Meme morfogenezini yeniden düzenleyen üç boyutlu insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntem

Summary

Bu protokol, kontrollü üç boyutlu bir kültür sisteminde meme morfogenezinin temel özelliklerini özetleyen insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntemi tanımlar.

Abstract

Doku mimarisini ve hücre durum dinamiklerini özetleyen fizyolojik olarak ilgili insan model sistemlerinin geliştirilmesi, meme gelişimi ve kanserogenezdeki erken olayların incelenmesinde büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir. Geleneksel iki boyutlu kültürler ve birçok üç boyutlu sistem, insan meme bezini tanımlayan yapısal organizasyon ve mikroçevresel ipuçlarını yakalayamıyor. Burada, tip I kollajen, laminin, fibronektin ve hyaluronik asidden oluşan tanımlanmış bir hidrojel matriksin içinde gömülü primer epitel hücrelerinden üç boyutlu insan meme organoidleri üretmek için tekrarlanabilir bir yöntem tanımlıyoruz. Bu sistem, 21 günlük kültür dönemi boyunca meme morfogenezinin ana aşamalarında tek hücrelerin ilerlemesini destekler; bunlar arasında progenitor genişleme, epitel desenleri ve terminal duktal lobular birim benzeri yapıların oluşumu ile mezenkim benzeri bir bölmenin ortaya çıkması dahildir. Hidrojel hazırlanması, hücre tohumlama ve kültür koşulları için adım adım bir protokol sunuyoruz. Yöntem, organoid sayısı, boyut dağılımı ve mimari karmaşıklığın yüksek içerikli görüntüleme ve nicel analiziyle uyumludur. Bu platform, epitel plastisitesi ve çevresel bozulmaların mekanik çalışmalarını mümkün kılarak, meme kanseri riskiyle ilişkili erken doku düzeyindeki değişikliklerin araştırılması için ölçeklenebilir ve biyolojik olarak ilgili bir sistem sunar.

Introduction

İnsan meme bezi gelişimini ve dokuyu kötü niyetli dönüşüme yatkın yapan erken olayları anlamak, doku mimarisini, hücre hiyerarşisini ve mikroçevresel sinyalleri sadakatle özetleyen deneysel sistemler gerektirir. İki boyutlu epitel kültürleri önemli mekanistik içgörüler sağlamış olsa da, epitel organizasyonu ve^{morfogenez 1'i} modellemek için gerekli yapısal bağlamdan yoksundurlar. Mevcut üç boyutlu kültür sistemleri, bazal membran ekstraktlarına dayananlar dahil, alanı ilerletmiş ancak değişken bileşim, ekstrasellüler matris bileşenleri üzerinde eksik kontrol ve yüksek dereceli doku mimarisi 1'in tutarsız desteğiyle sınırlı kalıyor^. Ayrıca, bazal zar ekstraktlarına dayalı birçok organoid sistem, doku benzeri^{organizasyonun ortaya} çıkmasını tutarlı şekilde destekleyememeleriyle kısıtlanır. Özellikle, birçok sistem, destekleyici mikro ortamların endogen gelişimini mümkün kılmak yerine dışsal stromal bileşenlere dayanır; bu da doku gelişimi ve hastalık için merkezi olan epitelal–mezenkimal etkileşimleri modelleme yeteneklerini sınırlar. Bu sınırlamalar, gelişimsel süreçlerin, epitel plastisitesinin ve çevresel veya moleküler bozulmaların doku organizasyonu üzerindeki etkilerinin tekrarlanabilir incelenmesini kısıtlar.

Bu sınırlamaları gidermek için, birincil epitel hücrelerinin tanımlanmış bir ekstraselüler^{matriks 2,3,4,5,8} içinde organize yapılar üretmesini sağlayan tanımlanmış hidrojel bazlı üç boyutlu insan meme organoidi modeli geliştirdik. Hidrojel, tip I kollajen, laminin, fibronektin ve hyaluronik asitten oluşur; bileşenler, meme bezi gelişimi ve epitel morfogenezindeki belirlenmiş rollerine göre seçilir. Bu ekstrasellüler matriks molekülleri, integrinler, diskoidin alan reseptörleri, CD44 ve RHAMM gibi farklı hücresel reseptörleri ele alır ve epitel polaritesi, dallanan morfogenezi, kök hücre bakımı, mekanik transduksiyon ve meme^{bezinde doku organizasyonunu düzenlediği bilinir 6,7}. Bu hidrojel sistemi tanımlayan önceki çalışmalar, bu ekstrasellüler matriks bileşenlerinin dahil edilmesinin, sadece kollajen veya Matrigel bazlı koşullara kıyasla kanal-lobüler morfogenez ve epitel olgunlaşmasını belirgin şekilde^{iyileştirdiğini göstermiştir 3,8}. Ayrıca, bu hidrojel formülasyonun fiziksel özellikleri daha önce atomik kuvvet mikroskobu ile karakterize edilmişti ve kompozit ekstrasellüler matriks hidrojelin, sadece kolajen içeren jellere göre daha düşük sertlik ve şişlikte artış gösterdiğini göstermiştir (Young modülü: sırasıyla 256,7 ± 20,0 Pa vs. 559,2 ± 204,0 Pa), bu da daha yumuşak ve daha hidratlı bir matris^{ortamı ile uyumludur 8}.

