Yöntem makalesi

C57BL/6 Farelerde Saç Yeniden Çıkışı için 3BDO Yüklü Çözünür Mikroiğne Yamalarının Hazırlanması ve Karakterizasyonu

74 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/71814

⸱

25 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Stomatology, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, bir fare tüy yeniden büyüme modelinde transdermal ilaç iletimi için 3BDO yüklü çözünür mikroiğne yamalarının fabrikasyonunu, karakterizasyonunu ve uygulamasını açıklamaktadır.

Özet

Androgenetik alopesi (AGA) için geleneksel tedavilerin kısıtlamaları, alternatif iletim yaklaşımlarını teşvik etmektedir. Bu protokol, C57BL/6 fare tüy yeniden büyüme modelinde 3BDO yüklü hyaluronik asit/kitosan (HA/CS) çözünebilir mikroiğne (MN) yamalarının üretimi, karakterizasyonu ve uygulamasını açıklamaktadır. Yöntem, ilaç içermeyen bir HA/CS destek tabakası oluştururken 3BDO'yu iğne uçlarında yoğunlaştırmak için bir polidimetilsiloksan (PDMS) kalıpta iki aşamalı bir kalıplama işlemi kullanır. Yama; taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleme, mekanik testler, cilt yerleştirme ve çözünme testleri, in vitro salınım testleri, antibakteriyel analizler, sitotoksisite testi ve in vivo tüy yeniden büyüme değerlendirmesi ile karakterize edilir. Yerleştirme üzerine MN uçları çözünerek 3BDO'yu lokal olarak salar. In vivo değerlendirme, 3BDO yüklü MN grubunun, test edilen deri altı enjeksiyon ve kontrol gruplarına göre daha tekdüze tüy yeniden büyümesine sahip olduğunu göstermiştir. Bu protokol ayrıca yama morfolojisinin, yerleştirme performansının ve lokal biyouyumluluğun değerlendirilmesini de desteklemektedir. Bu yöntem, tüy yeniden büyüme uygulamaları için 3BDO'nun MN aracılı iletimini değerlendirmek üzere preklinik bir iş akışı sağlar.

Giriş

Androgenetik alopesi (AGA), temel olarak saç derisindeki saçların ilerleyici şekilde incelmesi ve kaybı ile karakterize olan en yaygın klinik alopesi bozukluklarından biridir. Erkekler arasındaki yaşam boyu prevalansı sürekli yüksek seyretmektedir ve bu durum, acil çözüm gerektiren kritik bir sağlık sorunu haline gelmektedir1,2. Günümüzde AGA için klinik tedaviler temel olarak farmakolojik müdahaleler ve cerrahi transplantasyon olarak ikiye ayrılmaktadır ve her iki yöntemin de önemli dezavantajları bulunmaktadır. Finasterid ve minoksidil gibi birinci basamak terapötik ilaçlar belirli tedavi edici etkiler göstermektedir; ancak cinsel işlev bozukluğu, saç derisinde kaşıntı ve saç derisinde kuruluk gibi belirgin advers reaksiyonlarla ilişkilendirilmektedirler1,3. Saç ekimi lokal saç rejenerasyonu sağlayabilse de yüksek tedavi maliyetleri, donör bölgelerdeki yetersiz saç miktarı ve değişken greft sağkalım oranları nedeniyle sınırlıdır ve bu durum yöntemin klinik pratikte yaygınlaşmasını zorlaştırmaktadır1. Bu sınırlamalar göz önüne alındığında, etkinlik, güvenlik ve hasta uyumunu birleştiren yeni terapötik stratejilere ihtiyaç duyulmaktadır.

3BDO, rapamisin ile yarışan küçük moleküllü bir mTOR aktivatörüdür4. Çeşitli sistemlerde yaygın olarak bir otofaji inhibitörü olarak kullanılmıştır5,6,7. Örneğin, 3BDO ile yapılan uzun süreli tedavi, otofagozom sayısını azaltarak hafıza fonksiyonunu iyileştirebilir8. Ayrıca, artan kanıtlar 3BDO'nun bağımsız bir mTOR aktivatörü olarak hareket edebileceğini göstermektedir. Örneğin, 3BDO, mTOR aktivitesinden bağımsız olarak farelerde endotel hücre ölümünü ve ateroskleroz gelişimini engellemiştir9. Ancak, kıl folikülü büyümesindeki potansiyel rolü rapor edilmemiştir. Özellikle, ön çalışmalarımızda 3BDO'nun saç yeniden büyümesini teşvik ettiği bulunmuştur. Bununla birlikte, geleneksel topikal ilaç iletim yöntemlerinin belirgin sınırlamaları vardır. Derinin stratum corneum tabakası transdermal verimliliği kısıtlayarak, ilaçların dermisteki kıl folikülü hedef bölgesine iletilmesini zorlaştırmaktadır. Transdermal jeller ilaç tutulum süresini uzatabilse de istenmeyen kalıntılar bırakabilirler. Yukarıda belirtilen her iki tedavi stratejisinin klinik etkinliği suboptimal kalmaktadır10,11.

