C2C12 miyoblastlarında ferroptoz ile ilişkili okumalarla demir aşırı yükünün demir amonyum sitrat bazlı modeli

Özet

Burada, C2C12 miyoblastlarında demir yüklenmesi, ferroptoz ile ilişkili moleküler değişiklikler ve erken ferrostatin duyarlı canlılık kaybı sağlayan hızlı ferrik amonyum sitrat bazlı demir aşırı yük modelini sunuyoruz.

Özet

Ferropoz, yaşlanma ve dejeneratif hastalıklarla ilişkili demire bağımlı bir hücre ölümü biçimidir. Daha önce yaşlı kas kök hücrelerinin hücre içi demir biriktirdiğini ve aktivasyon sırasında ferroptotik ölüm geçirdiğini tespit etmiştik. Burada, demir amonyum sitrat kullanarak fare C2C12 miyoblastlarında demir aşırı yükü üreten basit bir in vitro modeli tanımlıyoruz. Ferrik amonyum sitrat tedavisi, ferritin ağır ve hafif zincirli transkriptlerin yükselmesi, ferritin proteininin artması ve canlı hücre sabit demir boyasından gelen sinyalin artmasıyla hücre içi demir yükünü artırdı. Ferrik amonyum sitrat (FAC) maruziyeti, ferroptozla ilişkili moleküler değişikliklere de yol açtı; bunlar arasında artan Slc40a1 ve Hmox1 ekspresyonu ve azalan glutatyon peroksidaz 4 proteini de yer aldı. Glutatyon peroksidaz 4'teki FAC ile ilişkili azalma deferoksamin ile kısmen tersine çevrildi. 12 saat sonra, sitotoksik ferrik amonyum sitrat hücre canlılığını azalttı ve bu etki, hücre ölümünde ferroptoz hassasiyetli bir bileşenle uyumlu ferrostatin-1 tarafından kurtarıldı. Daha sonraki zaman noktalarında, artan değişkenlik ve azalan analiz dinamik aralığı, uygulanabilirlik ölçümlerinin yorumlanabilirliğini sınırlar. Bu nedenle, bu protokol, ferroptoz ile ilişkili yanıtları incelemek ve kas hücrelerinde demir veya ferroptoz modifiye edici müdahaleleri test etmek için kullanılabilecek hızlı ve ölçeklenebilir bir demir amonyum sitrat aracılı demir yükleme modeli sunar.

Giriş

Feroptoz, diğer KRB'lerden moleküler olarak farklı olan düzenlenmiş hücre ölümü (KRB) türüdür. İlk olarak, RAS (fare sarkoması) için seçici olan ölümcül küçük molekül erastin kullanılarak keşfedilmiştir ve bu molekülün apoptotik olmayan hücre^{ölümüne neden olduğu tespit edilmiştir 1}. Dixon ve ark. bu temel çalışmalarında mekanizmasını ilk olarak demire bağımlı olarak tanımladılar ve böylece ferroptoz terimini ortaya attılar; bu terim "demir¹ tarafından düşme (ölüm) gibi" anlamına gelir. Moleküler olarak, ferroptoz aşırı demir birikimi, artan lipid peroksidasyonu ve reaktif oksijen türlerinin birikimi olarak ortaya çıkar; bu da hücre^{ölümüne yol açar 2}. Oksidatif stres ve diğer RCD formlarından, apoptozun ayırt edici özelliği olan kaspaz aktivasyonundan bağımsızlığı ve fosforile alınmış reseptör etkileşimli protein kinaz 3 (RIPK3) ile karışık soy kinaz domaini benzeri pseudo kinaz (MLKL) eksikliğiyle benzersiz şekilde ayırt edilebilir; bunlar sadece^{nekroptoz 3'te} görülür. Ayrıca, ferroptoz lipid antioksidanları ferrostatin-1 ve liproksstatin-1 ile demir şelatörü deferoksamin⁴ ile hafifletilebilir. Feroptoz, diğer RCD türlerine benzer bir şekilde hücrelerin ölümüne yol açsa da, sunumu onu diğer RCD türlerinden mekanik olarak farklı kılar.

Feroptoz çalışmaları, son on yılda, özellikle alanda yeni özelliklerin belirlenmesi ve altta yatan mekanizmalarını ve insan hastalığına katkısını incelemek için yeni araçlar geliştirme çabaları sayesinde yoğun bir ilgi^{görmüştür.} Son zamanlarda elde edilen kanıtlar, demir aşırı yükü ve ferroptozun yaşa bağlı kırılganlık ve sarkopeniye az incelenmiş katkılar ^{olduğunu göstermektedir 6,7,8}. Yakın zamanda, yaşlı kas kök hücrelerinin (MuSC'ler) epigenetik susturma yoluyla antioksidatif genetik programı baskılayan kronik iltihaplanma sonucu ferroptotik ölüme benzersiz şekilde duyarlı^{olduğunu gösterdik.} 9. Yaşlanan MuSC'lerin hücre içi elemental demir miktarı anormal bir şekilde biriktirdiklerini, bu da yetişkin muadillerinden yaklaşık 30 kat daha fazla olduğunu bulduk. Feroptoz, çoğunlukla yaşlanmayla ilgili birçok organ ve dokuda hastalıkla ilişkilendirilmiş olsa da, fizyolojik rolü belirsizdir ve daha fazla araştırma gerektirir.

Önceki çalışmamız, yaşlı MuSC'lerin aktivasyon sırasında ferroptotik ölüme duyarlı olduğunu gösterse de, demir yükünün bu fenotipe özgü katkısı henüz netleşmemiştir. Burada, ferrik amonyum sitrat (FAC) ile işlenmiş C2C12 miyoblastlarında basit bir demir aşırı yük modeli oluşturuyoruz ve fazla demirin ferroptoz ile ilişkili moleküler değişiklikler ve ferrostatin-duyarlı canlılık kaybı için yeterli olup olmadığını soruyoruz. C2C12 hücreleri, düşük bakım gerektiren, ölçeklenebilir ve kolayca erişilebilir bir fare kas aprogenitör sistemi^{sağlar 10}. Bu yaklaşımın, kas hücrelerinde demir kaynaklı stres yanıtlarını incelemek ve ferroptoz ile ilişkili fenotipleri değiştiren müdahaleleri test etmek için pratik bir platform sunacağını öngörüyoruz.

