Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

SHMT2: Agresif Akciğer Adenokarsinomunun Metabolik ve İmmün Bir Biyobelirteci

104 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71812

⸱

28 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic Surgery, Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Jiangxi Medical College, Nanchang University, 2Department of Thoracic Surgery, Affiliated Hospital of Jiujiang University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Entegre metabolomik, transkriptomik, tek hücreli ve fonksiyonel analizler, SHMT2'nin akciğer adenokarsinomunda SGOC metabolik yeniden programlanmasının, agresif davranışın ve öngörülen immünoterapi yanıtındaki azalmanın bir biyobelirteci olduğunu belirlemektedir.

Özet

Serin/glisin-tek karbon (SGOC) metabolizması akciğer adenokarsinomunda (LUAD) sıklıkla bozulur, ancak tümör davranışı ve öngörülen immünoterapi yanıtı ile ilişkisi henüz tam olarak tanımlanmamıştır. 23 çift LUAD ve komşu normal akciğer dokusunun metabolomik profillemesi, dahili ekstraktif elektrospray iyonizasyon kütle spektrometrisi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. SHMT2 ekspresyonu, prognoz, diferansiyel ekspresyon gösteren genler ve bağışıklıkla ilgili özellikleri değerlendirmek için The Cancer Genome Atlas LUAD kohortundan (TCGA-LUAD) elde edilen transkriptomik ve klinik veriler analiz edilmiştir. İmmün kontrol noktası blokajına öngörülen yanıt, Tümör İmmün Disfonksiyonu ve Eksklüzyonu (TIDE) ve The Cancer Immunome Atlas (TCIA) kullanılarak değerlendirilmiş ve ilaç duyarlılığı oncoPredict ile çıkarılmıştır. SHMT2'nin hücresel dağılımını incelemek için tek hücre RNA-seq verileri kullanılmıştır. Deneysel doğrulama; kantitatif ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR), western blotting, Human Protein Atlas (HPA) immünohistokimyası ve kısa saç tokası RNA (shRNA) aracılı SHMT2 nakavtını takip eden proliferasyon, yara iyileşmesi ve koloni oluşumu analizlerini içermiştir. Metabolomik analiz, glisin, serin ve treonin metabolizmasını LUAD'da belirgin şekilde değişmiş bir yolak olarak tanımlamıştır. SHMT2, LUAD'da yukarı regüle edilmiş olup daha kötü genel sağkalım ve olumsuz klinikopatolojik özelliklerle ilişkilendirilmiştir. SHMT2-yüksek tümörler; hücre döngüsü ve SGOC ile ilgili transkripsiyonel programların zenginleşmesini, daha düşük immün ve stromal skorları ve immünoterapiye karşı azalmış öngörülen yanıtı göstermiştir. Tek hücre analizi, B hücresi popülasyonlarında SHMT2 ekspresyonunun göreceli zenginleşmesini göstermiştir. In vitro ortamda, SHMT2 LUAD hücrelerinde aşırı eksprese edilmiş olup, nakavtı proliferasyonu, migrasyonu ve klonojenik büyümeyi baskılamıştır. Toplu olarak SHMT2, LUAD'da SGOC metabolik yeniden programlama, agresif tümör fenotipleri ve immün-dezavantajlı bir durum ile ilişkilidir ve bir biyobelirteç olarak potansiyel önemini desteklemektedir; terapötik hedefleme için ek farmakolojik ve in vivo doğrulama gereklidir.

Giriş

LUAD, belirgin moleküler heterojenite, erken metastaz eğilimi ve mevcut tedavi stratejilerinin sınırlı kalıcılığı nedeniyle dünya çapında kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir1,2. İmmün kontrol noktası inhibitörleri (ICIs), LUAD'ın terapötik manzarasını yeniden şekillendirmiş olsa da, sürdürülebilir klinik fayda hastaların yalnızca bir alt kümesiyle sınırlıdır ve hem birincil hem de kazanılmış direnç sıklıkla gözlemlenmektedir3,4. Hastalar arasındaki bu belirgin değişkenlik, tümör immün mikroçevresini şekillendiren ve immünoterapi yanıtını yöneten biyolojik belirleyicilerin tanımlanmasına duyulan acil ihtiyacın yanı sıra, hasta stratifikasyonunu ve tedavi sonuçlarını iyileştirmek için kullanılabilecek uygulanabilir zayıflıkların belirlenmesinin önemini vurgulamaktadır.

