonrası, AA farelerinde vücut ağırlığında azalma görülürken, KAST uygulanan farelerin vücut ağırlığı model grubuna kıyasla anlamlı düzeyde artış göstermiştir (Şekil 1B). Pulmoner inflamasyonun bir göstergesi olan akciğer katsayısı, AA farelerinde yükselmiş ancak KAST sonrası belirgin şekilde azalmıştır (Şekil 1C). Davranışsal değerlendirmeler, AA farelerinde burun kaşıma ve hapşırmada artış olduğunu, bunların ise KAST ile anlamlı şekilde hafifletildiğini ortaya koymuştur (Şekil 1D–E). Tüm vücut pletismografisi, hava yolu hiperreaktivitesinin göstergesi olan Penh değerlerinin AA farelerinde yükseldiğini ancak tedavi sonrası düştüğünü göstermiş ve bu durum akciğer fonksiyonlarının iyileştiğine işaret etmiştir (Şekil 1F). HE boyama ile yapılan histopatolojik analiz, normal kontrollere kıyasla model grubunda peribronşiyal ve perialveoler inflamatuar hücre infiltrasyonu olduğunu ortaya koymuştur. Buna karşılık, KAST grubunda inflamatuar infiltrasyon azalmıştır (Şekil 2A–B). İmmünohistokimya, IL-4, IL-5 ve IL-13'ün öncelikle infiltre olan inflamatuar hücrelerin ve bazı epitel hücrelerin sitoplazmasında lokalize olduğunu ve interstisyel boşluklarda birikme potansiyeli taşıdığını göstermiştir. Normal kontrollere kıyasla model grubu, belirgin şekilde artmış pozitif sinyaller ve ortalama optik yoğunluk değerleri sergilemiş, bu değerler KAST grubunda anlamlı düzeyde azalmıştır (Şekil 2C–H). Akış sitometrisi ayrıca, AA farelerinin akciğerlerindeki ILC2 sayılarının normal kontrollere kıyasla anlamlı düzeyde arttığını, buna karşın KAST'nin ILC2 sayılarını belirgin şekilde azalttığını kanıtlamıştır (Şekil 2I–J).
KAST, CGRP/RAMP1 eksenini baskılayarak tip 2 hava yolu inflamasyonunu hafifletir
ILC2 hiperaktivasyonu birden fazla faktör tarafından düzenlenmektedir. RNA-seq analizi, AA farelerinde CGRP ekspresyonunun anlamlı şekilde artmış olduğunu ve KAST'nin akciğer CGRP seviyelerini belirgin şekilde düşürdüğünü ortaya koymuştur (Şekil 3A). Western blot ve ELISA, kontrol grubuna kıyasla model grubunda yükselmiş olan CGRP protein seviyelerini doğrulamış olup, bu seviyelerin KAST ile azaldığı görülmüştür (Şekil 3B–D). Bu sonuçlar, KAST'nin AA akciğerlerinde CGRP ekspresyonunu zayıflatarak ILC2 immün yanıtlarını modüle ettiğini göstermektedir. Birlikte değerlendirildiğinde, yüksek throughput sekanslama ve protein taramasındaki bu varyasyonlar, KAST terapötik müdahalesi ile AA farelerinde pulmoner CGRP seviyelerinin downregulation'ı arasında güçlü bir ilişki olduğunu düşündürmektedir.
CGRP'nin rolünü daha detaylı araştırmak için AA fareleri ekzojen CGRP, CGRP reseptör antagonisti BIBN-4096 veya CGRP ile kombine edilmiş KAST ile tedavi edildi. ELISA sonuçları, KAST ve BIBN-4096 gruplarında CGRP protein seviyelerinin önemli ölçüde azaldığını, CGRP grubunda seviyelerin yükseldiğini ve KAST + CGRP grubunda seviyelerin tek başına KAST'a kıyasla daha yüksek olduğunu gösterdi (Şekil 4A). Akış sitometrisi, model grubuna kıyasla KAST ve BIBN-4096 gruplarında ILC2 sayılarının azaldığını, ancak CGRP ve KAST + CGRP gruplarında arttığını ortaya koydu (Şekil 4B–C). HE boyaması, KAST ve BIBN-4096 gruplarında hava yolları ve alveoller çevresindeki inflamatuar hücre infiltrasyonunun azaldığını, CGRP ve KAST + CGRP gruplarında ise infiltrasyonun şiddetlendiğini gösterdi (Şekil 4D–E). ELISA, KAST ve BIBN-4096 gruplarında IL-4, IL-5 ve IL-13 seviyelerinin azaldığını, ancak CGRP ve KAST + CGRP gruplarında bu seviyelerin arttığını daha da teyit etti (Şekil 4F–H).