Önemli olarak, bu model epitel yapılarının yanında ortaya çıkan mezenkim benzeri bir bölmenin ortaya çıkmasını destekler ve doğal doku^{organizasyonunu daha} yakından yansıtan endojen yapısal ve sinyal desteği sağlar 3. Bu hidrojel sisteminin fizyolojik önemi, hem morfolojik hem de transkriptomik analizler kullanılarak geleneksel Matrigel bazlı organoid kültürlerle doğrudan karşılaştırmalar yoluyla değerlendirilmiştir. Daha önceki çalışmalar, hidrojel kültürlerinin Matrigel bazlı kültürlere göre daha organize kanal-lobular doku oluşumunu ve çoklu hatlı farklılaşmayı desteklediğini ve aynı zamanda hormon yanıtlılığını^{koruduğunu göstermiştir 8}. Daha yakın zamanda, hidrojel kökenli organoidler, Matrigel kökenli organoidler ve birincil insan meme dokusunu karşılaştıran entegre tek hücreli RNA dizileme analizleri, hidrojel yetiştirilen organoidlerin yerli insan meme dokusunda bulunan epitelyal hiyerarşi, hücresel çeşitlilik ve epitelal–mezenkimal etkileşimleri daha sadık şekilde^{tekrarladığını göstermiştir 3}. Buna karşılık, Matrigel tarafından yetiştirilen organoidler proliferatif hibrit bazal durumlar için zenginleştirilmiş ve stromal benzeri popülasyonlardan yoksundu; bu da yönlendirilmiş organogenez yerine epitel kendi kendine toplanma ile tutarlıdır.

Burada açıklanan protokol, birincil insan dokusundan organoidler üretmek için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir yöntem sunar; ayrıca fibroblast azalması ve tek hücrelere ayrılması için isteğe bağlı adımlar bulunur. Bu platform, canlı görüntüleme, yüksek içerikli görüntüleme, nicel morfometrik analiz, hücre takibi ve genetik bozulma çalışmalarıyla uyumlu olduğundan, organoid sayısı, büyüklüğü, mimarisi ve büyüme dinamiklerini değerlendiren aşağı akış yaklaşımlarıyla entegre edilebilir. Bu platform, insan meme gelişimini, epitel plastisitesini, epitelal–mikroçevre etkileşimlerini ve gelişimsel, moleküler veya çevresel bozulmalara doku düzeyinde yanıtları incelemek için biyolojik olarak ilgili bir sistem sağlar.

Doku işleme, hidrojel hazırlanması, organoid kültürü, gelişimsel ilerleme ve sonraki analizleri içeren iş akışının şematik bir genel görünümü Şekil 1'de sunulurken, bu platformla oluşturulan temsil organoid morfolojileri Şekil 2'de gösterilmiştir.

Şekil 1. Hidrojel bazlı organoid üretim iş akışına genel bakışı. (A) Protokol iş akışını özetleyen akış şeması; doku toplama, doku işleme, kriyo-koruma, iyileşme ve isteğe bağlı hücre hazırlığı, hidrojel hazırlığı, organoid kültürü, organoid geliştirme ve sonraki analitik uygulamaları içerir. (B) Hidrojel bazlı organoid üretim protokolünün ana aşamalarını gösteren görsel şematik; doku işleme ve hazırlığı, geri kazanım ve isteğe bağlı hücre hazırlığı ile hidrojel hazırlığı ve organoid tohumlama dahil. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Tanımlanmış hidrojel sisteminde oluşturulan temsili organoid morfolojiler. Tanımlanmış hidrojel matriksinde kültürlenmiş farklı insan dokularından türetilen organoidlerin temsil parlak alan görüntüleri. Redüksiyon mamoplastisiyle türetilen tek epitel hücrelerinden oluşan meme organoidleri, kültürün 21. gününde görüntülendi. Tümör parçalarından üretilen hasta kaynaklı ksenograft organoidler, kültürün 16. gününde görüntülendi. Epitel parçalarından üretilen tükürük bezi organoitleri kültürün 3. gününde görüntülendi. Epitel parçalarından üretilen böbrek organidleri, kültürün 17. gününde görüntülendi. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

Ameliyattan sonra tıbbi atık olarak atılmış birincil dokular, Maine Tıp Merkezi ve Tufts Tıp Merkezi'ndeki kurumsal inceleme kurulları tarafından onaylanan protokoller kullanılarak tüm ilgili yasalara uygun olarak alındı. Tüm dokular nakil öncesi anonimleştirildi ve belirli hastalara izlenemedi. Bu nedenle, bu araştırmaya Massachusetts Teknoloji Enstitüsü ve Tufts Üniversitesi Sağlık Bilimleri (IRB #13521) İnsanların Deneysel Olarak Kullanımı Komitesi tarafından muafiyet statüsü verilmiştir. Bu çalışmaya kayıtlı tüm hastalar, çalışmaya katılmayı ve sonuçların yayımlanmasını kabul eden bilgilendirilmiş bir onay formu imzaladı.

1. Doku İşleme ve Hazırlığı

NOT: İnsan dokusuyla ilgili tüm işlemleri kurumsal biyogüvenlik ve etik yönergeler doğrultusunda gerçekleştirin. İşleme başlamadan önce protokol adımlarının ve organoid hazırlık iş akışının görsel bir genel bakılması için Şekil 1A ve 1B'de gösterilen iş akışı şemalarına bakabilirsiniz.

