Bu protokol, kontrollü üç boyutlu bir kültür sisteminde meme morfogenezinin temel özelliklerini özetleyen insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntemi tanımlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Meme morfogenezini yeniden düzenleyen üç boyutlu insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntem
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Doku mimarisini ve hücre durum dinamiklerini özetleyen fizyolojik olarak ilgili insan model sistemlerinin geliştirilmesi, meme gelişimi ve kanserogenezdeki erken olayların incelenmesinde büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir. Geleneksel iki boyutlu kültürler ve birçok üç boyutlu sistem, insan meme bezini tanımlayan yapısal organizasyon ve mikroçevresel ipuçlarını yakalayamıyor. Burada, tip I kollajen, laminin, fibronektin ve hyaluronik asidden oluşan tanımlanmış bir hidrojel matriksin içinde gömülü primer epitel hücrelerinden üç boyutlu insan meme organoidleri üretmek için tekrarlanabilir bir yöntem tanımlıyoruz. Bu sistem, 21 günlük kültür dönemi boyunca meme morfogenezinin ana aşamalarında tek hücrelerin ilerlemesini destekler; bunlar arasında progenitor genişleme, epitel desenleri ve terminal duktal lobular birim benzeri yapıların oluşumu ile mezenkim benzeri bir bölmenin ortaya çıkması dahildir. Hidrojel hazırlanması, hücre tohumlama ve kültür koşulları için adım adım bir protokol sunuyoruz. Yöntem, organoid sayısı, boyut dağılımı ve mimari karmaşıklığın yüksek içerikli görüntüleme ve nicel analiziyle uyumludur. Bu platform, epitel plastisitesi ve çevresel bozulmaların mekanik çalışmalarını mümkün kılarak, meme kanseri riskiyle ilişkili erken doku düzeyindeki değişikliklerin araştırılması için ölçeklenebilir ve biyolojik olarak ilgili bir sistem sunar.
Giriş
İnsan meme bezi gelişimini ve dokuyu kötü niyetli dönüşüme yatkın yapan erken olayları anlamak, doku mimarisini, hücre hiyerarşisini ve mikroçevresel sinyalleri sadakatle özetleyen deneysel sistemler gerektirir. İki boyutlu epitel kültürleri önemli mekanistik içgörüler sağlamış olsa da, epitel organizasyonu vemorfogenez 1'i modellemek için gerekli yapısal bağlamdan yoksundurlar. Mevcut üç boyutlu kültür sistemleri, bazal membran ekstraktlarına dayananlar dahil, alanı ilerletmiş ancak değişken bileşim, ekstrasellüler matris bileşenleri üzerinde eksik kontrol ve yüksek dereceli doku mimarisi 1'in tutarsız desteği....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Ameliyattan sonra tıbbi atık olarak atılmış birincil dokular, Maine Tıp Merkezi ve Tufts Tıp Merkezi'ndeki kurumsal inceleme kurulları tarafından onaylanan protokoller kullanılarak tüm ilgili yasalara uygun olarak alındı. Tüm dokular nakil öncesi anonimleştirildi ve belirli hastalara izlenemedi. Bu nedenle, bu araştırmaya Massachusetts Teknoloji Enstitüsü ve Tufts Üniversitesi Sağlık Bilimleri (IRB #13521) İnsanların Deneysel Olarak Kullanımı Komitesi tarafından muafiyet statüsü verilmiştir. Bu çalışmaya kayıtlı tüm hastalar, çalışmaya katılmayı ve sonuçların yayımlanmasını kabul eden bilgilendirilmiş bir onay formu imzaladı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolün başarılı uygulanması, organize epitel morfolojisi ve dokuya özgü mimari özellikler sergileyen üç boyutlu organoid yapıların oluşmasına yol açar. Organoidler, tohumlamadan sonra 3–7 gün içinde oluşmaya başlar ve kültür boyunca gelişmeye devam eder. Bu hidrojel organoid sisteminin önceki karakterizasyonu, birden fazla bağımsız birincil insan bağışçısı arasında tekrarlanabilir organoid oluşumunugöstermiştir 3. Bu çalışmada, hastalıksız 12 redüksiyon mam.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada tanımlanan protokol, mememorfogenezi 3'ün temel özelliklerini destekleyen tanımlanmış bir hidrojel mikro ortamında üç boyutlu insan meme organoidlerinin tekrarlanabilir üretilmesini sağlar. Bu yöntemin başarısı için birkaç adım kritik öneme sahiptir. İlk olarak, doku işleme ve enzimatik ayrışma, epitel canlılığını korumak ve aşırı sindirimi en aza indirmek için dikkatlice kontrol edilmelidir; bu da hücre verimini azaltabilir ve sonraki morfogenez
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
C.K., Naveris'in kurucu ortağı ve danışmanıdır.