Protokol

1. C2C12 hücrelerinin hazırlanması

1. Erime hücreleri
   NOT: Tüm hücre kültürü adımları steril bir biyogüvenlik dolabında yapılmalıdır.
   1. 9 mL sıcak tam ortam içeren konik bir tüp hazırlayın (Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı, yüksek glikoz ve piruvat + %10 fetal sığır serumu + %1 pen/streptok).
   2. Ana medya stokundan şişeye 800 μL önceden ısıtılmış tam madde ekleyerek donmuş C2C12 hücrelerinden bir şişe (~1 milyon) eritilin. Yavaşça yukarı ve aşağı pipet yapın.
   3. Eritme şişesine eklenen ortam soğuduğunda, onu çıkarın ve konik tüpe ekleyin. Tüpten aynı hacimdeki sıcak ortamla değiştirin. Donmuş hücreler yeniden süzülene kadar yukarı aşağı pipetleme ve madde değiştirmeye devam edin.
   4. Şişenin içeriğini konik bir medya tüpüne pipet edin. Karıştırmak için ters çevirin, ardından içeriği 10 cm hücre kültürünle işlenmiş bir kaba ekleyin. 37 °C'de 4 saat kuluçka yapın.
   5. Hücreleri mikroskop altında kontrol ederek yapıştıklarından emin olun. Bağlı hücreler uzun görünürken, yüzen hücreler dairesel olur ve plaka hareket ettiğinde hareket eder.
      NOT: Plakalı hücreler sağlıklı olduğu varsayarsak, çoğu bağlı olmalıdır.
   6. Ölü hücreleri ve kalıntıları çıkarmak için ortamdan aspirasyon yapın. Yerine 10 mL sıcak tam ortam ile değiştirin ve inkubatöre geri dönersiniz. Gece boyunca inkuluçka yapın ya da tabak %80 birleşimine ulaşana kadar.
2. Demir arımı için C2C12 hücrelerinin tohumlanması
   1. İstenilen birleşme noktasına ulaşıldığında, hücre ortamından aspirasyon yapın. Plakaya 2 mL PBS damla olarak ekleyin, böylece tüm yüzey kaplı olur; Aspirasyon.
   2. Hücrelere 2 ml %0,25 tripsin ekleyin. 37 °C'de 5–10 dakika veya hücreler ayrılana kadar kuluçka yapın. Hücreler ayrıldıktan sonra mikroskop altında dairesel görünür ve tripsin ile hücre süspansiyonu bulanık ve kalınlaşır.
   3. 8 mL sıcak tam DMEM ekleyerek tripsini nötralize edin. Serolojik pipet kullanarak çözeltiyi iyice karıştırın ve tabağı yıkayın. Hücre süspansiyonunu konik bir tüpe aktarın.
   4. Tüpü nazikçe 3–5 kez ters çevirin. Uygun hacmi çıkarın ve hücreleri tercih edilen yöntemle (hücre sayacı, hemositometre vb.) sayabilirsiniz.
   5. Her koşul için istenen sayıda kuyuyu/plaka tohumu olacak kadar hücre askısı yapın: 10 cm plaka (western blot için): 100.000 hücre/plaka, 6 kuyu plaka (qPCR için): 50.000 hücre/kuyu, 96 kuyu plaka (labile demir ve lüminesans boyama için): 1.000 hücre/kuyyu. Hücrelerin gece boyunca 37 °C'de kuluçka oluşmasına izin verin.
3. Tohumlu hücrelere demir muamelesi uygulanması
   1. Tedavi gününde ferrik amonyum sitrat (FAC; formül = C₆H₁₁FeNO₇⁺³; MW = 265 g/mol) steril koşullarda aşağıdaki konsantrasyonlarda DMEM'i tamamlamak için gereklidir: Şiddetli: 180 μM (0,0477 mg/mL), Sitotoksik: 1.800 μM (0,477 mg/mL).
      NOT: Ayrıca kontrol eklerini de düşünün; bunlar arasında ancak bunlarla sınırlı olmakla sınırlı olmakla birlikte, araç + 150 μM deferoksamin (bir demir şelatörü), araç + 150 μM deferoksamin ve/veya araç + RSL3 (ferroptoz indükleyicisi; pozitif kontrol) dahildir. Ayrıca, DMEM'in başlangıçta az miktarda demir (III) nitrat nonahidrat, yani demir demiri kaynağı olduğu da belirtilmekte fayda var. Okuyucu, yukarıda önerilen FAC konsantrasyonlarını, araç kültür ortamında zaten bulunan herhangi bir ferrik demirin yanı sıra yorumlamalıdır.
   2. FAC'ın tam ortamda çözünmesini sağlamak için ters çevirin.
      NOT: FAC suda çözünebilen olduğundan, DMSO veya ek çözücüye gerek yoktur. FAC eklenmesi, çözeltinin pH'ını değiştirebilir, bu nedenle ciddi bir ortam renk değişikliği gözlemlenirse, kültüre işlenmiş ortam eklendiğinde hücrelerin canlılığını sağlamak için pH ölçülmesi önerilir.
   3. Hücrelerden aspirasyon maddesi alın. Aynı miktarda demir takviyeli tam ortamı tedavi koşullarına ve araçların kuyularına/plakalarına aynı miktarda demir takviyeli tam madde ekleyin. Tercih edilen teste geçmeden önce istenen tedavi süresi boyunca 37 °C'de inkübe yapın: Labile demir testi: 2 saat FAC tedavisi, qPCR ve western blot: 12–24 saat FAC tedavisi, Lüminesans testi: 12 saat FAC tedavisi.