Farklı gruplardaki pulmoner RAMP1+ILC2 sayısı, çok renkli immünofloresan boyama ile değerlendirilmiştir. Sonuçlar, normal kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, model grubunun akciğer dokularındaki toplam RAMP1+ILC2 sayısının anlamlı düzeyde arttığını göstermiştir. Model grubuyla karşılaştırıldığında, pulmoner RAMP1+ILC2 sayısı CGRP grubunda daha da anlamlı şekilde artarken, hem BIBN-4096 grubunda hem de KAST grubunda belirgin şekilde azalmıştır. Özellikle, KAST grubuyla karşılaştırıldığında KAST + CGRP grubu, pulmoner RAMP1+ILC2 sayılarında anlamlı bir artış sergilemiştir; bu durum, eksojen CGRP takviyesinin KAST'ın toplam RAMP1+ILC2 popülasyonları üzerindeki inhibitör etkilerini başarıyla geri çevirdiğini göstermektedir (Şekil 5A–B).
VERİLERİN ERİŞİLEBİLİRLİĞİ:
Bu çalışma sırasında oluşturulan ve analiz edilen tüm ham veri setleri, herkese açık bir veri deposuna kaydedilmiştir. Spesifik olarak, bu kapsamlı materyaller; Western blot (WB) analizlerine ait tüm orijinal membran taramalarını, histoloji (HE ve IHC) ve immünofloresan (IF) analizlerine ait tüm ham, yüksek çözünürlüklü mikroskobik görüntülerin tamamını, ayrıca bireysel replikasyon veri setlerini ve kantifikasyon Excel tablolarını içermektedir. Tüm ham verilere şu kalıcı DOI adresi üzerinden açıkça erişilebilir: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32979065. Akış sitometrisi için kapılama sırası Ek Şekil 1'de verilmiştir. İki adet tam blot görüntüsü Ek Şekil 2–3 olarak sunulmuş ve kantitatif veriler Ek Tablo 1'de sunulmuştur.
Şekil 1: KAST'nin AA farelerinde semptomlar ve akciğer fonksiyonu üzerindeki etkileri. (A) OVA kullanılarak alerjik astım indükleme protokolü. (B) Her gruptaki farelerin vücut ağırlığı istatistikleri, n = 5. (C) Her gruptaki farelerin akciğer katsayısı, n = 5. (D) Son challenge sonrası 10 dakika içindeki burun sürtünme sayısı, n = 5. (E) Son challenge sonrası 10 dakika içindeki hapşırma sıklığı, n = 5. (F) Farklı konsantrasyonlarda asetilkolin stimülasyonu sonrası her gruptaki farelerin Penh değerleri, n = 5. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. İstatistiksel karşılaştırmalar, uygun olduğu durumlarda ardından bir post hoc çoklu karşılaştırma testi uygulanarak, tek yönlü ANOVA veya iki yönlü ANOVA kullanılarak gerçekleştirilmiştir. n = biyolojik tekrarlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: AA farelerde ILC2 sayılarının ve tip 2 havayolu enflamasyonunun KAST tarafından düzenlenmesi. (A) HE boyama ile incelenen akciğerlerin morfolojik değişiklikleri. Ölçek çubuğu = 50 µm. Büyütme: 200×. Enflamasyon skoru körleme yöntemiyle değerlendirilmiştir. (B) Farklı gruplar arasındaki enflamasyon skorlarının istatistiksel analizi, n = 5. (C–H) Farklı grupların akciğer dokularındaki IL-4 (C, D), IL-5 (E, F) ve IL-13 (G, H) protein ekspresyonuna ait temsili IHC görüntüleri ve ortalama optik yoğunluk değerleri, n = 5. Ölçek çubuğu = 50 µm. Büyütme: 200×. (I) Normal, Model ve KAST grupları genelinde pulmoner ILC2'lerin nihai kapılamasını (gating) gösteren temsili akış sitometrisi grafikleri. Tekli, canlı hücreler sırasıyla CD45+ Lineage- (CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G, CD19), ardından CD90.2+ olarak kapılanmış ve pulmoner ILC2'ler nihayetinde KLRG1+ pozitif ekspresyonu ile tanımlanmıştır. Veriler yüksek performanslı bir akış sitometrisi platformunda elde edilmiş ve özel bir akış sitometrisi analiz yazılım paketi kullanılarak analiz edilmiştir. (J) Canlı hücreler arasındaki CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ hücrelerin yüzdesi ile belirtilen ILC2 analizi, n = 5. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. İstatistiksel karşılaştırmalar, tek yönlü ANOVA ve ardından uygun post hoc çoklu karşılaştırma testleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. n = biyolojik tekrarlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: KAST, AA farelerinin akciğer dokularında CGRP ekspresyonunu inhibe eder. (A) Farklı gruplar arasındaki gen ekspresyonunun ısı haritası, n = 4. (B) Her gruptan alınan akciğer dokularındaki CGRP (10 kDa) ve GAPDH (37 kDa) ekspresyonuna ait temsili WB görüntüleri. (C) Akciğer dokularındaki CGRP protein ekspresyonunun WB analizi, göreceli CGRP ekspresyonu (CGRP/GAPDH oranı) olarak sunulmuştur, n = 3. (D) Akciğer dokularındaki CGRP protein ekspresyonunun ELISA analizi, n = 4. