Kechuanting Akupunktur Noktası Yapıştırma Terapisi, ILC2 Sayısını Modüle Ederek Alerjik Astımlı Farelerde Tip 2 Hava Yolu Enflamasyonunu Hafifletir

Qiu Yue Zhao; Yong Lin Chen; Jing Jing Yang; Shao Bo Guo; Wan Qi Shao; Zhong Yi Wang; Yi Lu; Shu Mei Zhao; Xiao Yan Gong; Meng Cao; Lan Ying Liu

doi:10.3791/71749

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Kechuanting Akupunktur Noktası Yapıştırma Terapisi, ILC2 Sayısını Modüle Ederek Alerjik Astımlı Farelerde Tip 2 Hava Yolu Enflamasyonunu Hafifletir

108 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71749

⸱

1 Eylül 2026

Qiu Yue Zhao^*¹^,² , Yong Lin Chen^*¹^,² , Jing Jing Yang¹^,² , Shao Bo Guo¹^,² , Wan Qi Shao¹^,² , Zhong Yi Wang¹^,² , Yi Lu¹^,² , Shu Mei Zhao¹ , Xiao Yan Gong¹^,³ , Meng Cao⁴ , Lan Ying Liu¹^,²

¹Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, ²Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of the Ministry of Education, Nanjing University of Chinese Medicine, ³First Clinical Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, ⁴Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine

^* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, kalsitonin gen ilişkili peptid (CGRP)/reseptör aktivite modifiye edici protein 1 (RAMP1) yolu üzerinden pulmoner Grup 2 doğal lenfoid hücrelerini (ILC2'ler) modüle ederek, Kechuanting Akupunktur Noktası Yapıştırma Tedavisinin (KAST) tip 2 hava yolu inflamasyonu üzerindeki terapötik mekanizmalarını değerlendirmek amacıyla bir ovalbumen (OVA)-indüklenmiş alerjik astım (AA) fare modelinin oluşturulmasını açıklamaktadır.

Özet

Kechuanting Akupunktur Noktası Yapıştırma Terapisi'nin (KAST), alerjik astımlı (AA) hastalarda hava yolu inflamasyonunu etkili bir şekilde iyileştirdiği gösterilmiştir; ancak, altında yatan mekanizmalar henüz aydınlatılmamıştır. Bu çalışma, KAST'nin bir AA fare modelindeki terapötik mekanizmalarını nöro-immün bir bakış açısıyla araştırmayı amaçlamıştır. Ovalbumin (OVA)-indüklü alerjik astım fare modeli oluşturulmuş ve farelere KAST uygulanmıştır. KAST'nin pulmoner Grup 2 doğal lenfoid hücreler (ILC2'ler) ve tip 2 hava yolu inflamasyonu üzerindeki etkileri; akış sitometrisi, hematoksilin-eozin (HE) boyama ve immünohistokimya kullanılarak değerlendirilmiştir. Akciğer dokularındaki kalsitonin gen ilişkili peptid (CGRP) protein seviyelerini belirlemek için Western blotting (WB) ve ELISA kullanılmıştır. CGRP/reseptör aktivite modifiye edici protein 1 (RAMP1) yolağının ILC2'ler ve tip 2 hava yolu inflamasyonu üzerindeki düzenleyici rolünü araştırmak için, alerjik astımlı farelere intranazal olarak CGRP veya CGRP reseptör inhibitörü BIBN-4096 uygulanmıştır. KAST, akciğer dokularındaki CGRP ekspresyonunun azalmasıyla birlikte, ILC2 sayısını azaltmış ve tip 2 hava yolu inflamasyonunu hafifletmiştir. İntranazal CGRP, akciğerlerdeki RAMP1⁺ILC2'leri ve toplam ILC2'leri artırarak tip 2 hava yolu inflamasyonunu şiddetlendirmiştir. Aksine, intranazal BIBN-4096 pulmoner ILC2'leri azaltmış ve tip 2 hava yolu inflamasyonunu hafifletmiştir. Farmakolojik inhibisyonla desteklendiği üzere, KAST alerjik astımda hava yolu inflamasyonunu azaltmakta olup, bu durum CGRP/RAMP1 yolağının downregülasyonu ve ardından pulmoner ILC2'lerin baskılanması ile yakından ilişkilidir.

Giriş

Alerjik astım (AA), Çin'deki tüm astım vakalarının %60–80'ini oluşturarak astımın en yaygın fenotipidir¹. Yüksek prevalansı ve hastaların yaşam kalitesini ciddi şekilde bozan ve önemli ekonomik yüklere neden olan suboptimal hastalık kontrolü ile karakterizedir²^,³^,⁴^,⁵. İnhale kortikosteroidler (ICS) klinik tedavinin temel taşı olmaya devam etse de⁶, bazı hastalar sınırlı yanıt göstermekte olup uzun süreli kullanım sıklıkla yan etkilerle ve hastalığın ilerlemesini durduramama durumuyla ilişkilendirilmektedir⁷. Bu nedenle, güvenli ve etkili yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi hem klinik hem de araştırma ortamlarında bir öncelik olmaya devam etmektedir. Geleneksel Çin tıbbına ait bir dış uygulama olan Kechuanting Akupunktura Yapıştırma Tedavisi (KAST), aktif bileşikleri transdermal olarak ileterek potansiyel olarak hepatik ilk geçiş etkisini önler ve sistemik yan etkileri minimize eder⁸^,⁹. Klinik çalışmalar, KAST'ın astım semptomlarını hafifletebileceğini, pulmoner fonksiyonun bir kısmını geri kazandırabileceğini ve hastaların yaşam kalitesini artırabileceğini göstermiştir¹⁰^,¹¹^,¹². Eş zamanlı olarak, serum metabolomikleri, ağ farmakolojisi ve astım modelleri kullanılarak yapılan hayvan çalışmaları; KAST'ın, IgE, IL-4 ve IL-13 ekspresyonunun downregülasyonu da dahil olmak üzere, serum ve bronkoalveoler lavaj sıvısı (BALF) düzeylerindeki inflamatuar medyatörleri azaltarak hava yolu inflamasyonunu hafiflettiğini öne sürmektedir⁹^,¹³^,¹⁴. Toplu olarak bu bulgular, KAST'ın astımdaki terapötik etkinliği için destekleyici kanıtlar sunmaktadır. Ancak, kesin etki mekanizmaları henüz netlik kazanmamıştır.