2. qPCR

1. qPCR için mRNA'nın izolasyonu
   DIKKAT: RNA ekstraksiyon reaktüsü ve kloroform solunum tehlikeleri oluşturur. Sadece uygun PPE (laboratuvar önlüğü, kimyasal dirençli tek kullanımlık eldiven ve göz koruma) giyerek duman kapüşonunda kullanın.
   1. Tezgahta, hücrelerden aspirasyon maddesi alın. Hücreleri steril PBS ile 2 kez yıkayın ve kalan sıvıyı iyice aspire edin.
   2. Buhar kapasında, hücrelere RNA ekstraksiyon reaktifini aşağıdaki hacimlerde ekleyin: 6 kuyuk plakası: 250 μL/guy, 10 cm çanak: 1 mL/tabak için.
   3. Buhar davlumbazında buz üzerinde çalışırken, hücre kazıyıcısını kullanarak lizlenmiş hücreleri nazikçe kazıyın. RNA verimini maksimize etmek için plakanın tüm kısımlarını iyice kazımaya özen gösterin.
   4. Lizat steril, önceden soğutulmuş, RNAssız mikrofüj tüplerine pipet yapın. Oda sıcaklığında 5 dakika beklet.
   5. Ekstraksiyon reaktivinin her mL için, bir duman başlığı içinden 200 μL kloroform ekleyin. Ekstraksiyon reaktüsü ve kloroformu birleştirmek için örnekleri en az 30 saniye boyunca sertçe çalkalayın. Oda sıcaklığında 5 dakika beklet.
      NOT: Zaman geçtikten sonra, faz ayrımı gerçekleşir ve üzerinde RNA'yı içeren berrak sulu faz bulunur.
   6. Santrifüj örnekleri 15 dakika boyunca 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de alın. Bu arada, yeni otoklavlanmış tüpleri etiketleyin ve buz üzerindeki tüplere 500 μL (ekstraksiyon reaktifi başına 500 μL) izopropanol ekleyin.
   7. Her ilgili tüpe sadece sulu fazı aktarın. Nazikçe ters çevirerek karıştırın, sonra oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Düşük verim bekleniyorsa, pelleti görselleştirmek için 2 μL GlycoBlue ekleyin.
   8. 12.000 × 4 °C'de 15 dakika santrifüj yapın.
      NOT: Çökeltilmiş RNA tüpün tabanında görülebilir.
   9. Fazla izopropanol dikkatlice belirlenmiş bir atık kabına dökün. Tüpteki yerinden çıkarmamaya dikkat ederek 1 mL moleküler kalitede, %100 etanol damla olarak ekleyin. 7.500 × 4 °C'de 5 dakika santrifüj yapın.
   10. Etanol dök. Tüpleri ters çevirin ve kapağını kağıt havlu üzerinde açık bırakın. Pelletin damlasız kalmasına (~15–30 dakika) kadar kurumasına izin verin.
       NOT: GlycoBlue eklenmezse pellet şeffaf hale gelebilir.
   11. Pelleti 25 μL steril, RNAse içermeyen suya yeniden süzülür. UV-görünür spektrotometri ile RNA konsantrasyonunu nicelikle ölçün. Örnekler arasında eşit bir konsantrasyona normalleştirin; böylece her örnek başına 16 μL'de maksimum 1 μg RNA izin verilir.
2. qPCR için cDNA sentezi
   NOT: RNA/cDNA verimini maksimize etmek için buz üzerinde tüm adımları tamamlayın.
   1. Numuneleri erit. Çalışma alanını RNA temizleyici ile yıkayın.
   2. Her örnekten 1 μg RNA ekleyin, ilgili bir PCR şerit tüpüne ekleyin.
   3. Her tüpe 4 μL cDNA karışımı ekleyin. Gerekirse, steril su ekleyerek toplam hacmi 20 μL elde edin. Karışımları aşağıdaki termodöngücü parametreleri altında çalıştırın: 25 °C 5 dakika, 42 °C 30 dakika, 85 °C 5 dakika, 4 °C sonsuz.
3. qPCR çalıştırma
   1. Daha fazla reaksiyon yapmadan önce cDNA'yı steril suda 1:10 seyreltin.
      NOT: cDNA -20 °C'de 1 ay veya -80 °C'de 6 ay boyunca dondurulabilir.
   2. Astarları steril suyla 10 μM konsantrasyona kadar seyreltin. Doğru kontrol ve/veya temizlik genlerini (örneğin, B2M, TBP1) ekleyin.
   3. Her ev bakım geni ve ilgi çekici gen için ana karışımlar yapın; böylece her DNA koşulu üçlü olarak çalıştırılacak kadar reaksiyon karışımı olsun. Ana karışım tarifi (reaksiyon başı) şöyledir: 2x PCR karışımı: 10 μL, Ön primer (10 μM): 1 μL, Ters primer (10 μM): 1 μL, Steril su: 8 μL.
   4. QPCR reaksiyon plakasını 96 kuyruklu soğutucu metal bloka yerleştirin. Her örnek kuyusuna 5 μL seyreltilmiş cDNA ve her kuyuya 20 μL reaksiyon ana karışımı ekleyin. Her kuyuyu inceleyin, hepsinin aynı hacmi aldığından emin olun, plakayı bir plaka sızdırmazlayıcı ile kapatın ve kabarcıkları düzleştirmek için düz kenarlı bir alet kullanın.
   5. Plakayı 1.000 × g ve 4 °C'de 1 dakika boyunca santrifüjleyin. Plakayı bir qPCR makinesine yerleştirerek doğru konumda yüklendiğinden emin olun.
   6. qPCR yazılımında, her kuyu için örnek ve ilgi çekici gen kimliklerini belirleyin. Aynı kurulumla birden fazla replika çalıştırmayı planlıyorsanız bir şablon yapmayı düşünün.
   7. Tablo 1'de gösterilen qPCR programını çalıştırın (süre: ~1:36 saat).
   8. Sonuçları bir şekilde dışa aktarın. CSV veya . XLSX dosyası. Kullanılan qPCR makinesi kullanıcının hangi değerleri dışa aktaracağını seçmesine izin veriyorsa, CT değerlerinin dışa aktarılan dosyada yer aldığından emin olun.
   9. İlgi duyulan her durum ve genin ortalama BT değerlerini—ilgili durumdaki ev genlerinin BT değerleriyle karşılaştırın—her genin katlama değişimini hesaplamak için kullanın. Araç durumunun katlanma değişimini 1.0'a normalleştirin.