Metabolik yeniden programlama, malign progresyonun merkezi bir özelliğidir5. Metabolik programlar arasında SGOC metabolizması, glikolitik girdileri amino asit metabolizması ve nükleotid sentezi ile birbirine bağlayarak purin/pirimidin üretimi ve metil donörü oluşumu için tek karbonlu birimler sağlar6. Biyokütle üretiminin ötesinde SGOC metabolizması, redoks homeostazına katkıda bulunur ve DNA, RNA ve histon metilasyonunu etkilemek için metiyonin döngüsü ile etkileşime girerek kendisini proliferasyon ve epigenetik düzenlemenin merkezine konumlandırır7,8. Serin hidroksimetiltransferazın mitokondriyal izoformu olan serin hidroksimetiltransferaz 2 (SHMT2), 5,10-metilen-tetrahidrofolat üretirken serini glisine dönüştürür ve SGOC ağı içerisinde mitokondriyal tek karbon kaynağı için ana giriş noktasını oluşturur9. SHMT2, birçok malignitede anormal şekilde yukarı regüle edilmiştir ve artmış proliferasyon, invazyon, terapötik direnç ve oksidatif stres adaptasyonu ile ilişkilendirilmiştir10,11,12,13. SHMT2 ayrıca BRISC kompleksi aracılığıyla inflamatuar sinyalleme ile kesişir, ancak LUAD'da doğrudan SHMT2 tarafından yönlendirilen bir immün mekanizma henüz belirlenmemiştir14,15. Buna bağlı olarak, SHMT2'nin LUAD'da klinik olarak anlamlı bir metabolik fenotipi işaretleyip işaretlemediği ve immün mikroçevre özellikleri ile öngörülen immünoterapi yanıtı ile nasıl ilişkili olduğu entegre bir değerlendirme gerektirmektedir.

Tümör metabolizması ile antitümör immünite arasındaki çift yönlü etkileşim, çağdaş kanser biyolojisinin merkezinde yer almaktadır16. Tümör hücreleri; besin maddelerinin rekabetçi tüketimi, immünomodülatör metabolitlerin birikimi ve immün hücre diferansiyasyonunu ve efektör programlarını yeniden yapılandıran metabolik-epigenetik eşleşme yoluyla immün yetkinliği bozabilmektedir7,16,17. Artmış tek karbon metabolizması, T hücrelerindeki metilasyona bağımlı programları ve metabolik uygunluğu etkileyebilir, ancak bu etkilerin yönü ve büyüklüğü hücre tipine ve besin bağlamına bağlıdır17. Adaptif immün regülasyon T hücrelerinin ötesine de uzanır: B hücreleri, antikor yanıtları, antijen sunumu ve tersiyer lenfoid yapılar (TLS), immünoterapi etkinliği ile ilişkilendirilmiştir18. Bu gözlemler, platformlar arası uyumun tek başına nedenselliği kanıtladığını varsaymadan, metabolik bir adayı bulk-tümör, tek hücre ve fonksiyonel bağlamlar içinde konumlandırabilecek çok katmanlı bir analizi gerekli kılmaktadır.

Hücresel kaynağını veya fenotipik ilgisini belirlemeden değişen metabolitleri tanımlayan yalnızca metabolomik odaklı bir tasarımın ve metabolit değişimlerini doğrudan gözlemlemeden yolak aktivitesini çıkarabilen yalnızca bulk-transkriptomik odaklı bir tasarımın aksine, mevcut iş akışı eşleşmiş doku metabolomiğini, bulk ve tek hücre transkriptomiğini ve in vitro fonksiyonel analizleri entegre etmektedir. Bu katmanlar arasındaki uyum, adayların önceliklendirilmesini destekler ve herhangi bir tek analitik platforma olan bağımlılığı azaltır; ancak, elde edilen kanıtlar, immün ko-kültür veya in vivo sistemlerde doğrulanmadığı sürece immün regülasyon için ilişkisel kalmaya devam eder.

Glisinle ilişkili metabolik pertürbasyonları belirlemek için öncelikle LUAD ve komşu normal akciğer dokularının eşli doku metabolomikleri kullanılmıştır. Daha sonra; yolak ilgisi, tümördeki artış, prognostik ilişki ve deneysel uygulanabilirlik ile desteklenen mitokondriyal bir SGOC enzimi olan SHMT2'yi değerlendirmek için TCGA transkriptomik ve klinik verileri entegre edilmiştir. İmmün mikroçevre profillemesi, tek hücre haritalaması ve in vitro fonksiyonel doğrulama; metabolik değişim, enzim düzensizliği, hücresel dağılım ve tümör hücresi fenotipini kapsayan çok katmanlı, hipotez oluşturucu bir çerçeve oluşturmuştur. Pratik bir perspektiften, bu iş akışı taze dondurulmuş eşli dokular gerektirir. Kütle spektrometresi ile metabolit tanımlaması yarı niceldir; aday metabolitler bağımsız olarak doğrulanmalıdır. İmmünoterapi öngörüleri (TIDE/TCIA) ve ilaç duyarlılığı çıkarımları (oncoPredict), gerçek dünyadaki ICI tedavili kohortlarda klinik doğrulamanın yerini tutmayan transkriptom tabanlı hesaplamalı tahminlerdir ve hipotez oluşturucu olarak yorumlanmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, Nanchang Üniversitesi İkinci Bağlı Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (CDEFYYLK 3-05). Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak, örnek toplama işleminden önce tüm hastalardan yazılı onam alınmıştır. Ham veriler, Materyaller Tablosu'nda listelenen yazılım ve web kaynakları kullanılarak dışa aktarılmış ve analiz edilmiştir.

