Akut Lösemide Ölçülebilir Kalıntı Hastalık Değerlendirmesi için Standartlaştırılmış Çok Renkli Akış Sitometri Protokolü

Özet

Bu protokol, akut lösemide ölçülebilir kalıntı hastalık değerlendirmesi için standartlaştırılmış çok renkli akış sitometrisi iş akışını tanımlar; kontrollü örnek işleme, uyumlu alım parametreleri, ardışık kapı stratejileri ve payda ayarlı yorumu entegre ederek rutin klinik laboratuvarlarda analitik tekrarlanabilirliği artırır.

Özet

Ölçülebilir kalıntı hastalık (MRD), akut lösemi yönetiminde önemli bir prognostik göstergedir. Ancak, rutin çok renkli akış sitometri (MFC) değerlendirmesi, hemodilutasyon, tutarsız alım derinliği ve öznel yorum gibi ön-analitik ve analitik değişkenliğe karşı savunmasızdır. Bu makale, B-hücreli akut lenfoblastik lösemi (B-ALL) ve akut miyeloid lösemi (AML) için rutin MRD değerlendirmesi için standartlaştırılmış bir operasyonel iş akışını sunmaktadır. Protokol, entegre hemodilisyon değerlendirmesi ile katı örnek kabul kriterlerini içerir ve kemik iliği ile periferik kan örnekleri için toplu kırmızı kan hücresi lizisi yöntemi kullanır. Analitik standartlaştırma, hastalığa özgü iki tüplü, sekiz renkli antikor panelleri, en az 500.000 CD45 pozitif olayı gerektiren uyumlu edinim hedefleri ve sabit ardışık kapı stratejileriyle sağlanır. Ayrıca, iş akışı hedefe dayalı üç kademeli bir raporlama sistemini desteklemek için paydaya göre ayarlanmış tespit sınırları (LOD) ve nicelik (LOQ) uygular. 197 klinik örnek üzerinde yapılan doğrulama, güçlü tekrarlanabilirlik, sağlam seyreltici doğrusal ve eşleştirilmiş ortogonal moleküler testlerle yüksek uyumluluk göstermiştir. Toplu olarak, bu protokol standartlaştırılmış MRD izleme için pratik bir çerçeve sağlar. rutin klinik laboratuvarlarda kontrollü ön analitik işlem ve uyumlu analitik parametrelerin entegre edilmesiyle standartlaştırılmış MRD izleme için.

Giriş

Morfolojik remisyona ulaştıktan sonra bile, akut lösemi hastalarının nüks riskini doğru değerlendirmek için ölçülebilir kalıntı hastalığı (MRD) için sürekli izleme gerekmektedir. Geleneksel morfolojik ve sitopatolojik muayeneler, düşük seviyeli kalıntı lökemik popülasyonları tespit etmek için gereken hassasiyetten yoksundur. Sonuç olarak, MRD değerlendirmesi hem akut miyeloid lösemi (AML) hem de B-hücreli akut lenfoblastik lösemi (B-ALL) hastalık izlemesinde vazgeçilmez bir bileşen haline gelmiştir. Avrupa LeukemiaNet tarafından yapılan son öneriler, AML'de güvenilir MRD değerlendirmesinin basit test kullanılabilirliğinden ziyade teknik standartlaşmaya ve gözlemciler arası tekrarlanabilirliğe bağlı^{olduğunu vurgulamaktadır 1,2}. B-ALL'de, çok renkli akış sitometrisi (MFC), stabil moleküler hedefleri olmayan hastalar için özellikle önemlidir. Önceki çalışmalar, yapılandırılmış antikor panel tasarımları kullanılarak standartlaştırılmış çok renkli akış sitometrik yaklaşımların tekrarlanabilir ve hassas kalıntı hastalık tespiti^{sağlayabileceğini göstermiştir 3}. Akış sitometrisi, geniş uygulanabilirliği, hızlı dönüş süresi ve maliyet etkinliği nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. Test performansı, standartlaştırılmış numune hazırlığı, satın alma parametreleri ve veri yorumuna büyük ölçüde bağlıdır⁴.

Akış sitometrik MRD değerlendirmesindeki başlıca teknik zorluklardan biri, nadir olay tespitidir; bu durum, alım derinliği ve toplam olay sayısından güçlü şekilde etkilenir. Aynı antikor panelleri, tutarsız payda boyutlarında alınan örnekler^{alındığında farklı analitik hassasiyetler üretebilir. 5}. Bu nedenle standartlaştırma, antikor seçiminin ötesine geçer ve uyumlu numune işleme, toplu kırmızı kan hücresi lizisi, enstrüman telafisi, edinim hedefleri ve kapı stratejileri gerektirir. Kemik iliği örneklerinde, hemodilusiyon ayrıca çevresel kan kontaminasyonunun görünen kalıntı lökemik yükü yapay olarak azaltabileceği için önemli bir ön analitik^{değişkendir 6,7}. Ayrıca, düşük frekanslı olayların yorumlanması, örnek özgül alım derinliğine dayalı olarak net tanımlanmış raporlama eşikleri gerektirir. Son çalışmalar, akış sitometrik MRD yorumunun tutarlılığını artırmak için paydaya göre ayarlanmış tespit sınırları (LOD) ve nicel (LOQ) önemini^{vurgulamıştır 8}.

