Yöntem makalesi

Kontrollü Gen Düzenleme ve İlaç Salınımı için Işık ve X-Işını ile Aktive Edilen Lipozomlar

77 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71788

⸱

14 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1EosGene Therapeutics Pty Ltd, 2School of Biomedical Engineering, University of New South Wales, 3Biomedical AI Centre, Centenary Institute and Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 4Centre for Vision Research, Department of Ophthalmology, and Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney, 5Department of Ophthalmology, Westmead Hospital, 6School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering and Information Technology (FEIT), University of Technology Sydney

Bu makalede

Özet

Bu protokol, CRISPR-Cas9 ribonükleoproteinlerinin ve kemoterapötik ajanların uzamsal ve zamansal olarak kontrollü iletimi için görünür ışık veya X-ışını radyasyonu ile aktive edilen, verteporfin entegreli lipid nanopartiküllerin üretim yöntemlerini açıklamaktadır; bu yöntemler oftalmik ve onkolojik uygulamalar için potansiyel translasyonel öneme sahiptir.

Özet

Fotodinamik terapi (PDT), temel olarak tekil oksijen olmak üzere reaktif oksijen türleri (ROS) üretmek için fotosensitizatör aktivasyonundan yararlanır. Bu fotokimya, doğrudan sitotoksisitenin ötesinde, lipid nanotaşıyıcı sistemlerden isteğe bağlı kargo salınımı için yeniden yapılandırılabilir ve böylece geleneksel lipid nanopartiküllerle başarılması mümkün olmayan terapötik iletim üzerinde spatiotemporal kontrol sağlar. Bu protokol, iki farklı verteporfin (VP) entegreli lipid nanopartikül formülasyonunun hazırlanması ve karakterizasyonu için yöntemler sunmaktadır: (1) CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein (RNP) komplekslerinin iletimi için DOTAP, DOPE, kolesterol ve VP'den oluşan ışıkla tetiklenen lipozomlar; ve (2) kontrollü kemoterapi ilacı salınımı için DOTAP, DOPC, VP ve altın nanopartiküllerden oluşan X-ışını ile tetiklenen lipozomlar. 690 nm'de (görünür ışık) veya klinik X-ışını radyasyonu (6 MeV) ile aktivasyon üzerine VP, doymamış lipid bileşenlerini okside eden tekil oksijen üretir, nanopartikül membranını stabilize bozarak kapsüllenmiş kargoların salınmasını sağlar. İnce film hidratasyonu ve membran ekstrüzyonu ile lipozom formülasyonu, fizikokimyasal karakterizasyon, ışık ve X-ışını ile tetiklenen kargo salınım değerlendirmesi, insan hücrelerinde in vitro gen nakavtı ve kantitatif bir zebrafish görsel raporlayıcı sistemi ile bir fare ksenogreft tümör modeli kullanılarak in vivo doğrulama için protokoller sağlanmıştır. Temsilci sonuçlar, ışık aktivasyonu yoluyla zebrafish embriyosu başına yaklaşık 326'ya kadar yavaş kas lifinin nakavt edildiğini ve X-ışını ile tetiklenen doksorubisin salınımı yoluyla tümör büyümesinin önemli ölçüde baskılandığını göstermektedir. Gözde 689–690 nm verteporfin aktivasyonuna dair klinik öncelik, retinal biyodağılım, farmakokinetik ve büyük hayvan güvenliği henüz belirlenmemiş olsa da bu platformun oftalmik iletim için değerlendirilmasını teşvik etmektedir. Bu yöntemler, dışarıdan kontrollü terapötik kargo salınımı için translasyonel potansiyele sahip deneysel bir yaklaşım sunmaktadır. 

Giriş

COVID-19 mRNA aşılarındaki kullanımlarıyla kanıtlandığı üzere, lipid nanopartiküller (LNP'ler), nükleik asit terapötikleri için klinik olarak en fazla doğrulanmış non-viral iletim platformu haline gelmiştir1. Ancak geleneksel LNP'ler, hücre içine alındıktan sonra endozomal kaçış yoluyla yüklerini serbest bırakırlar ve yük iletiminin zamanlaması, konumu veya miktarı üzerinde herhangi bir dış kontrol sunmazlar2. Bu spatiotemporal kontrol eksikliği; bölgeye özgü gen düzenleme, heterojen tümörlerde hedefli kemoterapi ve göz gibi anatomik olarak erişilebilir organlarda titre edilmiş gen susturma dahil olmak üzere, hassas ve talep üzerine salınımın terapötik olarak avantajlı olduğu uygulamalardaki kullanımlarını sınırlandırmaktadır3,4.

Fotodinamik tedavi (PDT), dışarıdan tetiklenen biyolojik etkiler için iyi tanımlanmış bir mekanizma sunar. Belirli dalga boylarında aktive olduklarında, fotosensitize ediciler, yakındaki biyomolekülleri okside edebilen singlet oksijen (1O2) ve diğer ROS'ları üretirler5. Yaşa bağlı makula dejenerasyonunda (AMD) subfoveal koroidal neovaskülarizasyonun fotodinamik tedavisi için Visudyne olarak klinik onay almış bir benzoporfirin türevi olan Verteporfin (VP), nanoparçacık fotosensitize edici bileşeni olarak özellikle uygundur6. VP, oftalmik fotodinamik tedavi için klinik olarak 689 nm'de aktive edilir ve bu durum, yerleşik bir oküler ışık iletim örneği oluşturur6,7,8. VP, doku penetrasyonu sağlayan dalga boylarında, birinci nesil hematoporfirin türevlerinden yaklaşık dört kat daha fazla fotodinamik aktiviteye sahiptir6.

VP'nin hem klinik olarak onaylanmış bir fotosensitizer hem de nanoparçacık yükünün salınımı için ışığa duyarlı bir tetikleyici olarak aynı anda görev yaptığı bu çift fonksiyonellik, burada açıklanan protokollerin mekanistik temelini oluşturur. Düşük molar oranlarda lipid çift katmanına entegre edildiğinde VP, aydınlatma üzerine, önceki literatürle tutarlı olarak, doymamış fosfolipid açil zincirlerini oksitleyerek membran stabilitesini bozduğu ve kapsüllenmiş yükleri serbest bıraktığı öngörülen 1O2 üretir9. 1O2'nin kısa difüzyon yarıçapı (biyolojik ortamlarda ~20 nm), membran destabilizasyonunu fotosensitizer'ın hemen yakın çevresiyle sınırlandırarak, çift katmanı etkili bir şekilde bozarken yüke verilen hasarı minimize eder9,10. Ayrıca, X-ışını aktivasyon yöntemi, görünür ışığın doku penetrasyon derinliği sınırlamasını aşar. Altın nanoparçacıklar (3–5 nm) lipid çift katmanına birlikte gömüldüğünde, klinik X-ışını ışınlaması (6 MeV), Auger elektronu aracılı enerji transferi yoluyla VP aktivasyonunu artırarak uygulanabilirliği derin yerleşimli tümörlere kadar genişletir11,12. Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) kullanılarak yapılan doğrudan singlet oksijen ölçümleri, 1O2 üretiminin X-ışını dozuyla birlikte arttığını ve altın nanoparçacık birlikte yüklemesinin, yalnızca VP'ye kıyasla üretimi yaklaşık 1,4 kat artırdığını doğrulamaktadır11.

Bu platform, oftalmik gen tedavisi için özel bir translasyonel öneme sahiptir. Neovasküler AMD için mevcut anti-VEGF tedavileri sık intravitreal enjeksiyonlar gerektirmekte ve gerçek dünya sonuçları kronik yetersiz tedavi altında düşmektedir13,14; öte yandan, gelişmekte olan AAV gen tedavileri bu yükü azaltmakta ancak anti-VEGF'yi konstitütif olarak eksprese etmektedir15,16. Bu nedenle, sürekli VEGF supresyonu ile coğrafi atrofi, retinal iskemi ve fibroz arasındaki bağlantı göz önüne alındığında, bu tedavilerin titre edilememesi veya geri çekilememesi bir endişe kaynağıdır17,18. VP-lipozomlar kullanan ışık tetiklemeli, CRISPR tabanlı bir yaklaşım, bunun yerine klinisyen kontrollü ve mekansal olarak sınırlandırılmış bir VEGF-A nakavtına olanak sağlayabilir; böylece gen düzenlemenin kalıcılığını korurken, başlangıçtaki düzenleme olayının klinisyen kontrollü mekansal ve zamansal kapılanmasını sağlar. Aynı tetiklenmiş salım prensibi, Stargardt hastalığı (ABCA4)19,20 gibi büyük genli retinal distrofしやすい hastalıklara ve VP'nin konverjan mekanizmalarının tümör biyolojisiyle iyi örtüştüğü uveal melanoma durumuna da uygulanabilir21,22.