1. MEGM, 52 μg/mL sığır hipofiz ekstraktı, 10 ng/mL insan epidermal büyüme faktörü, 5 μg/mL insülin, 500 ng/mL hidrokortizon, %1 (v/v) GlutaMAX ve %1 (v/v) Antibiyotik-Antimikotik (100X) ile takviye edilmiş meme epitelyal bazal ortam ile hazırlanır.
2. Dissosiyasyon ortamını, meme epitelyal büyüme ortamına (MEGM) 1,5 mg/mL kollagenaz A (−20°C'de depolanmış) ve 100 U/mL hialuronidaza (4°C'de depolanmış) ekleyerek hazırlayın.
3. Profilaktik mastektomi ve redüksiyon mamoplastileriyle alınan insan meme dokusu alınmalı, fosfatla tamponlu tuzlu (PBS) hapsedilmemiş ve 4°C'de tutulur. Dokuyu hassas bir tartıda tartarak toplam doku ağırlığını belirleyin.
4. Dokuyu steril bir biyogüvenlik dolabına yerleştirin. Dokuyu steril skalpellerle 3–5 mm³ parçalara mekanik olarak doğranır. Yaklaşık 2–3 g kıyma dokusunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Her tüpe 10 mL dissosiyasyon ortamı ekleyin.
5. Tüpleri 37°C'de 8 rpm'de bir orbital rotator üzerinde 12–18 saat boyunca inkübe edin, böylece doku enzimatik olarak sindirilecektir. Büyük doku parçaları kalmadığında ve ortam boyunca eşit parçalanmış bir maddenin homojen bir süspansiyonu göründüğünde sindirimi tamamlanmış sayabilirsiniz.
6. Epitel parçalarının yerçekimiyle 5 dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Ortamda görünür bir parçanın asılı kaldığını ve belirgin bir peletin bulunduğunu doğrulayın. Süpernatantı dikkatlice boşaltıp pelleti rahatsız etmeden atın.
   NOT: Üst yüzey stromal hücreler ve matris bileşenleri içerir ve yıkanıp kullanılabilir veya başka çalışmalar için korunabilir.
7. Pelleti, %5 fetal sığır serumu (FBS) içeren 10 mL yıkama ortamında tekrar askıya alın. Oda sıcaklığında sallanan kovalı santrifüjde 250 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
8. Yıkama adımını üç kez daha tekrarlayın veya üst kısım temiz ve görünür kalıntılardan arınana kadar.
9. Son pelleti, MEGM içinde %10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren dondurucu ortamda başlangıç doku ağırlığının gramı başına 1 mL hacimde yeniden askıya alın.
   DIKKAT: DMSO temas veya soluma sırasında zararlıdır. Kurumsal yönergeler gerektirdiğinde uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın ve kimyasal bir koruyucu kapüşonla çalışın.
10. Her kriyovialin içine 1 ml süspansiyon al. Kriyovialleri sıvı azotta uzun süreli depolamadan önce −80°C sıcaklığında dondurucu bir kaba yerleştirin.
    NOT: Bu adım bir duraklama noktasını temsil eder. Örnekleri −80°C'de depolayın ve ardından uzun süreli depolama koşullarına aktarın.

2. İyileşme ve isteğe bağlı hücre hazırlığı

1. Erime ve İlk Kurtarma
   1. Kriyokonserve dokuları, en az 24 saat donduktan sonra −80°C depolamadan veya sıvı azot uzun süreli depolamadan çıkarın. Hemen kriyovialı kapağına kadar 37°C su banyosuna batırın ve hücre ölümünü en aza indirmek için 1 dakika hızla çözülün.
      NOT: Erime sırasında kriyovial'ı nazikçe karıştırarak eşit ısınma sağlanır.
   2. Tamamen çözüldükten sonra, kriyovialin içeriği hemen 10 mL MEGM içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarılır. Santrifüj 250 × g'de 5 dakika koyun.
2. Opsiyonel Fibroblast Azalması
   NOT: Ön kaplama ile fibroblast tükenmesi, daha epitelel zenginleştirilmiş bir başlangıç popülasyonu istendiğinde hızla yapışan stromal veya fibroblast popülasyonlarını azaltmak için kullanılan isteğe bağlı bir zenginleştirme adımıdır. Bu adım organoid oluşumu için gerekli değildir ve deneysel hedefe bağlı olarak ayarlanabilir.
   1. Pelleti 10 mL MEGM ile yeniden askıya alın.
   2. Yeniden askılanan dokuyu 10 cm'lik bir hücre kültürü kabına aktarın. Fibroblast tutunması için %5 CO₂ ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37°C'de 90 dakika kuluçka yapın.
      NOT: Verimli fibroblast yapışmasını sağlamak için kuluçka sırasında kültür kabını rahatsız etmeyin.
   3. Yapışmayan hücreleri içeren süpernatantı 10 mL serolojik pipet ile topla ve kültür kabını nazikçe yaklaşık 45°'ye doğru eğit. Tabağı nazikçe 5 mL PBS ile durulayın ve durulamayı toplanan süpernatantla birleştirin.
   4. Birleşik süspansiyonu 250 × g ile 5 dakika boyunca santrifüjlenerek epitelyal zenginleştirilmiş materyal elde edin.
      NOT: Plakaya yapışan hücreler meme bezi fibroblastları için zenginleştirilir ve DMEM + %10 FBS ve antibiyotik içeren ortam eklenerek ayrı olarak çoğaltılanabilir.
3. Tek Hücrelere Opsiyonel Ayrışma
   1. Pellet, %0,25 tripsin içeren önceden ısıtılmış (37°C) dissosiyasyon enzim çözeltisi 500 μL içinde yeniden süzülür. Alternatif dissosiyasyon reaktifleri optimizasyon gerektirebilir. Süspansiyonu 1.5 mL bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Dissosiyasyonu teşvik etmek için örneği P1000 pipeti kullanarak 20 kez tritüre edin.
      DIKKAT: Enzimatik dissosiyasyon reaktifleri zararlı olabilir. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın ve cilt ile göz teması yapmaktan kaçının.
   2. Tüpü 37°C'de 3-5 dakika kuluçka edin. Inkubasyondan hemen sonra bir P1000 pipeti kullanarak 20 kez tritürasyon yaparak örneği mekanik olarak ayırın.
   3. Enzimatik reaksiyonu nötralize etmek için 1 mL serum içeren yıkama ortamı ekleyin. 500 × gr'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
   4. Pelleti 300 μL dispaz çözeltisi (5 U/mL) ve 30 μL DNaz çözeltisi (1 mg/mL) içinde yeniden süzülür. 37°C'de 3–5 dakika kuluçka yapın.
   5. Örneği mekanik olarak 15–20 kez pipetle ayırın. Süspansiyona 700 μL serum içeren yıkama ortamı ekleyin.
   6. Hücre süspansiyonunu 40 μm hücre süzgecinden temiz bir tüpe filtreleyin. Standart 40 μm hücre süzgeci veya Flowmi pipet uçlu süzgeç kullanılabilir. Flowmi süzgeçleri, sınırlı hücre sayılarıyla çalışırken örnek kaybını azaltabilir.
   7. Trypan mavisi hariç tutularak uygulanabilir hücre sayısını belirleyin. Hücre süspansiyonundan 10 μL tripan mavisiyle 1:1 oranında karıştırın ve karışımdan 10 μL hücre sayma odasına veya sayma slaytına yükleyin. Hücre canlılığını otomatik hücre sayacı veya hemositometre kullanarak belirleyin.
   8. Süspansiyonu 500 × g ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
   9. Hücre pelletini MEGM'de istenen konsantrasyonda yeniden askıya alın, hidrojel tohumlama için.
      NOT: Tek hücreli tohumlama deneylerinde, tipik girdiler deneysel hedef ve donör örnek özelliklerine bağlı olarak yaklaşık 200 μL hidrojel başına 1.000–5.000 hücre arasında değişir. Daha düşük tohumlama yoğunlukları genellikle canlı görüntüleme ve morfogenez çalışmalarında bireysel organoid gelişiminin izini kolaylaştırmak için kullanılırken, yüksek yoğunluklar genellikle RNA ve protein toplama dahil son nokta moleküler analizlerinde kullanılır.