3. Western Blot

1. Western Blot için proteini izole etmek
   NOT: Protein verimini maksimize etmek için buz üzerinde tüm adımları yapın.
   1. Bir biyogüvenlik dolabında, kültür ortamından aspirasyon yapın. Hücreleri, kültür plakasının altını kaplayacak kadar soğuk PBS ile durulayın. Aspirasyon yapın, sonra tekrarlayın.
   2. Proteinin bozulmasını önlemek için proteaz inhibitörü ve fosfataz inhibitörü kokteylleriyle desteklenen RIPA tamponu ekleyin. 6 kuyu bir plakada kültür için 75 μL RIPA çözeltisi veya 10 cm bir plakada 200 μL RIPA çözeltisi kullanın.
   3. Buz üzerinde çalışırken, hücre kazıyıcı kullanarak lizlenmiş hücreleri levhadan nazikçe gevşetin. Plakanın tüm bölgelerinden, kenarları da dahil olmak üzere hücreleri çıkarmaya özel özen gösterin. Çözüm berrak ve biraz viskoz görünecektir.
   4. RIPA hücresi süspansiyonunu soğutucu mikrofuge tüplerine pipet edin. Santrifüj örnekleri maksimum hızda 4 °C'de 10 dakika boyunca alın. Süpernatantı (protein lizatını) önceden soğutulan bir tüpe aktarın. Pelleti at.
   5. Protein konsantrasyonunu Bradford veya BCA testi yaparak niceliklerini ölçebilirsiniz. Numuneleri, buz üzerinde proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyliyle zenginleştirilmiş saf suda 1 μg/μL olarak normalize edin.
   6. Laemmli tamponu içinde seyreltilerek nihai protein konsantrasyonlarının örnekler arasında eşit olmasını sağlar. Lizatları 95 °C'de 10 dakika boyunca kaynatarak proteini denatüre edin. En iyi sonuçlar için hazırlıktan hemen sonra western blotting kullanın. Aksi takdirde, proteinleri Laemmli'de kısa süreli (1 ay ≤ -20 °C) veya uzun vadede -80 °C'de depolayın.
2. SDS-PAGE için akrilamid jellerinin hazırlanması
   DIKKAT: Akrilamid bir nörotoksindir ve yalnızca uygun PPE (laboratuvar önlüğü, kimyasal dirençli eldiven ve göz koruma) giyilirken ele alınmalıdır.
   1. İlgilenecek proteinleri ve bu proteinlerin boyutunu belirleyin; kullanılacak antikor/ie'lerin şirket web sitesine bakabilirsiniz. İlgilendiğiniz protein(ler)in tahmini boyutunu kullanarak jel(ler)in akrilamid yüzdesinde olması gerektiğine karar verin.
      NOT: %10-15 akrilamid çoğu moleküler ağırlık için iyi çalışır.
   2. Jel döküm standı ve çerçevesini üreticinin talimatlarına göre monte edin.
   3. Çözümleyici jel için, hazırlanacak jellerin akrilamid sayısı ve yüzdesi için uygun hacimlerde akrilamid, steril su, 1,5 M Tris/HCl pH8,8 tampon ve %10 sodyum dodesil sülfatı konik bir tüpte birleştirin; bu oran 2 jel için gerekli bileşenleri listeleyen Tablo 2'ye göre. Ters çevirilere göre karıştırın.
   4. Karışıma %10 amonyum persülfat çözeltisi ve TEMED ekleyin. Karıştırmak için ters çevir.
   5. Çözeltiyi hemen jel döküm çerçevesine ekleyin ve jel döküm çerçevesindeki çözeltinin hacmi, tarak yerleştirilecekse tarakın altına ulaşmak için gereken miktarın hemen altına kadar doldurun.
   6. Sertleştirici jelin üzerine hemen damla olarak 100–200 μL saf etanol ekleyin. Protein lizatlarının çözülmesi ve/veya denatüre edilmesi gerekiyorsa, bu kuluçka döneminde bunu tamamlayın. Proteinleri buz üzerinde erit.
      NOT: Bu, çözeltiyi dağıtacak ve jelin eşit olmayan şekilde sertleşmesini sağlar.
   7. Sertleştikten sonra etanolü dökün. Üst üste biriktirme jeli için, hazırlanacak jellerin akrilamid sayısı ve yüzdesi için uygun hacimlerde akrilamid, steril su, 0.5 M Tris/HCl pH6.8 tampon ve %10 sodyum dodesil sülfatı konik bir tüpte birleştirin; bu işlem iki jel için gerekli bileşenleri listeleyen Tablo 2'ye göre. Ters çevirilere göre karıştırın.
   8. Karışıma %10 amonyum persülfat çözeltisi ve TEMED ekleyin. Ters çevirilere göre karıştırın.
   9. Hemen biriktirme çözümünü jel döküm çerçevesine ekleyin, hacim üst seviyeye ulaşana kadar. Jeli döktükten hemen sonra jel taragını ekleyin. ~1 saat dinlenin veya jel döküm standı hafifçe sallandığında kuyunun şekli değişmediği sürece.
3. Yükleme jelleri
   1. Elektroforez odasını, çalıştırılacak jel sayısı için uygun doldurma hattına koşma tamponu ile doldurun.
   2. Jel çerçeveyi taraklar hâlâ içinde olduğu şekilde elektroforez odasına aktarın. Jeller arasındaki boşluğa daha fazla koşu tamponu ekleyin, rezervuar dolana kadar. Damarları batırılmış jellerden nazikçe çıkarın.
   3. Her jelden bir kuyuya 5–10 μL merdiven pipet koyun.
   4. Her kuyuya ekstraksiyon proteininden 5–20 μL pipet ve Laemmli tampon örnekleri ekleyin. Boş kuyulara 5–10 μL 1x Laemmli tamponu ekleyin.
      NOT: Eklediğiniz hacim, ilgilendiğiniz protein(ler)in yaygınlığı ve/veya antikor(lar)ın etkinliğine göre optimizasyon gerektirebilir.
4. SDS-PAGE çalıştırma
   1. Elektroforez odasını bir güç paketine bağlayın. 150 V'da 45 dakika çalıştırmaya ayarlandı.
      NOT: Kuruluma bağlı olarak, tam göçün gerçekleşmesi için daha fazla zaman veya daha yüksek voltaj gerekebilir, bu yüzden gerektiğinde ayarlama yapın.
   2. Protein jelin ucuna (jel caster ve jel çerçevesinin cihazın alt kısmında buluştuğu yere) geçtikten sonra çalıştırmayı durdurun ve güç paketini kapatın.
5. Protein transferini tamamlamak
   NOT: Bu bölüm hızlı bir protein transfer cihazı kullanılarak geliştirilmiştir.
   1. Transfer tamponunu jel tepsisine dök. Bir transfer yığını, ardından nitroselüloz membranı ve sıvıya başka bir transfer yığını ekleyin; böylece ortada membran olan bir sandviç oluşturulur. Sandviç yığınının transfer tamponuna tamamen batırıldığından emin olun.
   2. Hızlı protein transfer cihazını açın ve ilgilenilen protein(ler)in sayı ve boyutu için uygun protokolü seçin.
      NOT: 1.3 A ve 10 dakika için 25 V iyi çalıştığı bulundu, ancak optimizasyon gerekebilir.
   3. Üst transfer yığınını forsepsle çıkarın ve fazla sıvının jel tepsisine akmasına izin verin. Yığını protein transfer cihazına taşıyın ve mümkün olduğunca düz ve düz yerleştirin; Kırışıklıkları düzeltmek için bir rulo veya konik tüp kullanın. Zarla tekrarlayın.
   4. Döküm çerçevesinin üst ve alt yarısını nazikçe ayırmak için kör uçlu bir alet kullanın. Jeli, protein transfer cihazındaki zara aktarın.
   5. Jel tepsisinden kalan transfer yığınını kaldırmak için forseps kullanın. Fazla sıvıyı boşaltın, sonra zarın ve diğer yığının üzerine koyun. Jel kutusunu kapat ve programı çalıştır.
6. Antikorlarla bloklama ve boyama
   1. Jel kutusunu açın ve forsepsle üst yığını çıkarın, ardından jeli kaldırın. Merdivenden membran üzerindeki bantların olduğunu doğrulayın. Zarı sadece ilgi duyduğunuz boyut aralığını dahil edecek şekilde kesin.
   2. Zarı temiz bir leke kutusuna aktarın. 5 mL bloklayıcı tampon ekleyin, ya da membranı kapatacak kadar. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca çalkalama blokla.
   3. Bu arada, önerilen birincil antikor(lar) konsantrasyonunu yıkama tamponunda 5 mL sığır serum albümini kullanarak antikor boyamaya hazırlanın. Ev işleri için de protein(ler) (örneğin, GAPDH, β-aktin) boya.
   4. Ajitasyondan çıkarın ve bloklayıcı tamponu dökün. 5 mL birincil antikor çözeltisi ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de (~12–16 saat) karanlıkta kışkırtma altında kuluçka yapın.
      NOT: İleriye doğru tüm adımlar karanlıkta tamamlanmalıdır.
   5. Membranı oda sıcaklığında yıkama tamponu ile 3 x 5 dakika yıkayın.
   6. Önerilen ikincil antikor konsantrasyonunu yıkama tamponunda %5 BSA'ya ekleyin. Her zar için 5 mL çözelti hazırlayın.
   7. Fazla yıkama tamponunu dök. Her lekeye 5 mL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca karanlıkta kuluçka yapın.
   8. Zarı oda sıcaklığında yıkama tamponu altında 3 x 10 dakika yıkayın. Hemen görüntü ver.
7. İlgi duyulan proteinlerin tespit edilmesi ve analizi
   1. Tercih edilen platformu kullanarak proteinleri görüntüleyin.
   2. İlgi alanındaki her bandın yoğunluğunu nicelikten ölçmek için ImageJ veya başka bir platform kullanın.