Bu protokolün genel amacı, biri görünür ışıkla (690 nm) ve diğeri X-ışını radyasyonu ile aktive edilen iki farklı formülasyon kullanılarak VP entegreli lipid nanopartiküller üretmek ve hem in vitro hem de in vivo model sistemlerde iletim etkinliğini değerlendirmek için kapsamlı, tekrarlanabilir yöntemler sunmaktır. Bu formülasyonlar lipid kompozisyonları, yükleme stratejileri ve aktivasyon yöntemleri bakımından farklılık gösterdiğinden, ayrı protokoller olarak sunulmuşlardır. Bu protokol; tetiklemeli salım yapan nanopartikül platformları, PDT tabanlı iletim stratejileri, spasyotemporal kontrollü gen düzenleme veya ışıkla aktive edilen oftalmik ve onkolojik ilaç iletimi üzerine çalışan araştırmacılar için hazırlanmıştır.

Protokol

Zebrafish ile gerçekleştirilen tüm hayvan deneyleri, Macquarie University Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylanan protokoller (ARA: 2015-034) uyarınca standart koşullar altında yürütülmüştür. Fare xenograft deneyleri, Macquarie University Hayvan Etik Kurulu (onay No. 2017/001) ile uyumlu olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm prosedürler, 1985 Hayvan Araştırmaları Yasası ve 2010 Hayvan Araştırmaları Yönetmeliği ile uyumlu olarak yürütülmüştür.

Bölüm A: CRISPR-Cas9 iletimi için ışıkla tetiklenen VP-lipozomlar (Aksoy ve ark. 9 temel alınarak)

1. CRISPR-Cas9 RNP kapsülleyen ışıkla tetiklenen VP-lipozomların hazırlanması

  1. DOTAP, DOPE, kolesterol (Chol) ve VP'yi, cam yuvarlak tabanlı bir flask içerisinde 500 µL kloroformda 1:0,94:1:0,06 molar oranında çözün9.
    UYARI: Kloroform toksik ve uçucudur. Kloroform içeren tüm adımları, nitril eldivenler ve emniyet gözlükleri dahil uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak bir kimyasal çeker ocak altında gerçekleştirin.
  2. Flask duvarında ince bir lipid filmi oluşana kadar kloroformu argon gazı akışı altında uçurun.
  3. Kalıntı çözücüyü tamamen uzaklaştırmak için flaskı gece boyunca (≥12 sa) vakum altına (örneğin, bir vakum pompasına bağlı dondurarak kurutucuya veya desikatöre) yerleştirin.
  4. 500 µL nükleaz içermeyen su içerisinde sgRNA (0,01 µM final konsantrasyon) ve Cas9 proteini (0,1 mg/mL final konsantrasyon) birleştirilerek hidratasyon çözeltisini hazırlayın. Hidratasyondan önce, ribonükleoprotein (RNP) kompleks oluşumuna izin vermek için sgRNA ve Cas9'u oda sıcaklığında 5 dk ön-inkübe edin.
    NOT: RNP kompleksi, formasyon sonrası eklenmez, hidratasyon aşamasında yüklenir. Bu, lipozomun sulu çekirdeği içine enkapsülasyonu sağlar.
  5. 500 µL RNP çözeltisini doğrudan filmin üzerine ekleyerek kurutulmuş lipid filmini hidrate edin ve süspansiyon homojenleşene kadar karıştırın. Lipidlerin tam hidratasyonunu sağlamak için hidrate edilmiş lipid süspansiyonunu oda sıcaklığında 2 sa bekletin.
  6. Tekdüze boyutta unilameller lipozomlar üretmek için oluşan multilameller süspansiyonu bir mini-ekstrüder kullanarak 200 nm polikarbonat membran üzerinden 11 kez ekstrüde edin9.
    NOT: Bu formülasyon için boyut küçültme yöntemi sonikasyon değil, ekstrüsyondur. Ekstrüde edilmemiş veziküllerle kontaminasyonu azaltmak ve final ürünün başlangıç materyalinin membran üzerinde karşı tarafta kalmasını sağlamak için süspansiyonu tek sayıda (11) geçirin.
  7. VP-lipozomları 4°C'de, ışıktan koruyarak saklayın. Optimal aktivite için hazırlandıktan sonraki 48 sa içinde kullanın. Bu 48 sa'lık çalışma sınırı ihtiyatlıdır: %10 FBS içerisinde 96 sa boyunca VP salınımı %3'ün altında kalmaktadır9.
    NOT: In vitro ve in vivo uygulamalar için lipozomları standart aseptik teknikler kullanarak hazırlayın ve işleyin; final süspansiyonu kullanmadan önce 0,22 µm filtreden geçirerek sterilize edin.

2. VP-lipozomların fizikokimyasal karakterizasyonu

  1. Lipozom süspansiyonunu nükleaz içermeyen su ile 1:100 oranında seyreltin. Dinamik ışık saçılımı (DLS) ile hidrodinamik çapı, polidispersite indeksini (PDI) ve zeta potansiyelini ölçün. Tüm DLS ölçümlerini her örnek için üç tekrar şeklinde (n = 3 teknik tekrar) gerçekleştirin ve değerleri ortalama ± standart sapma olarak raporlayın.
    NOT: Başarılı bir Parça A formülasyonundan beklenen karakteristikler; 167,5 ± 1,9 nm hidrodinamik çap, PDI < 0,3, +28 ± 1,1 mV zeta potansiyeli ve yaklaşık %75,09 Cas9 enkapsülasyon verimliliğidir. Başarılı formülasyonların temsili fizikokimyasal özellikleri Tablo 1'de özetlenmiştir.9
  2. Geçirimli elektron mikroskobu (TEM) için, seyreltilmiş lipozom süspansiyonundan 10 µL'yi karbon kaplı bakır ızgara üzerine damlatın. 2% uranil asetat ile 20 s boyunca boyayın. 100 kV'de görüntüleme yaparak9 her seri için en az 10 temsili görüntü elde edin.
ParametreBölüm A: VP-lipozom
(ışıkla tetiklenen)		Bölüm B: VP/AuNP-lipozom
(X-ışını ile tetiklenen)
Hidrodinamik çap167.5 ± 1.9 nm~100–150 nm
Polidispersite indeksi (PDI)<0.3< 0.3 (tipik)
Zeta potansiyeli+28 ± 1.1 mVPozitif (DOTAP tabanlı)
Kapsülleme verimliliğiCas9 RNP: 75.09%Doksorubisin: amonyum sülfat uzak yükleme; %0.1 Triton X-100 lizini sonrası miktar belirlenmiştir
Altın nanopartikül yüklemesiUygulanamazLipozom başına 156 ± 24 AuNP (ICP-MS)
Yük salınım stabilitesi%10 FBS içinde 96 saat boyunca <%3 VP salınımı%0, %10, %25 ve %50 FBS ile pH 7.4, 6.0 ve 5.0 değerlerinde 48 saat boyunca stabil
Aktivasyon koşulu690 nm, 0.15 mW/cm² LED ışınlaması6 MeV klinik X-ışını ışınlaması
Birincil yükCRISPR-Cas9 RNP kompleksiDoksorubisin
Aktivasyon modalitesiGörünür ışıkX-ışını radyasyonu
Planlanan uygulamaTetiklenen gen düzenlemeTetiklenen kemoterapi ilacı salınımı

Tablo 1: İki verteporfin (VP)-lipozom formülasyonunun fizikokimyasal karakterizasyon kriterleri ve stabilite profilleri. Işıkla tetiklenen VP-lipozom formülasyonu (Bölüm A) ve X-ışını ile tetiklenen VP/AuNP-lipozom formülasyonu (Bölüm B) için temsilci formülasyon özellikleri, yükleme parametreleri, stabilite profilleri ve aktivasyon koşulları. Bu değerler, başarılı formülasyon hazırlama ve karakterizasyonu için beklenen kalite kontrol kriterlerini sağlar ve burada açıklanan protokoller yeniden uygulanırken referans kriterleri olarak kullanılabilir.

