Yöntem makalesi

Meme morfogenezini yeniden düzenleyen üç boyutlu insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntem

DOI:

10.3791/71831

⸱

26 Haziran 2026

 ,  ,  , 
1Department of Developmental, Molecular & Chemical Biology, Tufts University School of Medicine, 2Laboratory for the Convergence of Biomedical, Physical, and Engineering Sciences, Tufts University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kontrollü üç boyutlu bir kültür sisteminde meme morfogenezinin temel özelliklerini özetleyen insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntemi tanımlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku mimarisini ve hücre durum dinamiklerini özetleyen fizyolojik olarak ilgili insan model sistemlerinin geliştirilmesi, meme gelişimi ve kanserogenezdeki erken olayların incelenmesinde büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir. Geleneksel iki boyutlu kültürler ve birçok üç boyutlu sistem, insan meme bezini tanımlayan yapısal organizasyon ve mikroçevresel ipuçlarını yakalayamıyor. Burada, tip I kollajen, laminin, fibronektin ve hyaluronik asidden oluşan tanımlanmış bir hidrojel matriksin içinde gömülü primer epitel hücrelerinden üç boyutlu insan meme organoidleri üretmek için tekrarlanabilir bir yöntem tanımlıyoruz. Bu sistem, 21 günlük kültür dönemi boyunca meme morfogenezinin ana aşamalarında tek hücrelerin ilerlemesini destekler; bunlar arasında progenitor genişleme, epitel desenleri ve terminal duktal lobular birim benzeri yapıların oluşumu ile mezenkim benzeri bir bölmenin ortaya çıkması dahildir. Hidrojel hazırlanması, hücre tohumlama ve kültür koşulları için adım adım bir protokol sunuyoruz. Yöntem, organoid sayısı, boyut dağılımı ve mimari karmaşıklığın yüksek içerikli görüntüleme ve nicel analiziyle uyumludur. Bu platform, epitel plastisitesi ve çevresel bozulmaların mekanik çalışmalarını mümkün kılarak, meme kanseri riskiyle ilişkili erken doku düzeyindeki değişikliklerin araştırılması için ölçeklenebilir ve biyolojik olarak ilgili bir sistem sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan meme bezi gelişimini ve dokuyu kötü niyetli dönüşüme yatkın yapan erken olayları anlamak, doku mimarisini, hücre hiyerarşisini ve mikroçevresel sinyalleri sadakatle özetleyen deneysel sistemler gerektirir. İki boyutlu epitel kültürleri önemli mekanistik içgörüler sağlamış olsa da, epitel organizasyonu vemorfogenez 1'i modellemek için gerekli yapısal bağlamdan yoksundurlar. Mevcut üç boyutlu kültür sistemleri, bazal membran ekstraktlarına dayananlar dahil, alanı ilerletmiş ancak değişken bileşim, ekstrasellüler matris bileşenleri üzerinde eksik kontrol ve yüksek dereceli doku mimarisi 1'in tutarsız desteğiyle sınırlı kalıyor. Ayrıca, bazal zar ekstraktlarına dayalı birçok organoid sistem, doku benzeriorganizasyonun ortaya çıkmasını tutarlı şekilde destekleyememeleriyle kısıtlanır. Özellikle, birçok sistem, destekleyici mikro ortamların endogen gelişimini mümkün kılmak yerine dışsal stromal bileşenlere dayanır; bu da doku gelişimi ve hastalık için merkezi olan epitelal–mezenkimal etkileşimleri modelleme yeteneklerini sınırlar. Bu sınırlamalar, gelişimsel süreçlerin, epitel plastisitesinin ve çevresel veya moleküler bozulmaların doku organizasyonu üzerindeki etkilerinin tekrarlanabilir incelenmesini kısıtlar.