Mikroiğneler (MN'ler), temel avantajı stratum corneum tabakasını kolayca geçebilme ve ilaçları epidermis ile dermis birleşimindeki perifoliküler mikroortama doğru bir şekilde iletebilme yeteneğinde yatan, yeni ve ağrısız bir ilaç iletim teknolojisidir. Ayrıca MN'ler, kullanım kolaylığı, minimal invazivlik ve makul maliyet gibi özelliklere sahiptir12,13,14. Topikal 3BDO'nun transdermal iletim darboğazını gidermek için, matris olarak hyaluronik asit (HA) ve fonksiyonel bileşen olarak kitosan (CS) kullanılarak bir MN yaması geliştirilmiştir. CS'nin eklenmesiyle, antibakteriyel potansiyeli olan fonksiyonel bir bileşenin sağlanması amaçlanmıştır. Dahası, HA'nın alopesik fare derisine uygulanması, kıl folikülü gelişimini önemli ölçüde uyarabilmektedir15. Bu nedenle, bu protokol, 3BDO yüklü çözünebilir bir MN sisteminin üretimi ve karakterizasyonunu ve bu sistemin tüyleri temizlenmiş bir C57BL/6 fare kıl yeniden büyüme modelindeki uygulamasını açıklamaktadır. Bu model, depilasyon sonrası kıl yeniden büyüme yanıtlarını değerlendirmek için kullanışlıdır, ancak tek başına AGA için klinik etkinlik kanıtlamaz.

Protokol

Çalışma, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences hayvan etik kurulu tarafından onaylanmıştır (W202112030345). Tüm yöntemler, ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak yürütülmüştür.

1. 3BDO@MN yamalarının üretimi

  1. CS/HA formülasyonunun hazırlanması
    1. 1 g CS tozu (deasetilasyon derecesi ≥ %95) tartın ve 20 mL distile suya ekleyin, ardından oda sıcaklığında (RT) 10 dk boyunca karıştırın.
    2. 0,4 mL %2 (v/v) asetik asit çözeltisi (moleküler ağırlık 60,05) eklemeye devam edin ve 2 saat boyunca karıştırmaya devam edin.
      UYARI: Konsantre asetik asit koroziftir. Seyreltme ve taşıma işlemlerini bir çeker ocak altında gerçekleştirin; cilt ve mukoza zarlarıyla teması önlemek için tek kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlük kullanın.
    3. 2 g HA tozu ekleyerek işleme devam edin ve ardından tam çözünmeyi sağlamak için karışmış formülasyonu 1.207 × g'de (yaklaşık 3.000 rpm) 5 dk boyunca santrifüjleyin.
      ​NOT: CS/HA formülasyonu taze olarak hazırlanmalı ve 4 °C'lik bir buzdolabında 24 saatten fazla tutulmamalıdır.
  2. 3BDO yüklü CS/HA formülasyonunun hazırlanması
    1. Önceden çözülmüş 3BDO çözeltisini (2 mg/mL) dimetil sülfoksit (DMSO) içine ekleyin.
      UYARI: DMSO cilt geçirgenliğine sahiptir. Doğrudan cilt temasından kaçınmak için işlem sırasında eldiven giyin ve çözeltiyi CS/HA formülasyonuna ekleyin. Tam çözünmeyi sağlamak için karıştırın.
    2. Sıkışmış hava kabarcıklarını gidermek için karışmış formülasyonu 1.207 × g'de 5 dk boyunca santrifüjleyin.
      ​NOT: Santrifüjden sonra kabarcıklar devam ederse, formülasyonu 5 dk bekletin ve ardından tekrar santrifüjleyin.
  3. 3BDO@MN yamalarının üretimi
    1. 600 µm yüksekliğe, 250 µm taban çapına ve 550 µm hatveye sahip konik uçlardan oluşan 20 × 20'lik bir diziye sahip bir polidimetilsiloksan (PDMS) MN kalıbı kullanın.
    2. PDMS kalıbın yüzeyini, tamamen hidrofilik hale getirmek için bir plazma temizleyici ile işleyin.
    3. PDMS MN kalıbına 1 mL 3BDO@CS/HA formülasyonu ekleyin. Vizkoz formülasyonun mikro boşluklara sızmasını kolaylaştırmak için kalıbı bir vakum odasına yerleştirin ve 10 dk boyunca vakum uygulayın.
    4. Formülasyonun tüm boşlukları doldurduğundan emin olmak için kalıbı oda sıcaklığında (RT) 134 × g'de 5 dk boyunca santrifüjleyin. Kalıp yüzeyindeki fazla formülasyonu, tamamen düz bir düzlem kalacak şekilde steril bir metal kazıyıcı ile dikkatlice temizleyin.
    5. 3BDO içermeyen CS/HA matriks karışımını kalıp yüzeyine dağıtın. Üniform bir destek tabakası oluşturmak için oda sıcaklığında (RT) 134 × g'de 5 dk boyunca santrifüjleyin.
    6. Kalıbı 36 °C sıcaklık ve %37 nemdeki bir fırına yerleştirin ve gece boyunca (yaklaşık 12–16 saat) kurutun.
    7. Kalıp oda sıcaklığına (RT) soğuduktan sonra, tamamen kurumuş MN yamasını kalıptan soyun.
      NOT: Üretilen 3BDO@MN yamalarını, kullanılmaya hazır olana kadar 4 °C'lik bir buzdolabında saklayın.