AA nüksünü tetikleyen temel patolojik mekanizmalardan biri, grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin (ILC2'ler) kilit rol oynadığı tip 2 havayolu inflamasyonudur¹⁵. Alerjen stimülasyonu üzerine ILC2'ler, IL-5 ve IL-13 gibi sitokinler salgılayarak havayolu inflamasyonunu tetikler¹⁶^,¹⁷. Çalışmalar, ILC2'lerin tüketilmesinin astımlı farelerde havayolu inflamasyonunu önemli ölçüde hafiflettiğini göstermiş ve hastalık progresyonundaki merkezi rollerini vurgulamıştır¹⁸. Özellikle ILC2'lerin aktivasyonu ve fonksiyonu birden fazla mekanizma tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmektedir ve nöro-immün etkileşimler son yıllarda giderek daha fazla dikkat çekmektedir. Ortaya çıkan kanıtlar, kalsitonin gen ilişkili peptidin (CGRP), ILC2'lerin yüzeyindeki reseptör aktivite düzenleyici protein 1'e (RAMP1) bağlanarak aktivasyonlarını ve ardından tip 2 sitokinlerin salınımını indükleyebildiğini, bunun da AA'da havayolu inflamasyonunu ağırlaştırdığını göstermektedir¹⁹^,²⁰^,²¹. Mevcut çalışmada, yüksek kapasiteli RNA dizileme (RNA-seq) taramamız, CGRP'yi KAST müdahalesi tarafından yoğun şekilde modüle edilen kritik derecede duyarlı bir nöropeptid olarak tanımlamıştır. Bu nedenle, CGRP/RAMP1 yoluna odaklanarak, ILC2 aktivitesini modüle etme ve tip 2 havayolu inflamasyonunu hafifletmedeki potansiyel mekanizmalarını araştırmak için AA farelerinde KAST'ı bir müdahale olarak kullandık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, National Academies of Sciences tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol, Nanjing Çin Tıbbı Üniversitesi Bağlı Hastanesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (onay No. 2023DW-059-01). Bu çalışmada kullanılan tüm malzemelerin, reaktiflerin, araçların ve yazılımların kapsamlı bir listesi Malzemeler Tablosu'nda ayrıntılı olarak verilmiştir.

Deney hayvanları ve gruplandırma

Sağlıklı dişi BALB/c fareler (SPF sınıfı, 8–10 haftalık), Nanjing Çin Tıbbı Üniversitesi Deney Hayvanları Merkezi'nden (lisans No. SYXK (Su) 2018-0049) temin edildi. Hayvanlar, 24–26 °C sıcaklıkta, 12 saatlik ışık/karanlık döngüsü içeren standart koşullar altında barındırıldı. Steril yem ve suya ad libitum olarak erişim sağlandı, altlıklar düzenli olarak değiştirildi ve kafesler rutin olarak temizlendi. 7 günlük adaptasyon süresinin ardından fareler rastgele altı gruba ayrıldı (n = 7/grup): Normal grup, model grup, CGRP grubu, BIBN-4096 grubu, KAST grubu ve KAST + CGRP grubu. Hayvanlar, bilgisayar tarafından oluşturulan rastgele bir sayı tablosu kullanılarak gruplara atanmış oldu. Grup dağılımı, müdahaleler atanana kadar araştırmacılardan gizlendi. Doku kullanımını optimize etmek amacıyla, randomize edilmiş kohorttan (grup başına n = 7) alınan akciğer örnekleri sistematik olarak farklı işlem yollarına ayrıldı; spesifik histolojik ve moleküler analizler için kullanılan kesin analiz edilen örnek boyutları (n = 5, 4 veya 3), ilgili şekil alt yazılarında açıkça belirtilmiştir. Analiz dışı bırakılan herhangi bir veri bulunmamaktadır.

KAST formülasyonunun hazırlanması

Formülasyon, Nanjing Çin Tıbbı Üniversitesi Bağlı Hastanesi Eczacılık Bölümü tarafından hazırlanmıştır²². Dokuz geleneksel Çin tıbbi bitkisi kullanılmıştır: Semen Brassicae (2 kısım), Rhizoma Corydalis (2 kısım), sirke ile işlenmiş Radix Kansui (1 kısım), Asarum (1 kısım), Ephedra (1 kısım), Semen Lepidii (1 kısım), Karanfil (1 kısım), Tarçın kabuğu (1 kısım) ve Gleditsia sinensis (1 kısım). Her bir bitki ince toz haline getirilmiş ve 80 mesh'lik bir elekten geçirilmiştir. Her 100 g karışık toz için 70 mL taze zencefil suyu ve 30 mL sıvı parafin eklenmiş, iyice karıştırılmış ve 0,5 cm çapında 0,3 g ± %5'lik yamalar haline getirilmiştir. Özellikle, tüm bitkisel içerikler ve taze zencefil, Baş Eczacı Lin-gang Zhao tarafından onaylanmış ve kullanım öncesinde 4 °C'de, karanlık ve kuru bir ortamda saklanmıştır⁹. Müdahale tekrarlanabilirliğini ve partiler arası stabiliteyi garanti etmek için, ekibimizin oluşturduğu UPLC-Q-TOF-MS ve HPLC yöntemlerine dayalı titiz bir kalite kontrol standardı uygulanmış ve sinapine thiocyanate gibi temel aktif markerların tutarlı varlığı doğrulanmıştır²³. Uygulamada, optimal transdermal iletimi sağlamak amacıyla 0,5 cm'lik yamalar, 2,5 cm × 5,5 cm boyutlarında tıbbi, nefes alabilen hipoalerjenik yapışkan bant kullanılarak sabitlenmiştir.

AA fare modelinin oluşturulması

AA modeli, literatürdeki yerleşik bir protokole uygun olarak OVA duyarlılığı ve intranazal challenge yöntemi kullanılarak oluşturulmuştur²⁴. Normal grup hariç tüm fareler, 0. ve 12. günlerde 100 µg OVA ve 2 mg alüminyum hidroksit içeren 200 µL salinle intraperitonyal enjeksiyon yapılarak duyarlı hale getirilmiştir. 18. günden 23. güne kadar farelere, günde bir kez 50 µL salin içinde 50 µg OVA ile intranazal challenge uygulanmıştır. 24. günden 53. güne kadar, gün aşırı olarak intranazal OVA uygulanmıştır. 54. günde, fareler tartıldıktan sonra servikal dislokasyon yoluyla ötanazi gerçekleştirilmiş ve dokular toplanmıştır. Ardından, toplam akciğer ağırlığının vücut ağırlığına bölünmesiyle akciğer katsayısı belirlenmiştir.