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. İstatistiksel karşılaştırmalar, tek yönlü ANOVA ve ardından post hoc çoklu karşılaştırma testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. n = biyolojik tekrarlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: AA farelerinde KAST'nın, CGRP aracılığıyla ILC2 sayıları ve tip 2 hava yolu inflamasyonu üzerindeki etkileri. (A) Farklı gruplardan alınan akciğer dokularındaki CGRP protein ekspresyonunun ELISA analizi, n = 4. (B) Her gruptaki ILC2'lerin (CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺) temsili akış sitometrisi grafikleri. (C) Canlı hücreler arasındaki CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ hücrelerin yüzdesi ile belirtilen ILC2 analizi, n = 5. (D) HE boyama ile incelenen akciğerlerin morfolojik değişiklikleri. Ölçek çubuğu = 50 µm. Büyütme: 200×. (E) Farklı gruplar arasındaki inflamasyon skorlarının istatistiksel analizi, n = 5. (F–H) Farklı gruplardan alınan akciğer dokularındaki IL-4 (F), IL-5 (G) ve IL-13 (H) protein ekspresyonlarının ELISA analizi, n = 4. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. İstatistiksel karşılaştırmalar, tek yönlü ANOVA ve ardından uygun post hoc çoklu karşılaştırma testleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. n = biyolojik tekrarlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5KAST'nin CGRP/RAMP1 yolu aracılığıyla akciğer dokularındaki ILC2 sayıları üzerindeki etkileri. (A) RAMP1 hücre sayımları⁺ ILC2'ler (KLRG1 olarak tanımlanan)⁺GATA3⁺RAMP1⁺ üçlü pozitif hücre) / 400× akciğer dokularındaki alan, n = 5. (B) Akciğer dokularının temsilci floresan boyaması. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyanmış; KLRG1 (mor), GATA3 (kırmızı) ve RAMP1 (yeşil) için immünoboyama gerçekleştirilmiştir. Ölçek çubuğu = 50 µmKantifikasyon: RAMP1'in manuel sayımı⁺ ILC2'ler (KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺ hücreler), özel bir görüntü analiz platformu kullanılarak körleme yöntemiyle analiz edilmiştir. Veriler ortalama olarak sunulmuştur ± Standart Sapma. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0,0001. İstatistiki karşılaştırmalar, tek yönlü ANOVA ve ardından uygulanan post hoc çoklu karşılaştırma testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. n = biyolojik tekrarlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil 1: Pulmoner ILC2'lerin izolasyonu için ardışık kapılamama (gating) stratejisini gösteren temsilci akış sitometrisi grafikleri. İlk olarak, toplam olaylar ileri saçılma (FSC-A) ve yan saçılma (SSC-A) kullanılarak kapılandı. Tek hücreleri elde etmek için FSC-A'ya karşı FSC-H aracılığıyla dubletler dışlandı. Ölü hücre popülasyonlarını elemek için canlı hücreler Ghost Dye Red 780⁻ olarak tanımlandı. Ardından lökositler CD45⁺ üzerinden kapılandı ve bunu lineage-negatif (Lin⁻) hücrelerin seçimi izledi. CD45⁺ Lin⁻ alt kümesi içinde, hücreler ayrıca CD90.2⁺ üzerinden kapılandı ve pulmoner ILC2'ler nihayetinde KLRG1'in pozitif ekspresyonu (KLRG1⁺) ile tanımlandı.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Fare akciğer dokusu örneklerinden alınan internal referans GAPDH (37 kDa) temsilci Western blot görüntüsü. Bant entegre optik yoğunluğu, sonraki normalizasyon için ImageJ yazılımı ile belirlenmiştir.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: Fare akciğer dokusu örneklerinden hedef protein CGRP'nin (10 kDa) temsilci Western blot görüntüsü. Bağıl CGRP ekspresyonu, CGRP bantlarının entegre optik yoğunluğunun karşılık gelen GAPDH entegre optik yoğunluk değerlerine bölünmesiyle hesaplanmıştır.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Ham veri değerleri. Grafikleri çizmek için kullanılan ham veri değerleri.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
AA tedavisi, uzun süreli ilaç kullanımına bağlı yan etkiler, yetersiz semptom kontrolü ve sık tekrarlayan alevlenmeler dahil olmak üzere çeşitli kısıtlamalarla karşı karşıyadır. Konvansiyonel farmakoterapi etkili olsa da, genellikle steroid bağımlılığı gibi olumsuz sonuçlar eşlik etmektedir26,27. Buna karşılık KAST, AA yönetimi için güvenli, ekonomik ve uygun bir alternatif sunmaktadır. Klinik kanıtlar, KAST'ın pulmoner immün fonksiyonu modüle ederek astım semptomlarını etkili bir şekilde hafifletebileceğini göstermiştir28. Bu çalışmada, KAST'ın CGRP/RAMP1 yolağını baskılayarak ve ILC2 sayısını azaltarak AA farelerinde tip 2 havayolu inflamasyonunu hafiflettiğini daha ayrıntılı olarak gösterdik.