2. 3BDO@MN yamalarının karakterizasyonu

  1. Hazırlanan 3BDO@MN yamasını, çift taraflı iletken karbon bant kullanarak bir stub üzerine monte edin.
    1. Elektriksel iletkenliği artırmak için monte edilen numuneyi ince bir altın (veya platin) tabakasıyla sputter-kaplayın.
    2. Numune stub'ını, bir alan emisyonlu taramalı elektron mikroskobunun (FE-SEM) vakum odasına yerleştirin.
    3. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için hızlandırma voltajını ve çalışma mesafesini ayarlayın. Genel dizi morfolojisini ve münferit MN'lerin ince yüzey topografyasını gözlemleyin.
    4. Temsili SEM mikrografları edinin. MN uzunluğunu ve uç çapını ölçün.
  2. Mekanik dayanım testi
    1. MN yamasını bir tekstür analizörünün numune test platformuna düz bir şekilde yerleştirin. Alt tabakanın tamamen düz olduğundan ve iğne uçlarının doğrudan yukarı baktığından emin olun.
    2. Düz silindirik bir probu (25 mm çapında) cihazın yük hücresine güvenli bir şekilde sabitleyin.
    3. Probu, MN uçlarının hemen üzerine gelene kadar dikey olarak indirin. Testten önce prob ile uçlar arasında herhangi bir fiziksel temas olmasından kaçının.
    4. Yazılımda spesifik test parametrelerini ayarlayın: aşağı yönlü test hızını 0.05 mm/s ve hedef yer değiştirme mesafesini 0.7 mm olarak ayarlayın.
  3. Çözünme testi
    1. Sıçan dorsal derisini diseksiyon tahtasına yayın ve deri yüzeyini kurulayın. Deriyi düz ve kırışıklıksız tutun.
    2. Kuru MN yamalarını, iğne uçları aşağı bakacak şekilde deri yüzeyine yerleştirin ve MN'lerin deriye yerleşmesini sağlamak için tekdüze dikey basınç uygulayın.
    3. Yamaları önceden belirlenmiş zaman aralıklarında (5, 10, 30 ve 60 s) deriden çıkarın ve 5 dk boyunca kurutun.
    4. Kalıntı morfolojisini aynı görüntüleme koşulları altında SEM ile gözlemleyin.
  4. In vitro ilaç salım analizleri
    1. 6 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna 500 µL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. 3BDO yüklü MN'leri, PBS ile temas edecek şekilde her kuyucuğa yerleştirin.
    2. Plakaları oda sıcaklığında inkübe edin. Her zaman noktasında, 3BDO konsantrasyonunun miktar tayini için 500 µL PBS toplayın.
    3. Sink koşullarını korumak için her kuyucuğu derhal 500 µL taze PBS ile yeniden doldurun.
    4. MN'lerdeki başlangıçtaki toplam ilaç yüklemesine dayanarak salınan 3BDO'nun kümülatif yüzdesini hesaplayın.
  5. Antibakteriyel analizler
    1. Bakteriyel hücre stoklarını (E. coli ve Staphylococcus aureus) -80 °C'deki depolama alanından çıkarın ve her bir bakteriyel hücre stoğundan 10 µL'yi 5 mL LB besiyerine ekleyin.
    2. İnoküle edilmiş besiyerini, bir inkübatör çalkalayıcıda 37 °C ve 250 rpm'de yaklaşık 16 saat (gece boyunca) inkübe edin.
    3. Bakteriyel kültürü, başlangıç OD620 değeri 0.01 olacak şekilde LB besiyeri ile ayarlayın.
    4. Altı farklı konsantrasyonda (1, 5, 10, 50, 100 ve 500 mg/mL) CS çözeltileri hazırlamak için CS stok çözeltisini steril su ile seyreltin ve her konsantrasyon için üç tekrar hazırlayın.
    5. Numuneleri üç gruba ayırın: boş grup, kontrol grubu ve CS grubu. Boş grup için 200 µL LB ekleyin. Kontrol grubu için 180 µL bakteriyel çözelti ve 20 µL steril su ekleyin. CS grubu için 180 µL bakteriyel çözelti ve ilgili konsantrasyondaki CS çözeltisinden 20 µL ekleyin.
    6. 37 °C'de 20 saat boyunca inkübe edin.
    7. 96 kuyucuklu plakanın her kuyucuğunun OD620 değerini 0. saat ve 20. saatte bir absorbans plaka okuyucuda ölçün ve kaydedin.
  6. Sitotoksisite değerlendirmeleri
    1. 96 kuyucuklu bir plakaya 100 µL epidermal veya dermal hücre süspansiyonu ekleyin (kuyucuk başına 2 × 103 hücre).
    2. Dört grup oluşturmak için belirlenen kuyucuklara ilgili tedavilerden 10 µL ekleyin: bir kontrol grubu (kültür besiyeri), bir 3BDO grubu (final konsantrasyonu 1 µM), bir MN ekstrakt grubu ve bir 3BDO+MN ekstrakt grubu; her grup için 3 tekrar yapın.
    3. 37 °C, %5 CO₂ ortamında 24 saat boyunca inkübe edin.
    4. Her kuyucuğa 10 µL Cell Counting Kit-8 (CCK-8) çalışma çözeltisi ekleyin.
      NOT: Absorbans okumalarını etkileyebileceği için kuyucuklarda hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.
    5. 37 °C, %5 CO₂ ortamında 2 saat boyunca inkübe edin.
    6. Bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak tüm kuyucuklar için 450 nm'deki absorbansı okuyun.
    7. Verileri analiz edin ve hücre sağkalım oranını hesaplayın.

