AAVS1'de Doksisiklin İndüklenebilir ASCL1/DLX2 İfadesi kullanılarak İnsan İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden GABAerjik Nöronların Üretimi

Özet

Bu protokol, insan tarafından indüklenen pluripotent kök hücrelerden GABAerjik nöronlar üretme yöntemini tanımlar; doksisiklin indüklenebilir transgenleri AAVS1. güvenli liman lokusuna entegre eder. Stabil, homojen transgen ifadesi, GABAergik nöronlara doğrudan farklılaşma için etkili bir yaklaşım sunarken, lentiviral yaklaşımlarda yaygın bir sorun olan transgen susturmasını sınırlar.

Özet

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler), insan nörolojik hastalıklarını in vitro modellemek için eşi benzeri görülmemiş bir fırsat sunar. Bu çalışmalar için gamma-aminobutirik asit (GABAerjik) nöronları gibi tanımlanmış nöronal popülasyonların güvenilir şekilde oluşturulması şarttır. Bu protokol, doksisiklin indüklenebilir bir sistem kullanarak hiPSC'leri GABAerjik nöronlara ayırmak için sağlam bir yöntemi detaylandırır. Yaklaşım, transkripsiyon faktörleri ASCL1 ve DLX2'nin güvenli liman adeno-ilişkili virüs entegrasyon alanı 1 (AAVS1.) loküsuna CRISPR/Cas9 aracılı knock-in yoluyla kararlı entegrasyonuna dayanır. Bu hedefli entegrasyon, rastgele lentiviral entegrasyonda sıkça gözlemlenen transgen susturmasını önler. Protokol, hiPSC'lerin bakımını, transgen entegrasyonu için nükleofeksiyon sürecini, başarılı şekilde mühendislik yapımı hücreleri zenginleştirmek için puromisin seçimini ve adım adım farklılaşma prosedürünü kapsar. Doksisiklin ile indüksiyonda, mühendislik ürünü hiPSC'ler hücre döngüsünden hızla çıkar, nöron morfolojisi kazanır ve 21 gün içinde GABAerjik soy belirteçlerini ifade eder. Önemli adımlar, nöro-indüksiyon ve belirli büyüme faktörleri kullanılarak sonraki olgunlaşma ile olgunlaşma sırasında hücresel yapışmayı iyileştirmek için olası yaklaşımları içerir. Bu standartlaştırılmış yöntem, GABAerjik soy belirteçlerini ifade eden indüklenmiş nöronlardan zengin popülasyonlar elde eder ve sinirbilim araştırmaları ile hücresel modelleme için değerli bir araç sağlar.

Giriş

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler), insan nörolojik hastalıklarını in vitro modellemek için benzersiz bir platform sağlar. ve gelişimi ve dejenerasyonu tetikleyen karmaşık moleküler mekanizmaları^{incelemek için 1}. Bu teknoloji, hastaya özgü hücresel modellerin oluşturulmasını mümkün kılarak sindromik siliopatilerde erken nörogelişimsel^{anomalilerden} sporadik Alzheimer hastalığında gözlemlenen ince epigenomik değişikliklere kadar geniş bir durum yelpazesini incelemek için^{olanak tanır 3}. Sonuç olarak, hiPSC'lerin yönlendirilmiş farklılaşması modern moleküler sinirbilimin temel taşlarından biri haline gelmiştir.