Müdahaleler

40. ile 53. günler arasında, KAST grubu ve KAST + CGRP grubu farelerinin 3 cm × 6 cm'lik dorsal alanı tıraşlandı. Bilateral Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) ve Shenshu (BL23) akupunktur noktalarının üzerine yamalar uygulandı ve bu yamalar 14 gün boyunca günde bir kez 1,5 saat boyunca yapışkan bantla sabitlendi. CGRP ve KAST + CGRP gruplarındaki farelere, 40. günden 53. güne kadar gün aşırı olarak 10 µL Kalsitonin/CALCA çözeltisi (1 pg/µL) intranazal olarak verildi. BIBN-4096 grubundaki farelere, gün aşırı 10 µL BIBN-4096 çözeltisi (0,3 mg/mL, CGRP reseptör antagonisti) intranazal olarak uygulandı. Normal ve model grupları müdahale olmaksızın standart besleme ile beslendi. KAST, alerjik havayolu inflamasyonunun oluşumundan sonra (18. gündeki ilk OVAye maruziyetten 22 gün sonrası olan 40. günde başlayarak) 40. günden 53. güne kadar uygulandı. Bu nedenle, bu çalışmadaki KAST, profilaktik bir müdahaleden ziyade terapötik bir müdahale olarak uygulanmıştır.

Cilt hazırlığı için, belirlenen dorsal bölgedeki tüyler elektrikli tüy alma makinesi kullanılarak temizlendi. Akupunktur noktalarının lokalizasyonunda, Çin Akupunktur-Moksibüsyon Derneği tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları için Akupunktur Noktalarının Standart Adlandırması ve Lokalizasyonu - Bölüm 3: Fareler (T/CAAM 0002-2020) kılavuzuna kesin olarak bağlı kalındı. Bilateral dört çift dorsal bölge hassasiyetle işaretlendi ve şu şekilde tanımlandı: Feishu (BL13: 3. torakal vertebra spinöz çıkıntısının altındaki kaburgaların arası, posterior orta hattın 3 mm laterali), Geshu (BL17: 7. torakal vertebra spinöz çıkıntısının altı, orta hattın 3 mm laterali), Pishu (BL20: 12. torakal vertebra spinöz çıkıntısının altı, orta hattın 3 mm laterali) ve Shenshu (BL23: 2. lomber vertebra spinöz çıkıntısının altı, orta hattın 3 mm laterali). 1.5 h süren tutma süresi boyunca yamanın kaymasını veya ikincil cilt erozyonunu önlemek amacıyla, stabil bir yapışma sağlamak için 3M bant sıkıca sarıldı.

CGRP/CALCA (1 pg/µL, fare başına 10 µL) ve BIBN-4096 (0,3 mg/mL, fare başına 10 µL) dozları, yayınlanmış çalışmalara²⁵ dayanarak seçilmiştir. Spesifik olarak, CGRP müdahalesi için, 1 mg BSA'nın 1 mL ddH₂O içinde çözülmesiyle %0,1'lik bir BSA çözeltisi hazırlanmış ve final konsantrasyonun 1 mg/mL olması için vorteks uygulanmıştır. Rekonstitüsyon öncesinde, liyofilize Kalsitonin/CALCA protein tozu, 4 °C'de 30 s boyunca 12.000 × g hızında santrifüj edilmiştir. Ardından, 1 µg/µL'lik bir stok çözelti elde etmek için hazırlanan %0,1'lik BSA çözeltisinden 20 µL eklenmiştir. Protein rekonstitüsyonunun tam gerçekleşmesini sağlamak için vial nazikçe birkaç kez ters yüz edilmiş (vorteks uygulanmadan), birkaç saniye santrifüjle çöktürülmüş ve oda sıcaklığında birkaç dakika bekletilmiştir. Yönetilemeyecek kadar büyük bir tek aşamalı hacim oluşturmadan 1 pg/µL'lik çalışma çözeltisini hazırlamak için standart iki aşamalı seri dilüsyon uygulanmıştır: Öncelikle, 1 ng/µL'lik bir ara çözelti formüle etmek için 1 µg/µL'lik stok çözeltiden 1 µL, 999 µL steril salin içinde dilüye edilmiş ve ardından bu ara çözeltiden 1 µL, final 1 pg/µL'lik çalışma çözeltisini elde etmek için başka bir 999 µL steril salin ile karıştırılmıştır. Çalışma çözeltisi 4 °C'de tutulmuş, kalan alikotlar ise -20 °C'de 2-3 aya kadar saklanmıştır. BIBN-4096 grubu için, 3 mg/mL'lik bir stok çözelti elde etmek amacıyla 1 mg BIBN-4096 tozu, 333 µL ddH₂O içinde çözülmüş, vial başına 50 µL'lik alikotlara ayrılmış ve -80 °C'de saklanmıştır. 0,3 mg/mL'lik çalışma çözeltisini hazırlamak için, stok çözeltinin her 50 µL'lik alikotu 450 µL steril salin ile iyice karıştırılmıştır. 40. günden 53. güne kadar, her bir fareye gün aşırı olarak, anestezi uygulanmadan nazikçe sabitlenmiş halde 10 µL hacminde 1 pg/µL CGRP çözeltisi veya 0,3 mg/mL BIBN-4096 çözeltisi intranazal olarak uygulanmıştır.

Sonuç ölçümleri ve tespit yöntemleri

Davranışsal testler

Son intranazal maruziyetin ardından 53. günde, burun kaşıma ve hapşırma epizotlarının frekansları bir dijital video sistemi kullanılarak 10 dakikalık bir süre boyunca izlendi ve kaydedildi. Videolardaki davranış frekansları, iki araştırmacı tarafından çift-kör yöntemle bağımsız olarak sayıldı. Sayımlar arasında önemli bir tutarsızlık olması durumunda, video üçüncü bir araştırmacı tarafından yeniden değerlendirildi ve istatistiksel analiz için nihai olarak en yüksek tutarlılığa sahip veriler seçildi.

Bronşiyal provokasyon testi

Son challenge sonrası 24 saat içerisinde, 0, 5, 10, 20 ve 40 mg/mL konsantrasyonlarda nebülize asetilkolin (ACh) kullanılarak (konsantrasyon başına 300 µL, 1 dk boyunca nebülize edilerek) hava yolu yanıtı değerlendirildi. Hava yolu daralmasını ampirik olarak belirtmek ve hava yolu hiperreaktivitesini (AHR) değerlendirmek için kullanılan boyutsuz bir indeks olan gelişmiş duraklama (Penh) değerleri, her nebülizasyondan sonra 5 dk boyunca non-invaziv tüm vücut pletismografisi kullanılarak kaydedildi. Fareler, kayıt öncesinde 10 dk boyunca hazneye alıştırıldı. Penh, ekspiratuar/inspiratuar süreyi ve pik akışları dengeleyen ampirik formüle göre, entegre manuel depolama/akış sistem yazılımı kullanılarak otomatik olarak hesaplandı.