Bu protokolün genel amacı, B-ALL ve AML'de rutin MFC tabanlı MRD değerlendirmesi için standartlaştırılmış bir iş akışı sağlamaktır. Protokol, örnek kabul kriterlerini, hemodilisyon değerlendirmesini, hastalığa özgü antikor panel tasarımını, toplu liz örneği hazırlığını, uyumlu edinim hedeflerini, sabit ardışık kapı stratejilerini ve paydaya göre ayarlanmış raporlama kriterlerini tek bir operasyonel^{çerçevede entegre eder 9,10}. Standartlaştırılmış ön analitik ve analitik prosedürleri birleştirerek, bu yöntem MRD izlemenin rutin klinik laboratuvar uygulaması için pratik ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar. Şekil 1, bu çalışmada uygulanan genel standartlaştırılmış ön analitik ve analitik iş akışını göstermektedir. Tablo 1, önceden belirlenmiş izleme aralıkları (İndüksiyon Sonu, Konsolidasyon ve Ön HSCT) doğrulama döneminde kayıtlı B hücreli akut lenfoblastik lösemi (B-ALL) ve akut miyeloid lösemi (AML) hastalarının kohort ve örnek özelliklerini özetlemektedir.

Şekil 1: Rutin çok renkli akış sitometrik MRD değerlendirmesi için standartlaştırılmış iş akışı. (A) Önceden tanımlanmış izleme aralıkları boyunca örnek taraması ve kalite değerlendirmesini gösteren ön analitik iş akışı. (B) Toplu kırmızı kan hücresi lizisi ve antikor boyamalarından ardışık gating, payda ayarlı yorumlama ve nihai MRD raporlaması yoluyla analitik iş akışı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Konsolide hasta demografisi, klinik örnek özellikleri ve rutin alım metrikleri. Bu tek revize tablo, B hücreli akut lenfoblastik lösemi (B-ALL) ve akut miyeloid lösemi (AML) vakalarını içeren kayıtlı kohortun temel klinik özelliklerini özetler ve hasta düzeyindeki demografik yapıları örnek düzeyindeki özellikler, tedavi izleme aralıkları, canlılık, hemodilisyon puanları, alım derinlikleri ve paydaya göre ayarlanabilir kalıntı hastalık sınıflandırmalarıyla birleştirir. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

İnsan örnekleriyle ilgili tüm prosedürler, kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi ve Neijiang İkinci Halk Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No. PXTS887192). Çalışma, rutin tanı testlerinden sonra elde edilen kimliği dekimsiz kalıntı klinik örnekleri kullandı. Bilgilendirilmiş onay, çalışma hasta bakımını, tedavi tahsisini veya örnek toplama prosedürlerini etkilemediği için muafilik verdi. Protokolde kullanılan kimyasallar, reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Örnek toplama ve ön analitik değerlendirme

1. Kemik iliği aspirasyonlarını ölçülebilir kalıntı hastalık (MRD) değerlendirmesi için tercih edilen örnek tipi olarak toplayın. Periferik kan örneklerini yalnızca kemik iliği aspirasyonu klinik olarak kontrendikasyon olduğunda veya seçilmiş gözetim ve karşılaştırıcı analizler sırasında kullanın.
2. Kemik iliği örneğini mümkün olduğunca ilk aspirat çekiminde toplayın. Çevresel kan kontaminasyonunu ve düşük seviyeli kalıntı hastalığı küçümsemesini azaltmak için sonraki aspirat çekimlerinden kaçının.
3. Örnekleri topladıktan hemen sonra dipotasyum etilendiamintetraasetik asit (K2-EDTA) veya sodyum-heparin antikoagülan tüplere aktarın. Örnekleri oda sıcaklığında (18–25 °C) depolayıp taşıyabilir ve doğrudan güneş ışığından korur.
   DIKKAT: Örnekleri buzdolabına koymayın.
4. Tüm örnekleri toplandıktan sonra 24 saat içinde işleyin. Stabilite çalışmaları için, oda sıcaklığında depolama koşullarını koruyarak 24 saat ve 48 saat tekrar analizi için aliquotlar tutulur.
5. Hasta tanımlayıcısını, antikoagülan türünü, numune bütünlüğünü ve numune alındığında toplanma süresini doğrulayın. Yaygın pıhtılaşma, ağır hemoliz veya belirgin hücresel dejenerasyon gösteren reddedilen örnekler
6. Son yorumdan önce kemik iliği örneklerinde hemodilasyon açısından değerlendirin. Periferik kan kontaminasyonunu tahmin etmek için 0.00 ile 1.00 arasında yarı nicel bir hemodilution puanı hesaplayın.
7. Bu değeri, olgun lenfositlerin oranını CD34-pozitif öncüller, olgunlaşmamış granülositler ve olgun lenfositlerin toplamına bölerek belirleyin; burada daha yüksek oran daha yüksek seyreltme etkisini gösterir.
   NOT: Skoru aşağıdaki formülle hesaplayın:
    