Klinik doku toplama

Ocak ve Haziran 2024 tarihleri arasında cerrahi rezeksiyon geçiren ve patolojik olarak invaziv akciğer adenokarsinomu tanısı konulan hastalardan eşleşmiş tümör ve uzak normal akciğer dokuları toplandı. Örnekler, operasyonu gerçekleştiren cerrah tarafından çıkarıldı, rezeksiyondan sonraki 5 dk içinde işlendi, hemen sıvı azot içinde şok donduruldu ve analize kadar saklandı. Kimliksizleştirilmiş klinikopatolojik özellikler Ek Tablo 1'de sunulmuştur.

LUAD'ı normal akciğer dokularından ayırt etmek için dahili ekstraktif elektrospray iyonizasyon kütle spektrometrisi (iEESI-MS)

Doku örnekleri (1 mm3), pozitif iyon modunda hibrit lineer iyon tuzağı-elektrostatik orbital-tuzak kütle spektrometresi kullanılarak iEESI-MS ile analiz edildi. Metanol ekstraksiyon çözücüsü (%100), +5 kV bias ile 3.0 µL/min hızında verildi. iEESI-MS1 tarama aralığı m/z 50–2,000 idi. iEESI-MS2, %25–35 normalize çarpışma enerjisi, m/z 2.0 izolasyon penceresi ve 30 s dinamik dışlama süresi ile çarpışma kaynaklı ayrıştırma kullandı. Cihaz standart prosedürüne göre yapılan günlük dış kalibrasyon ile kütle hatası <5 ppm seviyesinde tutuldu. Medyan normalizasyonu, log₂ dönüşümü ve otoskalama sonrası, 200 permütasyon testi ile OPLS-DA gerçekleştirildi. Metabolitler HMDB kullanılarak tanımlandı ve yol zenginleştirme analizi KEGG anotasyonları kullanılarak yapıldı.

Kütle spektrometrisi veri işleme ve metabolit tanımlama

Ham MS verileri, medyan normalizasyonunun ardından log₂ dönüşümü ve otoskalama (ortalama merkezleme ve her bir değişkenin standart sapmasına bölme) ile normalize edilmiştir. Ayırt edici m/z özelliklerini belirlemek için Ortogonal Kısmi En Küçük Kareler Diskriminant Analizi (OPLS-DA) kullanılmıştır. VIP > 1,0, |log₂(FC)| > 0,58 ve p < 0,05 olduğunda özellikler diferansiyel olarak kabul edilmiştir. Diferansiyel özellikler MS2 analizine tabi tutulmuş ve Human Metabolome Database kullanılarak tanımlanmıştır. Ardından, değişen yolakları belirlemek ve yolakla ilgili enzimleri önceliklendirmek için KEGG tabanlı yolak zenginleştirmesi kullanılmıştır. Tanımlanan diferansiyel metabolitler Ek Tablo 2'de sunulmuştur.

TCGA tabanlı SHMT2 ekspresyonu, sağkalım ve klinikopatolojik ilişki analizleri

TCGA-LUAD için RNA-seq ekspresyon profilleri ve ilgili klinik anotasyonlar 18 Aralık 2025 tarihinde Genomic Data Commons'tan indirilmiştir; tümör (n = 542) ve normal (n = 59). Milyon eşlenmiş okuma başına transkript kilobazı başına fragman (FPKM) değerleri log2(FPKM + 1) şeklinde dönüştürülmüştür. Prognostik analizlere yalnızca tam sağkalım bilgisine sahip örnekler dahil edilmiştir. Tümör ve normal SHMT2 ekspresyon değerleri Wilcoxon sıra toplamı testi kullanılarak karşılaştırılmıştır. Hastalar, medyan ekspresyon değerine göre SHMT2-yüksek ve SHMT2-düşük gruplarına ayrılmıştır. Genel sağkalım, Kaplan-Meier analizi ve log-rank testi ile değerlendirilmiştir. Tümör-nod-metastaz (TNM) evresi, yaş ve cinsiyet ile olan ilişkiler, uygun şekilde ki-kare veya Wilcoxon testleri kullanılarak değerlendirilmiştir. 1, 3 ve 5 yıllık sağkalım için zamana bağlı alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrileri oluşturulmuştur. Tüm istatistiksel testler çift yönlüdür.