3. Işıkla tetiklenen kargo salınımı ve singlet oksijen ölçümü

  1. Işıkla tetiklenen salım analizleri için, aynı lipid formülasyonu ve hidratasyon/ekstrüzyon protokolünü kullanarak VP-lipozomları hazırlayın. PBS içindeki lipozom süspansiyonundan 100 µL'yi, 80 rpm hızda karıştırılan 12 mL PBS içinde askıda olan bir diyaliz cihazına aktarın.
  2. Numuneleri, belirlenen aralıklarla (2, 4 ve 6 dk) 0,15 mW/cm2 şiddetinde 690 nm LED ışık kaynağı ile ışınlayın9.
  3. Harici diyalizatı 0, 1, 3, 6 ve 24. saatlerde örnekleyin ve salınan VP miktarını floresans ile belirleyin; toplam VP miktarını ise eşdeğer bir alikotu %0,1 Triton X-100 ile liz ederek elde edin.
  4. VP salımını Rvp (%) = (Ft − F0)/(Fmax − F0) × 100 formülüyle hesaplayın; burada Ft, F0 ve Fmax sırasıyla t anındaki, başlangıçtaki ve Triton lizi sonrası floresans değerleridir (n = 3).
  5. Işınlama öncesi ve sonrası DLS ile hidrodinamik çapta meydana gelen değişimi ölçerek membran destabilizasyonunu doğrulayın.
    NOT: Hazırlama ve saklama süreçleri boyunca VP içeren tüm numuneleri ortam ışığından koruyun. Kehribar renkli tüpler veya alüminyum folyo sargı kullanın.

4. In vitro transfeksiyon ve gen nakavt analizi

  1. HEK293-GFP hücrelerini (veya eşdeğer bir raporlayıcı hattı), işlem anında yaklaşık %70 konfluens sağlayacak uygun bir yoğunlukta 96 kuyucuklu plakalara ekleyin. Hücreleri tam besiyerinde (DMEM + %10 FBS + %1 penisilin-streptomisin), 37°C'de ve %5 CO2 ortamında kültüre edin.2.
  2. Anti-GFP sgRNA/Cas9 RNP kapsülleyen VP-lipozomları, kuyucuklara 50 ug/mL konsantrasyonda ekleyin. Floresan mikroskopi analizi için 2 saat; akış sitometrisi analizi için 1 saat inkübe edin.
  3. Besiyerini taze tamamlayıcı besiyeri ile değiştirin. İşlem görmüş kuyucukları 0,15 mW/cm2 şiddetinde 690 nm LED ışık ile ışınlayın. Floresan mikroskopi analizi için 2, 4 veya 6 dakika; akış sitometrisi analizi için 4 dakika boyunca ışınlayın. Karanlık kontrolleri (ışınlama yapılmamış lipozomlar) ve sadece ışık kontrollerini (lipozomsuz ışınlama) dahil edin.
  4. GFP nakavt durumunu, işlem sonrası 48. saatte floresan mikroskobu veya akış sitometrisi ile değerlendirin.
    NOT: Kılavuz RNA'lar kullanım öncesinde valide edilmelidir. Kaynak çalışmada, aday eGFP kılavuzları restriksiyon fragman uzunluk polimorfizmi (RFLP) analizi ile kesim verimliliği açısından taranmış ve seçilen kılavuz (sg_eGFP_06) %88,24 kesim oranı elde etmiştir. Kılavuz benzersizliği doğrulanarak (Bowtie/Bowtie2 kullanılarak referans genoma karşı BLASTN ile; ilk on 3’ bazda hiçbir uyumsuzluğa izin verilmeden), hedef dışı risk in silico olarak minimize edilmiştir. Genom çapında hedef dışı sekanslama yapılmamıştır ve bu işlem terapötik translasyon için önerilen bir adımdır.9.
  5. Kapsülleme verimliliğini ölçmek için santrifüjleyin lipozom örneği 4 °C'de 1 saat boyunca 15.000 rpm'de santrifüj edilir, ardından süpernatan 20 nm'lik bir Whatman Anotop 10 şırınga filtresinden süzülür.
  6. Süzüntüdeki serbest (enkapsüle edilmemiş) Cas9 miktarını BCA protein analizi ile belirleyin.
  7. Kapsülleme verimliliğini EE (%) = [(Ctot − Csup) / Ctot] × 100, burada Ctot eklenen toplam Cas9 ve C misup enkapsüle edilmemiş Cas9 süpernatantta geri kazanılır. Bakınız Tablo 1 temsili formülasyon performans metrikleri ve beklenen enkapsülasyon verimleri için.

5. In vivo doğrulama: zebrafish görsel raporlayıcı deneyi

  1. eGFP-hedefleyici sgRNA ve Cas9 proteinini kapsülleyen VP-lipozomları, orijinal protokolde9 belirtilen oranlarda birleştirerek enjeksiyon MasterMix'ini hazırlayın. Final 8 uL MasterMix; 3,5 uL sgRNA (75 ng/uL), 1,0 uL Cas9 proteini (500 ng/uL), 2,5 uL VP-lipozom ve 1,0 uL fenol kırmızısı içerir. Kontrol MasterMix'i için lipozomlar yerine 2,5 uL nükleaz içermeyen su kullanın.
  2. Kalibre edilmiş bir mikroenjeksiyon sistemi9 kullanarak, tek hücre aşamasındaki zebrafish embriyolarının hücresine (vitellusa değil) 2 nL MasterMix mikroenjekte edin.
    UYARI: Tüm zebrafish çalışmalarını onaylanmış hayvan etik protokolleri altında gerçekleştirin. Enjeksiyon sırasında mekanik hasarı en aza indirmek için embriyoları nazikçe taşıyın.
  3. Fertilizasyondan sonraki 2. saatte (hpf), kargo salınımını aktive etmek için enjekte edilen embriyoları belirlenen süreler boyunca (örneğin 0, 1, 2 ve 5 dk) 0,15 mW/cm2 şiddetinde 690 nm LED ışığına maruz bırakın9.
  4. 72 hpf'de, embriyoları Tricaine ile anestezi edin ve %1 düşük erime noktalı agaroz içerisine sabitleyin. smyhc1:eGFP transgenik raporlayıcı hattını kullanarak, yavaş kas lifi nakavtını, ters floresan mikroskobu ve konfokal mikroskop yardımıyla eGFP floresans kaybı olarak nicelendirin.
  5. Odak istifleme (focus-stacked) görüntüler elde edin ve genellikle grup başına 16 embriyoyu analiz ederek (örneğin Imaris'te), embriyo başına eGFP-negatif (nakavt edilmiş) yavaş kas liflerini sayın9.
    NOT: Bu analiz, gen nakavt verimliliğinin kantitatif ve görsel bir okumasını sağlar. smyhc1:eGFP raporlayıcı hattında yavaş kas lifleri normalde eGFP-pozitiftir; başarılı nakavt, bu liflerdeki eGFP floresans kaybı olarak puanlanır9.

Bölüm B: Kemoterapi ilaç iletimi için X-ışını ile tetiklenen VP-lipozomlar (Deng ve ark. 11 baz alınarak)

6. Doksorubisin yüklü, X-ışını tetiklemeli VP/AuNP-lipozomların hazırlanması

  1. 350 µL DOTAP (kloroform içinde 100 mg/mL) ve 370 µL DOPC'yi (kloroform içinde 100 mg/mL) cam taban yuvarlak bir flask içerisinde birleştirin ve kloroform ile toplam hacmi 1,0 mL'ye tamamlayın11.
    NOT: Bölüm B'de DOPE değil, DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) kullanılır. İki formülasyon yardımcı lipidleri bakımından farklıdır ve bu ayrım tekrarlanabilirlik açısından kritiktir.
  2. Lipid karışımına 50 µL VP (DMSO içinde 2,3 mg/mL) ve 40 µL altın nanoparçacık süspansiyonu (3–5 nm çapında) ekleyin. ICP-MS ile ölçüldüğü üzere, bu işlem lipozom başına yaklaşık 156 ± 24 altın nanoparçacık sağlar11.
    NOT: Lipid çift katmanına gömülmek için altın nanoparçacıkların çapı 3–5 nm olmalıdır. Daha büyük parçacıklar (örneğin 50 nm) membrana dahil olmayacak ve X-ışını aktivasyonu için gerekli olan Auger elektron enerji transferini gerçekleştirmeyecektir11.
    NOT: Burada açıklanan temel formülasyon hedeflemesizdir. Kaynak çalışmada, lipozomları folat reseptörü eksprese eden tümör hücrelerine yönlendirmek için DSPE-PEG2000-Folat'ın post-insersiyonu ile isteğe bağlı bir aktif hedefleme modifikasyonu eklenmiştir; bu adım, temel VP/AuNP salınım mekanizmasını değiştirmeden eklenebilir11.
  3. Kloroformu argon altında uçurun ve Adım 1.2–1.3'te açıklandığı gibi gece boyunca vakum altında kurutun.
  4. Lipid filmini 1,0 mL 250 mM amonyum sülfat tamponu (pH 5.5) ile hidrate edin. Vorteksleyin, hidrate edilmiş süspansiyonu gece boyunca bekletin ve ardından 200 nm polikarbonat membrandan 11 kez ekstrüde edin11.
  5. Transmembran amonyum sülfat gradyanını oluşturmak için, PBS (pH 7,4) ile 4 °C'de dört kez tampon değişimi yaparak serbest amonyum sülfatı diyaliz yoluyla uzaklaştırın.
  6. Diyalize edilmiş lipozomları, 1:10 ilaç-lipid ağırlık oranında 60°C'de 1 saat inkübe ederek doksorubisin (Dox) yüklemesi yapın11. Amonyum sülfat gradyanı, Dox'un lipozom içine akümülasyonunu sağlar.
  7. Kapsüllenmemiş Dox'u, PBS ile 4 °C'de dört kez tampon değişimi yaparak diyaliz yoluyla uzaklaştırın.
  8. Yüklenmiş lipozomları DLS ile karakterize edin (beklenen boyut: ~100–150 nm) ve lipozomları %0,1 Triton X-100 ile lizleyerek Dox floresansını (eksitasyon 485 nm, emisyon 590 nm) miktar belirleyerek enkapsülasyon verimliliğini ölçün .
    NOT: Başarılı Bölüm B formülasyonları tipik olarak yaklaşık 100–150 nm hidrodinamik çap, PDI < 0,3 ve lipozom başına yaklaşık 156 ± 24 altın nanoparçacık inkorporasyonu sergiler. Temsili fizikokimyasal özellikler Tablo 1'de özetlenmiştir.11