3. Hayvan deneyleri

  1. Deney hayvanlarının hazırlanması ve tedavisi
    1. 7 haftalık erkek C57BL/6 farelerini izofluran ile anestezi edin ve anestezi sırasında termoregülasyon sağlayın.
      DİKKAT: İzofluran uçucu bir anesteziktir. Aşırı solumayı önlemek için iyi havalandırılan bir ortamda çalışın.
    2. Farelerin gözlerini kurumadan korumak için oftalmik lubrikant uygulayın.
    3. Farelerin dorsal tüylerini elektrikli tıraş makinesi kullanarak, yaklaşık 2 × 2 cm2'lik bir alanı kapsayacak şekilde tıraş edin.
    4. Depilatuar kremi uygulayın, 5–10 s bekleyin ve ardından silerek temizleyin. Kalan depilatuar krem ve tüyleri temizlemek için cildi salinli bir pamukla silin.
    5. MN yamalarını kesin ve kenara ayırın.
    6. Tıraş edilen fareleri rastgele beş gruba (grup başına n = 5) ayırın ve şu şekilde tedavi edin:
      1. Tedavi edilmemiş kontrol grubu: Herhangi bir uygulama yapmadan sadece tüyleri tıraş edin.
      2. Boş MN yaması grubu: Tıraş edilmiş cildi, 3BDO@MN grubuyla aynı takvimi izleyerek 3BDO içermeyen MN yamaları ile tedavi edin.
      3. 3BDO@MN yaması grubu: Tıraş edilmiş cildi 1, 3, 5, 7, 9, 11 ve 13. günlerde 3BDO@MN yamaları ile tedavi edin.
      4. PBS deri altı enjeksiyon grubu: Farelerin tıraş edilmiş dorsal bölgesine günlük olarak PBS çözeltisi deri altı enjeksiyonu uygulayın.
      5. 3BDO deri altı enjeksiyon grubu: Farelerin tıraş edilmiş dorsal bölgesine günlük olarak 3BDO çözeltisi deri altı enjeksiyonu uygulayın.
    7. 3BDO@MN yamalarını tıraş edilmiş cildin üzerine yerleştirin ve MN'lerin cilde yerleşmesini sağlamak için tekdüze dikey basınç uygulayın. 3BDO@MN yamalarını elastik bir bandajla sabitleyin ve bandajı yerinde tutmak için düz bir klemps kullanın.
      ​NOT: Farklı dozaj programları, her stratejinin belirgin iletim özelliklerine göre seçilmiştir: 3BDO@MN yaması lokalize sürdürülebilir salım sağlarken, deri altı enjeksiyonu 3BDO'yu bolus doz şeklinde iletir.
    8. Farelerin anesteziden tamamen kurtulduğundan emin olmak için deney boyunca onları gözlemleyin.
  2. Numune toplama ve kıl büyüme değerlendirmesi
    1. Kıl büyümesini kaydetmek için farelerin dorsal cildini her gün fotoğraflayın.
    2. 15. günde kıl şaftı çapını, kıl kapsamını ve kıl yoğunluğunu ölçerek yeniden kıl çıkmasını değerlendirin. Tedavi edilen bölgedeki kıl kapsamı yüzdesini ImageJ yazılımını kullanarak nicelendirin.