Histopatoloji (HE boyama)

%4 paraformaldehit ile fikse edilen akciğer dokuları, dereceli bir alkol serisi ileydehidre edilmiş, ksilen ile şeffaflaştırılmış ve otomatik bir işlemci kullanılarak parafin bloklara gömülmüştür. Bloklar 4 µm kalınlığında kesilmiş, 42 °C'lik su banyosunda yüzdürülmüş ve cam slaytlara monte edilmiştir. Slaytlar 80 °C'de 2 saat boyunca fırınlanmış ve oda sıcaklığına soğutulmadan önce gece boyunca kurutulmuştur. Boyama için kesitler, ksilen ile deparafimize edilmiş (I ve II, her biri 20 dk), dereceli bir etanol serisi ile rehidre edilmiş (100% I/II ve 75%, her biri 5 dk) ve musluk suyu ile durulanmıştır. Slaytlar 3–5 dk boyunca hematoksilen ile boyanmış, %1'lik asit alkol ile diferansiye edilmiş ve bir maviye çevirme çözeltisinde mavileştirilmiştir. Yıkamanın ardından kesitler, %85 ve %95 etanol (her biri 5 dk) ileydehidre edilmiş ve 5 dk boyunca eozin ile karşı boyanmıştır. Son olarak slaytlar, mutlak etanolde (I, II ve III, her biri 5 dk)ydehidre edilmiş, ksilenle (I ve II, her biri 5 dk) şeffaflaştırılmış, nötr balsam ile kapatılmış ve havada kurutulmuştur. Görüntüler, bir ışık mikroskobu ve CaseViewer sistemi kullanılarak 200× büyütmede rastgele alanlardan yakalanmıştır. Akciğer inflamasyonu ve epitelyal kalınlaşma, 0–4 ölçeğinde körleme yöntemiyle derecelendirilmiştir: 0, inflamasyon yok; 1, nadir inflamatuar hücreler; 2, az sayıda (<3) inflamatuar odak; 3, çok sayıda (≥3) inflamatuar odak; 4, akciğer boyunca diffüz infiltrasyon. Epitelyal kalınlaşma şu şekilde skorlanmıştır: 0, normal; 1, belirgin kalınlaşma; 2, kısmi hava yolu kalınlaşması; 3, neredeyse tam tıkanma; 4, normal yapının kaybı. Her deney grubu için, ham histopatolojik skorları elde etmek amacıyla toplam 20 rastgele mikroskobik alan görüntülenmiş ve değerlendirilmiştir. Her dört alandan elde edilen veriler, tek bir bağımsız veri noktası oluşturmak için ortalaması alınmış ve istatistiksel analiz için grup başına n = 5 tekrar şeklinde nihai bir örneklem boyutu elde edilmiştir. Skorlama körleme yöntemiyle gerçekleştirilmiştir.

RNA-seq

Toplam RNA, üretici protokolüne uygun olarak TRIzol reaktifi kullanılarak fare akciğer dokularından ekstre edilmiştir. RNA saflığı, konsantrasyonu ve bütünlüğü, bir spektrofotometre ve mikroakışkan tabanlı bir platform kullanılarak değerlendirilmiştir. Transkriptom kütüphaneleri, ticari bir kütüphane hazırlama kiti kullanılarak oluşturulmuş ve 150 bp çift uçlu okumalar üretmek için yüksek kapasiteli bir dizileme platformunda dizilenmiştir. Ham veriler, temiz okumalar elde etmek amacıyla uygun filtreleme yazılımları ile kalite kontrolden geçirilmiş ve ekleme farkındalıklı (splice-aware) bir hizalama aracıyla referans genomla eşleştirilmiştir. Gen ekspresyon seviyeleri FPKM olarak hesaplanmış ve okuma sayıları bir okuma sayma aracıyla derlenmiştir. Diferansiyel ekspresyon analizi, eşik değerleri |log2 Fold Change| ≥ 1 ve düzeltilmiş p < 0,05 olarak belirlenmiş özel bir istatistik paketi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

ELISA

Taze fare akciğer dokuları hassas bir şekilde tartılmış ve 20 mg dokuya 200 µL tampon şeklinde kesin bir oranda PBS tamponunda homojenize edilmiştir. Protein süpernatanlarını toplamak için homojenatlar, 4 °C'de 10 dakika boyunca yaklaşık 13,400 × g hızında santrifüj edilmiştir. Normalizasyon için, süpernatanların ham protein içeriği BCA yöntemi kullanılarak kalibre edilmiştir. ELISA prosedürü, üretici protokolüne uygun olarak ticari kitler kullanılarak teknik üçte bir (triplicate) şeklinde gerçekleştirilmiştir. Kısaca, antikor kaplı 96 kuyucuklu plakalara 50 µL standart dilüsyon veya 50 µL ön seyreltilmiş örnek (5 katlık bir nihai dilüsyon elde etmek için 10 µL protein örneğinin 40 µL örnek dilüenti ile karıştırılmasıyla) eklenmiştir. Plakalar kapatılmış ve 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edilmiştir. 1:30 oranında seyreltilmiş yıkama tamponu ile beş kez yıkandıktan sonra, her kuyucuğa (boş kuyucuklar hariç) 50 µL enzim bağlı konjuge reaktif eklenmiş ve karışım 37 °C'de 30 dakika inkübe edilmiştir. Beş yıkama daha yapıldıktan sonra, her kuyucuğa 50 µL kromojen çözelti A ve 50 µL kromojen çözelti B eklenmiş ve plaka karanlıkta, 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edilmiştir. Reaksiyon, rengi maviden sarıya çeviren 50 µL durdurma çözeltisinin eklenmesiyle durdurulmuştur. Her kuyucuğun absorbsansı (OD değeri), 15 dakika içinde bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm'de ölçülmüştür. Dört parametreli lojistik veya doğrusal regresyon modeli (R² > 0.99 olacak şekilde) kullanılarak standart eğriler çizilmiş ve akciğer dokusu homojenatlarındaki hedef protein konsantrasyonları bu eğriler üzerinden hesaplanmıştır.