İnsan nörolojik süreçlerinin nüanslarını etkili bir şekilde yakalamak için, son derece spesifik ve saf nöronal alt tipler oluşturmak şarttır. Örneğin, insan^{nöronları 4'teki} MECP2 gibi proteinlerin spesifik transkripsiyonel rollerini açıklamak veya çevresel duyusal nöronların SARS-CoV-2 5 gibi viral enfeksiyonlara karşı hedeflenmiş savunmasızlıklarını değerlendirmek için tanımlanmış nöronal popülasyonlar^gereklidir. Ayrıca, fonksiyonel mikroglia'nın 3D beyin organoidlerine dahil edilmesi gibi karmaşık ve fizyolojik olarak ilgili mikro ortamlar oluşturmak, temelde sağlam ve öngörülebilir farklı sinir ve glial hatların oluşturulmasına^dayanır. Bu alt tipler arasında, GABAerjik nöronlar merkezi sinir sistemindeki kritik inhibitör rolleri ve çeşitli nörolojik ile psikiyatrik bozukluklarda etkisi nedeniyle özellikle ilgi^çekicidir. Bu yöntemin genel amacı, hiPSC'lerin GABAerjik soy belirteçlerini ifade eden indüklenmiş nöronlara yönlendirilmiş farklılaştırılması için güvenilir, verimli ve tekrarlanabilir bir protokol sağlamaktır. Dış sinyal moleküllerine dayanan GABAerjik nöronlar için geleneksel yönlendirilmiş farklılaşma protokolleri, zaman alıcı, oldukça değişken ve heterojen hücre popülasyonlarına yol açabilir⁸.

Bu sınırlamaları aşmak için, transkripsiyon faktörüyle yönlendirilen ileri programlama güçlü bir alternatif^{olarak ortaya çıkmıştır9}. Bu protokol, pronöral transkripsiyon faktörleri ASCL1 ve DLX2^10'un ekspresyonunu sürmek için dokksiklin-indüklenebilir bir ifade sistemi kullanır. Bu transgenleri CRISPR/Cas9 kullanarak adeno-ilişkili virüs entegrasyon alanı 1 (AAVS1.) güvenli liman lokusuna hedefleyerek bu yöntem, rastgele lentiviral entegrasyonla ilişkili yaygın transgen susturma^{sorununu aşmaktadır 10}. Donör yapısı, seçildikten sonra transgen pozitif hücreleri izlemek için mCherry gibi bir floresan raporlayıcı içerir. Bu strateji, rastgele entegrasyon yaklaşımlarından daha homojen transgen ifadesini desteklemeyi amaçlamaktadır; ancak her mühendislik hattı için ifade kararlılığı ve farklılaşma tekrarlanabilirliği doğrulanmalıdır. Bu standartlaştırılmış yöntem, yaklaşık 21 gün içinde GABAerjik soy belirteçlerini ifade eden indüklenmiş nöronlardan zengin popülasyonlar üretir; bu zaman dilimi geleneksel küçük molekül^{yaklaşımı 8,10'dan} daha kısadır. Bu protokol, yüksek içerikli mikroskopi, tek hücreli transkriptomik veya fonksiyonel fizyolojik testler gibi sonraki uygulamalar için ölçeklenebilir, tutarlı nöronal popülasyonlara ihtiyaç duyan araştırmacılar için son derece uygundur.

Protokol

DIKKAT: İnsan hiPSC kültürleri, kurumsal biyogüvenlik prosedürleri kapsamında potansiyel olarak biyolojik zararlı malzeme olarak ele alınmalıdır. Tüm insan hiPSC kültür prosedürlerini steril teknikle sertifikalı Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirin. İnsan hücreleri, insan hücrelerine maruz kalan ortamlar ve CRISPR/Cas9 plazmid materyali içeren tüm atıklar, bertaraftan önce yerel biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak dezinfekte edilmelidir. Doksisiklin, puromisin, DMSO ve diğer kimyasal reaktifler eldiven ve uygun göz ile cilt koruması ile ele alınmalı, atıklar ise kurumsal kimyasal atık prosedürlerine uygun olarak atılmalıdır. Bazal membran ekstraktı (BME) steril bir teknikle işlenmeli ve erken polimerleşmeyi önlemek için kullanılmadan önce buzda saklanmalıdır. Sıvı azot depolama ve kriyovial taşıma, uygun kriyojenik eldivenler, yüz koruma ve dondurma sırasında soğuk yanıklar veya şişe patlamasından kaçınmak için dikkatli olmalı.