Sonuçlar

Bu protokol, 3BDO@MN yamasının fabrikasyonunu ve karakterizasyonunu sunmaktadır. Şekil 1 3BDO@MN yamasının üretim sürecinin şeması gösterilmektedir. 3BDO, CS/HA formülasyonu ile karıştırılmış ve ardından matris karışımı, iğne uçlarını doldurmak üzere PDMS MN kalıbına eklenerek santrifüj edilmiştir. 3BDO içermeyen CS/HA matris karışımı, destek tabakasını doldurmak amacıyla kalıp yüzeyine eklenmiş ve santrifüj edilmiştir. Tam kuruma gerçekleştikten sonra, 3BDO@MN yamalarını elde etmek için yamalar soyulmuştur. MN'lerin morfolojisi, şunlarda gösterildiği gibi SEM ile karakterize edilmiştir: Şekil 2A.

Konik MN'ler, 15 × 15 mm'lik bir yama üzerinde 20 × 20'lik bir dizi şeklinde tekdüze olarak oluşturulmuştur ve her birinin taban genişliği 250 µm, yüksekliği ise 600 µm'dir. MN uçları, hematoksilin ve eozin (H&E) boyamasıyla gözlemlenen belirgin insersiyon iğne deliklerinin kanıtladığı üzere, cilt penetrasyonu için yeterli olan 1.2 N'luk bir kuvvete dayanmıştır (Şekil 2B,C). Ardından, 3BDO@MN yamalarının uygulamasını test etmek için fare dorsal cildi kullanılmıştır. Çözünme süresini ölçmek için yamalar fare derisine bastırılmış ve MN uçları 60 saniye içinde tamamen çözünmüştür (Şekil 2D). in vitro analizde, MN'lerden 3BDO salınım profili, ilacın yaklaşık %90'ının salındığını göstermiştir (Şekil 2E). MN ekstresi, epidermal ve dermal hücrelerde herhangi bir sitotoksisite göstermezken, 1 µM 3BDO hücre büyümesini önemli ölçüde teşvik etmiştir (Şekil 2F). Kitosan içeren formülasyon, hem E. coli hem de S. aureus'a karşı konsantrasyona bağlı antibakteriyel aktivite göstermiş ve 10 mg/mL'yi aşan konsantrasyonlarda daha belirgin bir etki sergilemiştir (Şekil 2G,H). Bu sonuçlar, kitosanın MN formülasyonunun fonksiyonel bir bileşeni olarak kullanımını desteklemektedir; ancak uygulama koşulları altındaki antibakteriyel performansı onaylamak için nihai olarak üretilen yamaların daha ileri testlere tabi tutulması gerekecektir.

Hayvan deney sonuçları, 3BDO@MN grubunun 5. günde belirgin cilt pigmentasyonu sergilediğini göstermiştir. 15. güne gelindiğinde, 3BDO enjeksiyonu yapılan grup kontrol grubundaki yaklaşık %39'luk orana kıyasla kabaca %45 kıl örtüsü gösterirken, 3BDO@MN grubu yaklaşık %90 örtü oranına ulaşmıştır (Şekil 3). 3BDO@MN grubundaki kıl yeniden büyümesi daha üniform ve yoğun gerçekleşmiş olup, bu durum doğrudan enjeksiyona kıyasla daha iyi ilaç penetrasyonu ve tutulumuna işaret etmektedir.