   burada daha yüksek puan, daha fazla periferik kan kontaminasyonunu gösterir.
8. Hemodilisyon puanlarını şu şekilde sınıflandırın: <0.20, kabul edilebilir; 0.20–0.39, hafif hemodilasyonlu; ve ≥0.40, önemli ölçüde hemodilasyonlu.
   NOT: Belirgin şekilde hemodilutelenmiş örneklere, yeterli payda boyutu ve korunmuş ilik öncü mimarisi doğrulanmadıkça kesin MRD-negatif yorumlar atanmayın.

2. Hastalığa özgü antikor panel hazırlama

1. B-ALL ve AML analizi için standartlaştırılmış hastalık spesifik iki tüplü, sekiz renkli antikor panelleri hazırlamak. Stabil popülasyon kapıtımı için tüm tüplerde sabit omurga işaretleyicilerine sıkı sıkı şekilde bağlı kalarak panel standartlaştırmasını sağlamak.
2. İlgili soy antijenleri için tutarlı florokrom konjugatları kullanın ve lotlar arası floresans değişkenliğini en aza indirmek için üretici tarafından önerilen titrasyon hacimlerini sıkı bir şekilde takip edin.
3. Belirteç kombinasyonları, florokrom atamaları, antikor klonları, boyama hacimleri ve alım parametreleri için Ek Tablo 1'e bakabilirsiniz.
4. B-ALL değerlendirmesi için, öncü popülasyonları ve olgunlaşma desenlerini tanımlamak için her iki tüpte de CD19, CD45, CD34, CD10 ve CD20 omurga belirteçleri olarak kullanılır. CD38, CD58 ve CD81'i Tube 1'e ekleyin.
5. Başlangıç değerlendirmesinde belirlenen tanısal lösemi ilişkili immünofenotipe göre CD66c, CD123 ve CD73 veya CD304 Tüp 2'ye eklenir.
6. AML değerlendirmesi için, blast ve olgunlaşmamış miyeloid popülasyonları tanımlamak için her iki tüpte de CD45, CD34, CD117, CD13, CD33 ve HLA-DR omurga belirteçleri olarak kullanılmalıdır.
7. Çapraz antijen ekspresyonunu değerlendirmek için CD7 ve CD56'yı Tüp 1'e ekleyin. Miyeloid olgunlaşma anormalliklerini değerlendirmek için Tüp 2'ye CD11b ve CD15 ekleyin.

3. Toplu liz hazırlama ve boyama

1. 2,0 mL iyi karışmış kemik iliği veya periferik kan örneğini 15 mL'lik polipropilen tüpte aktarın. Örnek hacmi sınırlıysa, minimum giriş hacmi 1.0 mL kalın.
2. Numuneye 10 mL önceden ısıtılmış amonyum klorür lizis tamponu ekleyin. Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka altına geçirerek kırmızı kan hücrelerini lizize edin.
3. Örneği 500 × g ile 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı çekirdekli hücre pelletini rahatsız etmeden dikkatlice atın.
4. Pellet, %0,5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM etilen diamintetraasetik asit (EDTA) içeren 2 mL fosfatla tamponlanmış tuzlu süzene (PBS) yeniden süzülür. Kalıntı hemoglobin kontaminasyonu görünürse yıkama adımını bir kez tekrarlayın.
5. Otomatik hematoloji analizörü veya tripan mavisi dışlama ile manuel hemositometre sayısı kullanarak çekirdekli hücre konsantrasyonunu belirleyin. Standart alım için minimum çekirdekli hücre konsantrasyonu 5 × 10⁶ hücre/mL olarak değerlendirin.
   NOT: Hücresel verim bu eşiğin altına düşerse, örneği 500 × g üzerinde 5 dakika boyunca ek bir santrifüjle yoğunlaştırın ve hücre yoğunluğunu maksimize etmek için yeniden süspansiyon tampon hacmini dikkatlice azaltın.
6. Aliquot 5 × rutin boyama için tüpte 10⁶ çekirdekli hücre vardır. Örnek kurtarma izin verdiğinde yüksek hassasiyetli analiz için boru başına girdiyi maksimum 1 × 10⁷ hücreye çıkarmak^.
7. Her tüpte, doğrulanmış boyama paneli konfigürasyonuna göre her tüpte tek tek titrlenmiş antikor kokteylini ve Malzeme Tablosu'nda belirtilen sabitlenebilir canlılık boyasını ekleyin. Rutin doğrulanmış panel, üretici önerisi farklı bir antikor-spesifik hacim göstermediği sürece florokrom konjuge antikor başına 5 μL kullanır.
8. Optimal antikor-antijen stoichiometry'nin korunması için her test başına son boyama reaksiyonu hacminin 100 μL olarak sıkı tutulduğundan emin olun. Örnekleri oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçka altına alın.
9. Boyalı hücreleri yıkama tamponu ile bir kez yıkayın ve son peleti 500 μL toplama tamponunda tekrar askıya alın.
10. Numune alındığı gün tazminat boncukları kullanarak tek boyalı tazminat kontrolleri hazırlayın.