NOT: CRISPR/Cas9 aracılı düzenleme ve nöronal farklılaşmadan önce, hiPSC kültürleri önceden tanımlanmış kalite kontrol kriterlerini karşılamalıdır. Hücrelerin mikoplazma için negatif olarak onaylanması, normal karyotip veya kabul edilebilir genomik bütünlük profili göstermesi ve OCT4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 ve/veya SSEA4 dahil olmak üzere plüripotensi belirteçlerinin sağlam ifadesini sürdürmelidir. Kültürler, yüksek nükleer-sitoplazmik oran, belirgin koloni sınırları ve minimal spontan farklılaşma ile tipik kompakt hiPSC koloni morfolojisi sergilemelidir. Önerilen geçiş aralığı içinde aktif olarak çoğalan kültürler kullanılmalı ve hücreler laboratuvarda tanımlanan maksimum geçiş sayısını, genellikle 40 geçişin altında, aksi doğrulanmadıkça aşmamalıdır. Anormal morfoloji, aşırı spontan farklılaşma, zayıf büyüme, onaylanmış kontaminasyon veya genomik istikrarsızlık kanıtı gösteren kültürler düzenleme ve farklılaştırma deneylerinden hariç tutulmalıdır. Bu protokol için gerekli tüm materyaller, medya tarifleri dahil, Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Reaktiflerin ve kültür plakalarının hazırlanması

1. Dondurma ortamını, 40 mL serum değişimi (KOSR) ve 10 mL dimetil sülfoksit (DMSO) 50 mL'lik konik bir tüpte birleştirerek hazırlayın.
2. Dondurma ortamını 10 kez yukarı ve aşağı pipetle homojenleştirin. Çözeltiyi 4 °C'de 1 aya kadar sakla.
3. Bazaz membran ekstraktını (BME) Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medium/F12 (DMEM/F12) ortamında son konsantrasyon 80 μg/mL olarak seyreltin.
   NOT: Sulandırmadan önce, alınan BME çözümünün konsantrasyonunu satıcının web sitesindeki lot numarasıyla doğrulayın.
4. Her kuyu başına 1 mL seyreltilmiş BME 6 kuyruklu bir plakaya ekleyin. Stok BME'yi hemen 4 °C'ye 1 aya kadar geri getirin.
5. Levhayı eğip çözeltiyi kuyunun tüm yüzeyine eşit şekilde dağıtın. Kaplamasız alanlar olmadığından emin olun.
6. Plakayı kullanmadan önce en az 30 dakika 37 °C'de kuluçka yapın.
   NOT: Maksimum kuluçka süresi yoktur. Eğer 1 günden fazla kuluçka yaparsanız, DMEM/F-12'nin buharlaşmadığından emin olun. Bir kuyu için kullanılan BME çözeltisi sadece bir kez ikinci bir kuyuyu kaplamak için yeniden kullanılabilir. BME'nin oda sıcaklığında manipülasyonu, hızlı polimerizasyonu nedeniyle kısa olmalıdır.

2. HiPSC'lerin bakımı ve aktarılması

NOT: Bu protokolde, hiPSC bakım ortamı mTeSR plus anlamına gelir. mTeSR plus, rutin bakım, geçiş, nükleofeksiyon sonrası iyileşme ve puromisin seçimi için önerilen ortamdır.

1. Hücreler %60 birleşime ulaştığında yaklaşık her 4–6 günde bir hiPSC geçişi yapın.
2. Kuyulardan eşimli pipet kullanarak kültür ortamını aspire edin.
3. Kuyuya 1 mL ReLeSR ekleyin ve oda sıcaklığında 30 saniye kuluçka yapın.
4. Dissosiyasyon reaktifini aspire edin ve plakayı 37 °C'de 8 dakika kuluçka yapın.
5. 5 mL pipet kullanarak nazikçe 1 mL hiPSC bakım ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpte toplayın.
6. 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisiyle mikrosantrifüj tüpünde karıştırın. Karışımdan 10 μL hücre sayaç slaytına yükleyerek canlı hücre konsantrasyonunu belirleyin.
7. BME kaplamayı önceden hazırlanmış bir kuyiden aspire edin. 2 mL hiPSC bakım ortamı eklenerek Rho ile ilişkili sarmal kinaz (ROCK) inhibitörü (Y-27632; 10 μM final) eklendi.
8. Kuyuya 100.000 hiPSC tohumu ekin, %90 > uygulanabilirlik hedefle. Plakayı sekiz şeklinde hareket ettirerek hücrelerin homojen dağılımı sağlanır.
9. Hücreleri %5_CO2 ile 37 °C'de kuluçka yapın.
10. 24 saat sonra, ortamı ROCK inhibitörü olmayan 2 mL taze mTeSR plus ortam ile değiştirin.
    NOT: ROCK inhibitörü varlığında hücre morfolojisinde geçici bir değişiklik (hücre uzaması) beklenir. Hücrelerin çıkarıldığından sonra karakteristik morfolojilerini geri kazandıklarını doğrulayın.