Birlikte değerlendirildiğinde bu bulgular, MN aracılı 3BDO iletiminin, bu çalışmada kullanılan depile edilmiş C57BL/6 fare modelinde saç yeniden büyümesini teşvik ettiğini göstermektedir. Bu yaklaşımın androgenetik alopesinin hastalığa özgü modellerinde ve klinik olarak ilgili dozaj koşulları altında etkili olup olmadığını belirlemek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

3D biyobasım süreci diyagramı: 3BDOQCS/HA kaplama, santrifüj, vakumlu kurutma, CS/HA matrisi.
Şekil 1. 3BDO@MN'lerin üretim sürecinin şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Mikroiğne dizisi diyagramları ve hücre canlılığı grafikleri; kitosan laktatın antibakteriyel özellikleri üzerine çalışma.
Şekil 23BDO@MN sisteminin üretimi ve karakterizasyonu. (A) 3BDO@MN'lerin morfolojisini gösteren SEM görüntüsü. Ölçek çubuğu = 500 µm. (B) 3BDO@MN'lerin kuvvet-yer değiştirme eğrisi. (C) H&3BDO@MN'lerin yerleştirilmesinin ve taban kısmının çıkarılmasının ardından, doku penetrasyonunun başarıyla gerçekleştiğini doğrulayan, H&E boyalı fare deri kesiti. Ölçek çubuğu = 100 µm. (D) Cilde yerleştirildikten sonraki 5 sn, 10 sn, 30 sn ve 60 sn'lerde MN'lerin çözünmesini gösteren SEM görüntüleri. (E) Kümülatif in vitro MN'lerden 3BDO'nun salınım profili. (F) 3BDO, MN ekstresi ve MN ekstresi içerenlerle işlem görmüş epidermal hücrelerin ve dermal hücrelerin hücre canlılığı 24. saatte 3BDO. (G,H) 620 nm'deki absorbans değeri (G) Staphylococcus aureus ve (H) Escherichia coli farklı konsantrasyonlarda kitosan içeren ortamda kültüre edilen süspansiyonlar. Veriler ortalama ± SD (n = 3) olarak sunulmuştur ve istatistiksel anlamlılık tek yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir (**p < 0.01). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Mikroiğne (MN) yamaları ile saç büyüme deneyi; farelerde pigmentasyon, saç kapsama sonuçları.
Şekil 33BDO@MN'lerin saç yeniden uzatma etkileri in vivo. (A) Hayvan deneylerinin şematik gösterimi. (B) Tedavi sonrası 0. gün (tıraşlama), 5. gün, 10. gün ve 15. gündeki fare dorsal deri örneklerinin temsilci görüntüleri. (C) ...'daki pigmentasyon skorlarının (keyfi birimler) kantitatif analizi (B). (D) ... uygulanan bölgedeki saç kaplama alanının (%) kantitatif analizi (B). (E) Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, tedavi edilen bölgedeki kıl kapsama alanının göreceli kat değişimi. Veriler ortalama ± SD (n = 5) olarak sunulmuştur ve istatistiksel anlamlılık tek yönlü ANOVA (**p < 0.01). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Günümüzde AGA için klinik tedaviler temel olarak farmakolojik müdahaleler ve cerrahi transplantasyon şeklinde kategorize edilmektedir. Bu çalışmada, 3BDO yüklü MN'ler bir C57BL/6 fare modelinde saç yeniden büyümesini teşvik etmiştir. Ancak, geleneksel ilaç iletim yöntemleri, düzensiz ilaç dağılımı gibi sınırlamalara sahiptir. Bu çalışmadaki temel protokol, 3BDO yüklü MN'lerin üretimi için iki aşamalı bir yöntemdir. HA ve CS, MN'lerin ana bileşenleridir. MN kalitesini sağlamak için birkaç kritik adımın dikkatle uygulanması gerekmektedir.