Doğal bağışıklık, özellikle de ILC2'ler, AA'daki tip 2 havayolu inflamasyonunun başlatılmasında, amplifikasyonunda ve sürdürülmesinde vazgeçilmez bir rol oynar29. Alerjene maruz kalındığında ILC2'ler, epitel kaynaklı alarminlere hızla yanıt vererek saatler içinde büyük miktarlarda IL-5 ve IL-13 salgılar ve böylece tip 2 inflamatuar yanıtları tetikler30,31. Dahası, ILC2'ler Th2 farklılaşmasını ve IgE sentezini teşvik ederek adaptif bağışıklık yanıtlarını daha da artırır ve havayolu inflamasyonunu şiddetlendirir32. Çalışmalar, ILC2'lerin genetik olarak yok edilmesinin AA modellerinde havayolu inflamasyonunun süresini önemli ölçüde kısalttığını göstermiş ve tip 2 inflamasyonun sürdürülmesindeki merkezi rollerini vurgulamıştır18. ILC2'ler; sitokinler (örneğin, IL-25, IL-33, TSLP), inflamatuar medyatörler (örneğin, lökotrienler) ve nöropeptidler (örneğin, CGRP, VIP, NMU) tarafından düzenlenir33. Bunlar arasında nöropeptidler, doğal bağışıklık düzenlemesinde kilit roller oynar. Neuromedin U (NMU), ILC2 aktivitesini doğrudan artırarak IL-5 ve IL-13 salınımını hızla indükler34. Vazoaktif intestinal peptid (VIP), besin alımına ve sirkadiyen düzenlemeye katkıda bulunarak ILC2'ler tarafından IL-5 üretimini teşvik eder ve eozinofil homeostazını korur33. CGRP, ILC2'lerden IL-5 salınımını belirgin şekilde artırarak AA'da havayolu inflamasyonunu teşvik eder. Özellikle, CGRP için reseptör alt birimi olan RAMP1, diğer nöropeptid reseptörlerine kıyasla ILC2'lerde çok daha yüksek seviyelerde eksprese edilir; bu durum, CGRP'nin ILC2 aktivasyonu için en güçlü ligand olduğunu düşündürmektedir35. Bu çalışmada, transkriptomik analiz CGRP'yi AA farelerinde en farklı şekilde eksprese edilen nöropeptidlerden biri olarak tanımlamış ve protein düzeyindeki analizler akciğer dokularındaki artışını doğrulamıştır. Ekzojen CGRP uygulaması, ILC2 sayılarını ve tip 2 sitokin salınımını daha da artırarak havayolu inflamasyonunu ağırlaştırmıştır.
Mekanizmaya bağlı olarak CGRP, ILC2'lerdeki RAMP1'e bağlanarak bunların aşağı akış immün yanıtlarını düzenler. Mevcut literatürdeki bazı çalışmalar, CGRP'yi hiper-enflamasyona karşı korumak amacıyla ILC2 genişlemesini sınırlayan negatif bir düzenleyici olarak tanımlasa da20,21, karşıt kanıtlar CGRP'nin, belirli patolojik mikroortamlarda grup 2 doğal bağışıklığını güçlü bir şekilde tetiklemek için alarmonlarla iş birliği yapabileceğini göstermektedir. Deneysel son noktalarımız özellikle bu ikinci kaskatla uyumluluk göstererek, OVA ile indüklenen alerjik mikroortamda CGRP kaynaklı pulmoner ILC2 infiltrasyonunun artışını ortaya koymaktadır. Buna karşılık, CGRP yolunun reseptör antagonisti BIBN-4096 ile bloke edilmesi, ILC2 aracılı hava yolu enflamasyonunu önemli ölçüde iyileştirmektedir. Doğrudan genetik ablasyon kanıtı sunmak yerine bulgularımız, KAST'ın terapötik korumasının ILC2'lerdeki CGRP/RAMP1 sinyalizasyon kümelerinin baskılanmasıyla yakından ilişkili olduğunu göstermek için ilişkisel transkriptomik varyasyonlardan ve paralel farmakolojik müdahale deneylerinden (ekzojen CGRP ve antagonist BIBN-4096 kullanılarak) yararlanmaktadır.