3. HiPSC'lerin çekirdek yapısı

1. Birleşme yaklaşık %60'a ulaştığında hücreleri geçirin.
   NOT: Bu protokolde, yaklaşık %60 birleşim, kuyu yüzeyinin biraz daha fazlasını kaplayan aktif büyüyen hiPSC kolonilerine karşılık gelir; koloniler arasında görünür boşluk ve minimum spontan farklılaşma vardır. Koloniler nükleofeksiyon sırasında aşırı büyümek, yoğun şekilde birleşmek veya yoğun, çok katmanlı merkezler sergilememek zorundadır.
2. Nükleofeksiyon cihazının açık olduğundan ve nükleofeksiyon takviyesinin P3 nükleofeksiyon çözeltisine eklendiğinden emin olun. Bir buz kovası hazırla.
3. Buz üzerine yerleştirilen mikrosantrifüj tüpüne 110 μL nükleofeksiyon çözeltisi P3 eklenin.
4. Tüpe 1 μg CRISPR/Cas9 plazmidi ve doksisiklin indüklenebilir ASCL1-P2A-DLX2 içeren donör plazmid eklenin. Kaset, floresan muhabir ve puromisin dirençli kaset. Kabarcıq eklemeden nazikçe karıştırın.
5. Varış plakasını iki kaplamalı kuyudan BME'yi aspire ederek hazırlayın. Her kuyuya 2 mL ROCK inhibitörü içeren hiPSC bakım ortamı ekleyin ve plakayı 37 °C'de inkübe yapın.
6. 2.2 ile 2.5. adımlarda açıklandığı gibi, 6 kuyululu bir plakanın kuyusundan %60 birleşimde hiPSC'leri ayırın. Süspansiyonu steril bir tüpe aktarın ve 500 x g sıcaklıkta oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
7. Üstten atılan ve hücre peletini, plazmidleri içeren 110 μL nükleofeksiyon çözeltisi P3'e yeniden süspansiyona yerleştirin. Baloncuk oluşumunu önlemek için nazikçe pipet yapın.
8. Hücre süspansiyonunun 100 μL'sini buz üzerine yerleştirilmiş bir nükleofeksiyon küvetine aktarın.
9. Küveti nükleofektor cihazına yerleştirin ve hiPSC'ler için CB-150 programını çalıştırın.
10. Plastik bir Pasteur pipeti kullanarak hücreleri hemen alın. Hücre süspansiyonunun eşit hacimlerini önceden hazırlanmış iki kuyuya aktarın.
11. Hücreleri sekiz şeklinde bir hareketle dağıtın ve 37 °C'de kuluçka yapın.
12. 24 saat sonra, ortamı ROCK inhibitörü olmayan mTeSR plus ortam ile değiştirin. Varsa floresansı gözlemleyerek nükleofeksiyon verimliliğini doğrulayın.

4. Antibiyotik seçimi

DIKKAT: Puromycin zehirlidir. Uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla müdahale edin ve atıkları kurumsal yönergelere uygun olarak bertaraf edin.