Diferansiyel ekspresyon analizi ve fonksiyonel zenginleştirme (GO/KEGG)

SHMT2-yüksek ve SHMT2-düşük gruplar arasındaki farklı eksprese edilen genler (DEGs), yanlış keşif oranı < 0.05 ve |log₂(FC)| ≥ 1 kullanılarak belirlendi. Sonuçlar, bir volkan grafiği ve satır bazlı z-skoru normalizasyonu ile en üstteki 40 DEG'in ısı haritası şeklinde görselleştirildi. Gen Ontolojisi (GO) ve KEGG zenginleştirme analizlerinde düzeltilmiş p < 0.05 değeri kullanıldı. İnsan gen anotasyonları Aralık 2025'te Ensembl'dan alındı.

İmmün infiltrasyon, immünoterapi yanıt tahmini ve ilaç duyarlılığı çıkarımı

ImmuneScore, StromalScore ve ESTIMATEScore dahil olmak üzere tümör mikroçevre skorları ESTIMATE kullanılarak hesaplanmıştır. İmmün hücre kompozisyonu, LM22 referans seti (5 Aralık 2025 tarihinde indirilmiştir), 1.000 permütasyon ve dekonvolüsyon p < 0,05 olan örneklerin tutulması ile CIBERSORT kullanılarak çıkarılmıştır. SHMT2-yüksek ve SHMT2-düşük tümörler arasında grup bazlı karşılaştırmalar yapılmıştır. SHMT2 ile immün kontrol noktasıyla ilişkili genler arasındaki Spearman korelasyonları bir korelasyon matrisi olarak görselleştirilmiştir. İmmünofenoskorlar TCIA'dan alınmış ve immünoterapi yanıtının tamamlayıcı tahmini için TIDE kullanılmıştır. İlaç duyarlılığı, IC50 değerlerini tahmin etmek amacıyla Aralık 2023 GDSC sürümü ile eğitilmiş oncoPredict kullanılarak çıkarılmıştır. Grup farkları için Wilcoxon testleri, sürekli değişkenlerle ilişkiler için ise Spearman korelasyonları kullanılmıştır.

LUAD'ın tek hücreli RNA-seq analizi

Tek hücreli transkriptomik verileri19 20 Aralık 2025 tarihinde Gene Expression Omnibus'tan indirilmiş ve analiz edilmiştir. 200–6.000 arasında saptanan özelliğe sahip hücreler ve < Mitokondriyal transkriptlerin %10'u tutuldu. Sayımlar, 10.000'lik bir ölçek faktörü ile LogNormalize kullanılarak normalize edildi; değişkenliği en yüksek olan ilk 2.000 gen seçildi ve tüm genler ölçeklendi. Temel bileşen analizi için ilk 20 bileşen, UMAP için 1–20 arası boyutlar ve kümeleme için 0,5 çözünürlük kullanıldı. Hücre tipleri, Human Primary Cell Atlas referansı kullanılarak tanımlandı. Tümör ve normal örnekler arasında hücre tipi oranları karşılaştırıldı ve Spearman korelasyon matrisleri oluşturuldu. SHMT2 dağılımları, tanımlanan hücre tipleri genelinde incelendi. Hücre döngüsü durumları cyclone kullanılarak çıkarıldı ve ridge plot'lar ile görselleştirildi.

Hücre kültürü

BEAS-2B, H1299 ve A549 hücreleri, Malzeme Tablosu'nda belirtilen besiyeri ve takviyeler kullanılarak, %5 CO2 ve yaklaşık %95 bağıl nem değerine ayarlanmış nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de kültüre edildi.

Kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR)

Toplam RNA, fenol bazlı bir RNA ekstraksiyon reaktifi kullanılarak ekstrakte edilmiştir. Ekstrakte edilen RNA, bir ters transkripsiyon master mix kullanılarak cDNA'ya ters transkribe edilmiştir. Ters transkripsiyon; 42 °C'de 2 dk genomik DNA uzaklaştırma, 50 °C'de 15 dk ters transkripsiyon ve 85 °C'de 5 sn sonlandırma adımlarını içeren 20 µL'lik bir sistemde gerçekleştirilmiştir. Kantitatif PCR, DNA bağlayıcı boya bazlı bir qPCR master mix ile real-time PCR sisteminde, 95 °C'de 3 dk, ardından 40 döngü boyunca 95 °C'de 10 sn ve 60 °C'de 30 sn ve son olarak erime eğrisi adımı olarak 95 °C'de 15 sn, 60 °C'de 60 sn ve 95 °C'de 15 sn uygulanarak gerçekleştirilmiştir. Tüm reaksiyonlar üç tekrarlı olarak yürütülmüştür. Göreceli ekspresyon, housekeeping geni olarak GAPDH kullanılarak 2−ΔΔCt yöntemiyle hesaplanmıştır. Primer stok çözeltileri, çift distile su içerisinde 10 µM konsantrasyonda hazırlanmış ve -20 °C'de karanlıkta saklanmıştır. Primer sekansları Ek Tablo 3'te verilmiştir.

Western blotting

Toplam hücresel protein, buz üzerinde 30 dk boyunca radyoimmunopresipitasyon assay tamponu kullanılarak ekstrakte edilmiş ve 4 °C'de 15 dk boyunca 12,000 x g hızında santrifüjlenmiştir. Proteinler %12 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılmış ve 0,22 µm poliviniliden florür membranlara aktarılmıştır. Membranlar, oda sıcaklığında 2 saat boyunca %0,1 Tween 20 içeren Tris-tamponlu salin (%5 (w/v) yağsız süt ile birlikte) (TBST) ile bloke edilmiş ve %5 yağsız süt-TBST içerisinde seyreltilmiş anti-SHMT2 (1:1,000) ve anti-GAPDH (1:2,000) primer antikorları ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edilmiştir. TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20) ile her biri 8 dk süren üç yıkama işleminin ardından, membranlar oda sıcaklığında 1 saat boyunca yaban turpu peroksidaz-konjuge sekonder antikorlar (1:5,000) ile inkübe edilmiştir. Sinyaller, A ve B solüsyonlarının eşit hacimlerde karıştırılmasıyla hazırlanan gelişmiş kemilüminesans substratı kullanılarak, karanlıkta oda sıcaklığında 2 dk inkübe edilmiş ve bir kemilüminesans görüntüleme sistemi ile kaydedilmiştir.

HPA immünohistokimya doğrulaması

Normal akciğer dokusu ve LUAD'daki SHMT2 protein ekspresyon paternleri HPA kullanılarak değerlendirildi. HPA'da “SHMT2” sorgusu yapıldı ve karşılaştırma amacıyla temsili immünohistokimya (IHC) görüntüleri ile ilgili patoloji notları indirildi. Antikor spesifikliğinden kaynaklanan yanlılığı en aza indirmek için, HPA'da doğrulama seviyeleri daha yüksek olan antikorlara öncelik verildi. Mevcut olan durumlarda, birden fazla antikordan elde edilen IHC sonuçları çapraz referansla kontrol edildi (HPA020543 ve HPA020549).

LUAD hücrelerinde SHMT2 nakavt (knockdown) işlemi

LUAD'da SHMT2'nin tümör hücresine özgü rolünü araştırmak için, H1299 ve A549 hücrelerinde shRNA kullanılarak SHMT2 nakavt (knockdown) işlemi gerçekleştirilmiştir. shRNA, H1 promotörü tarafından yönlendirilen, puromisin seçilebilir bir lentiviral vektör aracılığıyla taşınmıştır; virüs üretimi sırasında paketleme plazmidleri birlikte transfekte edilmiştir. sh-SHMT2 insan SHMT2 kodlayan bölgesini hedeflerken, sh-NC randomize edilmiş bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Hazırlanan viral stoklar ≥ 1 x 108 transducing units/mL titrede olup -80 °C'de saklanmıştır. Hücreler, Materyal Tablosu'nda belirtilen hazırlanan sh-SHMT2 veya sh-NC lentiviral partikülleri ile enfekte edilmiştir. 48 saat sonra, nakavt verimliliği RT-qPCR ve western blotting ile değerlendirilmiştir. Proliferasyon, migrasyon ve koloni oluşum analizleri için yalnızca SHMT2 susturulması doğrulanmış hücreler kullanılmıştır.

Hücre proliferasyon analizi

Hücre proliferasyonu CCK-8 testi kullanılarak değerlendirildi. Transfekte edilen H1299 ve A549 hücreleri, 96 kuyucuklu plaklara her kuyucuğa 5 x 103 hücre gelecek şekilde altılı tekrarlar halinde ekildi. 1, 2, 3, 4 ve 5. günlerde, her kuyucuğa 10 µL CCK-8 reaktifi eklendi (kültür ortamı hacminin %10'u) ve 37 °C'de 2 saat boyunca inkübe edildi. Absorbans 450 nm'de ölçüldü ve hücre canlılığı okuması olarak kullanıldı.