4. Enstrüman kurulumu ve veri toplama

1. Hasta örnekleri almadan önce akış sitometresinde günlük başlatma kalite kontrolü yapın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak akışkanlık, lazer hizalama, dedektör performansı ve floresan hedef değerlerini kalibrasyon boncukları kullanarak doğrulayın.
2. Antikor panellerinde bulunan aynı florokromları kullanarak tek boyalı telafi kontrollerini hazırlayın. Hasta alımı öncesi telafi matrisini ayarlayın ve omurga belirteçlerinin önceden tanımlanmış floresans hedef aralıkları içinde kaldığını doğrulayın.
3. Doğrulama döneminde analiz edilen tüm örnekler için aynı satın alma şablonu, dedektör ayarları, tazminat stratejisi ve kapı hiyerarşisi kullanın.
   NOT: Tüm dedektörler için özel kalibrasyon boncukları kullanarak standartlaştırılmış hedef medyan floresans yoğunluk değerleri belirleyerek cihazlar arasında uygun uyumu sağlamak ve aynı örneklerin klinik veri toplamadan önce platformlar arasında karşılaştırılabilir floresan profilleri sağladığını doğrulamak.
4. Çarpışma olaylarını azaltmak ve nadir olayı tespit doğruluğunu korumak için düşük ve orta akış hızında veri edinmek. Edinim sırasında olay oranını sürekli izleyin.
5. Her rapor edilen MRD sonucu için en az 500.000 CD45 pozitif çekirdekli olay edinin. Örnek kalitesi ve olay kararlılığı izin verdiğinde, özellikle düşük seviyeli kalıntı hastalık şüphesi olduğunda, toplamda 1,0–1,5 milyon olaya kadar uzatın.
6. Akışkanlık kararsızlık, örnek tıkanması, ani olay oranı değişiklikleri veya saçılma kalitesinde görünür bozulma meydana gelirse alım durdurma veya durdurulma. Uygun olduğunda numuneyi yeniden filtreleyebilir veya yeniden karıştırabilir ve örneği ancak stabil akış sağlandıktan sonra yeniden alınır.

5. Ardışık kapı ve paydaya göre ayarlanmış yorumlama

1. Doğrulanmış akış sitometrisi analiz yazılımı kullanarak akış sitometrisi verilerini analiz edin. Tüm örnekler için aynı ardışık kapı stratejisini kullanarak operatörler arası değişkenliği azaltabilirsiniz.
2. En az 20 normal veya yenilenen kemik iliği örneği referans bankasını bağımsız olarak edinip analiz ederek temel ifade şablonu olarak kullanılacak şekilde normal ve yenileyici olgunlaşma desenleri oluşturun.
3. Öne saçılma ve yan saçılma parametreleriyle döküntüleri dışlayın. Tek hücreleri öne saçılma alanı ile ileri saçılma yüksekliği gating uygulamasıyla izole edin.
4. Malzemeler tablosunda listelenen canlılık boya kapısı kullanılarak cansız hücreleri hariç tutun. Bu canlı olmayan hücreleri rutin olarak ortadan kaldırın çünkü spesifik olmayan antikor bağlanması gösterirler ve yapay olarak arka plan gürültüsünü yükseltebilir veya nadir anormal popülasyonları taklit edebilirler.
   NOT: Optimal aşağı akış analizi için %75 minimum yaşamlılık eşiği gerekmek, bu değerin altına düşen örneklerin olası nadir olay artefaktları konusunda dikkatli yorumlanmayı gerektirdiğini belirtmek. Lökosit paydasını uygun yan saçılma özelliklerine sahip geçerli CD45-pozitif olaylar üzerinde geçiş yaparak tanımlayın.
5. B-ALL örnekleri için analizi CD19-pozitif öncü bölme ile sınırlandırın. Anti-CD19 hedefli tedaviler alan hastalar için alternatif bir kapı çerçevesi uygulamak.
6. Birincil değerlendirmeyi CD22, CD24 veya CD34 pozitif bölmelere kaydırarak CD19 ekspresyonundan bağımsız olarak lökemik popülasyonu yakalamak. CD34, CD10 ve CD20 olgunlaşma kalıplarını değerlendirin ve CD38, CD58, CD81, CD66c, CD123 ve CD73 veya CD304 ifade kalıplarını kullanarak anormal popülasyonları belirleyin.
7. AML örnekleri için, CD45, yan saçılım, CD34 ve CD117 ekspresyonları kullanılarak blast veya öncül bölge tanımlanır.
8. CD13, CD33, HLA-DR, CD7, CD56, CD11b ve CD15 dahil miyeloid ve çapraz hatt belirteçlerinin anormal veya asenkron ifadesini değerlendirin.
9. Elde edilen geçerli CD45-pozitif olayların toplam sayısını payda olarak kullanarak örnek spesifik tespit sınırı (LOD) ve nicelendirme sınırı (LOQ) hesaplayın:
    