NOT: Düzenlenmiş hiPSC'leri seçmeden önce, her hiPSC hattı için optimal puromisin konsantrasyonunu belirleyin. ROCK inhibitörü ile takviye edilmiş BME kaplı 6 kuyu tabakasında, BME kaplı 6 hücreli bir plakada, düzenlenmemiş hiPSC'leri tohumlayın. 24 saat sonra, ortamı 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ve 1.5 μg/mL oranlarında puromisin içeren taze hiPSC bakım ortamı ile değiştirin. Puromisin içeren ortamı günlük olarak değiştirin ve hücre morfolojisi ile hayatta kalma durumu 5 gün boyunca brightfield mikroskopisiyle izlenin. Seçilen konsantrasyon, aşırı toksisiteyi en aza indirirken 3–5 gün içinde düzenlenmemiş tüm hiPSC'leri ortadan kaldırmalıdır. Bu protokolte, optimal puromisin konsantrasyonu genellikle 0,4–0,6 μg/mL olarak belirlenir.

1. Nükleofeksiyon sonrası 3 geçiş bekleyin; genellikle iyileşme ve büyüme hızına bağlı olarak yaklaşık 1–2 hafta sürer; böylece entegre olmayan plazmidlerin kaybı önlenir.
2. Bir hücre geçişi yapın ve her kuyu başına 100.000 hücre tohumlayın.
3. 24 saat sonra, öldürme eğrisinin belirlediği konsantrasyonda genellikle 0,4–0,6 μg/mL olarak puromisin eklenir.
4. Puromisin seçimini önceden belirlenmiş süre boyunca, genellikle yaklaşık 5 gün boyunca sürdürün.
5. Seçilen popülasyonu floresan mikroskobu veya akış sitometrisi ile doğrulayarak raporlayıcı pozitif hücrelerin oranını tahmin edin.
   NOT: Yalnızca genel olarak homojen raporlayıcı ekspresyonu gösteren toplamda popülasyonlarla devam edin; ideal olarak %80–90 raporlayıcı-pozitif hücreler >. Eğer raporlayıcı ekspresyonu mozaik kalıyorsa, seçimi genişletin, zenginleştirmeyi tekrarlayın veya farklılaşmadan önce klonal izolasyonu düşünün.
6. Nöron farklılaşmasına başlamadan önce bağlantı PCR ile doğru AAVS1. hedeflemeyi doğrulayın.
7. Titiz doğrulama gerektiğinde, PCR ürünlerini Sanger dizileme ile doğrulayın ve transgen kopya numarasını qPCR, ddPCR veya başka uygun kopya numarası testi ile değerlendirin.
8. Planlanan sonraki uygulamaya bağlı olarak, plazmid omurga dizileri için PCR tabanlı testler veya genom genelinde daha geniş entegrasyon analizleri kullanılarak rastgele entegrasyonu değerlendirin.
9. Seçilen hiPSC popülasyonunun mikoplazma-negatif kaldığını, tipik hiPSC koloni morfolojisini koruduğunu ve puromisin seçiliminden sonra sağlam büyümeyi sürdürdüğünü doğrulayın.
10. Genomik bütünlüğü karyotipleme, SNP dizisi veya başka doğrulanmış bir testle yeniden değerlendirin; özellikle düzenlenmiş hücreler hastalık modellemesi, fonksiyonel testler veya uzun vadeli çalışmalar için kullanılacaksa.
11. Tahmin edilen hedef dışı sitelerin hedefli dizilenmesi veya gerektiğinde daha geniş genomik yaklaşımlarla CRISPR/Cas9 potansiyel hedef dışı etkilerini değerlendirin.
    NOT: Anormal morfoloji, seçilimden sonra kötü iyileşme, kalıcı mozaik raporlayıcı ekspresyonu, doğrulanmış genomik anormallikler veya başarısız AAVS1 entegrasyonu varsa, kültürleri farklılaştırma için kullanmayın. Bu protokolde, seçilmiş mühendislik yapımı hiPSC'ler birleştirilmiş popülasyon olarak kullanılır ve doksisiklin indüksiyonundan önce kriyokonserve edilebilir; raporlayıcı ekspresyon AAVS1. hedefleme, morfoloji ve büyüme doğrulandıktan sonra. Dokksisiklin indüksiyonundan veya nöron olgunlaşma sırasında kriyokonserva, standart iş akışının bir parçası değildir ve kullanımdan önce ampirik olarak doğrulanmalıdır.