4. Değişken demir boya testi

1. Belirgin demir boyası boyama
   1. Tüm bölüm 1'i tamamlayın, hücreleri 96 kuyu bir plakada demir işleme altında 2 saat boyunca tohumlama. Her demir işlem durumu için en az üç kuyu ve negatif (araç kültür medyası + 150 μM demir kelatör deferoksamin) ve pozitif (kültür ortamı + 180 μM FAC + labile demir boyası ortak işleme) kontrolleri olduğundan emin olun.
   2. Serumsuz ortamda 1 mM sabit demir boyası çözeltisinin yeterli 1:200 seyreltmesini hazırlayın; böylece her örnek kuyusu için 200 μL elde edin.
   3. Kültür ortamından aspirasyon yapın. PBS ile iki kez yıkayın.
   4. Her kuyuya boyama çözeltisini ekleyin ve 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
   5. PBS ile bir kez yıkayın. PBS ile değiştirin.
   6. Hücreleri, bir floresan mikroskobunun uzak kırmızı kanalı (646/662 nm) kullanarak görüntüleyin. Görüntüleri kaydedip dışa aktar. TIF dosyaları.
2. Boyama analizi
   1. Görselleri ImageJ'de açın.
   2. Ölçüm penceresini m tuşuna basarak açın. Ölçüm penceresi içinde, Sonuçlar | Ölçümleri ayarlayın, Alan, Entegre Yoğunluk ve Ortalama Gri Değeri seçin. OK'yi seç.
   3. Görseldeki her hücrenin etrafını çizmek için Polygon Aracı'nı kullanın. Her hücreden sonra m tuşuna basın ve ölçümleri ölçüm penceresine ekleyin.
   4. Görüntüdeki tüm hücreler nicelendirildikten sonra, tüm değerleri bir tabloya kopyalayıp yapıştırın. Daire aracını kullanarak hücrelerin olmadığı alanlarda en az üç arka plan ölçümü yapın.
   5. Her hücre için düzeltilmiş toplam hücre floresansını (CTCF) hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
      CTCF = entegre yoğunluk – (seçilen hücre alanı x arka plan okumalarının gri ortalama değeri)
   6. Demirle işlenmiş hücrelerin CTCF değerlerini araç hücrelerinin değerleriyle karşılaştırın. Artan CTCF, değişken demir seviyelerinin arttığını gösterir.

5. Hücre lülümensans testi

1. Hücrelerin lüminesans testi için tedavisi
   1. 1. bölümü tamamlayın, dahil etmek istediğiniz her koşul için kuyu sayısının n = 3 olarak karşılık geldiğinden emin olun. En az üç hücresiz (sadece tam medya) kontrol kuyusu ekleyin. Her kuyuya 100 μL hücre ve toplam ortam eklenmelidir.
   2. Tedavi edilmemiş hücreleri gece boyunca inkubasyon yaptıktan sonra, istenen tedavileri ve kontrolleri uygulayın. Mutlaka bir araç (tedavi edilmemiş) durumu, sadece FAC içeren durumlar, sitotoksik + 10 μM ferrostatin-1 (anti-ferroptotik ajan), araç + 1 μM RSL3 ve/veya araç + 10 μM ferrostatin-1 + 1 μM RSL3 dahil edilsin. İstenilen süre boyunca kuluçka yapın (tedavi etkilerini maksimize etmek ve aşırı hücre ölümünü önlemek için 12–24 saat).
2. Lüminesans testinin tamamlanması
   1. Hücreler işlendikten sonra, lüminesans tampon bileşenlerini oda sıcaklığına kadar eritin. Gerekli bileşenleri birleştirin ve kullanıma hazır olana kadar karanlıkta saklayın. Sıcaklık depolama gereksinimleri için kit talimatlarına bakınız.
   2. Hücreler tedaviyi tamamladıktan sonra, hücreleri tedavi etmek için kit talimatlarını takip edin.
      NOT: Bu muhtemelen oda sıcaklığında dengelenmeyi, ardından lüminesans tamponunun eklenmesini ve son kısa bir oda sıcaklığında kuluçka dönemini içerecektir. Lüminesans tamponu eklendikten sonra tüm adımlar karanlıkta yapılmalıdır.
   3. Plaka okuyucu veya benzeri bir cihazla luminesansı tamamlayıp kaydedin.
      NOT: Bu protokol için 0.3 saniyelik bir entegrasyon süresi kullanılmıştır.
   4. Deneysel kuyupların lüminesans değerlerini, hücresiz kontrol kuyularının ortalama lüminesansına normalize edin.
      NOT: Daha yüksek lüminesans değerleri, daha fazla canlı hücre sayısını gösterir.

Sonuçlar

Bizim ve başkalarının önceki çalışmalarına dayanarak, hücre dışı demirin artırılmasının fare kas hücrelerinde hücre içi demir aşırı yükü yaratacağını ve aşağı akıştaki ferroptoz ilişkili yanıtları izlememize olanak sağlayacağını varsaydık. Bu nedenle, Şekil 1'de belirtilen C2C12 iş akışını geliştirdik; bu iş akışında hücreler, aşağı akış testine bağlı olarak 2–24 saat boyunca tanımlanmış ferrik amonyum sitrat konsantrasyonlarına maruz kaldı.