Bu gelecek vaat eden bulgulara rağmen, bazı temel kısıtlamaların kabul edilmesi gerekmektedir. İlk olarak, OVA ile indüklenen fare modeli değerli mekanistik öngörüler sağlasa da, türler arası farklılıklar nedeniyle insan alerjik astımının karmaşık patofizyolojik ve immünolojik tablosunu tamamen yansıtmayabilir. İkinci olarak, belirli keşifsel analizlerdeki nispeten küçük örneklem büyüklüğü, daha geniş istatistiksel genellemelere ulaşmak için daha büyük kohortlara ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir. Üçüncü olarak, bu çalışma öncelikli olarak CGRP/RAMP1/ILC2 sinyal eksenine odaklanmıştır; bu durum, potansiyel olarak ilgili diğer nöro-immün çapraz etkileşim yollarının ve örtüşen sitokin ağlarının gelecekte daha derinlemesine araştırılmasını gerektirmektedir. En dikkat çekici teknik kısıtlama, ilaçsız yamaların veya akupunktur noktası dışındaki bölgelerin kullanıldığı özel bir plasebo (sham) akupunktura yapıştırma kontrol grubunun yokluğudur. Sonuç olarak; tıraşlamadan kaynaklanan mekanik stres, deneysel müdahaleler ve yamanın kendisinin neden olduğu yapışkan uyarımı gibi potansiyel spesifik olmayan karıştırıcı faktörler, KAST'ın spesifik terapötik özelliklerinden tamamen ayrıştırılamamaktadır. Bu eksiklikleri gidermek adına, gelecekteki araştırma süreçlerimize, bu bulguların spesifitesini ve tekrarlanabilirliğini daha da pekiştirmek için titizlikle tasarlanmış plasebo kontrolleri ve çoklu yol doğrulamaları kesin olarak dahil edilecektir. BIBN-4096 müdahalesi sonrası gözlemlenen CGRP protein seviyelerindeki azalmaya gelince, BIBN-4096'nın doğrudan bir CGRP sentez inhibitöründen ziyade öncelikle RAMP1/CRLR reseptör kompleksini hedefleyen kompetitif bir antagonist olarak işlev gördüğünün, ancak in vivo uygulamasının lokal ligand doku birikimini azaltabileceğinin açıklığa kavuşturulması kritik önem taşımaktadır. Bu ikincil fenomen, muhtemelen nöro-immün pozitif geri besleme döngüsünün bozulması yoluyla gerçekleşmektedir. BIBN-4096, ILC2'ler gibi hedef immün hücreler üzerindeki RAMP1'i bloke ederek efektör sitokinlerin aşağı akış salınımını baskılar; bu da duyusal sinir terminallerinin ve pulmoner nöroendokrin hücrelerin (PNECs) retrograd inflamatuar aktivasyonunu azaltarak dolaylı yoldan aşağı akış CGRP sentezini ve dokuda tutulumunu zayıflatır.
Özetle, ampirik bulgularımız KAST'nin, nöral CGRP/RAMP1 aksını hedefleyerek pulmoner innate immün mikroçevreyi etkili bir şekilde yeniden şekillendirdiğini göstermektedir. Kemirgenler ve insanlar arasındaki biyolojik farklılıklar nedeniyle doğrudan klinik ekstrapolasyonun dikkatli bir optimizasyon gerektirdiğinin farkında olsak da, bu uç noktalar, geleneksel "Fei Wai He Pi Mao" (Akciğerin deri ve tüylerle birleşmesi) teorisini kanıtlayan, daha önce eksik olan kritik bir mekanistik temel sağlamaktadır. Geliştirilmiş bir nöro-immün perspektif sunan bu protokol, alerjik astım yönetimi için geleneksel herbal akupunktur yapıştırma tedavilerinin gelecekteki prospektif, çok merkezli klinik translasyonlarına rehberlik edecek ve destekleyecek güvenilir bir bilimsel baz oluşturmaktadır.
Açıklamalar
Yazarlar beyan edecek herhangi bir çıkar çatışmasına sahip değildir.