3. Hidrojel Hazırlığı ve Organoid Tohumlama

1. Stok Hazırlığı ve Hacim Hesaplamaları
   1. Laminin çözeltisi (1.18 mg/mL), hyaluronik asit çözeltisi (steril suda 1 mg/mL), fibronektin çözeltisi (steril suda 2 mg/mL) ve PBS 1× buzun üzerine kullanmadan önce yerleştirin. Laminin ve fibronektin alikotlarını −80°C'de sakla ve hyaluronik asit çözeltisini 4°C'de depola. Donmuş bileşenleri kullanmadan önce 0°C–4°C arasında buz üzerinde yavaşça eritin.
   2. 25× ekstrahücre matris takviye stok çözümü hazırlayın. 1 mL hazırlamak için, 425 μL laminin, 250 μL hyaluronik asit, 250 μL fibronektin ve 75 μL PBS buz üzerinde tutulan bir tüpte birleştirin. Tüpü 3–4 kez ters çevirerek nazikçe karıştırın. Çözeltiyi 4°C'de 1 aya kadar saklayın.
   3. Hazırlanmadan önce istenen nihai hidrojel hacmi ve bileşimini belirleyin. Pipetleme ve transfer sırasında malzeme kaybını hesaba katmak için en az %20 fazla hacim hazırlayın.
      NOT: Hidrojel formülasyonu, kolajen I, 25× stoktan 1× nihai ekstraselüler matriks takviyeleri ve pH nötralizasyon ve polimerizasyon için kolajen I hacmine göre %12,5 (v/v) 0,1 N sodyum hidroksitten oluşur.
      NOT: Son hidrojel konsantrasyonları 1.7 mg/mL kolajen I, 20 μg/mL laminin, 20 μg/mL fibronektin ve 10 μg/mL hyaluronik asittir.
   4. Aşağıdaki formülle gerekli kolajen I (V_kollajen) hacmini hesaplayın:
      
      Burada, C_final =1,7 mg/mL, V_toplamında istenen nihai hidrojel hacmi ve C_stoku kollajen stok çözeltisi konsantrasyonudur. 2–12 mg/mL arasında kolajen stok konsantrasyonları kullanın.
      NOT: Kolajen stok konsantrasyonu partiler arasında değişebilir. Yüksek konsantrasyonlar viskoziteyi artırır ve yavaş pipet yapılmalıdır.
   5. 0,1 N sodyum hidroksitin (V_NaOH) hacmini aşağıdaki formülle hesaplayın:
      V_NaOH = 0.125 x V_kolajen
      1 N sodyum hidroksit seyreltilerek 0,1 N sodyum hidroksit çalışma çözeltisi hazırlayın.
   6. Aşağıdaki formülle ekstraselüler matris takviyesinin (V_ES) hacmini hesaplayın:
      