Akış sitometrisi

Akciğer dokuları eksize edildi, kıyıldı ve %10 FBS, 50 µL Liberase TM ve 5 µL DNase I içeren 5 mL RPMI-1640 içerisinde, 37 °C'de 80 rpm çalkalama ile 45 dakika boyunca digere edildi. Digere edilen süspansiyon 400-mesh hücre süzgecinden geçirildi ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 × g hızında santrifüjlendi. Pelet, oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika boyunca 2 mL eritrosit lizis tamponunda resüspande edildi. Yıkama işleminden sonra hücreler, ölü hücrelerin dışlanması için 4 °C'de karanlıkta 20 dakika boyunca Ghost Dye Red 780 (örnek başına 1.25 µL) ile resüspande edildi ve boyandı. Yıkamanın ardından hücreler, 4 °C'de 10 dakika boyunca 10 µL FcR Bloklama Reaktifi ile bloklandı. Ardından hücreler, 4 °C'de 30 dakika boyunca şu florokrom-konjuge antikorlarla yüzey boyamasına tabi tutuldu: FITC anti-mouse CD45 (0.5 µL), PE anti-mouse/human KLRG1 (1.25 µL), BB700 rat anti-mouse CD90.2 (0.5 µL) ve anti-mouse CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) (her biri 0.5 µL) ve anti-mouse CD19 (2 µL) içeren biyotinize lineage karışımı. Yıkama sonrası hücreler, 4 °C'de 30 dakika boyunca Brilliant Violet 605 Streptavidin (2 µL) ile inkübe edildi. Veriler bir BD akım sitometre platformunda elde edildi ve FlowJo yazılımı kullanılarak analiz edildi. Floresans taşma kompanzasyon matrisleri, cihazın kalibre edilmiş veri toplama yazılımı tarafından otomatik olarak izlendi ve ayarlandı. Pulmoner ILC2'leri tanımlamak için kullanılan hiyerarşik gating stratejisi sırasıyla şu şekilde uygulandı: önce forward/side scatter (FSC-A/SSC-A) morfolojisi aracılığıyla toplam lenfositler izole edildi ve ardından singlet gating (FSC-H/FSC-A) yoluyla dublet ayrımı yapıldı. Canlı hücreler daha sonra ölü hücre dışlaması (Ghost Dye^-) ile tanımlandı ve ardından CD45⁺ ve Lineage^- popülasyonlarını seçmek için standart gate'ler aşamalı olarak uygulandı. Canlı CD45⁺Lineage^-gating penceresi içerisinde pulmoner ILC2'ler, CD90.2⁺ ve KLRG1⁺ kümelerinin ardışık pozitif kaskad gate'lerine dayanarak açıkça tanımlandı ve sayıldı.

İmmünofloresans (IF)

Dondurulmuş akciğer kesitleri oda sıcaklığında 15–30 dk boyunca çözülmüş ve OCT bileşiğini uzaklaştırmak için PBST (0.05% Tween-20 içeren PBS) ile her biri 6 dk sürecek şekilde üç kez yıkanmıştır. Fazla sıvı kurutulduktan sonra, bir immünohistokimya kalemi kullanılarak doku etrafına hidrofobik bir bariyer çizilmiştir. Kesitler, %0.3 Triton X-100 ve %5 keçi serumu içeren bir bloklama ve permeabilizasyon tamponunda 37 °C'de 100 dk boyunca inkübe edilmiş, ardından primer antikor ile 4 °C'de gece boyu (16–20 sa) inkübasyona bırakılmıştır. Ertesi gün, kesitler oda sıcaklığında 30 dk boyunca dengelenmiş, PBST ile üç kez yıkanmış ve türle eşleşmiş florofor-konjuge sekonder antikor ile 37 °C'de karanlıkta 60–90 dk boyunca inkübe edilmiştir. Üç ek PBST yıkamasının ardından, çekirdekler oda sıcaklığında karanlıkta 8 dk boyunca DAPI (PBS içinde 1:1 veya 2:1 oranında seyreltilmiş) ile karşıt boyanmıştır. Son PBST yıkama turundan (3 × 6 dk) sonra, kesitler anti-fade montaj medyumu ile kapatılmış, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için mühürlenmiş ve karanlıkta saklanmıştır. Görüntüler, konfokal mikroskop kullanılarak 400× büyütmede yakalanmıştır. Alan başına pozitif hücre sayısı Leica LAS X yazılımı kullanılarak manuel olarak sayılmıştır. Ham hücre sayılarını elde etmek için her deney grubu için toplam 15 rastgele mikroskobik alan görüntülenmiştir. Tek bir bağımsız veri noktası elde etmek için her üç alanın verilerinin ortalaması alınmış ve böylece istatistiksel analiz için grup başına n = 5 tekerrürden oluşan nihai bir örneklem büyüklüğüne ulaşılmıştır. Sayım işlemi körleme yöntemiyle gerçekleştirilmiştir.

İmmünohistokimya (IHC)

Parafin kesitler, üç kez değiştirilen ksilenle (her biri 15 dk) deparafine edildi, dereceli bir etanol serisiyle (iki kez %100, %85 ve %75; her biri 5 dk) yeniden hidrate edildi ve distile su ile durulandı. Antijen geri kazanımı, bir düdüklü tencere kullanılarak sitrat tamponunda (pH 6.0) gerçekleştirildi (kaynama sonrası yüksek basınçta 3 dk), ardından soğutma ve PBS'de (pH 7.4) üç kez 5 dakikalık yıkama yapıldı. Endojen peroksidaz, oda sıcaklığında karanlıkta 15 dk boyunca %3 H₂O₂ ile bloke edildi. Yıkamanın ardından kesitler, hidrofobik bir kalemle çevrelendi ve %3 keçi serumu ile 30 dk boyunca bloke edildi. Kesitler daha sonra, PBS içinde dilüe edilmiş primer antikorlarla (anti-IL-4 (1:400), anti-IL-5 (1:300) veya anti-IL-13 (1:150)) 4 °C'de gece boyunca inkübe edildi. Ertesi gün, kesitler yıkandı ve HRP-konjuge sekonder antikorlar (IL-4 için anti-mouse; IL-5 ve IL-13 için anti-rabbit) ile oda sıcaklığında 50 dk boyunca inkübe edildi. Sinyaller, mikroskobik kontrol altında taze hazırlanmış DAB çözeltisi kullanılarak görselleştirildi ve musluk suyu ile sonlandırıldı. Son olarak kesitler hematoksilin ile karşıt boyandı, diferansiye edildi, mavileştirildi, dereceli alkoller ve ksilen iley dehidrate edildi ve mikroskobik inceleme için nötral balsam ile lamella ile kapatıldı. Ortalama optik yoğunluk (IOD/Alan), bir görüntü analiz yazılım platformu kullanılarak 200× büyütmede nicelendirildi. Her deneysel grup için, ham değerleri elde etmek amacıyla toplam 15 rastgele mikroskobik alan görüntülendi. Her üç alanın verileri, tek bir bağımsız veri noktası elde etmek için ortalandı ve böylece istatistiksel analiz için grup başına n = 5 tekrardan oluşan nihai bir örneklem büyüklüğü sağlandı. Puanlama, iki kör gözlemci tarafından gerçekleştirildi.