Teşekkürler
Bu çalışma; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82274632), Jiangsu Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı Önde Gelen Yetenekler Yetiştirme Projesi (No. SLJ0309), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (No. BK20231381), Jiangsu Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı Bilim ve Teknoloji Geliştirme Planı Projesi (No. ZT202205) ve Nanjing Çin Tıbbı Üniversitesi bünyesindeki Eğitim Bakanlığı Akupunktur ve Tıp Araştırmaları Ana Laboratuvarı (No. AML202304) tarafından desteklenmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 3M Medical Nefes Alabilen Bant | 3M, USA | 1530C | Yamanın sabitlenmesi |
| Asetilkolin klorür | Sigma-Aldrich, USA | A6625 | Bronşiyal provokasyon |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, USA | G2939BA | RNA kalite ve bütünlük değerlendirmesi |
| Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, USA | (custom order) | İmmünofloresan (sekonder) |
| Alüminyum hidroksit | Sigma-Aldrich, USA | 239186 | Adjuvan |
| Anti-CGRP antikoru (tavşan) | Abcam, UK | ab81887 | Western blot / IF |
| BALB/c fare (dişi, SPF, 8–10 hafta, 18–22 g) | Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd. | B202407260106 | Hayvan modeli |
| BB700 sıçan anti-fare CD90.2 (klon 53-2.1) | BD Biosciences, USA | 566465 | Akış sitometrisi |
| BD FACSCanto II akış sitometresi | BD Biosciences, USA | FACSCanto II | Akış sitometrisi |
| BIBN-4096 (Olcegepant hidroklorür) | MedChemExpress LLC, USA | HY-10095A | CGRP reseptör antagonisti |
| Biotin-Lineage Kokteyli | BD Biosciences, USA | (Customized, clones as described) | Akış sitometrisi |
| Brilliant Violet 605 Streptavidin | BD Biosciences, USA | 563260 | Akış sitometrisi |
| BSA Albumin Fraksiyon V | BioFroxx (neoFroxx GmbH), Germany | 4240GR100 | Bloklama |
| Kalsitonin/CALCA proteini | MedChemExpress LLC, USA | HY-P77587 | CGRP müdahalesi |
| CD11c/ITGAX antikoru (tavşan) | Abmart, Shanghai, China | MU115408S | İmmünofloresan |
| Sitratt antijen geri kazanım tamponu | Boster, China | AR0024 | İmmünohistokimya |
| DAPI Boyama Solüsyonu | Beyotime, Shanghai, China | C1006 | Nükleer boyama |
| ddH2O (Çift distile su) | Sigma-Aldrich, USA | 10977015 | Protein rekonstitüsyonu ve toz çözünmesi |
| DESeq2 | Bioconductor (R package) | Version 1.42.0 | Diferansiyel ekspresyon analiz yazılımı |
| DNaz I | Roche Diagnostics, Germany | 10104159001 | Akciğer dokusu sindirimi |
| Eşek Anti-Fare IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam, UK | ab150106 | İmmünofloresan (sekonder) |
| ECL Substrat (Super Femto) | Nanjing Lanken Biotech, China | – | Western blot kemilüminesansı |
| Geliştirilmiş BCA Protein Analiz Kiti | Beyotime, Shanghai, China | P0010 | Protein kantifikasyonu |
| Eozin Y Boyama Solüsyonu | Sigma-Aldrich, USA | HT110216 | Histoloji (HE boyama) |
| Etanol (Mutlak, Analitik Derece) | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10009218 | Doku dehydrasyonu ve histoloji |
| F4/80 antikoru (fare, klon C-7) | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-377009 | İmmünofloresan |
| fastp | Open Source (GitHub) | Version 0.23.4 | RNA-seq ham veri kalite kontrol yazılımı |
| FITC anti-fare CD45 (klon 30-F11) | BD Biosciences, USA | 553080 | Akış sitometrisi |
| FlowJo | BD Biosciences, USA | 10 | Akış sitometrisi analizi |
| GAPDH monoklonal antikoru (fare) | Proteintech, Wuhan, China | 60004-1-Ig | Western blot |
| GATA3 antikoru (fare, klon L50-823) | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-268 | İmmünofloresan |
| Ghost Dye Red 780 | Tonbo Biosciences, USA | 13-0865-T100 | Ölü hücre dışlanması |
| Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Cross-Adsorbed Sekonder Antikor | Thermo Fisher Scientific, USA | A11008 | İmmünofloresan (sekonder) |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, USA | 10.1.2 | İstatistiksel analiz |
| Hematoksilen Solüsyonu (Harris) | Sigma-Aldrich, USA | HHS16 | Histoloji (HE boyama) |
| HISAT2 | Johns Hopkins University (Open Source) | Version 2.2.1 | RNA-seq referans genom hizalama yazılımı |
| HRP-konjuge Keçi Anti-Fare IgG (H+L) | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-1 | Western blot (sekonder) |
| HRP-konjuge Keçi Anti-Tavşan IgG (H+L) | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-2 | Western blot (sekonder) |
| HTSeq-count | EMBL (Python utility) | Version 2.0.3 | RNA-seq genomik özellik okuma-sayma aracı |
| Hidrojen Peroksit (H2O2, %3 Solüsyon) | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | Endojen peroksidaz bloklaması |
| iFluor™ 488 Konjuge Keçi anti-tavşan IgG Antikoru | Huabio, China | HA1121 | İmmünofloresan (sekonder) |