   7. Büyüme ortamıyla doldurulacak kalan hacmi aşağıdaki formülle hesaplayın:
      V_{büyüme ortamı} = V_toplam - (V_kollajen + V_NaOH + V_ES + V_{hücreler/doku})
      NOT: Her deney için hücre veya doku parçalarının hacmini ayrı ayrı belirleyin. İzin verilen hacim içinde tipik olarak 10–100 μL aralığı kullanın. Kesin parça sayımı yapılmaz, çünkü parça boyutu ve bileşimi hazırlıklar arasında önemli ölçüde değişir. Parça bolluğu ve dağılımının görsel olarak değerlendirilmesiyle tohumlamayı standartlaştırın.
2. Hidrojel Master Karışımının Hazırlanması
   1. Kolajen I, hücredışı matris takviyesi, sodyum hidroksit (0.1 N) ve büyüme ortamını 0°C–4°C aralığında buz üzerine yerleştirin. Tüm bileşenleri erken polimerleşmeyi önlemek için düşük sıcaklıkta tutun.
   2. Hesaplanan kollajen I hacmini soğutulmuş bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.
   3. Önceden soğutulmuş büyüme ortamının hesaplanan hacmini kolajen çözeltisine ekleyin.
   4. Çözeltiyi nötralize etmek için hesaplanan 0,1 N sodyum hidroksite hacmini ekleyin.
      NOT: Önceki optimizasyon, bu koşulların uygun jel pH ürettiğini ortaya koymuştur; bu nedenle, hidrojel karışımının rutin pH testi gerekmez.
      NOT: Erken kollajen polimerizasyonunu önlemek için sonraki tüm adımları hızlıca gerçekleştirin.
   5. Çözeltiyi tüpü saniyede yaklaşık bir sallama hızında, en az 6 sallama hızında sertçe sallayarak karıştırın.
   6. Karışıma ekstraselüler matris takviyesinin hesaplanan hacmini ekleyin.
   7. Hesaplanan tek hücre veya doku parçalarının hacmini P1000 pipeti veya geniş delikli pipet ucu kullanarak ekleyin. Adım 3.2.5'te tarif edildiği gibi hemen karıştırın ve hemen bir sonraki adıma geçin.
3. Hidrojel Biriktirme
   1. Hidrojel karışımını istenen hacimde kültür kaplarına pipetleyin. 4 kuyu slaytları için kuyu başına 200 μL hidrojel, 8 kuyuyla oda slaytları için 100 μL ve 96 kuyu plakaları için 20 μL kullanılır.
   2. Hidrojeli yüzey boyunca ince bir ped halinde yayarak oda sürer. Pipet ucunu odanın orta, üst kenarına yerleştirin ve jeli dağıtırken yüzey boyunca sürükleyerek eşit bir ped oluşturun. 96 kuyu plakalar için, pipet ucunu yüzeyle temas halinde tutarken kuyunun ortasına yerleştirin ve jeli merkezi olarak dağıtarak kubbe yapısını koruyun. Jelin içine hava pipetinden kaçının, çünkü bu kabarcıklar oluşturur.
   3. Kültür kaplarını %5_CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37°C'de 60 dakika boyunca kuluçka yapın ki tam polimerleşme sağlansın.
      NOT: Burada tanımlanan polimerizasyon koşulları, bu çalışmada kullanılan kültür formatları için optimize edilmiştir. Kültür kap geometrisi, hidrojel hacmi ve kuluçka koşullarına bağlı olarak polimerizasyon süresinde küçük ayarlamalar gerekebilir.
4. Kültür ve Bakım
   1. Her kuyuya önceden ısıtılmış MEGM ekleyin. Kullanılan kültür formatına göre ses seviyesini ayarlayın.
   2. Hidrojeli kültür yüzeyinden pipet ucu kullanarak nazikçe ayırarak jelin yüzmesini sağlayın. Pipet ucunu jelin çevresinde kaydırın ve polimerize hidrojelin altına nazikçe kaldırarak yüzeyden serbest bırakın.
   3. MEGM'i haftada iki kez taze önceden ısıtılmış ortamla değiştirin. Kültürleri %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka atöründe yaklaşık 3–4 hafta boyunca tutun ve tam hidrojel çöküşü olmadan önce kültürleri sonlandırın. Çökmüş hidrojelleri, jel içindeki geniş hücresel büyümeden kaynaklanan yoğun, opak, tıkaç benzeri yapıların ortaya çıkışıyla tanımlayın ( Ek Şekil 1'deki temsilci örneklere bakınız).

Results

Bu protokolün başarılı uygulanması, organize epitel morfolojisi ve dokuya özgü mimari özellikler sergileyen üç boyutlu organoid yapıların oluşmasına yol açar. Organoidler, tohumlamadan sonra 3–7 gün içinde oluşmaya başlar ve kültür boyunca gelişmeye devam eder. Bu hidrojel organoid sisteminin önceki karakterizasyonu, birden fazla bağımsız birincil insan bağışçısı arasında tekrarlanabilir organoid oluşumunu^{göstermiştir 3}. Bu çalışmada, hastalıksız 12 redüksiyon mamoplasti donöründen izole edilen primer epitel hücreleri değerlendirildi ve 12 donör örneğinden 11'i tanımlanan kültür koşullarında organoid üretti. Donörler arasında, 100 tohumlanmış hücrede oluşan organoid yapıların medyan sayısı 1.775 (%95 GA: 0.45–4.10) idi. Organoid oluşum etkinliği ve büyüme dinamiklerinde önemli donörler arası değişkenlik gözlemlenmiş olsa da, bağışçılar arasında karmaşık kanal-lobular ve asinar morfolojiler tekrarlanabilir şekilde üretilmiştir.