Bu sınırlamaları gidermek için, birincil epitel hücrelerinin tanımlanmış bir ekstraselülermatriks 2,3,4,5,8 içinde organize yapılar üretmesini sağlayan tanımlanmış hidrojel bazlı üç boyutlu insan meme organoidi modeli geliştirdik. Hidrojel, tip I kollajen, laminin, fibronektin ve hyaluronik asitten oluşur; bileşenler, meme bezi gelişimi ve epitel morfogenezindeki belirlenmiş rollerine göre seçilir. Bu ekstrasellüler matriks molekülleri, integrinler, diskoidin alan reseptörleri, CD44 ve RHAMM gibi farklı hücresel reseptörleri ele alır ve epitel polaritesi, dallanan morfogenezi, kök hücre bakımı, mekanik transduksiyon ve memebezinde doku organizasyonunu düzenlediği bilinir 6,7. Bu hidrojel sistemi tanımlayan önceki çalışmalar, bu ekstrasellüler matriks bileşenlerinin dahil edilmesinin, sadece kollajen veya Matrigel bazlı koşullara kıyasla kanal-lobüler morfogenez ve epitel olgunlaşmasını belirgin şekildeiyileştirdiğini göstermiştir 3,8. Ayrıca, bu hidrojel formülasyonun fiziksel özellikleri daha önce atomik kuvvet mikroskobu ile karakterize edilmişti ve kompozit ekstrasellüler matriks hidrojelin, sadece kolajen içeren jellere göre daha düşük sertlik ve şişlikte artış gösterdiğini göstermiştir (Young modülü: sırasıyla 256,7 ± 20,0 Pa vs. 559,2 ± 204,0 Pa), bu da daha yumuşak ve daha hidratlı bir matrisortamı ile uyumludur 8.

Önemli olarak, bu model epitel yapılarının yanında ortaya çıkan mezenkim benzeri bir bölmenin ortaya çıkmasını destekler ve doğal dokuorganizasyonunu daha yakından yansıtan endojen yapısal ve sinyal desteği sağlar 3. Bu hidrojel sisteminin fizyolojik önemi, hem morfolojik hem de transkriptomik analizler kullanılarak geleneksel Matrigel bazlı organoid kültürlerle doğrudan karşılaştırmalar yoluyla değerlendirilmiştir. Daha önceki çalışmalar, hidrojel kültürlerinin Matrigel bazlı kültürlere göre daha organize kanal-lobular doku oluşumunu ve çoklu hatlı farklılaşmayı desteklediğini ve aynı zamanda hormon yanıtlılığınıkoruduğunu göstermiştir 8. Daha yakın zamanda, hidrojel kökenli organoidler, Matrigel kökenli organoidler ve birincil insan meme dokusunu karşılaştıran entegre tek hücreli RNA dizileme analizleri, hidrojel yetiştirilen organoidlerin yerli insan meme dokusunda bulunan epitelyal hiyerarşi, hücresel çeşitlilik ve epitelal–mezenkimal etkileşimleri daha sadık şekildetekrarladığını göstermiştir 3. Buna karşılık, Matrigel tarafından yetiştirilen organoidler proliferatif hibrit bazal durumlar için zenginleştirilmiş ve stromal benzeri popülasyonlardan yoksundu; bu da yönlendirilmiş organogenez yerine epitel kendi kendine toplanma ile tutarlıdır.

Burada açıklanan protokol, birincil insan dokusundan organoidler üretmek için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir yöntem sunar; ayrıca fibroblast azalması ve tek hücrelere ayrılması için isteğe bağlı adımlar bulunur. Bu platform, canlı görüntüleme, yüksek içerikli görüntüleme, nicel morfometrik analiz, hücre takibi ve genetik bozulma çalışmalarıyla uyumlu olduğundan, organoid sayısı, büyüklüğü, mimarisi ve büyüme dinamiklerini değerlendiren aşağı akış yaklaşımlarıyla entegre edilebilir. Bu platform, insan meme gelişimini, epitel plastisitesini, epitelal–mikroçevre etkileşimlerini ve gelişimsel, moleküler veya çevresel bozulmalara doku düzeyinde yanıtları incelemek için biyolojik olarak ilgili bir sistem sağlar.