Western blot (WB)

Numune hazırlığı için, fare akciğer dokuları (yaklaşık 30 mg) ince kıyılmış ve %1 proteaz/fosfataz inhibitör kokteyli ile desteklenmiş, önceden soğutulmuş 300 µL RIPA lizis tamponu içinde homogenize edilmiştir. Homojenizasyon, bir doku homojenizörü kullanılarak 60 Hz'de dört döngü boyunca (döngü başına 60 s) gerçekleştirilmiştir. Ardından, süpernatantı toplamak için lizatlar yaklaşık 13.400 × g hızında, 4 °C'de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Toplam protein konsantrasyonları, standart bir BCA protein analiz kiti aracılığıyla belirlenmiştir. Numuneler daha sonra normalize edilmiş, 4:1 hacim oranında 5x yükleme tamponu ile karıştırılmış ve 95 °C'de 7 dakika boyunca denatüre edilmiştir. SDS-PAGE için, protein numuneleri (hat başına 20 µg) önceden boyanmış bir protein moleküler ağırlık markeri ile birlikte yüklenmiş, 80 V sabit voltajda 20 dakika boyunca ayrıştırılmış ve ardından 120 V'a ayarlanarak 70 dakika boyunca işleme devam edilmiştir. Proteinler daha sonra bir buz banyosunda 300 mA sabit akımda 120 dakika boyunca 0,22 µm PVDF membranlara ıslak transfer edilmiştir. Membranlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBST içinde %5 BSA ile bloke edilmiş ve CGRP (1:500) ve GAPDH (1:2000) karşıt primer antikorlar ile 4 °C'de gece boyunca (18 saate kadar) inkübe edilmiştir. Üç kez TBST ile yıkama işleminden sonra (her biri 10 dakika), membranlar oda sıcaklığında 1–2 saat boyunca horseradish peroksidaz konjugeli sekonder antikorlar (1:10000) ile inkübe edilmiştir. Diğer üç yıkama işleminin ardından, protein bantları bir VILBER Fusion FX görüntüleme sistemi içinde geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) substrat kullanılarak görselleştirilmiştir. Bant yoğunlukları ImageJ 1.8 kullanılarak nicelendirilmiş ve hedef protein ekspresyonu GAPDH iç kontrolüne göre normalize edilmiştir.

İstatistiksel analiz

Tüm deneysel veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edilmiştir. Veri analizi ve istatistiksel çizimler, özel bir istatistik yazılım platformu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Gruplar arası karşılaştırmalar öncesinde, veri setleri sistematik olarak normallik testine tabi tutulmuştur. Homojen varyanslara sahip normal dağılımlı veriler için tek yönlü veya iki yönlü varyans analizi (ANOVA) uygulanmış, ardından çoklu ikili karşılaştırmalar için Tukey, Šídák, Holm-Šídák veya Fisher'ın LSD post hoc testleri yapılmıştır. Birden fazla grubun tek bir kontrol grubuyla karşılaştırıldığı durumlarda Dunnett testi uygulanmıştır. Heterojen varyanslara sahip veri setleri için Brown-Forsythe ANOVA kullanılmış, ardından Dunnett's T3 post-hoc testi uygulanmıştır. Normalliğe uygun olmayan veri setleri için nonparametrik Kruskal-Wallis testi kullanılmış, ardından çoklu karşılaştırmalar için Dunn's post hoc testi yapılmıştır. P değeri < 0.05, istatistiksel olarak anlamlı farkları belirtmek için temel alınmıştır. Farklı anlamlılık düzeyleri dinamik olarak *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 ve ****p < 0.0001 şeklinde belirtilmiştir. Histolojik skorlama, akış sitometrisi analizi ve görüntü kantifikasyonu dahil olmak üzere tüm deneysel sonuç değerlendirmeleri tamamen körleme yöntemiyle yürütülmüştür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

KAST, pulmoner ILC2'leri azaltır ve tip 2 hava yolu inflamasyonunu hafifletir

KAST'nin terapötik etkilerini araştırmak için OVA ile indüklenmiş bir AA fare modeli oluşturuldu ve Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) ile Shenshu (BL23) akupunktur noktalarına yama uygulandı (Şekil 1A). Modelleme sonrası, AA farelerinde vücut ağırlığının azaldığı görülürken, KAST uygulanan farelerde model grubuna kıyasla vücut ağırlığının anlamlı derecede arttığı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

AA tedavisi, uzun süreli ilaç kullanımına bağlı yan etkiler, yetersiz semptom kontrolü ve sık tekrarlayan alevlenmeler dahil olmak üzere çeşitli kısıtlamalarla karşı karşıyadır. Konvansiyonel farmakoterapi etkili olsa da, genellikle steroid bağımlılığı gibi olumsuz sonuçlar eşlik etmektedir²⁶^,²⁷. Buna karşılık KAST, AA yönetimi için güvenli, ekonomik ve uygun bir alternatif sunmaktadır. Klinik kanıtlar, KAST'ın pulmoner immün fonksiyonu modüle ederek astım sempto...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar beyan edecek herhangi bir çıkar çatışmasına sahip değildir.