Tek epitel hücrelerinden türetilen meme organoidleri, kültürün 21. gününde progresif morfogenez gösterir ve dallanan yapılar oluşturur (Şekil 2). Bu yapılar, uzun projeksiyonlar ve çok hücreli organizasyonla karakterizedir. Organoidler, 18. güne kadar 10.000–90.000^{μm 2} arasında projeksiyon alanları gösterdi, dairesellik değerleri ise 0.3'ün altında yer aldı ve 4π × olarak hesaplandı (Alan/^{Çevre 2})^3,9. Doku parçalarından türetilen organoidler genellikle 18. güne kadar 90.000^{μm 2'yi} aşan yapılar oluştururken, tümör parçalarından türeyenler daha yoğun ve düzensiz yapılar oluştururken, azalmış organizasyon ve artan radyal projeksiyonlarla daha yoğun ve düzensiz yapılar oluşturur; bu da değişen büyüme davranışıyla uyumlu olurdu.

Tükürük bezinden ve böbrek epitel parçalarından türetilen organoidler de aynı hidrojel koşullarında farklı morfolojiler gösterir (Şekil 2). Tükürük bezi organoidleri erken zaman noktalarında (3. gün) kompakt yapılar oluştururken, böbrek organoidleri 17. güne kadar uzun ve asimetrik morfolojiler geliştirir. Bu gözlemler, hidrojel bazlı organoid sistemin meme dokusunun ötesindeki daha geniş uyum sağlayabilmesini göstermek ve birden fazla epitel dokusu kaynakından organoid oluşumunu destekleme yeteneğini göstermek için dahil edilmiştir.

Daha önce yapılan immünboyama ve moleküler^{analizler 3,5,8}, ^epitel soy belirteçlerinin varlığını gösterdi; bunlar arasında KRT8, KRT18, KRT19, E-kadherin, GATA3, JAG1, Notch1 ve MUC1 gibi luminal belirteçler ile KRT5, KRT14, Slug, SOX9 ve TP63 bazal veya miyoepitel belirteçleri de vardı; bu da organoidler içindeki epitel heterojenliğinin korunduğunu göstermektedir. Terminal duktal lobular birim benzeri organizasyonla uyumlu yapısal özellikler, konfokal mikroskopi ve üç boyutlu rekonstrüksiyonla gözlemlendi ve terminal lobul veya alveolar benzeri tomurcuklara bağlı uzun kanal bölgeleri içeren yapılar olarak tanımlandı; bu bölgeler insanın terminal kanal lobular birimlerinin organizasyonuna benziyordu. Bu yapılar ayrıca, bu platformun daha önce yayımlanmış analizleriyle uyumlu lümineral ve bazal hücre desenleriyle örtülü katmanlı epitel^{organizasyonu sergilemiştir 3}.

Epitel yapılarıyla ilişkili ve arasında mezenkim benzeri bir bölme gözlemlendi ve VIM, SNAI1, ZEB1, S100A, CD90 ve FAPα gibi göç davranışı ve belirteçlerin ekspresyonuyla karakterize edildi. Zaman geçişli mikroskopi analizleriyle birlikte, bu gözlemler kültür sisteminde destekleyici bir mikro ortamın ortaya çıkmasını^{destekler 3}.

Önemli olarak, bu protokol, tek bir sabit biyolojik kıyaslama oluşturmak yerine geniş çaplı uyarlanabilir bir metodolojik çerçeve sağlamayı amaçlamaktadır. Organoid oluşum etkinliği, boyut, dallanma karmaşıklığı ve hücresel bileşim gibi nicel sonuçlar, donör kaynağına, menopoz durumuna, başlangıç materyaline (örneğin, doku parçaları ile tek hücrelere karşı) ve deneysel koşullara bağlı olarak değişebilir.

Optimal olmayan sonuçlar arasında organoid oluşum etkinliğinin azalması (500 tohumlu hücre başına <1 organoid), aşırı hücresel döküntü, kolajen polimerizasyonunun başarısızlığı veya organize yapıların kurulamaması yer alır. Bu sonuçlar genellikle düşük hücre canlılığı, eksik doku ayrışması, yanlış hidrojel bileşimi veya yanlış pH nötralizasyonu ile ilişkilidir.

Organoid gelişiminin nicel analizi, organoid sayısını, boyut dağılımı, dallanma davranışını, yapısal karmaşıklığı ve hücre dinamiklerini ölçmek için canlı görüntüleme ve yüksek içerikli görüntüleme yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu platformu kullanan önceki çalışmalar, organoid büyüme dinamiklerini ve soy davranışını zaman içinde niceliklendirmek için uzunlamasına canlı görüntüleme, hücre takibi, morfometrik analiz ve genetik bozulma^{çalışmaları yapmıştır 3,5}. Görüntüleme konfokal mikroskopi kullanılarak yapıldı ve görüntü analizi NIS-Elements yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi.

Ek Şekil 1. 18. günde uzun süreli organoid kültürü sırasında çökmüş bir hidrojelin temsilci örneği. Çökmüş hidrojeller, yoğun hücresel büyüme ve matriks kasılmasından kaynaklanan yoğun, opak, tıkaç benzeri yapılar olarak görülür. Bu morfolojik özellikler, tam hidrojel çöküşünden önce kültürlerin sonlandırılması için kriter olarak kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Burada tanımlanan protokol, meme^{morfogenezi 3'ün} temel özelliklerini destekleyen tanımlanmış bir hidrojel mikro ortamında üç boyutlu insan meme organoidlerinin tekrarlanabilir üretilmesini sağlar. Bu yöntemin başarısı için birkaç adım kritik öneme sahiptir. İlk olarak, doku işleme ve enzimatik ayrışma, epitel canlılığını korumak ve aşırı sindirimi en aza indirmek için dikkatlice kontrol edilmelidir; bu da hücre verimini azaltabilir ve sonraki morfogenez¹⁰. Özellikle, kısa ve ardışık enzimatik tedaviler ile nazik mekanik ayrışma fonksiyonel epitel popülasyonlarının sürdürülmesi için gereklidir. İkinci olarak, hidrojel hazırlamak için kolajen konsantrasyonu, pH ve^{zamanlama 11} hassas kontrol gereklidir. Kolagenin nötralizasyonu polimerizasyonu başlatır; Bu nedenle, sodyum hidroksit eklendikten sonraki tüm adımlar hızlı ve buz üzerinde yapılmalıdır, böylece tutarlı jel oluşumu sağlanır. Eksik veya gecikmeli polimerizasyon, organoid gelişimini desteklemeyen kötü yapılandırılmış veya çökmüş hidrojellere yol açabilir. Son olarak, tohumlama yoğunluğu her donör örnek için ampirik olarak optimize edilmelidir; çünkü aşırı doku veya hücre yükü hızlı jel kasılmasına ve yapısal bütünlüğün kaybına yol açabilir¹².