Doku işleme, hidrojel hazırlanması, organoid kültürü, gelişimsel ilerleme ve sonraki analizleri içeren iş akışının şematik bir genel görünümü Şekil 1'de sunulurken, bu platformla oluşturulan temsil organoid morfolojileri Şekil 2'de gösterilmiştir.

figure-introduction-1
Şekil 1. Hidrojel bazlı organoid üretim iş akışına genel bakışı. (A) Protokol iş akışını özetleyen akış şeması; doku toplama, doku işleme, kriyo-koruma, iyileşme ve isteğe bağlı hücre hazırlığı, hidrojel hazırlığı, organoid kültürü, organoid geliştirme ve sonraki analitik uygulamaları içerir. (B) Hidrojel bazlı organoid üretim protokolünün ana aşamalarını gösteren görsel şematik; doku işleme ve hazırlığı, geri kazanım ve isteğe bağlı hücre hazırlığı ile hidrojel hazırlığı ve organoid tohumlama dahil. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-introduction-2
Şekil 2. Tanımlanmış hidrojel sisteminde oluşturulan temsili organoid morfolojiler. Tanımlanmış hidrojel matriksinde kültürlenmiş farklı insan dokularından türetilen organoidlerin temsil parlak alan görüntüleri. Redüksiyon mamoplastisiyle türetilen tek epitel hücrelerinden oluşan meme organoidleri, kültürün 21. gününde görüntülendi. Tümör parçalarından üretilen hasta kaynaklı ksenograft organoidler, kültürün 16. gününde görüntülendi. Epitel parçalarından üretilen tükürük bezi organoitleri kültürün 3. gününde görüntülendi. Epitel parçalarından üretilen böbrek organidleri, kültürün 17. gününde görüntülendi. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ameliyattan sonra tıbbi atık olarak atılmış birincil dokular, Maine Tıp Merkezi ve Tufts Tıp Merkezi'ndeki kurumsal inceleme kurulları tarafından onaylanan protokoller kullanılarak tüm ilgili yasalara uygun olarak alındı. Tüm dokular nakil öncesi anonimleştirildi ve belirli hastalara izlenemedi. Bu nedenle, bu araştırmaya Massachusetts Teknoloji Enstitüsü ve Tufts Üniversitesi Sağlık Bilimleri (IRB #13521) İnsanların Deneysel Olarak Kullanımı Komitesi tarafından muafiyet statüsü verilmiştir. Bu çalışmaya kayıtlı tüm hastalar, çalışmaya katılmayı ve sonuçların yayımlanmasını kabul eden bilgilendirilmiş bir onay formu imzaladı.

1. Doku İşleme ve Hazırlığı

NOT: İnsan dokusuyla ilgili tüm işlemleri kurumsal biyogüvenlik ve etik yönergeler doğrultusunda gerçekleştirin. İşleme başlamadan önce protokol adımlarının ve organoid hazırlık iş akışının görsel bir genel bakılması için Şekil 1A ve 1B'de gösterilen iş akışı şemalarına bakabilirsiniz.