Teşekkürler

Bu çalışma; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82274632), Jiangsu Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı Önde Gelen Yetenekler Yetiştirme Projesi (No. SLJ0309), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (No. BK20231381), Jiangsu Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı Bilim ve Teknoloji Geliştirme Planı Projesi (No. ZT202205) ve Nanjing Çin Tıbbı Üniversitesi bünyesindeki Eğitim Bakanlığı Akupunktur ve Tıp Araştırmaları Ana Laboratuvarı (No. AML202304) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3M Medical Nefes Alabilen Bant	3M, USA	1530C	Yamanın sabitlenmesi
Asetilkolin klorür	Sigma-Aldrich, USA	A6625	Bronşiyal provokasyon
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, USA	G2939BA	RNA kalite ve bütünlük değerlendirmesi
Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific, USA	(custom order)	İmmünofloresan (sekonder)
Alüminyum hidroksit	Sigma-Aldrich, USA	239186	Adjuvan
Anti-CGRP antikoru (tavşan)	Abcam, UK	ab81887	Western blot / IF
BALB/c fare (dişi, SPF, 8–10 hafta, 18–22 g)	Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd.	B202407260106	Hayvan modeli
BB700 sıçan anti-fare CD90.2 (klon 53-2.1)	BD Biosciences, USA	566465	Akış sitometrisi
BD FACSCanto II akış sitometresi	BD Biosciences, USA	FACSCanto II	Akış sitometrisi
BIBN-4096 (Olcegepant hidroklorür)	MedChemExpress LLC, USA	HY-10095A	CGRP reseptör antagonisti
Biotin-Lineage Kokteyli	BD Biosciences, USA	(Customized, clones as described)	Akış sitometrisi
Brilliant Violet 605 Streptavidin	BD Biosciences, USA	563260	Akış sitometrisi
BSA Albumin Fraksiyon V	BioFroxx (neoFroxx GmbH), Germany	4240GR100	Bloklama
Kalsitonin/CALCA proteini	MedChemExpress LLC, USA	HY-P77587	CGRP müdahalesi
CD11c/ITGAX antikoru (tavşan)	Abmart, Shanghai, China	MU115408S	İmmünofloresan
Sitratt antijen geri kazanım tamponu	Boster, China	AR0024	İmmünohistokimya
DAPI Boyama Solüsyonu	Beyotime, Shanghai, China	C1006	Nükleer boyama
ddH2O (Çift distile su)	Sigma-Aldrich, USA	10977015	Protein rekonstitüsyonu ve toz çözünmesi
DESeq2	Bioconductor (R package)	Version 1.42.0	Diferansiyel ekspresyon analiz yazılımı
DNaz I	Roche Diagnostics, Germany	10104159001	Akciğer dokusu sindirimi
Eşek Anti-Fare IgG H&L (Alexa Fluor 555)	Abcam, UK	ab150106	İmmünofloresan (sekonder)
ECL Substrat (Super Femto)	Nanjing Lanken Biotech, China	–	Western blot kemilüminesansı
Geliştirilmiş BCA Protein Analiz Kiti	Beyotime, Shanghai, China	P0010	Protein kantifikasyonu
Eozin Y Boyama Solüsyonu	Sigma-Aldrich, USA	HT110216	Histoloji (HE boyama)
Etanol (Mutlak, Analitik Derece)	Sinopharm Chemical Reagent, China	10009218	Doku dehydrasyonu ve histoloji
F4/80 antikoru (fare, klon C-7)	Santa Cruz Biotechnology, USA	sc-377009	İmmünofloresan
fastp	Open Source (GitHub)	Version 0.23.4	RNA-seq ham veri kalite kontrol yazılımı
FITC anti-fare CD45 (klon 30-F11)	BD Biosciences, USA	553080	Akış sitometrisi
FlowJo	BD Biosciences, USA	10	Akış sitometrisi analizi
GAPDH monoklonal antikoru (fare)	Proteintech, Wuhan, China	60004-1-Ig	Western blot
GATA3 antikoru (fare, klon L50-823)	Santa Cruz Biotechnology, USA	sc-268	İmmünofloresan
Ghost Dye Red 780	Tonbo Biosciences, USA	13-0865-T100	Ölü hücre dışlanması
Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Cross-Adsorbed Sekonder Antikor	Thermo Fisher Scientific, USA	A11008	İmmünofloresan (sekonder)
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	10.1.2	İstatistiksel analiz
Hematoksilen Solüsyonu (Harris)	Sigma-Aldrich, USA	HHS16	Histoloji (HE boyama)
HISAT2	Johns Hopkins University (Open Source)	Version 2.2.1	RNA-seq referans genom hizalama yazılımı
HRP-konjuge Keçi Anti-Fare IgG (H+L)	Proteintech, Wuhan, China	SA00001-1	Western blot (sekonder)
HRP-konjuge Keçi Anti-Tavşan IgG (H+L)	Proteintech, Wuhan, China	SA00001-2	Western blot (sekonder)
HTSeq-count	EMBL (Python utility)	Version 2.0.3	RNA-seq genomik özellik okuma-sayma aracı
Hidrojen Peroksit (H2O2, %3 Solüsyon)	Sigma-Aldrich, USA	H1009	Endojen peroksidaz bloklaması
iFluor™ 488 Konjuge Keçi anti-tavşan IgG Antikoru	Huabio, China	HA1121	İmmünofloresan (sekonder)
IL-4 Monoklonal antikoru	Proteintech, Wuhan, China	66142-1-Ig	Western blot
IL13 Antikoru	Affinity Biosciences, USA	DF6813	Western blot
IL5 Antikoru	Affinity Biosciences, USA	AF5123	Western blot
Illumina Novaseq 6000	Illumina, USA	–	RNA sekanslama
ImageJ	NIH, USA	1.8	Western blot kantifikasyonu
Image-Pro Plus	Media Cybernetics, USA	Version 6.0	Görüntü optik yoğunluk kantifikasyonu
KAST bitkisel formülasyonu	Pharmacy Department, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine	–	Müdahale
KLRG1 Monoklonal Antikor (2F1)	Thermo Fisher Scientific, USA	58-5893-82	İmmünofloresan
Leica LAS X	Leica Microsystems, Germany	4.5	İmmünofloresan kantifikasyonu
Leica STELLARIS 8 DIVE konfokal mikroskobu	Leica Microsystems, Germany	STELLARIS 8	İmmünofloresan görüntüleme
Liberase TM	Roche Diagnostics, Germany	5401119001	Akciğer dokusu sindirimi
Marker (Ön boyalı Protein Merdiveni)	NCM Biotech, Suzhou, China	P9001	Western blot
Fare CGRP ELISA kiti	Aifang Biotechnology, Hunan, China	AF2491-A	ELISA
Fare IL-13 ELISA kiti	Aifang Biotechnology, Hunan, China	AF-02456M1	ELISA
Fare IL-4 ELISA kiti	Aifang Biotechnology, Hunan, China	AF-02448M1	ELISA
Fare IL-5 ELISA kiti	Aifang Biotechnology, Hunan, China	AF-11729M1	ELISA
Nötr balsam montaj ortamı	Sinopharm Chemical Reagent, China	10014061	Histoloji lam montajı
Normal keçi serumu (bloklama için)	Abcam, UK	ab7481	İmmünohistokimya/IF bloklaması
OCT gömme bileşiği	Sakura, USA	4583	Kriyoseksiyon gömme
Tek Adımlı PAGE Jel Hızlı Hazırlama Kiti	Vazyme, Nanjing, China	E303-01	SDS-PAGE jel hazırlama
Ovalbumin (OVA)	Sigma-Aldrich, USA	A5503	Sensitizasyon/challenge
Paraformaldehit (PBS içinde %4)	Biosharp, China	BL539A	Doku fiksasyonu
PE anti-fare/insan KLRG1 (klon 2F1)	BD Biosciences, USA	564022	Akış sitometrisi
Fosfataz inhibitör kokteyli (50×)	Beyotime, Shanghai, China	P1092	Protein ekstraksiyonu
Poly-L-lizin solüsyonu	Boster, China	AR0003	Histoloji lam kaplama
Proteinaz ve fosfataz inhibitörü	NCM Biotech, Suzhou, China	P002	Protein ekstraksiyonu
PVDF membran (0.22 μm)	Merck Millipore, USA	ISEQ00010	Western blot
RAMP1 poliklonal antikoru (tavşan)	Proteintech, Wuhan, China	10327-1-AP	İmmünofloresan
Kırmızı kan hücresi (RBC) liz temponu	Beyotime, Shanghai, China	C3702	Akış sitometrisi örnek hazırlama
RIPA liz tamponu (Güçlü)	Beyotime, Shanghai, China	P0013B	Protein ekstraksiyonu
RPMI-1640 medyumu	Thermo Fisher Scientific, USA	11875093	Doku hücresi sindirim tabanı
SuperKine™ Geliştirilmiş Antifade Montaj Ortamı	Wuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd.	BMU104	İmmünofloresan montaj
Triton X-100 (Deterjan)	Sigma-Aldrich, USA	T8787	İmmünofloresan permeabilizasyon
TRIzol reaktifi	Thermo Fisher Scientific, USA	15596026	RNA ekstraksiyonu
VAHTS Universal V10 RNA-seq Kütüphane Hazırlama Kiti	Vazyme, Nanjing, China	NR605-01	RNA-seq kütüphanesi oluşturma
Tüm vücut pletismografi sistemi	Guangyuanda, Beijing, China	WBP-4	Akciğer fonksiyonu (Penh)
Ksilen (Analitik Derece)	Sinopharm Chemical Reagent, China	10023418	Deparafinizasyon ve şeffaflaştırma