İlk olarak, polimer çözeltisinde hava kabarcıklarının hapsolmasını önlemek için, santrifüjleme sırasında çözücü buharlaşmasını yavaşlatmak amacıyla önceden soğutulmuş bir kalıp kullanılmıştır. İkinci olarak, kurutma koşulları uç kırılganlığını ve destek tabakası bütünlüğünü doğrudan etkilemektedir. Kontrollü nem altında 36 °C'de 16 sa boyunca kurutma, aşırı kurutmadan kaçınarak destek tabakasının esnekliğini korurken uçların yeterli mekanik dayanıklılığa sahip olmasını sağlamaya yardımcı olmuştur. Üçüncü olarak, 5 dk boyunca 134 × g hız, 3BDO'yu uç bölgesinde etkili bir şekilde yoğunlaştırır; ancak daha yüksek hızlar veya daha uzun süreler, ilaç çökelmesine neden olarak iletim verimliliğini azaltabilir. in vivo analiz için, tüy yeniden büyüme modeli olarak C57BL/6 fareler kullanılmıştır. C57BL/6 farelerinin kıl folikülleri görünür ve oldukça senkronize bir tüy büyüme döngüsü sergileyerek deneysel kolaylık sağlar ve bu da onları deri hastalıklarını incelemek için en yaygın modellerden biri haline getirir16. Yaklaşık 7 haftalık yaşta, C57BL/6 farelerinin kıl folikülleri doğal olarak telojen fazına girer. Farelerin yapay depilasyonundan sonra, kıl folikülleri hemen anajen fazına yeniden girer17. in vivo analiz, bu modelde MN sisteminin, deri altı enjeksiyona kıyasla daha üniform tüy yeniden büyümesini teşvik ettiğini göstermiştir.

3BDO@MN sistemi, saç rejeneratif bir küçük molekülü minimal invaziv bir transdermal iletim platformuyla entegre ederek, saç kaybı tedavisi için gelecek vadeden bir preklinik stratejiyi temsil edebilir. Uzun etkili mikroiğne formülasyonlarının; kontrollü veya sürdürülebilir ilaç salınımına olanak tanıdığı, uygulama sıklığını azalttığı ve hasta uyumunu artırdığı, böylece konvansiyonel topikal veya sistemik tedavilerle ilişkili bazı sınırlamaları giderdiği bildirilmiştir18,19. Ayrıca, kök hücre iletimi dahil olmak üzere, son dönemdeki mikroiğne destekli saç rejenerasyonu stratejileri, mikroiğne platformlarının bu alandaki daha geniş uygulanabilirliğini desteklemektedir20. Bununla birlikte, klinik uygulamaya geçilmeden önce; uzun vadeli biyogüvenliği, farmakokinetik/farmakodinamik profilleri, doz optimizasyonunu, depolama stabilitesini ve ölçeklenebilir üretimi değerlendirmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyulmaktadır.

Açıklamalar

Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82273554), Shandong Eyaleti Tıp ve Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Geliştirme Projesi (No.202304030716), Çin Ulusal Üniversite Öğrencileri İnovasyon ve Girişimcilik Eğitim Programı (No. 202410439001) ve Tai’an Bilim ve Teknoloji İnovasyon Geliştirme Projesi (No. 2023NS232) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3BDOYuanye Bio-Technology Co., Shanghai, China890405-51-33BDO yüklü CS/HA formülasyonunun hazırlanması
6 kuyucuklu plakaCorning Incorporated, USAREF 3516antibakteriyel analiz ve in vitro ilaç salım analizi
75% etanolShandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.1202050004Dezenfeksiyon
96 kuyucuklu plakaCorning Incorporated, USAREF3599hücre sitotoksisite değerlendirmeleri ve antibakteriyel analiz
C57BL/6 fareleriCharles River Laboratories7 haftalıkhayvan deneyleri
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)Dojindo, JapanCK04sitotoksisite değerlendirmeleri
SantrifüjThermo Fisher Scientific75007204Formülasyon santrifüjü
Kitozan (CS) Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd9012-76-4CS/HA formülasyonunun hazırlanması
Epilasyon kremiVeet3059944023307Epilasyon
Dimetil sülfoksit (DMSO)Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd67-68-53BDO yüklü CS/HA formülasyonunun hazırlanması
Elektronik teraziRadwagAS 220.R2Toz tartımı
Escherichia coli (E. coli)ATCC/antibakteriyel analiz
Hiyalüronik Asit (HA) tozuBloomage Biotechnology Co. China9067-32-7CS/HA formülasyonunun hazırlanması
ImageJ yazılımıNational Institutes of Health/İstatistiksel analiz
İnkübatör çalkalayıcıThermo Scientific  50163013bakteriyel inkübasyon
İzofluran vaporizatörüGene&IAMShayvan anestezi
LB besiyeriSigma Life ScienceL3022antibakteriyel analiz
Manyetik karıştırıcıHangzhou MiuLab Instrument Co., Ltd.SP-16Formülasyon karıştırma
Multiskan SkyHigh mikroplaka spektrofotometresiThermo Fisher Scientific/OD ölçümü
EtüvShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co.,LtdDHG-9260AMikroiğne kurutma
Parafilm MAmcor PM-996Mikroiğne mühürleme
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)BiosharpBL302Ain vitro ilaç salım analizi
Staphylococcus aureus (S. aureus)ATCC/antibakteriyel analiz
Universal TA tekstür analizörüShanghai Tengba Instrument Technology Co., Ltd/Mekanik dayanım testi
Vakum odasıShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co.,LtdDZF-6050Vakumla kurutma