  1. MEGM, 52 μg/mL sığır hipofiz ekstraktı, 10 ng/mL insan epidermal büyüme faktörü, 5 μg/mL insülin, 500 ng/mL hidrokortizon, %1 (v/v) GlutaMAX ve %1 (v/v) Antibiyotik-Antimikotik (100X) ile takviye edilmiş meme epitelyal bazal ortam ile hazırlanır.
  2. Dissosiyasyon ortamını, meme epitelyal büyüme ortamına (MEGM) 1,5 mg/mL kollagenaz A (−20°C'de depolanmış) ve 100 U/mL hialuronidaza (4°C'de depolanmış) ekleyerek hazırlayın.
  3. Profilaktik mastektomi ve redüksiyon mamoplastileriyle alınan insan meme dokusu alınmalı, fosfatla tamponlu tuzlu (PBS) hapsedilmemiş ve 4°C'de tutulur. Dokuyu hassas bir tartıda tartarak toplam doku ağırlığını belirleyin.
  4. Dokuyu steril bir biyogüvenlik dolabına yerleştirin. Dokuyu steril skalpellerle 3–5 mm3 parçalara mekanik olarak doğranır. Yaklaşık 2–3 g kıyma dokusunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Her tüpe 10 mL dissosiyasyon ortamı ekleyin.
  5. Tüpleri 37°C'de 8 rpm'de bir orbital rotator üzerinde 12–18 saat boyunca inkübe edin, böylece doku enzimatik olarak sindirilecektir. Büyük doku parçaları kalmadığında ve ortam boyunca eşit parçalanmış bir maddenin homojen bir süspansiyonu göründüğünde sindirimi tamamlanmış sayabilirsiniz.
  6. Epitel parçalarının yerçekimiyle 5 dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Ortamda görünür bir parçanın asılı kaldığını ve belirgin bir peletin bulunduğunu doğrulayın. Süpernatantı dikkatlice boşaltıp pelleti rahatsız etmeden atın.
    NOT: Üst yüzey stromal hücreler ve matris bileşenleri içerir ve yıkanıp kullanılabilir veya başka çalışmalar için korunabilir.
  7. Pelleti, %5 fetal sığır serumu (FBS) içeren 10 mL yıkama ortamında tekrar askıya alın. Oda sıcaklığında sallanan kovalı santrifüjde 250 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  8. Yıkama adımını üç kez daha tekrarlayın veya üst kısım temiz ve görünür kalıntılardan arınana kadar.
  9. Son pelleti, MEGM içinde %10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren dondurucu ortamda başlangıç doku ağırlığının gramı başına 1 mL hacimde yeniden askıya alın.
    DIKKAT: DMSO temas veya soluma sırasında zararlıdır. Kurumsal yönergeler gerektirdiğinde uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın ve kimyasal bir koruyucu kapüşonla çalışın.
  10. Her kriyovialin içine 1 ml süspansiyon al. Kriyovialleri sıvı azotta uzun süreli depolamadan önce −80°C sıcaklığında dondurucu bir kaba yerleştirin.
    NOT: Bu adım bir duraklama noktasını temsil eder. Örnekleri −80°C'de depolayın ve ardından uzun süreli depolama koşullarına aktarın.