5. GABAerjik nöronlara farklılaşma

1. Gerekli sayıda BME kaplı kuyuyu hazırlayın. Bir iyi tohumlanmış, 0. Günde iyi tohumlandığında, bir GABAerjik nöron kuyusu vereceğini unutmayın.
2. Her kuyu başına 6,9 mL nöro-indüksiyon ortamı hazırlayın, bunu dokksisiklin (1 μg/mL) ile takviye edin. Buharlaşma veya pipetleme hatalarını hesaba katmak için %15 fazla hacim ekleyin.
   NOT: Doksisiklin 0. günden itibaren 1 μg/mL nihai konsantrasyonda kullanılır ve farklılaşma ile olgunlaşma boyunca korunur. Her ortam değişiminde tutarlı transgen indüksiyonunu korumak için taze doksisiklin içeren ortam hazırlanır. Bu doz, ellerimizde güçlü raporlayıcı ifadesi ve etkili nöron dönüşümü sağladığı için seçildi. Bu protokolde resmi bir dokksisiklin doz-yanıtı gerçekleştirilmemiştir; bu nedenle, yöntemi uyarlayan laboratuvarlar, transgen indüksiyonu optimal değilse 0.1–2 μg/mL doksisiklin ampirik olarak test edebilir.
3. 0. günde, mühendislik ürünü hiPSC'leri ayrıştırılın ve 200.000 hücreyi hazırlanmış BME kaplı kuyulara ekin. 37 °C'de kuluçka yapın.
4. 1., 2. ve 3. günlerde ortamı aspire edin ve 2 mL doksisiklin içeren taze nöro-indüksiyon ortamı ekleyin.
   NOT: 3. güne gelindiğinde hücre genişlemesi belirgin şekilde azalmalı ve dendritik benzeri yapılar ortaya çıkmaya başlayabilir. Hücre döngüsünden çıkışın deneysel doğrulanması gerekirse, 3–4. Günlerde Ki-67 immünboyama veya EdU/BrdU inkorporasyonu yapılabilir.
5. 4. günde, beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF), glial hücre hattından türetilen nörotrofik faktör (GDNF) ve nörotrofin-3 (NT-3) içeren nöro-olgunlaşma ortamı hazırlanın; her biri nihai konsantrasyon olarak 10 ng/mL, dokksisiklin 1 μg/mL ve PluriSln 20 μM.
6. Nöro-indüksiyon ortamını aspire edin. Yeni oluşan nöronları rahatsız etmemek için kuyu duvarı boyunca damla-damla 2 mL nöro-olgunlaşma ortamı dikkatlice ekleyin.
7. 7. günde, ortamı aspire edin ve nörotrofinler ve doksisiklin içeren ancak pluripotent hücre hayatta kalma inhibitörü çıkarılarak nazikçe 2 mL nöro-olgunlaşma ortamı ekleyin.
8. Uzun vadeli bakım için, nöro-olgunlaşma ortamını her 3-4 günde bir tamamen değiştirin, frekansı hücre yoğunluğuna göre uyarlayın.
   NOT: 21. gün, GABAerjik nöron kimliğinin değerlendirilmesi için standart son noktadır. 21. Güne gelindiğinde, hücreler DLX1 dahil olmak üzere GABAerjik nöron özellikleri göstermelidir.ifadelerini ve aksonal ağlarını olgunlaştırmaya devam ederler. Kuyu başına 200.000 hücre tohumlama yoğunluğu, aşırı kalabalık ve olgunlaşma ile ilişkili hücre ölümünü önlemek için iyi aralıklı kolonileri üretmek için ampirik olarak seçildi. 150.000–300.000 hücre/kuyu yoğunlukları uyumludur; morfoloji için daha düşük yoğunluklar, malzeme geri kazanımı için ise daha yüksek yoğunluklar tercih edilir. Ayrılmayı azaltmak için, plakayı eğiltmeden düşük akışta 1.000 μL pipet kullanarak daha sık yarı-ortam değişimleri yapın. Gerekirse, hücreler 3 günlük dokksisiklin indüksiyonundan sonra, olgunlaşma ortamı eklenmeden önce, poli-L-lizin/laminin veya laminin-521 gibi güçlendirilmiş kaplamalar kullanılarak yeniden kaplama yapılabilir. Olgunlaşma başladıktan sonra daha fazla geçiş kaçınılmalıdır.
9. Ağlar bağlı, canlı ve çoğalan hiPSC benzeri kolonilerden arınmışsa, kültürler 21. günden sonra uzun olgunlaşma için sürdürülebilir. 21. günden sonra, doksisiklin ve nörotrofik faktörler içeren taze nöroolgunlaşma ortamı ile her 3–4 günde bir yarım ortam değişiklikleri yapın.
   NOT: Nöronal morfoloji ve nöürit ağları stabil olduğunda, ayrılma minimuma ulaştığında ve farklılaşmamış koloni görünmediğinde aşağı akış testleri için kültürler kullanın. Bizim elimizde, kültürler genellikle 21. ve 35. gün arasında kullanılır.