    
10. Nihai MRD yorumunu üç kategoriden birine ayırın: MRD-pozitif, LOD'un altında veya analitik olarak sınırlı.
    1. Sonucu MRD-pozitif olarak atanmak, net, bitişik bir anormal olay kümesi örnekle spesifik LOD'u aşıyorsa ve normal veya yenilenen hematopoietik popülasyonlardan farklı dahili tutarlı bir immünofenotip gösterdiğinde.
       NOT: Dağınık, kümelenmemiş olayları MRD-pozitif olarak sınıflandırmayın. Başlangıç tanı örnekinden takip edilen lösemi ile ilişkili immünofenotipi (LAIP) ile normalden farklı (DfN) desen tanıma stratejilerini birleştiren entegre bir analiz yaklaşımı kullanın.
    2. Nadir şüpheli olaylar ortaya çıktığında ancak örnekle ilgili rapor eşiğine ulaşmadığında, sonucu LOD'un altında atanın.
    3. Payda yeterli değilse, hemodilyusiyon belirsizse, örnek kalitesi zayıfsa veya analitik öncesi veya analitik sınırlamalar güvenli olumsuz yorumu engelliyorsa sonucu analitik olarak sınırlı olarak atanır.
11. Tüm MRD-pozitif ve sınırda düşük seviyeli vakaları ikinci bir nitelikli analist tarafından bağımsız olarak inceleyin.
12. Moleküler karşılaştırıcı verilerini, nicel polimeraz zincir reaksiyonu veya yeni nesil dizileme sonuçları dahil olmak üzere eşleştirilmiş moleküler karşılaştırıcı verilerini incelemeden önce akış sitometrisi yorumunu tamamlayın.

6. Analitik doğrulama metodolojisi

1. Aynı liz sonrası hücre süspansiyonundan tekrarlanan aliquotlar hazırlayarak analitik tekrarlanabilirliği değerlendirin. En az 30 çift örneği bağımsız olarak edinin ve analiz edinin.
2. Beklenen düşük yük aralığında altı seviyede seri sulandırmalar hazırlayarak seyreltme doğrusallığını değerlendirin. Gözlemlenen MRD değerleri, seyreltme serisi boyunca beklenen MRD değerleri ile karşılaştırın.
3. Birden fazla nitelikli operatör ve uyumlu akış sitometreleri arasında referans örnekleri analiz ederek operatörler arası ve enstrümanlar arası tekrarlanabilirliği değerlendirin.
4. Akış sitometrik ve eşleştirilmiş moleküler MRD yüzdelerini log10 dönüşümü ile dönüştürün, ardından istatistiksel karşılaştırma. Korelasyon analizi ve Bland-Altman analiziyle nicel uyumu değerlendirin.

Sonuçlar

Rutin uygulama veri setinin özellikleri

Çalışma döneminde, ardışık 197 örnek uygunluk taraması ve ön analitik kalite değerlendirmesinden geçerek raporlanabilir iş akışına girmiştir. Çalışma kohortunda 98 hasta yer aldı; 62'si (%63,3) B-hücreli akut lenfoblastik lösemi (B-ALL) ve 36'sı (%36,7) akut miyeloid lösemi (AML) ile izlendi. Kohort, 64 erkek (%65,3) ve 34 kadından (%34,7) oluşuyordu ve medyan yaş 32 idi (çeyreklerarası aralık [IQR], 13–49 yaş; 2–73 yaş). Medyan başlangıç patlama yüzdesi %67,2 (IQR, %56,9 – %80,2) idi.

Analiz edilen örneklerin çoğu kemik iliği aspiratlarıydı (174/197, %88,3), periferik kan örnekleri ise %23/197'sini (%11,7) oluşturdu. Önceden tanımlanmış izleme aralıklarına göre, 86 örnek (%43,7) indüksiyon tedavisinin sonunda, 65'i (%33,0) konsolidasyon tedavisinde ve 46 örnek (%23,4) hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) öncesinde alınmıştır (Tablo 1).