2. İyileşme ve isteğe bağlı hücre hazırlığı

  1. Erime ve İlk Kurtarma
    1. Kriyokonserve dokuları, en az 24 saat donduktan sonra −80°C depolamadan veya sıvı azot uzun süreli depolamadan çıkarın. Hemen kriyovialı kapağına kadar 37°C su banyosuna batırın ve hücre ölümünü en aza indirmek için 1 dakika hızla çözülün.
      NOT: Erime sırasında kriyovial'ı nazikçe karıştırarak eşit ısınma sağlanır.
    2. Tamamen çözüldükten sonra, kriyovialin içeriği hemen 10 mL MEGM içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarılır. Santrifüj 250 × g'de 5 dakika koyun.
  2. Opsiyonel Fibroblast Azalması
    NOT: Ön kaplama ile fibroblast tükenmesi, daha epitelel zenginleştirilmiş bir başlangıç popülasyonu istendiğinde hızla yapışan stromal veya fibroblast popülasyonlarını azaltmak için kullanılan isteğe bağlı bir zenginleştirme adımıdır. Bu adım organoid oluşumu için gerekli değildir ve deneysel hedefe bağlı olarak ayarlanabilir.
    1. Pelleti 10 mL MEGM ile yeniden askıya alın.
    2. Yeniden askılanan dokuyu 10 cm'lik bir hücre kültürü kabına aktarın. Fibroblast tutunması için %5 CO₂ ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37°C'de 90 dakika kuluçka yapın.
      NOT: Verimli fibroblast yapışmasını sağlamak için kuluçka sırasında kültür kabını rahatsız etmeyin.
    3. Yapışmayan hücreleri içeren süpernatantı 10 mL serolojik pipet ile topla ve kültür kabını nazikçe yaklaşık 45°'ye doğru eğit. Tabağı nazikçe 5 mL PBS ile durulayın ve durulamayı toplanan süpernatantla birleştirin.
    4. Birleşik süspansiyonu 250 × g ile 5 dakika boyunca santrifüjlenerek epitelyal zenginleştirilmiş materyal elde edin.
      NOT: Plakaya yapışan hücreler meme bezi fibroblastları için zenginleştirilir ve DMEM + %10 FBS ve antibiyotik içeren ortam eklenerek ayrı olarak çoğaltılanabilir.
  3. Tek Hücrelere Opsiyonel Ayrışma
    1. Pellet, %0,25 tripsin içeren önceden ısıtılmış (37°C) dissosiyasyon enzim çözeltisi 500 μL içinde yeniden süzülür. Alternatif dissosiyasyon reaktifleri optimizasyon gerektirebilir. Süspansiyonu 1.5 mL bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Dissosiyasyonu teşvik etmek için örneği P1000 pipeti kullanarak 20 kez tritüre edin.
      DIKKAT: Enzimatik dissosiyasyon reaktifleri zararlı olabilir. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın ve cilt ile göz teması yapmaktan kaçının.
    2. Tüpü 37°C'de 3-5 dakika kuluçka edin. Inkubasyondan hemen sonra bir P1000 pipeti kullanarak 20 kez tritürasyon yaparak örneği mekanik olarak ayırın.
    3. Enzimatik reaksiyonu nötralize etmek için 1 mL serum içeren yıkama ortamı ekleyin. 500 × gr'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    4. Pelleti 300 μL dispaz çözeltisi (5 U/mL) ve 30 μL DNaz çözeltisi (1 mg/mL) içinde yeniden süzülür. 37°C'de 3–5 dakika kuluçka yapın.
    5. Örneği mekanik olarak 15–20 kez pipetle ayırın. Süspansiyona 700 μL serum içeren yıkama ortamı ekleyin.
    6. Hücre süspansiyonunu 40 μm hücre süzgecinden temiz bir tüpe filtreleyin. Standart 40 μm hücre süzgeci veya Flowmi pipet uçlu süzgeç kullanılabilir. Flowmi süzgeçleri, sınırlı hücre sayılarıyla çalışırken örnek kaybını azaltabilir.
    7. Trypan mavisi hariç tutularak uygulanabilir hücre sayısını belirleyin. Hücre süspansiyonundan 10 μL tripan mavisiyle 1:1 oranında karıştırın ve karışımdan 10 μL hücre sayma odasına veya sayma slaytına yükleyin. Hücre canlılığını otomatik hücre sayacı veya hemositometre kullanarak belirleyin.
    8. Süspansiyonu 500 × g ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    9. Hücre pelletini MEGM'de istenen konsantrasyonda yeniden askıya alın, hidrojel tohumlama için.
      NOT: Tek hücreli tohumlama deneylerinde, tipik girdiler deneysel hedef ve donör örnek özelliklerine bağlı olarak yaklaşık 200 μL hidrojel başına 1.000–5.000 hücre arasında değişir. Daha düşük tohumlama yoğunlukları genellikle canlı görüntüleme ve morfogenez çalışmalarında bireysel organoid gelişiminin izini kolaylaştırmak için kullanılırken, yüksek yoğunluklar genellikle RNA ve protein toplama dahil son nokta moleküler analizlerinde kullanılır.