Modelimizi doğrulamanın ilk adımı, FAC'ın hücrelere girebileceğini doğrulamaktı. Tablo 3'te açıklanan doğrulanmış primerleri kullanarak, hem ağır hem hafif ferritin zincirleri için qPCR yaptık ve artan demir girdisinin yükselen ferritin mRNA seviyeleriyle ilişkili olduğunu belirledik (Şekil 2A,B). Protein seviyesinde, FAC konsantrasyonu arttıkça ferritin seviyelerinde benzer bir artış görülüyordu, ancak bu doz bağımlı görünmüyordu (Şekil 2C). Benzer şekilde, canlı, FAC ile işlenmiş C2C12 hücrelerinin boyaması, sitotoksik dozda demir ile tedavi edilenlerin—ve aynı anda pozitif kontrol olarak ağır doz ve değişken demir lekesi ile tedavi edilen hücrelerin—görsel ve nicel olarak daha fazla demir deposu gösterdiklerini, tedavi edilmemiş hücrelere ve sadece demir şelatör deferoksamine maruz kalanlara (DFO; Şekil 2D). Genel olarak, bu sonuçlar FAC ile hücre ortamına giren demirin aslında hücrelere girdiğini göstermektedir.

FAC'nin hücre içi demir yükünü artırdığını tespit ettikten sonra, demir aşırı yüklenmesinin ferroptozla ilişkili moleküler ve fonksiyonel değişikliklerle birlikte olup olmadığını belirlemeye çalıştık. FAC, Slc40a1 (ferroportin) ekspresyonunu artırdı (Şekil 3A) ve Hmox1'i yükseltti (Şekil 3B). FAC ayrıca GPX4 proteinini azaltmış ve bu azalma deferoksamin ile kısmen geri alınmıştır (Şekil 3C). RSL3 ile yapılan tedavi, GPX4'te benzer bir azalma sağladı ve FAC yanıtını ferroptoz ile ilişkili daha geniş bir moleküler bağlamda konumlandırdı. Fonksiyonel olarak, sitotoksik FAC dozu 12 saat içinde lüminesans temelli canlılığı azaltmış ve bu erken canlılık kaybı ferrostatin-1 ile kurtarılmıştır (Şekil 3D). Buna karşılık, 24 saat içinde koşullar arasındaki ayrım daha az belirgin ve daha değişken hale gelir (Şekil 3E). Ferrostatin 1 ile işlenmiş örnekler yalnızca sitotoksik FAC'ye göre yüksek kalsa da, genel analiz dinamik aralığı bu sonraki aşamada azalmıştır. Bu veriler birlikte, FAC tedavisinin demir aşırı yükü, ferroptoz ile ilişkili moleküler değişiklikler ve C2C12 hücrelerinde zamana bağlı ferrostatin hassasiyetli canlılık azalması yarattığını göstermektedir.

Şekil 1: Demir aşırı yük modelinin grafiksel özeti. Bu modelde, C2C12 hücreleri tohumlanarak çeşitli fizyolojik olarak önemli dozlarda demir injekte edilmiş kültür ortamı ve doğrudan moleküler analizle tedavi edilmeden önce bir gece kuluçkaya bırakılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Ferrik amonyum sitrat eklendikten sonra artan labil demir deposu ve ferritin sentezi. (A) ferritin ağır zinciri ve (B) ferritin hafif zincirinin mRNA seviyeleri, sisteme demir amonyum sitrat eklenmesiyle artar. (C) FTH1 protein seviyeleri, sisteme demir eklenmesiyle artar. (D) Ferrik demir ile işlenmiş C2C12 hücrelerinde, araç + deferoksamin kontrolüne kıyasla ferrik demir ile işlenilen ve aynı zamanda aşırı kırmızı labile demir boyası ile boyanma ile birlikte alınan demir seviyeleri artışır. Ortak tedavi durumu, kültür ortamı + 180 μM FAC + labile demir boyası ile eşzamanlı tedaviyi gösterir. Hata çubukları +/- SD'dir. Kısaltmalar: FTH1 = ferritin ağır zincir; FTL1 = ferritin hafif zincir; DFO = deferoksamin. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Ferropoz ile ilişkili moleküler değişiklikler ve FAC eklendikten sonra hücre canlılığında zamana bağlı azalma. (A) ferroportin (Slc40a1) ve (B) Hmox1 mRNA seviyeleri FAC tedavisinden sonra artar. (C) FAC tedavisinden sonra ve pozitif kontrol RSL3 varlığında GPX4 proteini azalır; deferoksamin GPX4'teki FAC ile ilişkili azalmayı kısmen tersine çevirir. (D) FAC, RSL3 ve/veya ferrostatin-1 ile 12 saat işlem sonrası C2C12 hücrelerinin lüminesansını, hücresiz (sadece ortam) kuyulara normalleştirilmesi. (E) FAC, RSL3 ve/veya ferrostatin-1 ile 24 saat işlem sonrası tedavi edilen C2C12 hücrelerinin normalize lüminesansı. Hata çubukları +/- SD'dir. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sahneyi tut
1	Sıcaklığı 1.6 °C/s ile 50 °C'ye çıkarın, 2 dakika bekleyin
2	Sıcaklığı 1.6 °C/s ile 95 °C'ye çıkarın, 10 dakika bekleyin
PCR Aşaması (Run x 40)
1	95 °C'de 15 saniye bekleyin
2	Sıcaklığı 1.6 °C/s ile 60 °C'ye düşürün, 1 dakika bekleyin
Erime Eğrisi Evresi
1	Sıcaklığı 1.6 °C/s'de 95 °C'ye çıkar, 15 saniye bekleyin
2	Sıcaklığı 1.6 °C/s ile 60 °C'ye düşürün, 1 dakika bekleyin
3	0.15 °C/s ile 95 °C'ye yükseltin, 1 saniye bekleyin

Tablo 1: protokol bölümü 2'de qPCR programı (süre: ~1:36 saat).

	Çözüm jeli			Stacking jeli
Bileşen	10%	12.50%	15%
Akrilamid (mL)	5.6	6.9	8.3	0.65
Steril su (mL)	6.9	5.3	3.9	3.05
Tris/HCl, 1.5 M pH 8.8 (mL)	4.2			-
Tris/HCl, 0.5 M pH 6.8 (mL)	-			1.25
%10 Sodyum dodesil sülfat (μL)	166			50
0.1 g/mL Amonyum persülfat (μL)	80			25
TEMED	8.3			5

Tablo 2: Western Blot için çözümleme ve üst üste yığma jellerinin başarılı kurulumu için gereken bileşenler ve hacimlerin özeti. Verilen hacimler iki jel için yeterlidir ve buna göre ölçeklenebilir. Yüzdeler, karışımdaki akrilamid miktarını gösterir.  NOT: APS ve TEMED en son ve ancak dökmeye hazır olduğunda eklenmelidir çünkü jel polimerizasyon sürecini tetikler.