| IL-4 Monoklonal antikoru | Proteintech, Wuhan, China | 66142-1-Ig | Western blot |
| IL13 Antikoru | Affinity Biosciences, USA | DF6813 | Western blot |
| IL5 Antikoru | Affinity Biosciences, USA | AF5123 | Western blot |
| Illumina Novaseq 6000 | Illumina, USA | – | RNA sekanslama |
| ImageJ | NIH, USA | 1.8 | Western blot kantifikasyonu |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, USA | Version 6.0 | Görüntü optik yoğunluk kantifikasyonu |
| KAST bitkisel formülasyonu | Pharmacy Department, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine | – | Müdahale |
| KLRG1 Monoklonal Antikor (2F1) | Thermo Fisher Scientific, USA | 58-5893-82 | İmmünofloresan |
| Leica LAS X | Leica Microsystems, Germany | 4.5 | İmmünofloresan kantifikasyonu |
| Leica STELLARIS 8 DIVE konfokal mikroskobu | Leica Microsystems, Germany | STELLARIS 8 | İmmünofloresan görüntüleme |
| Liberase TM | Roche Diagnostics, Germany | 5401119001 | Akciğer dokusu sindirimi |
| Marker (Ön boyalı Protein Merdiveni) | NCM Biotech, Suzhou, China | P9001 | Western blot |
| Fare CGRP ELISA kiti | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF2491-A | ELISA |
| Fare IL-13 ELISA kiti | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02456M1 | ELISA |
| Fare IL-4 ELISA kiti | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02448M1 | ELISA |
| Fare IL-5 ELISA kiti | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-11729M1 | ELISA |
| Nötr balsam montaj ortamı | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10014061 | Histoloji lam montajı |
| Normal keçi serumu (bloklama için) | Abcam, UK | ab7481 | İmmünohistokimya/IF bloklaması |
| OCT gömme bileşiği | Sakura, USA | 4583 | Kriyoseksiyon gömme |
| Tek Adımlı PAGE Jel Hızlı Hazırlama Kiti | Vazyme, Nanjing, China | E303-01 | SDS-PAGE jel hazırlama |
| Ovalbumin (OVA) | Sigma-Aldrich, USA | A5503 | Sensitizasyon/challenge |
| Paraformaldehit (PBS içinde %4) | Biosharp, China | BL539A | Doku fiksasyonu |
| PE anti-fare/insan KLRG1 (klon 2F1) | BD Biosciences, USA | 564022 | Akış sitometrisi |
| Fosfataz inhibitör kokteyli (50×) | Beyotime, Shanghai, China | P1092 | Protein ekstraksiyonu |
| Poly-L-lizin solüsyonu | Boster, China | AR0003 | Histoloji lam kaplama |
| Proteinaz ve fosfataz inhibitörü | NCM Biotech, Suzhou, China | P002 | Protein ekstraksiyonu |
| PVDF membran (0.22 μm) | Merck Millipore, USA | ISEQ00010 | Western blot |
| RAMP1 poliklonal antikoru (tavşan) | Proteintech, Wuhan, China | 10327-1-AP | İmmünofloresan |
| Kırmızı kan hücresi (RBC) liz temponu | Beyotime, Shanghai, China | C3702 | Akış sitometrisi örnek hazırlama |
| RIPA liz tamponu (Güçlü) | Beyotime, Shanghai, China | P0013B | Protein ekstraksiyonu |
| RPMI-1640 medyumu | Thermo Fisher Scientific, USA | 11875093 | Doku hücresi sindirim tabanı |
| SuperKine™ Geliştirilmiş Antifade Montaj Ortamı | Wuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd. | BMU104 | İmmünofloresan montaj |
| Triton X-100 (Deterjan) | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | İmmünofloresan permeabilizasyon |
| TRIzol reaktifi | Thermo Fisher Scientific, USA | 15596026 | RNA ekstraksiyonu |
| VAHTS Universal V10 RNA-seq Kütüphane Hazırlama Kiti | Vazyme, Nanjing, China | NR605-01 | RNA-seq kütüphanesi oluşturma |
| Tüm vücut pletismografi sistemi | Guangyuanda, Beijing, China | WBP-4 | Akciğer fonksiyonu (Penh) |
| Ksilen (Analitik Derece) | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10023418 | Deparafinizasyon ve şeffaflaştırma |
Kaynaklar
- Chinese guidelines for the diagnosis and treatment of allergic asthma (2019, the first edition). Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2019;58(9):636-55.
- Huang K, et al. Prevalence, risk factors, and management of asthma in China: a national cross-sectional study. LANCET. 2019;394(10196):407-18.
- Zhou J, et al. Characteristics of different asthma phenotypes associated with cough: a prospective, multicenter survey in China. Respir Res. 2022;23(1):243.
- Venkatesan P. 2023 GINA report for asthma. Lancet Respir Med. 2023;11(7):589.
- Schatz M, Rosenwasser L. The allergic asthma phenotype. J Allergy Clin Immunol Pract. 2014;2(6):645-8; quiz 9.
- Reddel HK, et al. Global Initiative for Asthma Strategy 2021: executive summary and rationale for key changes. Eur Respir J. 2022;59(1).
- Smith SG, et al. Increased numbers of activated group 2 innate lymphoid cells in the airways of patients with severe asthma and persistent airway eosinophilia. J Allergy Clin Immunol. 2016;137(1):75-86.e8.
- Mu JX, et al. Effects of fermented white mustard seed plaster on airway immune balance and its inflammatory response mechanism in bronchial asthma rats. Zhen Ci Yan Jiu. 2025;50(3):287-94.