Kaynaklar

Chinese guidelines for the diagnosis and treatment of allergic asthma (2019, the first edition). Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2019;58(9):636-55.
Huang K, et al. Prevalence, risk factors, and management of asthma in China: a national cross-sectional study. LANCET. 2019;394(10196):407-18.
Zhou J, et al. Characteristics of different asthma phenotypes associated with cough: a prospective, multicenter survey in China. Respir Res. 2022;23(1):243.
Venkatesan P. 2023 GINA report for asthma. Lancet Respir Med. 2023;11(7):589.
Schatz M, Rosenwasser L. The allergic asthma phenotype. J Allergy Clin Immunol Pract. 2014;2(6):645-8; quiz 9.
Reddel HK, et al. Global Initiative for Asthma Strategy 2021: executive summary and rationale for key changes. Eur Respir J. 2022;59(1).
Smith SG, et al. Increased numbers of activated group 2 innate lymphoid cells in the airways of patients with severe asthma and persistent airway eosinophilia. J Allergy Clin Immunol. 2016;137(1):75-86.e8.
Mu JX, et al. Effects of fermented white mustard seed plaster on airway immune balance and its inflammatory response mechanism in bronchial asthma rats. Zhen Ci Yan Jiu. 2025;50(3):287-94.
Zhao SM, et al. Anti-asthma components and mechanism of Kechuanting acupoint application therapy: based on serum metabolomics and network pharmacology. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(24):6780-93.
Hu J, et al. A systematic review and meta-analysis of acupoint application combined with western medicine therapy in the treatment of bronchial asthma. Ann Palliat Med. 2021;10(11):11473-81.
Hu W, et al. Study on Raman spectroscopy evaluating the contact dermatitis produced by acupoint sticking during treating bronchial asthma. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2022;37(3):1830-3.
Wang H, et al. Effect of Acupoint Application Induced Contact Dermatitis on Asthma Control and Serum IFN-gamma/IL-4 in Asthmatic Patients. Journal of Traditional Chinese Medicine. 2018;59(7):582-5.
Yang Q, et al. Modulation of helper T cell 2 cytokines in asthmatic rats by acupoint application with ginger juice hydrogel. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2024;39(6):3068-72.
Wang Y, et al. Effects of Baijiezi Powder and Its Disassembled Formula on the Ig-E,IL-4,IFN-gamma and TNF-alpha in Allergic Asthmatic Rats. Chinese Pharmaceutical Journal. 2019;54(18):1491-6.
Guidelines for the prevention and management of bronchial asthma (2024 edition). Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2025;48(3):208-48.
Boonpiyathad T, Sözener ZC, Satitsuksanoa P, Akdis CA. Immunologic mechanisms in asthma. Semin Immunol. 2019;46:101333.
Klein Wolterink RG, et al. Pulmonary innate lymphoid cells are major producers of IL-5 and IL-13 in murine models of allergic asthma. Eur J Immunol. 2012;42(5):1106-16.
Christianson CA, et al. Persistence of asthma requires multiple feedback circuits involving type 2 innate lymphoid cells and IL-33. J Allergy Clin Immunol. 2015;136(1):59-68.e14.
Kabata H, Artis D. Neuro-immune crosstalk and allergic inflammation. J Clin Invest. 2019;129(4):1475-82.
Wallrapp A, et al. Calcitonin Gene-Related Peptide Negatively Regulates Alarmin-Driven Type 2 Innate Lymphoid Cell Responses. Immunity. 2019;51(4):709-23.e6.
Nagashima H, et al. Neuropeptide CGRP Limits Group 2 Innate Lymphoid Cell Responses and Constrains Type 2 Inflammation. Immunity. 2019;51(4):682-95.e6.
Shi K, et al. Optimization of acupoint application scheme in the treatment of bronchial asthma based on the orthogonal design method. Zhongguo Zhen Jiu. 2017;37(6):571-5.
Hu J, et al. Components of drugs in acupoint sticking therapy and its mechanism of intervention on bronchial asthma based on UPLC-Q-TOF-MS combined with network pharmacology and experimental verification. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(5):1359-69.
Li Y, et al. Kinetics of the accumulation of group 2 innate lymphoid cells in IL-33-induced and IL-25-induced murine models of asthma: a potential role for the chemokine CXCL16. Cell Mol Immunol. 2019;16(1):75-86.
Xu J, et al. Excess neuropeptides in lung signal through endothelial cells to impair gas exchange. Dev Cell. 2022;57(7):839-53.e6.
Patel VH, et al. Current Limitations and Recent Advances in the Management of Asthma. Dis Mon. 2023;69(7):101483.
Farinha I, Heaney LG. Barriers to clinical remission in severe asthma. Respir Res. 2024;25(1):178.
Zhao SM, et al. Repeated Herbal Acupoint Sticking Relieved the Recurrence of Allergic Asthma by Regulating the Th1/Th2 Cell Balance in the Peripheral Blood. Biomed Res Int. 2020;2020:1879640.
van Rijt L, von Richthofen H, van Ree R. Type 2 innate lymphoid cells: at the cross-roads in allergic asthma. Semin Immunopathol. 2016;38(4):483-96.
Cortez VS, Robinette ML, Colonna M. Innate lymphoid cells: new insights into function and development. Curr Opin Immunol. 2015;32:71-7.
Thio CL, Chang YJ. The modulation of pulmonary group 2 innate lymphoid cell function in asthma: from inflammatory mediators to environmental and metabolic factors. Exp Mol Med. 2023;55(9):1872-84.
Kubo M. Innate and adaptive type 2 immunity in lung allergic inflammation. Immunol Rev. 2017;278(1):162-72.
Kabata H, Moro K, Koyasu S, Asano K. Group 2 innate lymphoid cells and asthma. Allergology International. 2015;64(3):227-34.
Cardoso V, et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 2017;549(7671):277-81.
Xie X, et al. Mediation of the JNC/ILC2 pathway in DBP-exacerbated allergic asthma: A molecular toxicological study on neuroimmune positive feedback mechanism. J Hazard Mater. 2024;465:133360.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Tip 2 İnflamasyon ILC2 Hücreleri CGRP Yolağı RAMP1 Proteini Akış Sitometrisi İmmünohistokimya Western Blot ELISA Analizi