Medyan örnek canlılığı %88,3 (IQR, %84,4 – %92,6) idi. Satın alma iş akışı, veri temizlemeden önce toplam 1.116.901 ortalama olay (IQR, 908.521–1.258.946) verdi. Döküntüler, aynı anda gelen çiftler ve cansız hücrelerin ardışık analitik dışlanmasının ardından, kapı stratejisi medyan 907.325 geçerli tek CD45-pozitif hedef olayına (IQR, 690.112–1.095.836) ulaştı ve medyan alım süresi 11,9 dakikadır. Medyan hemodilisyon puanı 0,20 (IQR, 0,14–0,28) idi. Paydaya göre uyarlanmış yoruma göre, 41 örnek (%20,8) MRD-pozitif olarak sınıflandırıldı ve 156 örnek (%79,2) numuneye özgü tespit sınırının (LOD) altında sınıflandırıldı (Tablo 1).

Analitik doğrulama: tekrarlanabilirlik, doğrusal ve kararlılık

Standartlaştırılmış iş akışının analitik performansı, tekrarlanabilirlik, seyreltici doğrusal yapı ve kısa vadeli kararlılık çalışmalarıyla değerlendirildi (Şekil 2). Aynı toplu lizlenmiş örneklerden hazırlanan tekrarlı aliquotlar, %0,101 %0,101 olan medyan çift varyasyon katsayısı (CV) ve %95'te %0,222 olan %95'lik CV ile güçlü tekrarlanabilirlik göstermiştir.

Şekil 2: Standartlaştırılmış çok renkli akış sitometrisi MRD iş akışının analitik doğrulaması. (A) Analiz edilen örnekler arasında örnek yaşama dağılımı. (B) Logaritmik analizde seri seyreltme deneylerinde beklenen ve gözlemlenen MRD değerleri arasındaki korelasyon. (C) Tekrarlanabilirlik değerlendirmesi sırasında bağımsız tekrarlanan analizler arasında anlaşma. (D) 0 saat, 24 saat ve 48 saat içinde oda sıcaklığında depolamadan sonra MRD ölçümlerinin kararlılığı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Düşük seviyeli tespit davranışını değerlendirmek için, beklenen alt MRD aralığında toplam 72 gözlemden oluşan 12 seri seyreltme deneyi analiz edildi. Gözlemlenen MRD değerleri, logaritmik analizde beklenen değerlerle güçlü uyum gösterdi (r = 0.999, ayarlanmış R² = 0.998, eğim = 1.009, kesişme = 0.018), bu da düşük frekanslı olay aralıklarında doğrusal korunduğunu gösterdi.

Kısa vadeli stabilite testi, örnek yaşamasında zamanla kademeli azalmalar gösterdi; medyan canlılık 0 saatte %89,1'den 24 saatte %84,9'a ve 48 saatte %80,6'ya düştü. Buna karşılık, MRD yükündeki medyan mutlak göreli değişim 24 saat (%6,2) ve 48 saat (%12,0) olarak sınırlı kaldı ve 24 saat sonrakı rutin işlemi destekledi.

Operatörler arası ve enstrümanlar arası tekrarlanabilirlik

Operatörler arası ve enstrümanlar arası tekrarlanabilirlik, çoklu operatörler ve uyumlu akış sitometreleri arasında analiz edilen 24 referans örnek kullanılarak değerlendirildi ve toplam 96 değerlendirme yapıldı. Referans değerlerden medyan mutlak göreli sapma %13,7'dir. Bu bulgular, örnek hazırlığı, alım ayarları ve ardışık kapı stratejilerinin standartlaştırılmasından sonra tutarlı analitik performansı göstermektedir (Tablo 2).

Tablo 2: Standartlaştırılmış ölçülebilir kalıntı hastalık iş akışı için analitik doğrulama ve yöntem karşılaştırma performans göstergeleri. Bu tablo, analiz içi tekrarlanabilirlik, seyreltici doğrusallık, kısa vadeli kararlılık, operatörler arası ve enstrümanlar arası tekrarlanabilirlik ve ortogonal moleküler yöntem karşılaştırma metrikleri dahil olmak üzere doğrulama sonuçlarıyla sınırlıdır; Tablo 1'de bildirilen hasta demografik veya örnek özelliklerini tekrarlamaz. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Klinik uygulama ve ortogonal yöntem karşılaştırması

Ortogonal karşılaştırma yapıldı; bunların 75'i niceliksel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile analiz edildi ve 42'si yeni nesil dizileme (NGS) ile analiz edildi. qPCR değerlendirmeleri, öncelikle tanı sırasında belirlenen hastalığa özgü füzyon transkriptlerini izledi; bunlar arasında BCR::ABL1, RUNX1::RUNX1T1 ve PML::RARA dahildir. NGS yaklaşımları, lenfoblastik lösemi için klonal immünoglobulin veya T-hücre reseptör gen yeniden düzenlemelerini değerlendirdi ve akut miyeloid lösemi için hedefli miyeloid paneller kullanarak tekrarlayan somatik mutasyonları takip etti. Akış sitometrik MRD değerleri, ölçülebilir hastalık seviyeleri arasında eşleştirilmiş moleküler sonuçlarla güçlü bir korelasyon gösterdi (logaritmik analizde r = 0.893).