3. Hidrojel Hazırlığı ve Organoid Tohumlama

  1. Stok Hazırlığı ve Hacim Hesaplamaları
    1. Laminin çözeltisi (1.18 mg/mL), hyaluronik asit çözeltisi (steril suda 1 mg/mL), fibronektin çözeltisi (steril suda 2 mg/mL) ve PBS 1× buzun üzerine kullanmadan önce yerleştirin. Laminin ve fibronektin alikotlarını −80°C'de sakla ve hyaluronik asit çözeltisini 4°C'de depola. Donmuş bileşenleri kullanmadan önce 0°C–4°C arasında buz üzerinde yavaşça eritin.
    2. 25× ekstrahücre matris takviye stok çözümü hazırlayın. 1 mL hazırlamak için, 425 μL laminin, 250 μL hyaluronik asit, 250 μL fibronektin ve 75 μL PBS buz üzerinde tutulan bir tüpte birleştirin. Tüpü 3–4 kez ters çevirerek nazikçe karıştırın. Çözeltiyi 4°C'de 1 aya kadar saklayın.
    3. Hazırlanmadan önce istenen nihai hidrojel hacmi ve bileşimini belirleyin. Pipetleme ve transfer sırasında malzeme kaybını hesaba katmak için en az %20 fazla hacim hazırlayın.
      NOT: Hidrojel formülasyonu, kolajen I, 25× stoktan 1× nihai ekstraselüler matriks takviyeleri ve pH nötralizasyon ve polimerizasyon için kolajen I hacmine göre %12,5 (v/v) 0,1 N sodyum hidroksitten oluşur.
      NOT: Son hidrojel konsantrasyonları 1.7 mg/mL kolajen I, 20 μg/mL laminin, 20 μg/mL fibronektin ve 10 μg/mL hyaluronik asittir.
    4. Aşağıdaki formülle gerekli kolajen I (Vkollajen) hacmini hesaplayın:
      figure-protocol-1
      Burada, Cfinal =1,7 mg/mL, Vtoplamında istenen nihai hidrojel hacmi ve Cstoku kollajen stok çözeltisi konsantrasyonudur. 2–12 mg/mL arasında kolajen stok konsantrasyonları kullanın.
      NOT: Kolajen stok konsantrasyonu partiler arasında değişebilir. Yüksek konsantrasyonlar viskoziteyi artırır ve yavaş pipet yapılmalıdır.
    5. 0,1 N sodyum hidroksitin (VNaOH) hacmini aşağıdaki formülle hesaplayın:
      VNaOH = 0.125 x Vkolajen
      1 N sodyum hidroksit seyreltilerek 0,1 N sodyum hidroksit çalışma çözeltisi hazırlayın.
    6. Aşağıdaki formülle ekstraselüler matris takviyesinin (VES) hacmini hesaplayın:
      figure-protocol-2
    7. Büyüme ortamıyla doldurulacak kalan hacmi aşağıdaki formülle hesaplayın:
      Vbüyüme ortamı = Vtoplam - (Vkollajen + VNaOH + VES + Vhücreler/doku)
      NOT: Her deney için hücre veya doku parçalarının hacmini ayrı ayrı belirleyin. İzin verilen hacim içinde tipik olarak 10–100 μL aralığı kullanın. Kesin parça sayımı yapılmaz, çünkü parça boyutu ve bileşimi hazırlıklar arasında önemli ölçüde değişir. Parça bolluğu ve dağılımının görsel olarak değerlendirilmesiyle tohumlamayı standartlaştırın.
  2. Hidrojel Master Karışımının Hazırlanması
    1. Kolajen I, hücredışı matris takviyesi, sodyum hidroksit (0.1 N) ve büyüme ortamını 0°C–4°C aralığında buz üzerine yerleştirin. Tüm bileşenleri erken polimerleşmeyi önlemek için düşük sıcaklıkta tutun.
    2. Hesaplanan kollajen I hacmini soğutulmuş bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.
    3. Önceden soğutulmuş büyüme ortamının hesaplanan hacmini kolajen çözeltisine ekleyin.
    4. Çözeltiyi nötralize etmek için hesaplanan 0,1 N sodyum hidroksite hacmini ekleyin.
      NOT: Önceki optimizasyon, bu koşulların uygun jel pH ürettiğini ortaya koymuştur; bu nedenle, hidrojel karışımının rutin pH testi gerekmez.
      NOT: Erken kollajen polimerizasyonunu önlemek için sonraki tüm adımları hızlıca gerçekleştirin.