Kaynaklar

  1. Zhou C, Li X, Wang C, Zhang J. Alopecia areata: an update on etiopathogenesis, diagnosis, and management. Clin Rev Allergy Immunol. 2021;61(3):403-23.
  2. Rudnicka L. Hair loss is a symptom of many complex medical and psychological problems. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2023;37(8):1460-1.
  3. Alessandrini A, Bruni F, Piraccini BM, Starace M. Common causes of hair loss: clinical manifestations, trichoscopy and therapy. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2021;35(3):629-40.
  4. Zhao X et al. Long noncoding RNA CA7-4 promotes autophagy and apoptosis via sponging MIR877-3P and MIR5680 in high glucose-induced vascular endothelial cells. Autophagy. 2020;16(1):70-85.
  5. Wang L et al. An effective pharmacological hydrogel induces optic nerve repair and improves visual function. Sci China Life Sci. 2024;67(3):529-42.
  6. Wei Y et al. Midline-1 regulates effector T cell motility in experimental autoimmune encephalomyelitis via mTOR/microtubule pathway. Theranostics. 2024;14(3):1168-80.
  7. Gao Y et al. Rheb1 promotes tumor progression through mTORC1 in MLL-AF9-initiated murine acute myeloid leukemia. J Hematol Oncol. 2016;9:36.
  8. Wei L et al. A butyrolactone derivative 3BDO alleviates memory deficits and reduces amyloid-beta deposition in an AbetaPP/PS1 transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 2012;30(3):531-43.
  9. Meng N et al. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein E1 regulates protein disulphide isomerase translation in oxidized low-density lipoprotein-activated endothelial cells. Acta Physiol (Oxf). 2015;213(3):664-75.
  10. Clavel C et al. Sox2 in the dermal papilla niche controls hair growth by fine-tuning BMP signaling in differentiating hair shaft progenitors. Dev Cell. 2012;23(5):981-94.
  11. Yang CC, Cotsarelis G. Review of hair follicle dermal cells. J Dermatol Sci. 2010;57(1):2-11.
  12. Jin Y et al. Multifunctional microneedle patches loaded with engineered nitric oxide-releasing nanocarriers for targeted and synergistic chronic wound therapy. Adv Mater. 2025;37(5):e2413108.
  13. Wu H et al. Ultrasonic hollow microneedle array (USHM) for androgenetic alopecia treatment through modulating the expression of hair-growth-associated genes. ACS Appl Mater Interfaces. 2025;17(14):21419-30.
  14. Cao Y et al. Dissolvable microneedle-based wound dressing transdermally and continuously delivers anti-inflammatory and pro-angiogenic exosomes for diabetic wound treatment. Bioact Mater. 2024;42:32-51.
  15. Liu J et al. Medium-molecular weight hyaluronic acid orchestrates hair follicle regeneration via CD44/AKT-driven endogenous ROS activation of beta-catenin. Int J Biol Macromol. 2026;360:151752. doi:10.1016/j.ijbiomac.2026.151752.
  16. Nareswari A et al. Development and validation of a C57BL/6 mouse model of androgenetic alopecia through testosterone propionate induction. Trends Sci. 2026;23(8):12711.
  17. Liu M, He G, Wang F, Wang Y. In vivo non-invasive observation of dynamic changes in hair shaft, melanin, and collagen during the C57BL/6 follicle cycle. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.09.15.676351.
  18. Vora LK et al. Long-acting microneedle formulations. Adv Drug Deliv Rev. 2023;201:115055.
  19. Xiang H et al. Dissolving microneedles for alopecia treatment. Colloids Surf B Biointerfaces. 2023;229:113475.
  20. Xiao T et al. Microneedle assisted delivery of epidermal and dermal stem cells to promote hair growth. J Mater Sci. 2024;59(19):8427-40.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Bioengineering3BDOWnt cateninAndrogenetic alopeciaHair regenerationMicroneedleTransdermal delivery

İlgili makaleler