Gen Hedefi	Gen Sembolü	Fonksiyon	Türler	İleri Dizisi	Ters Dizisi
Beta-2-mikroglobulin	B2m	Ev Hizmetleri geni	Fare	TCACACTGAA TTCACCCCCA	TCACATGTCT CGATCCCAGT
TATA kutu bağlama proteini	Tbp	Ev Hizmetleri geni	Fare	CAGATGTGC GTCAGGCGTT	CCATGAAATAGT GATGCTGGGCAC
Ferritin ağır zinciri	Fth1	Demir depolama proteini ferritinin alt birimi	Fare	TGGCTCTGAA GAACTTTGCCA	TCATCACGGTC TGGTTTCTTTA
Ferritin hafif zinciri	Ftl1	Demir depolama proteini ferritinin alt birimi	Fare	AATGGGGTAAA ACCCAGGAGG	AGGAAGTCACA GAGATGAGGGT
Heme oksijenaz 1	Hmox1	Biliverdin'i hem, CO2 ve demir varlığında bilirubine dönüştürür; Ferroptozda yüksek seviyeler vardır	Fare	CTAGCCTGGT GCAAGATACTG	TGTCTGGGAT GAGCTAGTGC
Ferroportin 1	SLC40a1	Hücrelerden fazla demiri taşır	Fare	GCTGCTAGAA TCGGTCTTTTGG	TGGAGTTCTG CACACCATTGA

Tablo 3: İlgi duyulan demir taşınımı ve ferroptoz genleri için doğrulanmış qPCR primerlerinin listesi. Primerler, C2C12 hücrelerinden kaynaklanan mRNA'da kullanıldıkları için fareye özgeldir.

Tartışma

Bu çalışmanın amacı, fare kası öncüllerinde demir aşırı yükünün pratik in vitro modelini oluşturmak ve ferroptoz ile ilişkili yanıtların güvenilir şekilde tespit edilebileceği koşulları tanımlamaktı. Bu iş akışını kullanarak, ferrik amonyum sitrat tedavisinin güçlü hücre içi demir birikimine yol açtığını, ferritin ifadesinin artması ve belirgin demir sinyalinin yükseltmesiyle birlikte olduğunu gösteriyoruz. Demir yükü, ferroptozla ilişkili stresle uyumlu moleküler değişikliklerle de ilişkilidir; bunlar arasında artan Slc40a1 ve Hmox1 ekspresyonu ve azalan GPX4 proteini de vardır. Fonksiyonel olarak, sitotoksik FAC maruziyeti, ferrostatin-1 tarafından erken zaman noktalarında kurtarılan hücre canlılığında bir azalmaya neden olur ve gözlemlenen hücre ölümüne katkıda bulunan ferroptoz duyarlı bir bileşenin varlığını destekler.

Demir dozu ve tedavi süresi, bu sistemin yorumlanabilirliğini doğrudan etkileyen kritik parametrelerdir. Bizim elimizde, erken zaman noktaları (yaklaşık 12 saat) koşullar arasındaki en net ayrımı sağlar ve ferrostatin-1'in FAC kaynaklı sitotoksisiteyi tekrarlanabilir şekilde kurtarmasına olanak tanır. Daha sonraki zaman noktalarında (örneğin 24 saat), genel canlılık azalır ve koşullar arasında değişkenlik artar, bu da analiz dinamik aralığını azaltır. Bu, artan antioksidan kapasitesi veya değişen demir kullanımı gibi hayatta kalan popülasyonun birikimli hücre kaybı ve adaptasyonuyla tutarlıdır.

Demir demiri (Fe²⁺) yerine demir (Fe³⁺) uygulaması, verilen demir konsantrasyonu ve tedavi süresi de protokolün kritik unsurlarıdır. Demir kullanımı gereklidir çünkü demir, transferrin tarafından kolayca benimsenmektedir; transferrin demir ithalatından sorumlu^{ana taşıyıcıdır.} Demirli demir, diğer taşıyıcılar tarafından da (özellikle çift değerli metal taşıyıcı DMT1) alınabilse de, bu bağlamda demir demir, demirli^{demir 12'ye} göre daha etkili bir şekilde dahil edilmişti. Bu protokol için seçilen FAC konsantrasyonları, fizyolojik önemleri ve geçmiş benzer modellerde kullanımı nedeniyle^{seçilmiştir 13,14}. Demir tedavisinin süresi 24 saat olup, bizim ve başkalarının benzer modellerine dayanıyordu. Ancak, bazı bağlamlarda (özellikle değişken demir boyama ve hücre lüminesans testlerinde) 24 saat tedavi süresi çok uzun çıktı. Bu durumlarda, 24 saatlik bir tedavi o kadar önemli hücre ölümüne yol açtı ki, hücresel materyalin yok edilmesi nedeniyle hiçbir sonuç çıkarılamamıştır. Örneğin, RSL3 o kadar güçlü bir lipid peroksidasyon ajanıdır ki, 12 saatlik bir işlem süresi lipid peroksidasyonunu indüklemek için yeterliydi ve aynı zamanda demir aşırı yükünün etkilerinin aynı anda görünür olmasını sağladı (Şekil 3C-E). Ayrıca, değişken demir boyası için, hücreler sadece 2 saat süreyle FAC ile işlenmiş, ardından boyama yapıldıktan sonra (2, 4 ve 24 saat demir tedavilerinden sonra boyama denenmiş) ve aşırı hücre yok oluşundan önce demir aşırı yüküne karşı ilk yanıt yakalanması sağlanmıştır (Şekil 2D). Genel olarak, gen ve protein düzeyindeki değişikliklerin en iyi ölçüldüğünü, muhtemelen bu değişikliklerin hücrelerin daha uzun süre faaliyet göstermesi, boyamanın ise daha kısa bir tedavi süresinden sonra yapılması nedeniyle en iyi şekilde 12–24 saat demir tedavisinden sonra ölçüldüğü görülmektedir.

Diğerleri benzer modeller geliştirmiştir. Bir grup, ferroptizde p53-Slc7a11 ekseninin rolünü incelemek için demir ile işlenmiş C2C12 modeli oluşturdu. 48 saat boyunca demir tedavisinin lipid peroksidasyonunu artırdığını ve Slc7a11 seviyelerini azalttığını buldular; bu da ferroptoz^13'ü gösteriyor. Benzer bir başka model—bu sefer demir sülfatla işlenmiş C2C12 hücrelerini kullanarak Akt-FoxO3-E3 ubiquitin ligaza yolu ile ferroptoz arasındaki ilişkiyi incelemiş—demirle 4^{saat 14} boyunca tedavi uygulandı. Bunlar arasında ortak bir nokta, kök hücre benzeri miyoblast durumunda kalmak yerine miyotüplere ayrılmış C2C12 hücrelerinin demir tedavisini içermesidir. Bu da sistemimizi MuSC'lerde daha önce gözlemlenen demir birikimi açısından özellikle önemli kılar.