Teşekkürler
Tufts Biyomedikal Deposu'ndan doku desteği için Karla Murga, Daniela Requena ve Megan Maloney'yi minnettarlıkla takdir ediyoruz. Bu araştırma, Find The Cause Meme Cancer Foundation ve Tufts CTSI NIH Klinik ve Translasyonel Bilim Ödülü (UM1TR0043, G.R.) tarafından desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 15 mL konik tüpler | VWR | 89039-664 | Dokunun işlenmesi ve santrifüjleme için steril tüpler |
| 40 µm hücre süzgeci | VWR | 732-2757 | Tek hücreli süspansiyon hazırlığı için filtreleme cihazı |
| Düşük hacimlerde 40 µm hücre süzgeci | Bel-Art | 136800040 | Tek hücreli süspansiyon hazırlığı için filtreleme cihazı |
| Otomatik hücre sayacı | Bio-Rad | 1450102 | Hücreleri saymak ve canlılığı belirlemek için kullanılan cihaz |
| Boğa hipofiz özü | Thermo Scientific | 13028014 | Epitel hücre ortamı için takviye |
| Hücre sayım slaytları | Bio-Rad | 145-0011 | Hücre sayımı için kullanılan çift hazneli slaytlar |
| Santrifüj | Yok | Yok | Tezgah üstü santrifüj/ler en az 500 x g hız kabiliyetine ve 15 mL ve 1.5 mL tüplerin konaklanmasına sahip olmalıdır. |
| Kollajen I | Millipore Sigma | 08-115 | Hidrojel oluşumu için kullanılan hücre dışı matris proteini |
| Kollajenaz A | Sigma-Aldrich | 11088793001 | Dokunun ayrışması için kullanılan enzim |
| Krioviyaller | Corning | 976171 | Numunelerin kriyojenik depolanması için steril şişeler |
| Kültür kapları (örn., hazneli slaytlar, çok kuyucuklu plakalar) | Corning | 354104 354108 3603 | Hidrojel birikimi ve organoid kültürü için platformlar. |
| Dimetil sülfoksit | Millipore Sigma | 317275 | Dondurma ortamında kullanılan kriyoprotektif |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | İkincil doku ayrışması için kullanılan enzim |
| DNase I | Roche | 10104159001 | Hücre ayrışması sırasında kullanılan enzim. |
| Fetal boğa serumu | Gibco | 10437 | Yıkama ve nötralizasyon ortamında kullanılan serum takviyesi |
| Fibronektin | Sigma-Aldrich | F2006 | Hücre dışı matris proteini bileşeni |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050061 | Epitel hücre ortamı için takviye |
| İnsan epidermal büyüme faktörü | Sigma-Aldrich | E9644 | Epitel hücre ortamı için takviye |
| Hidrokortizon | Sigma-Aldrich | H0888 | Epitel hücre ortamı için takviye |
| Hiyalüronik asit | Millipore Sigma | 385908 | Hidrojel formülasyonu için hücre dışı matris bileşeni |
| Hiyaluronidaz | Sigma-Aldrich | H3506 | Dokunun ayrışması için kullanılan enzim |
| İnkübatör | Thermo Scientific | 3598 | Dokunun kültürü inkübasyonu için kullanılan cihaz |
| İnsülin | Sigma-Aldrich | I9278 | Epitel hücre ortamı için takviye |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Hücre dışı matris proteini bileşeni |
| Meme epitelyal bazal ortamı | Thermo Scientific | M171500 | Epitel hücreleri için büyüme ortamı |
| Mikrosantrifüj tüpleri (1.5 mL) | Thermo Scientific | 3451 | Küçük hacimli reaksiyonlar için kullanılan tüpler |
| Orbital döndürücü | Thermo Scientific | 400110 | Enzimatik ayrışma sırasında dokunun dağılımı için kullanılan döndürücü |
| P1000 pipeti | Gilson | P1000 | 1.000 µL'ye kadar hacimlerin karıştırılması ve aktarılması için kullanılan cihaz |
| Penisilin-streptomisin | Thermo Scientific | 15140122 | Epitel hücre ortamı için antibiyotik takviyesi |
| Fosfat tamponlu salin | Gibco | 20012-027 | Yıkama ve durulama için kullanılan tampon çözeltisi |
| Hassas denge | Mettler Toledo | ML303E | Dokunun tartılması için kullanılan denge |
| Serolojik pipet | Nunc | 170356N | Yapışkan olmayan epitel hücrelerini hasat etmek için kullanılan pipet |
| Sodyum hidroksit (1 N) | Fisher Chemical | SS261 | Kollajen nötralizasyonu için kullanılan reaktif |
| Sterili skülpel | Bard-Parker | 372615 | Mekanik doku doğramada kullanılan aletler |
| Tripan mavisi çözeltisi | Gibco | 15250061 | Hücre canlılık değerlendirmesi için kullanılan boya |
| Tripsin (%0,25) | Gibco | 25200056 | Hücre ayrışması için kullanılan enzimatik reaktif |
| Su banyosu (37 °C) | VWR | 10LA | Numunelerin kontrollü çözülmesi için kullanılan cihaz |
Kaynaklar
- Rauner G, Gupta PB, Kuperwasser C. From 2D to 3D and beyond: the evolution and impact of in vitro tumor models in cancer research. Nat Methods. 2025;22:1776-87.
- Traugh N, et al. Immune-epithelial interactions via TGF-β orchestrates stem-cell niche formation and morphogenesis [Preprint]. Available from: https://doi.org/10.1101/2025.05.22.655596. 2025.
- Rauner G, et al. Single-cell organogenesis captures complex breast tissue formation in 3D. Development. 2025. Available from: https://doi.org/10.1242/dev.204813.
- Trepicchio C, et al. DDR1 regulates RUNX1-CBFβ to control breast stem cell differentiation [Preprint]. bioRxiv. 2024. Available from: h....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