Bland-Altman analizi, −0.848 ile 0.663 arasında değişen anlaşma sınırları olan ortalama log farkı −0.093 olduğunu göstermiştir (Şekil 3). Uyumsuz vakalar arasında, 25 moleküler pozitif örnek arasında bir yanlış negatif sonuç tespit edildi. İş akışı %78,1 olarak pozitif bir uyum, %97,6 olarak negatif yüzde uyum ve genel uyum oranı %92,3 olarak gösterdi.

Şekil 3: Standartlaştırılmış MRD değerlendirmesinin klinik uygulaması ve ortogonal doğrulaması. (A) MRD-pozitif vakaların hastalık grupları ve izleme aralıkları arasında dağılımı. (B) Logaritmik analizde akış sitometrik MRD değerleri ile eşleştirilmiş moleküler karşılaştırıcı sonuçları arasındaki korelasyon. (C) Akış sitometri ve eşleştirilmiş moleküler MRD ölçümlerini karşılaştıran Bland-Altman analizi, ortalama önyargıyı ve analitik aralık boyunca %95 uyum sınırlarını belirten yatay çizgiler. (D) MRD-pozitif sonuçların tedavi izleme aralıkları arasında dağılımı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu bulgular, standartlaştırılmış çok renkli akış sitometrisi iş akışının rutin klinik örnekler arasında ortogonal moleküler MRD testleriyle güçlü uyum sağladığını göstermektedir.

Ek Tablo 1: Standartlaştırılmış çok renkli akış sitometrisi ölçülebilir kalıntı hastalık iş akışı için kapsamlı operasyonel parametreler. Bu birleşik tablo, temel metodolojik bileşenleri ayrı bölümlere ayrılmış şekilde tanımlar. A Bölümü , CD73 veya CD304 seçiminin başlangıç tanısal lösemi ilişkili immünofenotipe dayandığı hastalık-spesifik antikor panel konfigürasyonlarını detaylandırır. B Bölümü , standartlaştırılmış ön analitik örnek işleme ve akış sitometrik toplama hedeflerini özetler. C Bölümü, paydaya göre ayarlanmış raporlama eşiklerini nihai yorumlama kriterleriyle birlikte tanımlar. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışmanın temel amacı, akut lösemide ölçülebilir kalıntı hastalığın (MRD) çok renkli akış sitometrik değerlendirmesi için standartlaştırılmış bir iş akışı oluşturmaktı. Güvenilir MRD değerlendirmesi sadece antikor paneli seçimine değil, aynı zamanda tutarlı örnek yönetimi, toplama parametreleri ve veri yorumuna da^{bağlıdır 11}. Bu çalışmanın sonuçları, uyumlu örnek işleme, kontrollü alım derinliği ve paydaya göre ayarlanmış raporlama kriterlerinin rutin klinik laboratuvar ortamlarında analitik tekrarlanabilirliği artırabileceğini göstermektedir. Bu bulgular, farklı kurumlar ve operatörler arasında akış sitometrik MRD değerlendirmesini standartlaştırma yönündeki son çabalarla^{tutarlıdır 12}.

Bu iş akışının önemli bir bileşeni, amonyum klorür bazlı toplu kırmızı kan hücresi lizisi prosedürüdür. Nadir MRD tespiti, yeterli analitik duyarlılık sağlamak için büyük hücresel paydaların edinilmesini gerektirir. Standartlaştırılmış toplu liz hazırlığı, yeterli çekirdekli hücre sayısının tutarlı şekilde geri kazanılmasını sağladı ve genellikle 1,0–1,5 milyon edinilen olayı aştı, aynı zamanda kabul edilebilir örnek yaşamlılığını korudu. EuroFlow Konsorsiyumu'nun önceki çalışmaları, yüksek olay ediniminin hassas ve tekrarlanabilir MRD^{tespitini desteklemek için gerekli olduğunu vurgulamıştır 13}. Analitik hassasiyeti optimal olmayan örneklerde, sorun giderme işlemi örnek hacmi, hücresel kurtarma ve alım derinliğinin değerlendirilmesini içermelidir.

Bu protokol ayrıca düşük seviyeli MRD-negatif sonuçların yorumlanmasından önce rutin hemodilisyon değerlendirmesini içerir. Hemodilution, kemik iliği bazlı MRD testlerinde önemli bir analiz öncesi sınırlama olarak kalır; çünkü periferik kan kontaminasyonu görünürdeki lökemik yükü yapay olarak azaltabilir. Yarı nicel hemodilisyon puanının doğrudan raporlama iş akışına dahil edilmesi, yanlış yorumlanmaya karşı ek bir koruma sağlar. Önceki çalışmalar, hemodilyusiyonun akut miyeloid lösemide akış sitometrik MRD analizinin güvenilirliğini önemli ölçüde etkilediğini^{bildirmiştir 7}. Bu nedenle, önemli hemodilisyon (≥0.40) gösteren örnekler, özellikle alım derinliği veya ilik öncül korunması yetersiz olduğunda dikkatli yorumlanmalıdır.