7. X-ışını tetiklemeli ilaç salınımı ve in vitro sitotoksisite

  1. Klinik bir lineer hızlandırıcı (6 MeV foton demeti) kullanarak, calcein yüklü VP/AuNP-lipozomlarını belirlenen dozlarda (1, 2 ve 4 Gy) ışınlayın11. Calcein floresansını (eksitasyon 485 nm, emisyon 510 nm) ölçerek kargo salınımını nicelleştirin ve %0,1 Triton X-100 ile parçalamayı takiben toplam salınım miktarını elde edin."
  2. Sitotoksisite analizleri için, HCT116 insan kolorektal kanser hücrelerini 96 kuyucuklu plakalara ekleyin (örneğin, %10 FBS içinde 2 × 104 hücre/mL).
  3. Hücreleri Dox yüklü VP/AuNP-lipozomları ile tedavi edin ve LipoDox-yalnızca, X-ışını-yalnızca ve tedavi edilmemiş kontroller de dahil olmak üzere, yukarıda açıklandığı şekilde X-ışınları ile ışınlayın. 4 Gy ışınlamadan sonraki 0, 2, 4 ve 24. saatlerde MTS analizi ile hücre canlılığını değerlendirin11.

8. In vivo doğrulama: fare ksenogreft tümör modeli

  1. 6–7 haftalık dişi BALB/c nude farelerin yan bölgesine, 100 µL serumsuz McCoy’s 5A medium11 içinde 5 × 106 HCT116 hücresi deri altına inoküle edin.
  2. Tümörler ~100 mm3 boyutuna ulaştığında, Dox yüklü VP/AuNP-lipozomları (10 mg/kg Dox eşdeğeri) 20 µL hacminde intratümöral olarak enjekte edin11.
  3. Enjeksiyondan 24 saat sonra, hedef dışı dokuların uygun şekilde zırhlandığı klinik bir lineer hızlandırıcı kullanarak tümörleri 4 Gy X-ışını radyasyonu (6 MeV) ile iradyasyon edin.
  4. Tümör hacmini her 2 günde bir dijital kumpas kullanarak izleyin. Tümör hacmini, L en uzun boyut ve W dik genişlik olmak üzere V = (π/6) × L × W2 formülüyle hesaplayın11.
  5. Deney sonlanım noktasında tümörleri çıkarın, %10 nötral tamponlu formalin içinde sabitleyin ve histolojik analiz (H&E boyama) için 6 µm kalınlığında kriyoseksiyonlar hazırlayın11.

9. İstatistiksel analiz

  1. Aksi belirtilmedikçe nicel veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur.
  2. Zebrafish gen nakavt çalışmaları için istatistiksel analizler, kaynak çalışmalarda bildirildiği üzere tek yönlü ANOVA kullanılarak gerçekleştirilmiş; iki grup arasındaki karşılaştırmalar ise iki kuyruklu Student t-testi kullanılarak analiz edilmiştir. İstatistiksel anlamlılık p < 0,05 olarak tanımlanmıştır.
  3. X-ışını tetiklemeli lipozom çalışmaları için tümör büyümesi, vücut ağırlığı, kargo salınımı ve histolojik veri setleri, orijinal yayında açıklandığı şekilde Student t-testleri kullanılarak analiz edilmiştir.
  4. Her deney için n tanımı, ilgili şekil açıklamalarında verilmiştir.
  5. İstatistiksel analizler GraphPad Prism versiyon 7.0 (GraphPad Software) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
    NOT: Bu protokol, daha önce yayınlanmış çalışmalardaki deneysel iş akışlarını ve temsili veri setlerini yeniden üretmektedir. Okuyucuların, uygun olduğu durumlarda eksiksiz istatistiksel analiz detayları için orijinal yayınlara başvurması önerilir9,11.

Sonuçlar

Işıkla tetiklenen gen düzenleme (Bölüm A):

Bölüm A protokolü takip edildiğinde, CRISPR-Cas9 RNP kapsülleyen VP-lipozomlar ışığa bağımlı kargo salınımı göstermiştir. Karanlık koşullar altında minimum salınım gözlemlenirken, 690 nm (0,15 mW/cm2) dalga boyunda ışınlama, aydınlatma süresiyle birlikte artan doza bağımlı bir salınım meydana getirmiştir (Şekil 1A)9. Zebrafish eGFP raporlayıcı testi, gen nakavt verimliliğinin kantitatif görsel okumasını sağlamıştır. Işıkla aktive edilen embriyolarda, karanlık kontrollerde (n = 80) 53,15 ± 35,38 lifle karşılaştırıldığında, embriyo başına 308,37 ± 40,21 eGFP-pozitif yavaş kas lifinde nakavt görülmüş ve 5 dakikalık ışınlama sonrası bu sayı 326,12 ± 36,55 life yükselmiştir (n = 60) (Şekil 1B,C)9. In vitro çalışmalarda, ışıkla aktive edilen VP-lipozomlar, Lipofectamine 2000 ile kıyaslanabilir düzeyde (yaklaşık %53'e karşı %50 azalma) GFP nakavtı gerçekleştirmiş ve aynı zamanda benzersiz bir şekilde ışıkla kontrol edilen spasyotemporal kontrol sağlamıştır (Şekil 1C)9. Aynı nanoparçacık formülasyonunun ışık maruziyetine bağlı olarak belirgin şekilde farklı nakavt verimlilikleri üretmesi, spasyotemporal kontrolün sağlandığını kanıtlamaktadır (Şekil 1A–C).

Fotokimyasal gen düzenleme yöntemi; CRISPR-Cas9, LED indüklemeli, floresan mikroskobi, deneysel sonuçlar, yoğunluk ölçümü.
Şekil 1. Zebrafish embriyolarında ışıkla tetiklenen CRISPR-Cas9 iletimi ve spatiotemporal gen nakavtı. (A) Cas9/sgRNA ribonükleoprotein (RNP) komplekslerini kapsülleyen verteporfin (VP)-lipozomların (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0.94:1:0.06) şematik gösterimi. 690 nm ışıkla ışınlama üzerine VP, lipozomal membranı destabilize eden ve CRISPR-Cas9 yükünün hücre içi salınımını tetikleyen reaktif oksijen türleri üretir. (B) VP-lipozom tedavisi ve artan ışık maruziyet süreleri (0, 1, 2 ve 5 dk; 690 nm, 0.15 mW/cm2) sonrası döllemeden 72 saat sonraki (hpf) smyhc1:eGFP zebrafish embriyolarının temsili floresan görüntüleri. eGFP floresansının kaybı, yavaş kas liflerinin nakavt olduğunu gösterir. İç görseller, kutulu bölgelerin büyütülmüş görünümlerini göstermektedir. (C) Işığa bağımlı CRISPR-Cas9 aktivasyonunu ve gen nakavtını gösteren, embriyo başına floresans yoğunluğunun ve nakavt edilen yavaş kas lifi sayısının nicelendirilmesi. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Zebrafish deneyleri tek yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir (floresans yoğunluğu ölçümleri için n = 80 embriyo ve lif sayısı analizi için n = 60 embriyo; p < 0.0001). HEK293-GFP doğrulama deneyleri iki kuyruklu t-testi kullanılarak analiz edilmiştir (n = 4). Ölçek çubukları = 500 µm (genel görüntüler) ve 100 µm (büyütülmüş görüntüler). Aksoy ve ark. 9 izinle uyarlanmıştır. Telif Hakkı © 2020 American Chemical Society. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Zebrafish deneyindeki suboptimal sonuçlar şunları içerebilir: (a) embaryo başına 50'den az bozulmuş lif, düşük lipozom kalitesini, yetersiz Cas9 aktivitesini veya suboptimal ışık dozunu gösterir; (b) %20'yi aşan embriyo mortalitesi, mikroenjeksiyon sırasında mekanik hasara veya aşırı VP fototoksisitesine işaret eder; veya (c) ışınlanmamış kontrollerde görülen bozulmuş lifler, lipozom formülasyonundan erken kargo sızıntısını gösterir.