Yara iyileşme analizi

Hücre göçü, yara iyileşmesi deneyi kullanılarak değerlendirildi. Transfekte edilmiş H1299 ve A549 hücreleri 6 kuyucuklu plaklara ekildi ve %90–95 konfluens düzeyine ulaşana kadar kültüre edildi. Steril bir 200 µL pipet ucu kullanılarak lineer bir yara oluşturuldu ve ayrılan hücreler, fosfat tamponlu salin ile nazikçe yıkanarak uzaklaştırıldı. Hücreler daha sonra serumsuz veya düşük serumlu besiyerinde tutuldu ve yara alanı, bir ters mikroskop altında 0. saatta ve 24. saatte görüntülendi. Yara kapanması, Materyaller Tablosu'nda listelenen görüntü analiz yazılımı kullanılarak nicelleştirildi ve başlangıçtaki yara alanına göre yüzde azalma olarak hesaplandı.

Koloni oluşum testi

Koloni oluşum analizi için, transfekte edilmiş H1299 ve A549 hücreleri 6 kuyucuklu plaklara kuyucuk başına 800 hücre olacak şekilde ekilmiş ve kültür süresince mikroskobik izleme yapılarak görünür koloniler oluşana kadar yaklaşık 10–14 gün boyunca kültüre edilmiştir. Koloniler, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile fikse edilmiş ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %0,1 kristal viyole ile boyanmıştır. 50'den fazla hücre içeren koloniler ışık mikroskobu altında sayılmıştır.

in vitro deneyler için istatistiksel analiz

Tüm in vitro deneyler birbirinden bağımsız olarak en az üç kez gerçekleştirilmiştir. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. İki grup arasındaki karşılaştırmalarda Student t-testi kullanılmış ve p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Doku metabolomikleri, glisinle ilişkili yolakların belirgin zenginleşmesiyle birlikte LUAD'da kapsamlı metabolik yeniden yapılanmayı ortaya çıkarmaktadır

LUAD tanılı 23 hastadan alınan eşleştirilmiş tümör ve komşu normal akciğer dokuları, doğrudan iEESI-MS ile profillendi; hasta özellikleri ve diferansiyel metabolit anotasyonları Ek Tablo 1 ve Ek Tablo 2'de sunulmuştur. log2 normalizasyonundan sonra, OPLS-DA tümör ve normal metaboli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada metabolomik keşif, enzim önceliklendirmesi, transkriptomik yorumlama, immün bağlam değerlendirmesi, tek hücreli lokalizasyon ve tümör hücresi fonksiyonel doğrulamasından oluşan ardışık bir çerçeve kullanılmıştır. Analizler, LUAD'da glisinle ilişkili ve SGOC metabolik yeniden yapılanmasını tanımlamakta ve SHMT2'yi olumsuz sonuçlar ile bilgisayar ortamında tahmin edilen daha düşük immünoterapi faydası ile ilişkilendirmektedir. Bu önceliklendirme, tek bir omik katmanına dayanmaktan daha güçlüdür ancak immün-ned...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, bu çalışmaya katılımları için hastalara ve ailelerine teşekkür ederler. Yazarlar ayrıca, verilerini kamuya açık hale getirdikleri için TCGA, GEO ve HPA veri tabanlarına katkıda bulunanlara şükranlarını sunarlar. Bu araştırma, Jiangxi Eyaleti Temel Araştırma ve Geliştirme Programı (hibe no. 20223BBG71009) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe no. 81860379 ve 82160410) tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
A549 hücreleriCCL-185ATCC
anti-GAPDH antikoruM1310-2Huaan Biotechnology
anti-SHMT2 antikoruD197021Sangon Biotech
BEAS-2B hücreleriCRL-9609ATCC
Hücre Sayım Kiti-8 (CCK-8)K1018APExBIO
Veritabanı: TCGA / GDCErişim tarihi 2025-12-18National Cancer Institute (NCI)
Veritabanı: GEOErişim tarihi 2025-12-20NCBI
Veritabanı: HMDBErişim tarihi 2025-12-12Human Metabolome Database
Veritabanı: KEGGErişim tarihi 2025-12-11Kanehisa Laboratories
Veritabanı: Human Protein AtlasProtein Atlas
Veritabanı: GDSC2023-12 sürümüSanger Institute
Veritabanı: Ensembl2025-12EMBL-EBI
Veritabanı: TCIAErişim tarihi 2025-12-10The Cancer Immunome Atlas
H1299 hücreleri (NCI-H1299)CRL-5803ATCC
HRP-konjuge ikincil antikorD110087Sangon Biotech
HiScript II Q Select RT SuperMixKR116Tiangen Biotech
LightCycler 480 Sistemi5015278001Roche
Yağsız sütYaygın laboratuvar reaktifiBD (veya kullanılan)
PVDF membran, 0.22 µmGVHP00010 (veya yaygın laboratuvar reaktifi)MilliporeSigma (veya kullanılan)
R paketi: pRoloc1.40.0Bioconductor
R paketi: TCGAbiolinks2.26.0Bioconductor
R paketi: survival3.4-0CRAN
R paketi: survminer0.4.9CRAN
R paketi: timeROC1.0.4CRAN
R paketi: DESeq21.38.1Bioconductor
R paketi: ggplot23.4.4CRAN
R paketi: pheatmap1.0.12CRAN
R paketi: clusterProfiler4.6.2Bioconductor
R paketi: org.Hs.eg.db3.16.0Bioconductor
R paketi: estimate1.0.13Bioconductor / GitHub
R paketi: CIBERSORT1(bağımsız R betiği)
R paketi: corrplot0.92CRAN
R paketi: TIDE0.3.0R paketi
R paketi: oncoPredict1.1.1CRAN / GitHub
R paketi: GEOquery2.66.0Bioconductor
R paketi: Seurat4.3.0CRAN
R paketi: SingleR1.10.0Bioconductor
R paketi: scran1.26.0Bioconductor
SYBR Green qPCR Master Mix (Universal)HY-K0501AMedChemExpress (MCE)
TRIzol Universal ReagentDP424Tiangen Biotech