Bu çalışmada yapılan ortogonal karşılaştırma, akış sitometri ve moleküler MRD değerlendirme yöntemleri arasında güçlü genel uyum göstermiştir. Ancak, uyumsuz durumlar ayrıca akış sitometrisi ve moleküler testlerin kalıntı hastalığın farklı biyolojik yönlerini değerlendirdiğini vurgular. Önceki çalışmalar, fenotipik kaymalar, klonal evrim ve rejeneratif hematopoezin analitik platformlar arasındaki tutarsızlıklara katkıda bulunabileceğini^{göstermiştir 14}. B-ALL'de, kalıntı lökemik öncüleri normal hematogonlardan ayırt etmek düşük hastalık yüklerinde özellikle zordur ve izole antijen anormallikleri yerine çok boyutlu immünofenotipik desenlerin entegre yorumlanmasını gerektirir¹⁵. Bu nedenle, bu iş akışındaki tüm sınırda ve düşük seviyeli MRD vakaları ikinci bir analist tarafından bağımsız olarak incelendi.

Bu çalışmanın birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, doğrulama sınırlı sayıda uyumlu enstrüman kullanılarak tek bir kurumda gerçekleştirildi. İkinci olarak, periferik kan örnekleri sadece belirli klinik durumlarda dahil edilmiştir çünkü çoğu akut lösemi ortamında tedavi sonrası MRD değerlendirmesi için kemik iliği yerine geçemezler. Ayrıca, hemodilution puanlama ve düşük seviyeli olay yorumu gibi bazı analitik parametreler, standart iş akışına rağmen hâlâ deneyimli operatör incelemesi gerektirmektedir. Buna rağmen, protokol standartlaştırılmış çok renkli akış sitometrik MRD değerlendirmesinin rutin klinik uygulaması için pratik bir çerçeve^{sağlar 16,17}. Ön analitik kalite değerlendirmesi, uyumlu satın alma stratejileri ve payda göre ayarlanmış yorumlama kriterlerini entegre ederek, bu iş akışı rutin laboratuvar uygulamalarında daha tekrarlanabilir ve klinik olarak tutarlı MRD raporlamasını destekler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Alım tamponu	Laboratuvarda hazırlanmış	%0,5 BSA ve 2 mM EDTA içeren PBS; son süspansiyon hacmi 500 µL	Akış sitometresi alımından önce son süspansiyon
AML Tüp 1 anti-CD117-APC antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: 104D2; florokromun: APC; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Erken miyeloidlerin/blastların tanımlanması
AML Tüp 1 anti-CD13-FITC antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: L138; florokromun: FITC; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Miyeloit soy ankrajı
AML Tüp 1 anti-CD33-PE antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: P67.6; florokromun: PE; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Miyeloit soy ankrajı
AML Tüp 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: 8G12; florokromun: PerCP-Cy5.5; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Olgunlaşmamışlık işaretçisi
AML Tüp 1 anti-CD45-APC-H7 antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: 2D1; florokromun: APC-H7; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Lökosit omurga işaretçisi ve payda tanımı
AML Tüp 1 anti-CD56-V500 antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: NCAM16.2; florokromun: V500; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Anormal blast ilişkili fenotipleme
AML Tüp 1 anti-CD7-V450 antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: M-T701; florokromun: V450; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Kesişebilirlik saptaması
AML Tüp 1 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: G46-6; florokromun: PE-Cy7; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Olgunlaşma ve alt tip ayrımı
AML Tüp 2 anti-CD117-APC antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: 104D2; florokromun: APC; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Erken miyeloidlerin/blastların tanımlanması
AML Tüp 2 anti-CD11b-V450 antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: ICRF44; florokromun: V450; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Olgunlaşma uyumsuzluğu değerlendirmesi
AML Tüp 2 anti-CD13-FITC antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: L138; florokromun: FITC; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Miyeloit soy ankrajı
AML Tüp 2 anti-CD15-V500 antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: HI98; florokromun: V500; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Normalden farklı miyeloit patern değerlendirmesi
AML Tüp 2 anti-CD33-PE antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: P67.6; florokromun: PE; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Miyeloit soy ankrajı
AML Tüp 2 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: 8G12; florokromun: PerCP-Cy5.5; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Olgunlaşmamışlık işaretçisi
AML Tüp 2 anti-CD45-APC-H7 antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: 2D1; florokromun: APC-H7; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Lökosit omurga işaretçisi ve payda tanımı
AML Tüp 2 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antikoru	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, ABD) / Beckman Coulter (Brea, CA, ABD)	Klon: G46-6; florokromun: PE-Cy7; boyama hacmi: rutin doğrulanmış panelde 5 µL/test, antikor özelinde titrasyon farklı ise	Ol