X-ışını tetiklemeli ilaç salımı (B Bölümü):

B Bölümü protokolüne göre hazırlanan VP/AuNP-lipozomlar, 1–4 Gy aralığında doza bağımlı kalsein salınımı göstermiştir (Şekil 2A,B)11. HCT116 ksenogreft modelinde, Dox yüklü VP/AuNP-lipozomlar alan ve ardından 4 Gy X-ışını radyasyonuna maruz bırakılan fareler; serbest Dox, tek başına X-ışını ve ışınlanmamış lipozom kontrollerine kıyasla anlamlı bir tümör büyüme baskılanması göstermiştir (Şekil 2C)11. Tümör kesitlerinin histolojik analizi, H&E boyaması ile değerlendirildiğinde, kombine tedavi grubunda daha geniş nekrotik alanların olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 2D).

X-ışını hedefli lipozomlarla kanser tedavisi; kalséin salınımı, tümör boyutu ve nekroz analizine ilişkin grafikler.
Şekil 2X-ışını ile tetiklenen doksorubisin salınımı ve tümör büyümesinin baskılanması. (A) Doksorubisin (Dox) içeren verteporfin (VP)/altın nanopartikül (AuNP) entegreli lipozomların şematik gösterimi. X-ışını radyasyonuna maruz kalma, AuNP aracılı enerji transferi yoluyla VP'yi aktive ederek, lipid çift tabakasını destabilize eden ve yük salınımını tetikleyen singlet oksijen üretir. (B) Artan X-ışını dozlarına (0–4 Gy) maruz kalan lipozomlardan kalsein salınım profilleri; VP/AuNP-lipozomlarından doza bağımlı kargo salınımını göstermektedir. Hata çubukları, dört ölçümden elde edilen standart sapmayı temsil etmektedir. (C) PBS, LipoDox, tek başına X-ışını veya X-ışını ile tetiklenen LipoDox uygulanan HCT116 xenograft taşıyan farelerde tümör hacmi (sol) ve vücut ağırlığı (sağ) ölçümleri. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur (n = grup başına 4 fare). İstatistiki anlamlılık, şu yöntem kullanılarak değerlendirilmiştir: t-test (P < 0,05, P < 0.01, P < 0.001). (D) Temsili hematoksilin ve eosin (H&E)&H&E ile boyanmış tümör kesitleri ve ortalama tümör nekrotik alanının morfometrik analizi. Oklar temsili nekrotik bölgeleri göstermektedir. Kutu grafikleri medyanı ve çeyrekler arası genişliği (IQR) göstermekte olup, sınırlar 1,5 × IQR'ye kadar uzanmaktadır. Veriler şu yöntem kullanılarak analiz edilmiştir: t-test (n = 5). Ölçek çubuğu = 50 µmDeng ve ark. çalışmasından uyarlanmıştır.11 Creative Commons Atıf 4.0 Uluslararası Lisansı şartları uyarınca. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ksenogreft modelindeki suboptimal sonuçlar şunları içerebilir: (a) ışınlanan ve ışınlanmayan lipozom grupları arasında tümör büyümesi açısından fark olmaması; bu durum VP aracılı salınımın yetersiz olduğunu veya altın nanoparçacık inklüzyonunun yetersiz olduğunu gösterir; veya (b) sistemik toksisite (kilo kaybı > %15), bu da X-ışını aktivasyonu öncesinde lipozomlardan Dox sızıntısı olduğunu düşündürür.

Tartışma

Bu protokollerdeki birkaç adım, başarının sağlanması için kritik öneme sahiptir. Bölüm A'da, VP konsantrasyonu 1O2 oluşumunun miktarını ve dolayısıyla kargo salım verimliliğini9 doğrudan belirlediğinden, lipid molar oranı (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0.94:1:0.06) kesin olarak korunmalıdır. Cas9/sgRNA RNP yüklemesinin, oluşum sonrası kompleksleşme yerine hidratasyon adımında yapılması, sulu çekirdek enkapsülasyonu için gereklidir. 200 nm polikarbonat membran üzerinden ekstrüzyon (11 geçiş), tek tip unilameller veziküller üretir; sonikasyon, Cas9 proteinini denatüre edebileceği için bunun yerine kullanılmamalıdır. Bölüm B için, altın nanopartikül boyutu (3–5 nm) kritiktir, çünkü partiküller, X-ışını ışınlaması altında VP'ye etkili Auger elektronu aracılı enerji transferi gerçekleşebilmesi için lipid çift tabakasına gömülecek kadar küçük olmalıdır11. Dox yüklemesi için kullanılan amonyum sülfat gradyan yöntemi, ilaç eklemeden önce dış amonyum sülfatın tamamen diyalize edilmesini gerektirir; eksik diyaliz yükleme verimliliğini düşürecektir.

VP aracılı salım mekanizması korunurken, lipid kompozisyonu farklı uygulamalara göre uyarlanabilir. Örneğin, DOTAP'ın bir kısmının PEGillenmiş bir lipidle (örneğin mol% 5 oranında DSPE-PEG2000) değiştirilmesi, sistemik uygulama için dolaşım süresini iyileştirebilir; ancak bu durum pozitif yüzey yükünü azaltacak ve in vitro ortamda hücresel alımı düşürebilecektir2. DLS ölçümleri PDI > 0,3 gösteriyorsa, ekstrüzyon geçiş sayısını artırın veya membran bütünlüğünü doğrulayın. VP entegrasyonu doğru olmasına rağmen tekil oksijen üretimi düşükse, VP aktivasyonu dalga boyuna özgü olduğundan (Soret bandı için 425 nm'de pik eksitasyon ve Q-bandı için 689–690 nm'de terapötik aktivasyon), LED ışık kaynağının dalga boyunu ve güç yoğunluğunu kalibre edilmiş bir güç ölçer ile doğrulayın9. Zebrafish deneyi için, tedavi edilen gruplarda embriyo mortalitesi %20'yi aşarsa, VP ilişkili fototoksisiteyi minimize etmek için enjeksiyon hacmini veya lipozom konsantrasyonunu azaltın. Tablo 1'deki referans değerlerine göre düzenlenmiş sorun giderme çerçevesi şu şekildedir. PDI > 0,3: ekstrüzyon geçiş sayısını artırın ve membran bütünlüğünü doğrulayın. Doğru VP entegrasyonuna rağmen düşük veya yok denecek kadar az tetiklenmiş salım: 690 nm çıktısını kalibre edilmiş bir güç ölçer ile onaylayın ve VP molar oranını doğrulayın. Embriyo başına ~50'den az nakavt edilmiş yavaş kas lifi: lipozomları yeniden hazırlayın, RNP aktivitesini onaylayın veya ışınlama süresini artırın. Işınlanmamış kontrollerde eGFP sinyal kaybı: hazırlama aşamasından sonraki 48 saat içinde kullanarak ve 4°C'de karanlıkta saklayarak saklama koşullarını kontrol edin ve membran stabilitesini doğrulayın. Xenogreft modelinde, ışınlanmış ve ışınlanmamış lipozom grupları arasında fark olmaması, 3–5 nm altın nanopartikül gömülmesinin onaylanması ve iletilen X-ışını dozunun doğrulanması gerektiğini gösterir.