    5. Çözeltiyi tüpü saniyede yaklaşık bir sallama hızında, en az 6 sallama hızında sertçe sallayarak karıştırın.
    6. Karışıma ekstraselüler matris takviyesinin hesaplanan hacmini ekleyin.
    7. Hesaplanan tek hücre veya doku parçalarının hacmini P1000 pipeti veya geniş delikli pipet ucu kullanarak ekleyin. Adım 3.2.5'te tarif edildiği gibi hemen karıştırın ve hemen bir sonraki adıma geçin.
  3. Hidrojel Biriktirme
    1. Hidrojel karışımını istenen hacimde kültür kaplarına pipetleyin. 4 kuyu slaytları için kuyu başına 200 μL hidrojel, 8 kuyuyla oda slaytları için 100 μL ve 96 kuyu plakaları için 20 μL kullanılır.
    2. Hidrojeli yüzey boyunca ince bir ped halinde yayarak oda sürer. Pipet ucunu odanın orta, üst kenarına yerleştirin ve jeli dağıtırken yüzey boyunca sürükleyerek eşit bir ped oluşturun. 96 kuyu plakalar için, pipet ucunu yüzeyle temas halinde tutarken kuyunun ortasına yerleştirin ve jeli merkezi olarak dağıtarak kubbe yapısını koruyun. Jelin içine hava pipetinden kaçının, çünkü bu kabarcıklar oluşturur.
    3. Kültür kaplarını %5CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37°C'de 60 dakika boyunca kuluçka yapın ki tam polimerleşme sağlansın.
      NOT: Burada tanımlanan polimerizasyon koşulları, bu çalışmada kullanılan kültür formatları için optimize edilmiştir. Kültür kap geometrisi, hidrojel hacmi ve kuluçka koşullarına bağlı olarak polimerizasyon süresinde küçük ayarlamalar gerekebilir.
  4. Kültür ve Bakım
    1. Her kuyuya önceden ısıtılmış MEGM ekleyin. Kullanılan kültür formatına göre ses seviyesini ayarlayın.
    2. Hidrojeli kültür yüzeyinden pipet ucu kullanarak nazikçe ayırarak jelin yüzmesini sağlayın. Pipet ucunu jelin çevresinde kaydırın ve polimerize hidrojelin altına nazikçe kaldırarak yüzeyden serbest bırakın.
    3. MEGM'i haftada iki kez taze önceden ısıtılmış ortamla değiştirin. Kültürleri %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka atöründe yaklaşık 3–4 hafta boyunca tutun ve tam hidrojel çöküşü olmadan önce kültürleri sonlandırın. Çökmüş hidrojelleri, jel içindeki geniş hücresel büyümeden kaynaklanan yoğun, opak, tıkaç benzeri yapıların ortaya çıkışıyla tanımlayın ( Ek Şekil 1'deki temsilci örneklere bakınız).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün başarılı uygulanması, organize epitel morfolojisi ve dokuya özgü mimari özellikler sergileyen üç boyutlu organoid yapıların oluşmasına yol açar. Organoidler, tohumlamadan sonra 3–7 gün içinde oluşmaya başlar ve kültür boyunca gelişmeye devam eder. Bu hidrojel organoid sisteminin önceki karakterizasyonu, birden fazla bağımsız birincil insan bağışçısı arasında tekrarlanabilir organoid oluşumunugöstermiştir 3. Bu çalışmada, hastalıksız 12 redüksiyon mam...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tanımlanan protokol, mememorfogenezi 3'ün temel özelliklerini destekleyen tanımlanmış bir hidrojel mikro ortamında üç boyutlu insan meme organoidlerinin tekrarlanabilir üretilmesini sağlar. Bu yöntemin başarısı için birkaç adım kritik öneme sahiptir. İlk olarak, doku işleme ve enzimatik ayrışma, epitel canlılığını korumak ve aşırı sindirimi en aza indirmek için dikkatlice kontrol edilmelidir; bu da hücre verimini azaltabilir ve sonraki morfogenez