Birkaç sorun giderme konusu tekrarlanabilirliği artırabilir. Zayıf organoid oluşumu, hücre canlılığının düşük olması, optimal olmayan hidrojel bileşimi veya^{biriktirme 13} sırasında düzgün jel kullanımı nedeniyle ortaya çıkabilir. Kolajen stoklarının 4°C'de tutulmasını ve erken polimerizasyona uğramamasını sağlamak, jel kalitesinin tutarlı^{olması için gereklidir 11}. Ayrıca, polimerizasyon sonrası kültür yüzeyinden hidrojellerin başarılı ayrılması, doğru jel oluşumunun göstergesi olarak hizmet eder; Ayrılmama genellikle eksik polimerleşme veya uygunsuz yüzey koşullarını^{yansıtır 14}. Organoid boyutu ve morfolojisindeki değişkenlik, donör örnekler arasında beklenir ve teknik başarısızlıktan ziyade biyolojik heterojenliği yansıtır. Bu platformu kullanan önceki çalışmalar, organoid oluşumu etkinliği ve morfogenezde önemli bağışçılar arası değişkenliğe rağmen, bağımsız birincil insan bağışçılarının geniş bir kitlesinde tekrarlanabilir organoid oluşumunu^{göstermiştir 3}.

Bu yöntemin birkaç sınırlaması vardır. Model, epitel yapılarının yanında mezenkim benzeri bir bölmenin ortaya çıkmasını desteklese de, in vivo stromal, bağışıklık ve vasküler mikro ortamın karmaşıklığını tam olarak yansıtmıyor. Hidrojelin bileşimi tanımlanmış olsa da, basitleştirilmiş bir hücredışı matris oluşturur ve doğal dokuda bulunan tüm biyomekanik veya biyokimyasal ipuçlarını yakalayamaz ^15,16. Ayrıca, bağışçıdan donöre değişkenlik organoid büyüme dinamiklerini ve morfolojisini etkileyebilir ve belirli uygulamalar için ampirik optimizasyon gerektirir. Bu sınırlamalara rağmen, bu sistemin öz-organizasyonu ve endojen epitelyal–mezenkimal etkileşimleri destekleme yeteneği, mevcut birçok kültür modeline göre önemli bir ilerleme niteliğindedir³.

Yaygın kullanılan bazaz membran ekstraktı bazlı sistemlere kıyasla, bu yaklaşım hücre dışı matris bileşimi üzerinde daha fazla kontrol sağlar ve tanımlanmamış malzemelerle ilişkili değişkenliği azaltır¹⁷. Bu hidrojel platformunu Matrigel bazlı organoid sistemlerle doğrudan karşılaştıran önceki çalışmalar, doku organizasyonu ve hücre bileşiminde önemli farklılıklar^{göstermiştir 3,8}. Hidrojel ile yetiştirilen organoidler, morfolojik ve transkriptomik düzeylerde yerli insan meme dokusuna daha çok benziyordu; luminal, bazal, progenitor ve mezenkimal benzeri bölmeler dahil olmak üzere çok hatlı epitel popülasyonlarını korurken, Matrigel tarafından yetiştirilen organoidler proliferatif hibrit bazal benzeri durumlarla hakim oldu ve stromal popülasyonlardan yoksundu. Ayrıca, dışsal stromal hücrelerin eklenmesine dayanan ortak kültür sistemlerinin aksine, bu model destekleyici mezenkim benzeri bir bölmenin içsel ortaya çıkmasını sağlar ve epitelal–mikroçevre etkileşimlerinin fizyolojik olarak daha ilgili ve daha az yapay bir bağlamda incelenmesine olanak tanır. Hidrojeller içindeki ortaya çıkan mezenkimal benzeri popülasyonlar, daha önce tamamlayıcı canlı görüntüleme, immünboyama ve tek hücreli transkriptomik analizlerle^{doğrulanmıştır 3}. Bu çalışmalar, Vimentin, THY1/CD90, FAP, S100A4, ZEB1 ve Salyangoz gibi mezenkimal ve epitelyal–mezenkimal geçiş ilişkili belirteçleri ifade eden yüksek hareketli stromal benzeri hücrelerin ortaya çıktığını ve ligand-reseptör analizleriyle belirlenen karşılıklı epitelyal–mezenkimal sinyal etkileşimlerinin ortaya çıktığını gösterdi. Bu özellikler, sistemi özellikle doku mimarisi ve hücre-hücre iletişimine bağlı süreçlerin araştırılması için oldukça uygun kılar; bunlar arasında morfogenez, epitel plastisitesi ve erken doku yeniden^{şekillendirme 4,5}.