Işıkla tetiklenen modalitenin (Bölüm A) temel kısıtlaması, doğrudan aktivasyonu yüzeysel olarak erişilebilir dokularla veya fiber optik ışık iletimine uygun olanlarla sınırlayan 690 nm ışığın penetrasyon derinliğidir5. X-ışını ile tetiklenen modalite (Bölüm B) bu derinlik kısıtlamasını aşar, ancak klinik bir lineer hızlandırıcıya erişim gerektirir ve çevredeki dokuları, terapötik dozlarda olsa dahi, iyonize radyasyona maruz bırakır11,12. Her iki formülasyon şu anda, sistemik uygulama için terapötik pencereyi sınırlayabilecek doza bağımlı sitotoksisite ile ilişkili katyonik bir lipid olan DOTAP'a dayanmaktadır2. RNP aracılı gen düzenlemenin geçici doğası güvenlik açısından avantajlıdır, ancak hedef hücre popülasyonunda yetersiz nakavt (knockout) işleminin, nanometrelerin yeniden uygulanması olmaksızın aynı bölgeye tekrarlanan dozlarla artırılamayacağı anlamına gelir. Ayrıca, bu protokoller hücre hatlarında ve küçük hayvan modellerinde doğrulanmıştır; daha büyük hayvan modellerine ve nihayetinde insan klinik uygulamalarına aktarım, GLP koşulları altında formülasyon optimizasyonu, farmakokinetik çalışmalar ve resmi toksikoloji değerlendirmesi gerektirecektir. Özellikle bu protokol; farmakokinetik, biyodağılım veya retinal penetrasyon verilerini içermemektedir. Oküler ve diğer dokulardan ışık penetrasyonu literatürde dalga boyuna, pigmentasyona ve dokuya bağımlı olduğu iyi karakterize edilmiş olsa da (ve optik temizleme ajanlarıyla artırılabilecek olsa da), translasyonel iddialar kanıtlanmadan önce kantitatif farmakokinetik, biyodağılım ve retinal iletim çalışmaları önemli sonraki adımlar olarak kalmaktadır.

mRNA aşılarında kullanılanlar da dahil olmak üzere konvansiyonel LNP sistemleri, endozomal kaçış yoluyla hücresel alım sonrası kargoyu pasif olarak serbest bırakır ve iletim üzerinde zamansal veya mekansal bir kontrol sağlamaz1,2. AAV gibi viral vektörler etkili gen iletimi sağlar ancak paketleme kapasitesi (~4.7 kb), yeniden dozlama sonrası immünojenite ve uygulama sonrası modüle edilemeyen konstitütif transgen ekspresyonu ile sınırlıdırlar3. VP-lipozom platformu; kargo türünden bağımsız, büyük yüklerle (proteinler, RNP kompleksleri ve küçük moleküller) uyumlu, viral olmayan ve tekrarlanan doz immünojenite ve toksikoloji çalışmalarına tabi olmak kaydıyla potansiyel olarak tekrarlı uygulamalarla uyumlu, dışarıdan kontrol edilebilir bir salım mekanizması sunarak bu kısıtlamaları giderir. Optogenetik veya termal duyarlı sistemlerin aksine, VP tabanlı yaklaşım, yerleşik güvenlik verilerine sahip ve özellikle 689 nm Visudyne lazerinin halihazırda standart ekipman olduğu oftalmoloji gibi alanlarda mevcut klinik lazer altyapısıyla uyumlu, klinik olarak onaylanmış bir fotosensitizör kullanır6. Sang ve ark., VP içeren lipid-polimer hibrit nanopartiküllerin kolorektal kanser modellerinde radyodinamik tedavi etkinliğini artırdığını göstererek, VP aracılı ROS üretiminin farklı nanopartikül mimarileri genelindeki uyarlanabilirliğini doğrulamıştır12.

Burada açıklanan yöntemler, üç oftalmik durumla özel olarak ilgilidir. Neovasküler AMD'de, anti-VEGF enjeksiyonlarının yükü, optimal sonuçların önünde kritik bir engel olmaya devam etmektedir. Gerçek dünya kayıt verileri, klinik araştırma protokollerine kıyasla belirgin bir yetersiz tedaviye (birinci yılda ortalama 7,3'e karşı 12 enjeksiyon, hastaların %38,8'inin tedaviyi bırakması ve minimal görme keskinliği kazanımı)14, ayrıca sık dozlamaya rağmen uzun vadeli görme kaybına23 işaret etmektedir. Bu yükü azaltmak için geliştirilen AAV gen tedavileri —ixoberogene soroparvovec15, ABBV-RGX-31416 ve RMAT olarak tanımlanan 4D-150 (%83 enjeksiyon azalması)24— yine de anti-VEGF transgenlerini sürekli olarak eksprese etmekte olup titre edilemez veya geri çekilemezler. Sürekli VEGF baskılanmasını geografik atrofi ile ilişkilendiren kanıtlar göz önüne alındığında (CATT17; 4.609 gözlük bir meta-analiz18; ve sekiz yıl içinde atrofi prevalansının %78,3'e yükselmesi25), bu durum potansiyel bir endişe kaynağıdır. VEGF-A'yı hedefleyen CRISPR-Cas9 taşıyan ışık tetiklemeli bir VP-lipozom sistemi, bunun yerine mekânsal olarak sınırlı gen nakavtına imkan tanıyarak, gen düzenlemenin kalıcılığını korurken başlangıç düzenleme olayının klinisyen kontrollü mekânsal ve zamansal kapılanmasını sağlayabilir. Preklinik çalışmalar bu yaklaşımın fizibilitesini desteklemektedir. Cas9 mRNA'sı ve VEGFA'yı hedefleyen sgRNA'nın LNP ile birlikte verilmesi, farelerde lazerle indüklenen koroidal neovaskülarizasyonu (CNV) azaltmış26, PEG-varyant LNP'ler retinal pigment epitelyumunda (RPE) genom düzenlemesi sağlamış27 ve peptit yönlendirmeli LNP'ler insan dışı primatlarda fotoreseptörlere mRNA iletmişti28. Bununla birlikte, 2026 başı itibarıyla hiçbir LNP tabanlı retinal gen tedavisi klinik deneylere girmemiştir29, bu da translasyonel fırsatı vurgulamaktadır. Stargardt hastalığında, yaklaşık 6,8 kb'lık ABCA4 kodlama dizisi AAV paketleme kapasitesini aşmakta ve bu durum, azalmış transdüksiyon verimliliğine sahip çift vektör stratejilerini gerekli kılmaktadır19. Klinik adaylar arasında, gen-agnostik modifiye tedavi OCU410ST31 ile birlikte SB-007 ve VG801 çift-AAV platformları yer almaktadır30. Viral olmayan nükleik asit iletimi, AAV paketleme kısıtlamalarını aşabilir. ABCA4 plazmidi taşıyan PEG-ECO nanopartikülleri, Abca4-/- farelerde A2E birikimini azaltmış20, ayrı çalışmalar ise büyük retinal DNA konstrüktlarının iletimini32 ve oküler dokularda LNP aracılı mRNA ekspresyonunu33 kanıtlamıştır. Makula ve foveanın lokalize tedavisi merkezi görmeyi korumak için yeterli olduğundan, VP-lipozomlar gen tedavisi yükünü tam olarak bu bölgelere yüksek konsantrasyonlarda iletmek için oldukça uygundur. Uveal melanom için verteporfin üç tamamlayıcı mekanizma üzerinden etki eder: PDT aracılı sitotoksisite, YAP/TAZ yolak inhibisyonu (YAP1 ekspresyonu en güçlü metastatik belirteçler olan monosomi 3 ve BAP1 kaybı ile korele olur)21 ve cGAS-STING aktivasyonu yoluyla immünojenik hücre ölümü. VP aracılı YAP inhibisyonu ve PDT'nin anti-PD-L1 tedavisi ile kombine edilmesi, immünolojik olarak soğuk tümörleri immünolojik olarak aktif tümörlere dönüştürerek, ortotopik modellerde tümör büyümesini belirgin şekilde baskılamış ve sağkalımı uzatmıştır22. Bu bulgular, koroidal melanom için birinci basamak tedavi olarak verteporfin tabanlı PDT için bildirilen %80 yanıt oranıyla tutarlıdır34. Gözün 689 nm aktivasyon için optik erişilebilirliği, çoğu uveal melanomun iyi tanımlanmış konumuyla birlikte, VP-lipozomları lokalize tedavi sağlamak için gelecek vaat eden bir platform olarak konumlandırmakta ve mevcut brakiterapi ve proton demeti yaklaşımlarıyla ilişkili morbiditeyi potansiyel olarak azaltmaktadır.