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.K., Naveris'in kurucu ortağı ve danışmanıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tufts Biyomedikal Deposu'ndan doku desteği için Karla Murga, Daniela Requena ve Megan Maloney'yi minnettarlıkla takdir ediyoruz. Bu araştırma, Find The Cause Meme Cancer Foundation ve Tufts CTSI NIH Klinik ve Translasyonel Bilim Ödülü (UM1TR0043, G.R.) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL konik tüplerVWR89039-664Dokunun işlenmesi ve santrifüjleme için steril tüpler
40 µm hücre süzgeciVWR732-2757Tek hücreli süspansiyon hazırlığı için filtreleme cihazı
Düşük hacimlerde 40 µm hücre süzgeciBel-Art136800040Tek hücreli süspansiyon hazırlığı için filtreleme cihazı
Otomatik hücre sayacıBio-Rad1450102Hücreleri saymak ve canlılığı belirlemek için kullanılan cihaz
Boğa hipofiz özüThermo Scientific13028014Epitel hücre ortamı için takviye
Hücre sayım slaytlarıBio-Rad145-0011Hücre sayımı için kullanılan çift hazneli slaytlar
SantrifüjYokYokTezgah üstü santrifüj/ler en az 500 x g hız kabiliyetine ve 15 mL ve 1.5 mL tüplerin konaklanmasına sahip olmalıdır. 
Kollajen IMillipore Sigma08-115Hidrojel oluşumu için kullanılan hücre dışı matris proteini
Kollajenaz ASigma-Aldrich11088793001Dokunun ayrışması için kullanılan enzim
KrioviyallerCorning976171Numunelerin kriyojenik depolanması için steril şişeler
Kültür kapları (örn., hazneli slaytlar, çok kuyucuklu plakalar)Corning354104
354108
3603		Hidrojel birikimi ve organoid kültürü için platformlar.
Dimetil sülfoksitMillipore Sigma317275Dondurma ortamında kullanılan kriyoprotektif
Dispase IIRoche4942078001İkincil doku ayrışması için kullanılan enzim
DNase IRoche10104159001Hücre ayrışması sırasında kullanılan enzim.
Fetal boğa serumuGibco10437Yıkama ve nötralizasyon ortamında kullanılan serum takviyesi
FibronektinSigma-AldrichF2006Hücre dışı matris proteini bileşeni
GlutaMAXThermo Scientific35050061Epitel hücre ortamı için takviye
İnsan epidermal büyüme faktörüSigma-AldrichE9644Epitel hücre ortamı için takviye
HidrokortizonSigma-AldrichH0888Epitel hücre ortamı için takviye
Hiyalüronik asitMillipore Sigma385908Hidrojel formülasyonu için hücre dışı matris bileşeni
HiyaluronidazSigma-AldrichH3506Dokunun ayrışması için kullanılan enzim
İnkübatörThermo Scientific3598Dokunun kültürü inkübasyonu için kullanılan cihaz
İnsülinSigma-AldrichI9278Epitel hücre ortamı için takviye
LamininGibco23017-015Hücre dışı matris proteini bileşeni
Meme epitelyal bazal ortamıThermo ScientificM171500Epitel hücreleri için büyüme ortamı
Mikrosantrifüj tüpleri (1.5 mL)Thermo Scientific3451Küçük hacimli reaksiyonlar için kullanılan tüpler
Orbital döndürücüThermo Scientific400110Enzimatik ayrışma sırasında dokunun dağılımı için kullanılan döndürücü
P1000 pipetiGilsonP10001.000 µL'ye kadar hacimlerin karıştırılması ve aktarılması için kullanılan cihaz
Penisilin-streptomisinThermo Scientific15140122Epitel hücre ortamı için antibiyotik takviyesi
Fosfat tamponlu salinGibco20012-027Yıkama ve durulama için kullanılan tampon çözeltisi
Hassas dengeMettler ToledoML303EDokunun tartılması için kullanılan denge
Serolojik pipetNunc170356NYapışkan olmayan epitel hücrelerini hasat etmek için kullanılan pipet
Sodyum hidroksit (1 N)Fisher ChemicalSS261Kollajen nötralizasyonu için kullanılan reaktif
Sterili skülpelBard-Parker372615Mekanik doku doğramada kullanılan aletler
Tripan mavisi çözeltisiGibco15250061Hücre canlılık değerlendirmesi için kullanılan boya
Tripsin (%0,25)Gibco25200056Hücre ayrışması için kullanılan enzimatik reaktif
Su banyosu (37 °C)VWR10LANumunelerin kontrollü çözülmesi için kullanılan cihaz

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Geli imsel BiyolojiSay 232Say 232HepsiSayHepsiSayHepsiSayHepsiSayHepsiBo De erSayorganoid3B hidrojelmeme geli imikanser
Video yakında

İlgili makaleler