- Zhao SM, et al. Anti-asthma components and mechanism of Kechuanting acupoint application therapy: based on serum metabolomics and network pharmacology. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(24):6780-93.
- Hu J, et al. A systematic review and meta-analysis of acupoint application combined with western medicine therapy in the treatment of bronchial asthma. Ann Palliat Med. 2021;10(11):11473-81.
- Hu W, et al. Study on Raman spectroscopy evaluating the contact dermatitis produced by acupoint sticking during treating bronchial asthma. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2022;37(3):1830-3.
- Wang H, et al. Effect of Acupoint Application Induced Contact Dermatitis on Asthma Control and Serum IFN-gamma/IL-4 in Asthmatic Patients. Journal of Traditional Chinese Medicine. 2018;59(7):582-5.
- Yang Q, et al. Modulation of helper T cell 2 cytokines in asthmatic rats by acupoint application with ginger juice hydrogel. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2024;39(6):3068-72.
- Wang Y, et al. Effects of Baijiezi Powder and Its Disassembled Formula on the Ig-E,IL-4,IFN-gamma and TNF-alpha in Allergic Asthmatic Rats. Chinese Pharmaceutical Journal. 2019;54(18):1491-6.
- Guidelines for the prevention and management of bronchial asthma (2024 edition). Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2025;48(3):208-48.
- Boonpiyathad T, Sözener ZC, Satitsuksanoa P, Akdis CA. Immunologic mechanisms in asthma. Semin Immunol. 2019;46:101333.
- Klein Wolterink RG, et al. Pulmonary innate lymphoid cells are major producers of IL-5 and IL-13 in murine models of allergic asthma. Eur J Immunol. 2012;42(5):1106-16.
- Christianson CA, et al. Persistence of asthma requires multiple feedback circuits involving type 2 innate lymphoid cells and IL-33. J Allergy Clin Immunol. 2015;136(1):59-68.e14.
- Kabata H, Artis D. Neuro-immune crosstalk and allergic inflammation. J Clin Invest. 2019;129(4):1475-82.
- Wallrapp A, et al. Calcitonin Gene-Related Peptide Negatively Regulates Alarmin-Driven Type 2 Innate Lymphoid Cell Responses. Immunity. 2019;51(4):709-23.e6.
- Nagashima H, et al. Neuropeptide CGRP Limits Group 2 Innate Lymphoid Cell Responses and Constrains Type 2 Inflammation. Immunity. 2019;51(4):682-95.e6.
- Shi K, et al. Optimization of acupoint application scheme in the treatment of bronchial asthma based on the orthogonal design method. Zhongguo Zhen Jiu. 2017;37(6):571-5.
- Hu J, et al. Components of drugs in acupoint sticking therapy and its mechanism of intervention on bronchial asthma based on UPLC-Q-TOF-MS combined with network pharmacology and experimental verification. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(5):1359-69.
- Li Y, et al. Kinetics of the accumulation of group 2 innate lymphoid cells in IL-33-induced and IL-25-induced murine models of asthma: a potential role for the chemokine CXCL16. Cell Mol Immunol. 2019;16(1):75-86.
- Xu J, et al. Excess neuropeptides in lung signal through endothelial cells to impair gas exchange. Dev Cell. 2022;57(7):839-53.e6.
- Patel VH, et al. Current Limitations and Recent Advances in the Management of Asthma. Dis Mon. 2023;69(7):101483.
- Farinha I, Heaney LG. Barriers to clinical remission in severe asthma. Respir Res. 2024;25(1):178.
- Zhao SM, et al. Repeated Herbal Acupoint Sticking Relieved the Recurrence of Allergic Asthma by Regulating the Th1/Th2 Cell Balance in the Peripheral Blood. Biomed Res Int. 2020;2020:1879640.
- van Rijt L, von Richthofen H, van Ree R. Type 2 innate lymphoid cells: at the cross-roads in allergic asthma. Semin Immunopathol. 2016;38(4):483-96.
- Cortez VS, Robinette ML, Colonna M. Innate lymphoid cells: new insights into function and development. Curr Opin Immunol. 2015;32:71-7.
- Thio CL, Chang YJ. The modulation of pulmonary group 2 innate lymphoid cell function in asthma: from inflammatory mediators to environmental and metabolic factors. Exp Mol Med. 2023;55(9):1872-84.
- Kubo M. Innate and adaptive type 2 immunity in lung allergic inflammation. Immunol Rev. 2017;278(1):162-72.
- Kabata H, Moro K, Koyasu S, Asano K. Group 2 innate lymphoid cells and asthma. Allergology International. 2015;64(3):227-34.
- Cardoso V, et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 2017;549(7671):277-81.
- Xie X, et al. Mediation of the JNC/ILC2 pathway in DBP-exacerbated allergic asthma: A molecular toxicological study on neuroimmune positive feedback mechanism. J Hazard Mater. 2024;465:133360.