Yukarıda tartışılan oftalmik ve onkolojik uygulamaların ötesinde, VP-lipozom platformu, dışarıdan kontrollü ve talep üzerine yük salınımı gerektiren her türlü terapötik bağlam için uygulanabilir durumdadır. Potansiyel uygulamalar arasında, transkütan aydınlatma ile erişilebilen dermatolojik durumlarda ışıkla tetiklenen gen düzenleme, klinik radyoterapi fraksiyonasyon programlarıyla senkronize edilmiş X-ışını tetiklemeli kemoterapi salınımı ve gelişim biyolojisi çalışmalarında mekansal olarak desenlenmiş gen nakavtı yer almaktadır. İn vivo ortamda spasyotemporal olarak kontrollü genom düzenleme için Mag-ABE fotoaktive edilebilir baz düzenleyici35 ve spasyotemporal kontrollü CRISPR-Cas9 düzenleme ve fotodinamik terapi için NIR-aktive edilmiş yükseltme nanoparçacık sistemi36 dahil olmak üzere, retinal olmayan dokularda çeşitli fotoaktive edilebilir gen düzenleme sistemleri gösterilmiştir. Oftalmolojide, kalıcı VEGF baskılama stratejilerine olan artan ilgi, uzun süreli terapötik etkinlik ile biyolojik aktivitenin zamanlaması ve konumu üzerinde dış kontrolü birleştiren iletim sistemlerine olan ihtiyacı daha da vurgulamaktadır37. Bu üretim yöntemlerinin, gelişen retinal LNP iletim teknolojileri ve fotoaktive edilebilir gen düzenleme sistemleriyle entegrasyonu, bireysel olarak valide edilmiş bileşenlerin birleşimini temsil etmekte olup, bunların gözdeki ortak uygulaması açık ve potansiyel olarak yüksek etkili bir araştırma sınırı olmayı sürdürmektedir. Grubumuzda yürütülen çalışmalar, subretinal ve intravitreal iletim yolları için formülasyonların optimizasyonu, büyük hayvan oküler modellerinde güvenlik profillerinin değerlendirilmesi ve X-ışını tetiklemeli modalitenin klinik onkolojide standart radyoterapi protokolleri ile eş zamanlı kullanımı için uyarlanması üzerine yoğunlaşmıştır.

Açıklamalar

Y.A.A., burada açıklanan ışıkla aktive edilen lipid nanopartikül teknolojisiyle ilgili patentlere sahip olan EosGene Therapeutics Pty Ltd'nin direktörü ve kurucu ortağıdır. E.M.G. ve W.D., EosGene Therapeutics'in kurucu ortaklarıdır.

Teşekkürler

Yazarlar, Macquarie University Zebrafish Facility'nin (zebrafish çalışmaları) ve Macquarie University Hayvan Etik Kurulu'nun sağladığı imkanlar ve teknik destek için teşekkür ederler. Bu çalışma kısmen ARC Centre of Excellence for Nanoscale BioPhotonics (CE140100003) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca EosGene Therapeutics Pty Ltd.'den aldıkları destek için teşekkür ederler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
20 nm filtrasyon membranı (Anotop 10 veya eşdeğeri)Whatman (Cytiva)N/AEnkapsülasyon verimliliği ölçümleri sırasında serbest Cas9'un ayrıştırılması için kullanılır
690 nm LED ışık kaynağıThorlabsM690L4VP aracılı lipozom yük boşalmasını tetiklemek için ışık kaynağı; ayarlanabilir güç yoğunluğu
Antibiyotik–Antimikotik (100X)Thermo Fisher Scientific15240062Hücre kültürü takviyesi; %1 nihai konsantrasyon
Argon gaz silindiri ve regülatörüN/AN/ALipid film hazırlama sırasında solvent evaporasyonu için kullanılır
Avanti Mini EkstrüderAvanti Polar Lipids610000Lipozom boyut standardizasyonu için 200 nm polikarbonat membranlarla kullanılan manuel ekstrüzyon sistemi
BALB/c çıplak fareler (dişi, 5–6 haftalık)Animal Resources CentreN/AHCT116 ksenogreft tümör modeli için kullanılan immünodefizyan fareler
BCA Protein Analiz KitiThermo Fisher ScientificN/ASerbest Cas9'un kantifikasyonu ve enkapsülasyon verimliliği ölçümleri için kullanılır
Bio-Rad ChemiDoc MP Görüntüleme SistemiBio-Rad Laboratories12003154Jel ve western blot görüntüleme sistemi
KalseinSigma-AldrichC0875Salım analizleri için floresan boya; yüksek konsantrasyonlarda kendi kendini söndürür (self-quenching)
Cary 5000 UV-Vis-NIR SpektrofotometreAgilent TechnologiesN/ALipozomların ve verteporfinin UV-Vis absorbsiyon spektroskopisi
CCD841 CoN hücreleri (insan normal kolon epitelyal)ATCCCRL-1790Normal kolon epitelyal hücre hattı; kanser olmayan kontrol olarak kullanılır
KloroformSigma-Aldrich288306Lipid film hazırlama için organik solvent
KolesterolSigma-AldrichC8667Işıkla tetiklenen formülasyonda kullanılan lipozom membran bileşeni
Klinik lineer hızlandırıcı (6 MeV foton demeti)Varian Medical SystemsN/AIşınlama çalışmaları için klinik X-ışını kaynağı
Dijital kumpasN/AN/AKsenogreft tümör hacmi ölçümleri için kullanılır
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-Aldrich472301Verteporfin stok hazırlama için solvent
DOPC (1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin)Avanti Polar Lipids850375PX-ışını ile tetiklenen formülasyonda kullanılan lipid bileşeni
DOPE (1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin)Sigma-AldrichP1223Işıkla tetiklenen formülasyonda kullanılan yardımcı lipid
DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonyum-propan)Avanti Polar Lipids890890PHer iki formülasyonda kullanılan katyonik lipid
Doksorubisin hidroklorürSigma-AldrichD1515X-ışını ile tetiklenen lipozomlara yüklenen kemoterapötik ilaç
DSPE-PEG2000Avanti Polar Lipids880120PX-ışını ile tetiklenen formülasyonda kullanılan PEGillenmiş lipid
Dulbecco Modifiye Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092HEK293 ve PC12 hücreleri için hücre kültürü ortamı
Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190144Yıkama tamponu
Fetal Bovin Serum (FBS)Thermo Fisher Scientific10099141Hücre kültürü takviyesi; %10 nihai konsantrasyon
Fluorolog-Tau3 SpektrofluorometreHORIBA ScientificN/AVerteporfin karakterizasyonu için floresans spektroskopisi
Odak istifleme yazılımı (örn. Zerene Stacker)N/AN/AZebrafish görüntülemede odak istiflenmiş görüntü oluşturma için kullanılır
Dondurarak kurutucu (Alpha 1-4 LDplus)Martin Christ / John Morris ScientificN/AVakumla kurutma ve solvent uzaklaştırma için kullanılır
GFP sgRNAThermo Fisher ScientificA35943eGFP'yi hedefleyen tek kılavuz RNA; nakavt doğrulaması için kullanılır
Altın nanopartiküller (3–5 nm, sitrat stabilize)NanoComposixN/AX-ışını ile tetiklenen formülasyonda kullanılan radyosensitizör
GraphPad PrismGraphPad Software7.0İstatistiksel analiz ve veri görselleştirme
HCT116 hücreleri (insan kolorektal karsinom)ATCCCCL-247In vitro ve in vivo çalışmalar için kullanılan kolorektal kanser hücre hattı
HEK293/GFP hücreleriGenTargetSC001CRISPR nakavt doğrulaması için kullanılan stabil GFP eksprese eden hücre hattı
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570Nükleer boya; 5 µg/mL çalışma konsantrasyonu
Görüntü analiz yazılımı (örn. Imaris)Bitplane (Oxford Instruments)N/ANakavt edilmiş yavaş kas liflerinin kantifikasyonu için kullanılır
ImageJ/FijiNational Institutes of Health (NIH)Açık kaynakGörüntü analiz yazılımı
Evirtilmiş floresan mikroskopLeica MicrosystemsDMi3000Zebrafish reporter görüntüleme ve GFP floresans değerlendirmesi için kullanılır
IVIS SpectrumCT In Vivo Görüntüleme SistemiPerkinElmer128201In vivo floresan görüntüleme sistemi
JEOL JEM-1400 Transmisyon Elektron MikroskobuJEOLJEM-1400Lipozomların TEM görüntülemesi
Leica SP2 Konfokal MikroskopLeica MicrosystemsN/AHücresel alımın konfokal görüntülemesi
Düşük erime noktalı agarozN/AN/AGörüntüleme sırasında zebrafish embriyolarını sabitlemek için kullanılır
Lipofektamin 2000Thermo Fisher Scientific11668019Pozitif kontrol olarak kullanılan transfeksiyon reaktifi
Living Image YazılımıPerkinElmerN/AGörüntü elde etme ve analiz yazılımı
McCoy's 5A OrtamıThermo Fisher Scientific16600082HCT116 hücreleri için hücre kültürü ortamı
Mikroenjeksiyon sistemiN/AN/ATek hücre evresindeki zebrafish embriyosu mikroenjeksiyonu için kullanılır
MTS Hücre Proliferasyon AnaliziPromegaG3582Hücre canlılık analizi
NanoDrop SpektrofotometreThermo Fisher ScientificND-2000RNA saflık ve konsantrasyon ölçümleri
Nükleaz içermeyen suThermo Fisher ScientificR0582CRISPR-Cas9 RNP hazırlama için kullanılır
Opti-MEM Azaltılmış Serum OrtamıThermo Fisher Scientific31985070Transfeksiyon ortamı
Paraformaldehit (%4)Sigma-AldrichP6148Histolojik analiz için fiksatif
PC12 hücreleri (sıçan feokromositoma)ATCCCRL-1721Alım çalışmaları için kullanılan nöron benzeri hücre hattı
Polikarbonat membran filtreler (200 nm)Avanti Polar Lipids610006Lipozom boyutlandırma için ekstrüzyon membranları
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN74134RNA ekstraksiyon kiti
Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG)Thermo Fisher ScientificS36002Singlet oksijen tespiti için floresan prob
Slide-A-Lyzer MINI Diyaliz Cihazları (10 kDa MWCO)Thermo Fisher Scientific69570Lipozom hazırlama ve ilaç yükleme için diyaliz cihazları
SYBR Gold Nükleik Asit Jel BoyasıThermo Fisher ScientificS11494Nükleik asit jel boyası
Tg(ubi:EGFP) zebrafishZebrafish International Resource CenterZDB-GENO-080606-2In vivo CRISPR doğrulaması için kullanılan transgenik zebrafish
TNF-α (insan rekombinant)Life TechnologiesRTNFAITNFAIP3 indüksiyon çalışmalarında kullanılan sitokin
TNFAIP3 sgRNAThermo Fisher ScientificN/ATNFAIP3'ü hedefleyen sgRNA
Trikain metansülfonat (MS-222)N/AN/AGörüntüleme öncesinde kullanılan zebrafish anestetiği
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Lipozom lizisi ve salım analizleri için kullanılan deterjan
TrueCut Cas9 Proteini v2Thermo Fisher ScientificA36498CRISPR-Cas9 RNP hazırlama için kullanılan Cas9 nükleaz
Tripsin-EDTA (%0,25)Thermo Fisher Scientific25200056Hücre disosiyasyon reaktifi
Uranyl asetat (%2)Electron Microscopy Sciences22400TEM görüntüleme için negatif boya
VerteporfinSigma-AldrichSML0534-5MGLipozom formülasyonlarına dahil edilen fotosensitizör
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalZEN3600Dinamik ışık saçılımı ve zeta-potansiyel ölçümleri