Demir aşırı yükünün kas üzerindeki etkilerini in vitro incelemenin basit bir yolu olmasına rağmen, yöntemin sınırlamaları vardır; çünkü sadece C2C12 hücreleri bağlamında kullanılmıştır. Önceki çalışmalar, kas kök hücrelerinin yaşlanma sırasında demir aşırı yüküne karşı hassas olduğunu göstermiştir; bu da benzer bir yöntemin bu bağlamda geçerli^{olabileceğini öne sürmektedir 9}.

Bir arada, bu model demir aşırı yükünün ferroptozla ilişkili moleküler değişikliklerin tekrarlanabilir bir seti ve C2C12 hücrelerinde ferrostatin hassasiyetli canlılık azalması için yeterli olduğunu göstermektedir. Ek ortogonal testler, hücre ölümünün belirli bağlamlarda sınıflandırılmasını daha da geliştirebilirken, burada gözlemlenen moleküler ve farmakolojik yanıtların birleşimi ferroptoz ilişkili hücre stresiyle tutarlıdır. Bu yaklaşımın, kas yaşlanması ve hastalıklarında demir düzensizliğinin mekanik çalışmalarını kolaylaştıracağını öngörüyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 kb Protein Ladder, 500 µL size	Bio-Rad	1610374	-20 °C'de saklayın. Buz üzerinde çözdürün.
15 mL Santrifüj Tüpleri CS500	Avantor/VWR	89039-664
30% Akrilamid/Bisfosfat çözeltisi, 29:1, 500 mL boyutu	Bio-Rad	1610156	Nörotoksindir. Uygun KKD (laboratuvar elbisesi, eldiven, göz koruması) ile çalışın.
5425 / 5425 R Mikrosantrifüj	Eppendorf	05-414-052
5910 Ri santrifüj	Eppendorf	05-414-459PM2
96 Kuyu Siyah/Şeffaf Taban Plaka, TC Yüzey	Thermo Fisher Scientific	165305
Amonyum persülfat, 10 g	Bio-Rad	1610700	Polimerizasyon maddesi olarak akrilamid jel dökümü için %10 ağırlık/hacim çözeltisi ile steril suda kullanılır. Toz oda sıcaklığında kararlıdır, ancak çözelti uzun süreli olarak -20 °C ve kısa süreli 4 °C'de saklanmalıdır.
Anti-GAPDH, fare antikoru, 100 µg boyutu	Thermo Fisher Scientific	AM4300	2% BSA + yıkama tamponunda 1:2000 konsantrasyonda kullanın. 37 kDa'da çalışır.
BCA Protein Assay Kit with Dilution-Free BSA Protein Standartları	Thermo Fisher Scientific	A55865	İlk kullanımdan sonra standartların 4 °C'de saklanması gerektiğini unutmayın. Kullanım için üreticinin talimatlarını izleyin.
Beta Actin Loading Kontrol Monoklonal Antikoru (BA3R), DyLight 800 4X PEG	Thermo Fisher Scientific	MA515739D800	2% BSA + yıkama tamponunda 1:1000 konsantrasyonda kullanın. 42 kDa'da çalışır.
BioLite 6 Kuyu Multidish Hücre Kültürü-İşlemli Yüzey	Thermo Fisher Scientific	130184
Blot Kutusu, Siyah, 9x6.5 cm, 5'li paket	Fisher Scientific	501870983
Bromofenol mavisi	Sigma-Aldrich	B0126	Laemmli tamponunun hazırlanmasında kullanılır.
BSA, katı, 100 g	Fisher Scientific	BP9703100	4 °C'de saklayın.
C2C12 hücreleri	ATCC	CRL-1772	Sıvı nitrojenin buhar fazında saklayın.
cDNA Supermix QScript 500 reaksiyon	Avantor/VWR	101414-108	-20 °C'de saklayın. Buz üzerinde çözdürün.
Hücre kaldırıcı, 100'lü paket	Fisher Scientific	8100240	Büyük olduğu için 10 cm ve daha büyük tabaklardan hücre çıkarmak için kullanılır.
Hücre kazıyıcı, 10 inç sap, 100'lü paket	Fisher Scientific	08-100-241	Küçük kafaları olduğu için çok kuyu plakalardan hücre çıkarmak için en uygundur.
CellTiter-Glo Işıksal Hücre Canlılık Kiti, 10 mL	Promega	G7570
Kloroform, %99.9	Thermo Fisher Scientific	610281000	Yalnızca bir havalandırma kabininde kullanın ve atıkları ayrı bir kapta bertaraf edin.
COMPLETE EDTA-içermeyen proteaz inhibitörü tabletleri	Sigma-Aldrich	4693132001	100x çözelti oluşturmak için 1 tableti 500 µL steril suda çözün.
CO2 100-120 V İnkübator	Binder	9640-0002	CBS 170-120 V model versiyonu. Hücre kültürü için kullanılır.
Deferoksamin mezilat, 50 mg	Fisher Scientific	5764/50	DFO bir demir şelatlardır, bu yüzden hücrelere eklenmesi demir içeriğini azaltır. 1 M stokun konsantrasyonu için suda çözün.
Dimetil sülfoksit, 100 mL	Fisher Scientific	D5879-100ML	Labil demir boyama ve yeniden kurulmasında kullanılır.
DMEM, yüksek glikoz, piruvat, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	11995065
Dylight 680 eşleştirilmiş Keçi anti-Tavşan IgG (H&L)	Thermo Fisher Scientific	35568	Yıkama tamponundaki 5% BSA'ya 1:5000 oranında ekleyin.
DyLight 800 4× PEG eşleştirilmiş Keçi anti-Fare IgG (H&L) İkincil Antikoru	Thermo Fisher Scientific	SA535521	Yıkama tamponundaki 5% BSA'ya 1:5000 oranında ekleyin.
Easypet 3 1 kanal pipet yardımcısı	Eppendorf	4430000018
Uzak kırmızı Labil Fe2+ Boyası	Sigma-Aldrich	SCT037	Stoka 50 µL DMSO'yu bir oda sıcaklığında alikotuna ekleyerek hazırlayın. Işığa duyarlıdır. Stok konsantrasyonu: 1 mM
Ferrik Amonyum Sitrat, 500 g	MP Biomedicals	158040
Ferrostatin 10 mg	Fisher Scientific	502259214	Lipit peroksidasyon yan ürünlerini sekeretre ederek in vitro ferroptozu inhibe eder. 10 mM stokun konsantrasyonu için DMSO'da çözün.
Fetal Bovin Serum, Premium Plus, şişe, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A5669701