Tarif edilen platform, temel ve çeviri araştırmalarında geniş uygulamalara sahiptir. İnsan meme gelişimini incelemek, hastalığın başlangıcındaki erken olayları modellemek ve moleküler veya çevresel bozulmaların doku organizasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu platformu kullanan önceki çalışmalar, DDR1 ve RUNX1 gibi gelişimsel düzenleyicilerin fonksiyonel bozulmasının üç boyutlu kültürde soy farklılaşmasını, epitel organizasyonunu ve kanal-lobular morfogenezi değiştirdiğini^{göstermiştir 5,18}. Nicel görüntüleme ve yüksek içerikli analizle uyumluluk, organoid boyutu, yapı ve karmaşıklıktaki değişiklikler dahil fenotipik sonuçların sistematik sorgulanmasını daha da mümkün kılar. Bu nedenle, bu yöntem insan dokusu organizasyonunu ve hastalıkla ilgili bağlamlarda bozulmasını incelemek için ölçeklenebilir ve biyolojik olarak ilgili bir platform sağlar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL konik borular	VWR	89039-664	Doku işleme ve santrifüjasyon için steril tüpler
40 μ M hücre süzgeci	VWR	732-2757	Tek hücreli süspansiyon hazırlığı için filtrasyon cihazı
40 μ Düşük hacimler için m hücre süzgeci	Bel-Art	136800040	Tek hücreli süspansiyon hazırlığı için filtrasyon cihazı
Otomatik hücre sayacı	Bio-Rad	1450102	Hücreleri saymak ve yaşamlılığı belirlemek için kullanılan cihaz
Sığır hipofiz ekstraktı	Termo Bilimsel	13028014	Epitel hücre ortamı için takviye
Hücre sayma slaytları	Bio-Rad	145-0011	Hücre sayımı için kullanılan çift odalı slaytlar
Santrifüj	Yok	Yok	Tezgah üstü santrifüj/ler en az 500 x g hız kapasitesine ve 15 mL ile 1,5 mL tüplerin kapasitesine sahip olmalıdır.
Kolajen I	Millipore Sigma	08-115	Hidrojel oluşumu için kullanılan ekstrasellüler matriks proteini
Kollagenaz A	Sigma-Aldrich	11088793001	Doku dissosiyasyonu için kullanılan enzim
Kryovialler	Corning	976171	Numunelerin kriyojenik depolanması için steril şişeler
Kültür kapları (örneğin, odalı kaydıraklar, çoklu kuyu plakaları)	Corning	354104 354108 3603	Hidrojel biriktirme ve organoid kültürü için platformlar.
Dimetil sülfoksit	Millipore Sigma	317275	Dondurma ortamında kullanılan kriyoprotektan
Dispase II	Roche	4942078001	İkincil doku dissosiyasyonu için kullanılan enzim
DNase I	Roche	10104159001	Hücre ayrışması sırasında kullanılan enzim.
Fetal sığır serumu	Gibco	10437	Yıkama ve nötralizasyon ortamlarında kullanılan serum takviyesi
Fibronektin	Sigma-Aldrich	F2006	Ekstraselüler matriks protein bileşeni
GlutaMAX	Termo Bilimsel	35050061	Epitel hücre ortamı için takviye
İnsan epidermal büyüme faktörü	Sigma-Aldrich	E9644	Epitel hücre ortamı için takviye
Hidrokortizon	Sigma-Aldrich	H0888	Epitel hücre ortamı için takviye
Hyaluronik asit	Millipore Sigma	385908	Hidrojel formülasyonu için ekstrasellüler matriks bileşeni
Hiyalüronidaz	Sigma-Aldrich	H3506	Doku dissosiyasyonu için kullanılan enzim
Kuluçka makinesi	Termo Bilimsel	3598	Doku kültürü kuluçkası için kullanılan cihaz
İnsülin	Sigma-Aldrich	I9278	Epitel hücre ortamı için takviye
Laminin	Gibco	23017-015	Ekstraselüler matriks protein bileşeni
Meme epitelyal bazal ortam	Termo Bilimsel	M171500	Epitel hücreleri için büyüme ortamı
Mikrosantrifüj tüpleri (1.5 mL)	Termo Bilimsel	3451	Küçük hacimli reaksiyonlar için kullanılan tüpler
Yörüngesel rotatör	Termo Bilimsel	400110	Enzimatik ayrışma sırasında doku dispersiyası için kullanılan rotator
P1000 pipeti	Gilson	P1000	1.000 &mu'ya kadar hacimleri karıştırmak ve aktarmak için kullanılan cihaz; L
Penisillin-streptomisin	Termo Bilimsel	15140122	Epitel hücre ortamı için antibiyotik takviyesi
Fosfatla tamponlanmış tuzlu su	Gibco	20012-027	Yıkama ve durulama için kullanılan tampon çözeltisi
Hassas denge	Mettler Toledo	ML303E	Doku tartımı için kullanılan teraziye
Serolojik pipet	Nunc	170356N	Yapışmayan epitel hücrelerinin hasatında kullanılan pipet
Sodyum hidroksit (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Kolajen nötralizasyonu için kullanılan reaktif
Steril bistürpeller	Bard-Parker	372615	Mekanik doku doğraması için kullanılan aletler
Tripan mavi çözeltisi	Gibco	15250061	Hücre canlılık değerlendirmesi için kullanılan boya
Tripsin (%0,25)	Gibco	25200056	Hücre ayrışması için kullanılan enzimatik reaktif
Su banyosu (37 derece ve derece; C)	VWR	10LA	Numunelerin kontrollü çözülmesi için kullanılan cihaz