Sonuçlar

Bu protokolün başarılı uygulanması, GABAerjik moleküler özelliklere sahip indüklenmiş nöronlardan oluşan zenginleştirilmiş bir popülasyonun ortaya çıkmasına yol açar. Strateji, dokksisiklin indüklenebilir bir ASCL1-P2A-DLX2 kasetinin AAVS1 lokusuna hedefli olarak yerleştirilmesine dayanmaktadır (Şekil 1A). Mühendislik yoluyla hazırlanmış hiPSC'lerin seçilmesinin ardından, doksisiklin indüksiyonu GABAerjik nöronal farklılaşmayı sürm...

Tartışma

GABAerjik nöronların başarılı üretimi, bu protokolün birkaç kritik adımına büyük ölçüde dayanır. Yüksek kaliteli, farklılaşmamış hiPSC'leri korumak çok önemlidir; Nükleofeksiyondan önce spontan farklılaşma, entegrasyon verimliliğini ve sonraki nöronal saflığı ciddi şekilde^{azaltır 8}. Ayrıca, puromisin öldürme eğrisinin hassas bir şekilde belirlenmesi, entegre olmayan hücrelerin doğru mühendislik yapmış klonlar üzerinde aşırı stres olmadan tamamen eliminasyonu sağla...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
4D-Nucleofector™ Core Unit	Lonza	AAF-1002B	hiPSC'lerin elektroporasyonu/nükleofeksiyonu için.
6 kuyu kültür plakası	Sarstedt	83.3920300	hiPSC bakımı ve farklılaşması için doku kültürü işlem görmüş plakalar.
BDNF (Beyin Türevli Nörotrofik Faktör)	STEMCELL Technologies	78005	Nöronal olgunlaşma için rekombinant insan proteini; üretici talimatlarına göre hazırlayın ve 10 ng/mL nihai konsantrasyonda kullanın.
Hücre sayacı (Countess)	Thermo Fisher Scientific	C10283	Hücre sayımı için kullanılır.
Santrifüj	VWR	76468-134	Hücre peletleme için.
CO2 inkübatör	Thermo Fisher Scientific	Heracell VIOS 160i veya eşdeğeri	Hümidifiye atmosfer ve %5 CO2 koruyan 37 °C'de hücre kültürü inkübatörü.
Kriyotüpler	Thermo Fisher Scientific	5000-0020	hiPSC'leri dondurmak için steril kriyojenik vials; eşdeğer harici vidalı 1.8–2.0 mL kriyovialler kullanılabilir.
Cultrex UltiMatrix Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran Ekstresi	Bio-Techne	BME001-05	Protokolde kullanılan standart BME kaplama matrisi. Bio-Techne analiz sertifikasından lot özgü stok konsantrasyonunu doğrulayın ve DMEM/F-12'de 80 µg/mL çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
DMEM/F-12	Wisent	319-090-CL	BME'yi seyreltmek için kullanılan bazal ortam.
DMSO (Dimetil sülfoksit)	Sigma-Aldrich	D2650	Donma ortamı hazırlanmasında kullanılan kriyoprotektif.
Donör plazmid: uyarılabilir ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 hedefleme kaset	Özel plazmid	Addgene erişimi bekleniyor	Doksisiklin-uyarılabilir ASCL1-P2A-DLX2 kaseti ve seçim/reporter elemanlarını içeren özel AAVS1 donör plazmiti. Plazmit haritasını ve tam sırasını ek dosya olarak veya talep üzerine sağlayın.