Kaynaklar

  1. Siegel RL, et al. Cancer statistics, 2025. CA Cancer J Clin. 2025;75(1):10-45.
  2. Lim ZF, Ma PC. Emerging insights of tumor heterogeneity and drug resistance mechanisms in lung cancer targeted therapy. J Hematol Oncol. 2019;12(1):134.
  3. Wang M, Herbst RS, Boshoff C. Toward personalized treatment approaches for non-small-cell lung cancer. Nat Med. 2021;27:1331-1340.
  4. Passaro A, et al. Managing resistance to immune checkpoint inhibitors in lung cancer: treatment and novel strategies. J Clin Oncol. 2022;40:598-609.
  5. Faubert B, Solmonson A, DeBerardinis RJ. Metabolic reprogramming and cancer progression. Science. 2020;368:eaaw5473.
  6. Wei S, et al. Targeting serine-glycine-one-carbon metabolism as a vulnerability in cancers. Biomark Res. 2023;11:48.
  7. Kao KC, Vilbois S, Tsai CH, Ho PC. Metabolic communication in the tumour-immune microenvironment. Nat Cell Biol. 2022;24(11):1574-1583.
  8. Wong C, Qian Y, Yu J. Interplay between epigenetics and metabolism in oncogenesis: mechanisms and therapeutic approaches. Oncogene. 2017;36:3359-3374.
  9. Xu M, Pei DS. Serine hydroxymethyltransferase 2: a novel target for human cancer therapy. Invest New Drugs. 2021;39:1671-1681.
  10. Zeng Y, et al. Roles of mitochondrial serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2) in human carcinogenesis. J Cancer. 2021;12(19):5888-5894.
  11. Liberati FR, et al. RNA-mediated inhibition of mitochondrial SHMT2 impairs cancer cell proliferation. Cell Death Discov. 2025;11:369.
  12. Fu R, et al. SHMT proteins: an emerging set of serine hydroxymethyltransferase in cancer. Cell Signal. 2025;135:111977.
  13. Zhang Y, et al. SHMT2 promotes cell viability and inhibits ROS-dependent, mitochondrial-mediated apoptosis via the intrinsic signaling pathway in bladder cancer cells. Cancer Gene Ther. 2022;29(10):1514-1527.
  14. Wens M, et al. Metabolic control of BRISC-SHMT2 assembly regulates immune signalling. Nature. 2019;570:460-464.
  15. Ivashkiv LB. IFNγ: signalling, epigenetics and roles in immunity, metabolism, disease and cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 2018;18:545-558.
  16. De Martino M, Rathmell JC, Galluzzi L, Vanpouille-Box C. Cancer cell metabolism and antitumour immunity. Nat Rev Immunol. 2024;24:654-669.
  17. Qi Y, et al. One-carbon metabolism shapes T cell immunity in cancer. Trends Endocrinol Metab. 2024;35:961-974.
  18. Huang D, et al. The single-cell immunogenomic landscape of B and plasma cells in early-stage lung adenocarcinoma. Cancer Discov. 2022;12:2545-2563.
  19. Dolgalev I, et al. Inflammation in the tumor-adjacent lung as a predictor of clinical outcome in lung adenocarcinoma. Nat Commun. 2023;14:6479.
  20. Han T, et al. Phosphorylated SHMT2 regulates oncogenesis through m6A modification in lung adenocarcinoma. Adv Sci (Weinh). 2024;11:e2307834.
  21. Lee GY, et al. Comparative oncogenomics identifies PSMB4 and SHMT2 as potential cancer driver genes. Cancer Res. 2014;74:3114-3126.
  22. Bernhardt S, et al. Proteomic profiling of breast cancer metabolism identifies SHMT2 and ASCT2 as prognostic factors. Breast Cancer Res. 2017;19:112.