Kaynaklar

  1. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-15.
  2. Cullis PR, Hope MJ. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Mol Ther. 2017;25(7):1467-75.
  3. Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358-78.
  4. Kim S et al. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014;24(6):1012-19.
  5. Wilson BC, Patterson MS. The physics, biophysics and technology of photodynamic therapy. Phys Med Biol. 2008;53(9):R61-R109.
  6. Scott LJ, Goa KL. Verteporfin. Drugs Aging. 2000;16(2):139-46.
  7. Treatment of Age-related Macular Degeneration With Photodynamic Therapy (TAP) Study Group. Photodynamic therapy of subfoveal choroidal neovascularization in age-related macular degeneration with verteporfin: one-year results of 2 randomized clinical trials—TAP Report 1. Arch Ophthalmol. 1999;117(10):1329-45. doi:10.1001/archopht.117.10.1329.
  8. Boettner EA, Wolter JR. Transmission of the ocular media. Invest Ophthalmol. 1962;1(6):776–83.
  9. Aksoy YA et al. Spatial and temporal control of CRISPR-Cas9-mediated gene editing delivered via a light-triggered liposome system. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(47):52433-44.
  10. Ogilby PR. Singlet oxygen: there is indeed something new under the sun. Chem Soc Rev. 2010;39(8):3181-209.
  11. Deng W et al. Controlled gene and drug release from a liposomal delivery platform triggered by X-ray radiation. Nat Commun. 2018;9(1):2713.
  12. Sang R et al. Unlocking the in vivo therapeutic potential of radiation-activated photodynamic therapy for locally advanced rectal cancer with lymph node involvement. EBioMedicine. 2025;116:105724.
  13. Fleckenstein M, Schmitz-Valckenberg S, Chakravarthy U. Age-related macular degeneration: a review. JAMA. 2024;331(2):147-57.
  14. Wykoff CC et al. Impact of anti-VEGF treatment and patient characteristics on vision outcomes in neovascular age-related macular degeneration: up to 6-year analysis of the AAO IRIS Registry. Ophthalmol Sci. 2024;4(2):100421.
  15. Khanani AM et al. Safety and efficacy of ixoberogene soroparvovec in neovascular age-related macular degeneration in the United States (OPTIC): a prospective, two-year, multicentre phase 1 study. EClinicalMedicine. 2024;67:102394.
  16. Campochiaro PA et al. Gene therapy for neovascular age-related macular degeneration by subretinal delivery of RGX-314: a phase 1/2a dose-escalation study. Lancet. 2024;403(10436):1563-73.
  17. Maguire MG et al. Five-year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the Comparison of Age-related Macular Degeneration Treatments Trials. Ophthalmology. 2016;123(8):1751-61.
  18. Eshtiaghi A et al. Geographic atrophy incidence and progression after intravitreal injections of anti-vascular endothelial growth factor agents for age-related macular degeneration: a meta-analysis. Retina. 2021;41(12):2424-35.
  19. Li R et al. Split AAV8 mediated ABCA4 expression for gene therapy of mouse Stargardt disease (STGD1). Hum Gene Ther. 2023;34(13-14):616-28.
  20. Sun D et al. Effective gene therapy of Stargardt disease with PEG-ECO/pGRK1-ABCA4-S/MAR nanoparticles. Mol Ther Nucleic Acids. 2022;29:823-35.
  21. Brouwer NJ et al. Targeting the YAP/TAZ pathway in uveal and conjunctival melanoma with verteporfin. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2021;62(4):3.
  22. Zhang S et al. Combination of YAP inhibition and photodynamic therapy induces dual DNA damage and activates STING pathway to enhance immunotherapy in uveal melanoma. Redox Biol. 2026;89:103965. doi:10.1016/j.redox.2025.103965.
  23. Cheema MR, DaCosta J, Talks J. Ten-year real-world outcomes of anti-vascular endothelial growth factor therapy in neovascular age-related macular degeneration. Clin Ophthalmol. 2021;15:279-87.
  24. Kay C et al. Interim results from the phase 2b population extension cohort in the PRISM clinical trial evaluating 4D-150 in adults with neovascular (wet) age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2025;66(8):1861.
  25. Vofo BN et al. Long-term macular atrophy growth in neovascular age-related macular degeneration: influential factors and role of genetic variants. Eye (Lond). 2025;39(9):1717-23.
  26. Cao D et al. Dynamically covalent lipid nanoparticles mediate CRISPR-Cas9 genome editing against choroidal neovascularization in mice. Sci Adv. 2025;11(28):eadj0006.
  27. Gautam M et al. Lipid nanoparticles with PEG-variant surface modifications mediate genome editing in the mouse retina. Nat Commun. 2023;14(1):6468.
  28. Herrera-Barrera M et al. Peptide-guided lipid nanoparticles deliver mRNA to the neural retina of rodents and nonhuman primates. Sci Adv. 2023;9(2):eadd4623.
  29. Wu H et al. Innovative gene delivery systems for retinal disease therapy. Neural Regen Res. 2026;21(2):542-52.
  30. Riedmayr LM et al. mRNA trans-splicing dual AAV vectors for (epi)genome editing and gene therapy. Nat Commun. 2023;14(1):6578.
  31. Khanani AM et al. A novel modifier gene therapy to treat Stargardt disease: Phase 1 GARDian1 Trial Insights. Eye (Lond). 2026;40:429–30.
  32. Goddaer S et al. Overcoming size barriers in retinal gene therapy via lipid nanoparticle-mediated delivery of full-length EYS DNA. Drug Deliv Transl Res. 2026;16(8):2921–36. doi:10.1007/s13346-025-02036-y.
  33. Chambers CZ et al. Lipid nanoparticle-mediated delivery of mRNA into the mouse and human retina and other ocular tissues. Transl Vis Sci Technol. 2024;13(7):7.
  34. Yordi S, Soto H, Bowen RC, Singh AD. Photodynamic therapy for choroidal melanoma: What is the response rate? Surv Ophthalmol. 2021;66(4):552-59.
  35. Zou Q et al. Photoactivatable base editors for spatiotemporally controlled genome editing in vivo. Biomaterials. 2023;302:122328.
  36. Zeng J et al. Near-infrared optogenetic nanosystem for spatiotemporal control of CRISPR-Cas9 gene editing and synergistic photodynamic therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 2025;17(1):701-10.
  37. Campochiaro PA. Sustained suppression of VEGF for treatment of retinal and choroidal vascular diseases. Am J Ophthalmol. 2025;277:1-6.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

MedicineVP liposomeverteporfinphotodynamic therapyCRISPR Cas9gene editinglight triggered releaseX ray activationspatiotemporal controldrug deliveryophthalmology

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.