Doksisiklin hiklat	Sigma-Aldrich	D9891	ASCL1-P2A-DLX2 ekspresyonunu indüklemek için kullanılır. Steril stok çözelti hazırlayın, alirkota ayırın, ışıktan koruyun, dondurulmuş olarak saklayın ve 1 µg/mL nihai konsantrasyonda kullanın.
Etanol (%70)	Commercial Alcohols / Greenfield Global	P016EAAN	Biyolojik güvenlik dolabının içinde sterilizasyon için; kurumsal onaylı %70 etanol veya eşdeğerini kullanın.
Floresan mikroskop	ECHO	Revolve R4	Reporter ekspresyonu ve nörnal morfoloji görüntülemede faz kontrast ve floresan görüntüleme için kullanılan mikroskop.
GDNF (Glial Türevli Nörotrofik Faktör)	STEMCELL Technologies	78058	Nöronal olgunlaşma için rekombinant insan proteini; üretici talimatlarına göre hazırlayın ve 10 ng/mL nihai konsantrasyonda kullanın.
hiPSC hattı PGP1	EditCo Bio	PGP1 insan iPSC hattı	Protokolde kullanılan ticari olarak mevcut açık onaylı insan iPSC hattı; düzenleme ve farklılaşma öncesi pasaj numarasını ve QC durumunu kaydedin.
Görüntü analiz yazılımı	ImageJ/Fiji	Açık kaynak; kullanılan sürüm rapor edilmelidir	Floresan kantifikasyon ve temsili görüntü işleme için.
KnockOut™ Serum Değiştirici (KOSR)	Thermo Fisher Scientific	10828028	Donma ortamının hazırlanmasında kullanılır.
Laminin-521	STEMCELL Technologies	200-0117	Sadece sorun giderme için isteğe bağlı reaktif. Standart kaplama protokolünün parçası değil; nörnal ayrılma devam ederse alternatif veya çift kaplama matrisi olarak kullanılabilir.
Sıvı nitrojen dewar	Thermo Fisher Scientific	Locator 6 Plus veya eşdeğeri	Kurumsal kriyojenik güvenlik prosedürlerine göre dondurulmuş hiPSC'lerin buharlaşma fazında veya sıvı nitrojen içinde uzun süreli depolanması.
Mr. Frosty™ Donma Konteyneri	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	-80 °C'de hücrelerin kontrollü oranlı dondurulması için.
mTeSR™ Plus	STEMCELL Technologies	100-0276	hiPSC'ler için besleyicisiz bakım ortamı.
Nöro-indüksiyon ortamı	STEMCELL Technologies	08582	Erken nörnal indüksiyonda kullanılan ticari nör-indüksiyon ortamı.
Nöro-olgunlaşma baz ortamı (BrainPhys™ Nöronal Ortam)	STEMCELL Technologies	05790	Nöronal olgunlaşma için baz ortam; protokolde açıklandığı gibi BDNF, GDNF, NT-3, doksisiklin ve PluriSln-1 ile takviye edin.
NT-3 (Nörotrofik Faktör 3)	STEMCELL Technologies	78074	Nöronal olgunlaşma için rekombinant insan proteini; üretici talimatlarına göre hazırlayın ve 10 ng/mL nihai konsantrasyonda kullanın.
P3 Primer Hücre 4D-Nucleofector™ X Kiti	Lonza	V4XP-3024	hiPSC nükleofeksiyonu için Çözelti P3 ve küvetler içeren kit.
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Bakteryal kont