  23. Yang G, Tan J, Guo J, Wu Z, Zhan Q. Exosome-mediated transfer of circ_0063526 enhances cisplatin resistance in gastric cancer cells via regulating the miR-449a/SHMT2 axis. Anticancer Drugs. 2022;33(10):1047-1057.
  24. Parsa S, et al. The serine hydroxymethyltransferase-2 (SHMT2) initiates lymphoma development through epigenetic tumor suppressor silencing. Nat Cancer. 2020;1:653-664.
  25. Cuthbertson CR, et al. A review of small-molecule inhibitors of one-carbon enzymes: SHMT2 and MTHFD2 in the spotlight. ACS Pharmacol Transl Sci. 2021;4:624-646.
  26. Reina-Campos M, Scharping NE, Goldrath AW. CD8+ T cell metabolism in infection and cancer. Nat Rev Immunol. 2021;21:718-738.
  27. Bacigalupa ZA, Landis MD, Rathmell JC. Nutrient inputs and social metabolic control of T cell fate. Cell Metab. 2024;36:10-20.
  28. Li S, et al. Metabolic regulation of immunity in the tumor microenvironment. Cell Rep. 2025;44(11):116463.
  29. Ouyang Y, et al. S-adenosylmethionine: a metabolite critical to the regulation of autophagy. Cell Prolif. 2020;53(11):e12891.
  30. Wang R, et al. The interaction of innate immune and adaptive immune system. MedComm. 2024;5(10):e714.
  31. Teillaud JL, et al. Tertiary lymphoid structures in anticancer immunity. Nat Rev Cancer. 2024;24:629-646.
  32. Fridman WH, et al. B cells and tertiary lymphoid structures as determinants of tumour immune contexture and clinical outcome. Nat Rev Clin Oncol. 2022;19:441-457.
  33. Lauss M, Donia M, Svane IM, Jönsson G. B cells and tertiary lymphoid structures: friends or foes in cancer immunotherapy? Clin Cancer Res. 2022;28(9):1751-1758.
  34. Xi Y, et al. Macrophage efferocytosis mediated by the TP63-RAC2 pathway promotes immunosuppressive remodeling in esophageal cancer. Cell Rep Med. 2026;7(1):102529.
  35. Jiang G, et al. SATB2 plays a critical role in pancreatic cancer cell proliferation, migration and T cell cytotoxicity. Cancer Genet. 2025;296-297:53-64.
  36. Liu Y, et al. TRIM29 promotes glioblastoma progression via ubiquitinating NEFL and activating the PI3K/AKT signaling pathway. Cancer Genet. 2025;296-297:88-99.
  37. Zhai H, et al. WDR54 enhances NF-κB signaling to promote progression of hepatocellular carcinoma. Cancer Genet. 2025;298-299:302-314.
  38. Yin H, et al. PLAU serves as a prognostic biomarker correlated with perineural invasion in HNSCC. Cancer Genet. 2025;294-295:145-155.
  39. Liu Z, et al. JAK inhibition in PD-1 immunotherapy and tumor microenvironment. Front Immunol. 2026;17:1790936.
  40. DeNicola GM, et al. NRF2 regulates serine biosynthesis in non-small cell lung cancer. Nat Genet. 2015;47(12):1475-1481.
  41. Zhang W, et al. NRF2-mediated persistent adaptation of oesophageal adenocarcinoma cells to HER2 inhibition. Oncogene. 2025;44(33):2929-2941.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

SHMT2 BiyobelirteciSGOC MetabolizmasıMetabolomik Profillemeİmmün Kontrol NoktasıTek Hücre RNA-Seqİmmün Disfonksiyonİlaç DuyarlılığıWestern BlottingSHMT2 Nakavtı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.