Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İmmünize Edilmiş Rhesus Makaklarının Kan ve Kemik İliğindeki Antijene Özgü ve Toplam Antikor Salgılayan Hücrelerin Kantifikasyonu için ELISpot Analizi

59 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71836

⸱

21 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Comparative Medicine, Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas, 2New Iberia Research Center, University of Louisiana at Lafayette, 3Department of Immunology and Microbiology, Scripps Research Institute

Bu makalede

Özet

B-Hücre ELISpot; hem kanda (bağışıklama sonrası kısa ömürlü plazmablastları yansıtan) hem de daha kalıcı kemik iliği ASC'lerinde, antijene özgü IgG, IgM ve IgA uzun ömürlü plazma hücrelerinin yanı sıra toplam antikor salgılayan hücrelerin (ASC'lerin) büyüklüğünü ve kalıcılığını nicelendirmek için doğrulanmış bir yöntemdir.

Özet

Yeni aşı antijenlerinin ve adjuvanların değerlendirilmesi geleneksel olarak, immünizasyonu takiben gelişmesi zaman alan antikor titrelerinin ölçülmesine dayanır. Primer ve booster immünizasyonlar sonrası antikor salgılayan hücrelerin (ASC'ler) kantifikasyonu, aşı ile indüklenen humoral immünitenin daha erken ve mekanistik olarak bilgilendirici bir ölçümünü sağlar; ayrıca aşı formülasyonlarının ve immünizasyon stratejilerinin optimizasyonunu kolaylaştırabilir. Burada, HIV aşı araştırmaları için önemli bir preklinik model olan rhesus makaklarının periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) ve kemik iliği (BM) hücrelerinden ASC'lerin sayılmasına yönelik bir protokol açıklanmaktadır. Bu enzimle bağlantılı immünospot (ELISpot) analizi, mutlak ve göreli frekanslarını ölçerek hem antijene özgü hem de toplam IgG, IgM ve IgA ASC'lerinin kantifikasyonunu sağlar. Periferik kanda analiz, immünizasyonu takiben gerçekleşen pik plazmablast yanıtını yakalarken; kemik iliğinde farklı izotiplerdeki antijene özgü plazma hücrelerinin birikimini tespit ederek uzun ömürlü ASC'lerin kalıcılığını değerlendirir. Bu protokol, preklinik aşı çalışmalarında immünojen ve adjuvan kombinasyonlarını değerlendirmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar ve gelecek vadeden aşı adaylarının klinik geliştirme aşamasına aktarılmasını destekleyecek değerli veriler sağlar.

Giriş

Antikor salgılayan hücreler (ASCs), adaptif immünitenin temel bileşenleridir ve hem immünizasyonu takiben hızla üretilen kısa ömürlü plazmablastları hem de sürdürülebilir antikor üretiminden sorumlu uzun ömürlü plazma hücrelerini içerir. Plazmablastlar, periferik kanda ve sekonder lenfoid organlarda geçici olarak tespit edilebilir ve immünizasyon sonrası, aşı formülasyonuna ve konakçı türe göre değişen belirli zaman noktalarında pik frekanslara ulaşırlar (tipik olarak rhesus makaklarda 4-5. günlerde ve insanlarda yaklaşık 7. günde). Buna karşılık, olgun plazma hücreleri uzun ömürlüdür ve öncelikle sekonder lenfoid dokularda ve kemik iliğinde (BM) bulunurlar. Etkili bir aşının hem güçlü humoral hem de hücre aracılı immün yanıtlar uyandırması gerekir. Hatırlatıcı doz immünizasyonunu takiben periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMCs) plazmablastların hızla genişlemesiyle yansıyan anımsama yanıtlarının ölçümü, aşı kaynaklı immün yanıtın büyüklüğü hakkında değerli bilgiler sağlar. Bu protokolün genel amacı, rhesus makaklarda Envle spesifik immünizasyonu takiben erken plazmablast ve uzun ömürlü plazma hücresi yanıtlarını nicelleştirmek için sağlam bir yöntem sunmaktır.

Enzim bağlı immünospot (ELISpot) analizinde, ASC'ler antijen (Ag) ile kaplanmış poliviniliden florür (PVDF) veya karışık selüloz ester (MCE) membran tabanlı 96 kuyucuklu plakalarda kültüre edilir; bu sayede canlı hücrelerin, doğrudan membran yüzeyinde yakalanan proteinler salgılaması sağlanır. Yakalanan proteinler daha sonra geleneksel bir sandviç immünosorbent analiz formatında antikorlar kullanılarak tespit edilir. Kromojenik ELISpot analizlerinde, 3-amino-9-etilkarbazol (AEC) substratının horseradish peroksidaz (HRP) tarafından çözünmeyen renkli bir çökeleğe dönüştürülmesiyle noktalar oluşturulur ve bu sayede tekil ASC'lerin görselleştirilmesi ve sayılması mümkün hale gelir. ELISpot, antijene özgü yanıtların ex vivo tespit edilebilmesi, tekil bağışıklık hücrelerinin yüksek hassasiyetli fonksiyonel değerlendirmesi ve hem preklinik hem de klinik çalışmalarda T ve B hücre immün yanıtlarının kantitatif izlemi dahil olmak de olmak üzere birçok önemli avantaj sunar1,2,3.

Burada, rhesus makaklarından alınan PBMC'ler ve BM hücrelerindeki toplam ve antijene özgü IgG, IgM ve IgA ASC'lerini nicelleştirmek için bir B-hücresi ELISpot protokolü açıklanmaktadır. Protokol, toplam ve Env-özgü plazmablast ve plazma hücresi yanıtlarının kinetiğini karakterize etmek için plaka kaplama, bloklama, hücre ekimi, assay geliştirme, spot sayımı ve veri analizi dahil olmak üzere tüm kritik adımları detaylandırmaktadır. Bu yöntem, preklinik aşı çalışmalarında farklı antijen ve adjuvan formülasyonlarının immünojenitesini değerlendirmek ve karşılaştırmak için tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar ve sonraki klinik translasyon için aşı stratejilerinin optimizasyonunu destekler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolde kullanılan rhesus makakları, New Iberia Araştırma Merkezi'nin spesifik patojen içermeyen (SPF) kolonilerinden temin edilmiş ve University of Texas MD Anderson Kanser Merkezi'ndeki Michale E. Keeling Karşılaştırmalı Tıp ve Araştırma Merkezi'nde barındırılmıştır. Hayvan bakımı ve tüm deneysel prosedürler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüş ve University of Texas MD Anderson Kanser Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (Protokol #2616RN00).

Bu protokol, ASC yanıtlarını tespit etmek için geliştirilen ve önceki immünizasyon preklinik çalışmalarında4,5,6,7 açıklanan tekniğin bir optimizasyonunu temsil etmektedir. Aşağıdaki protokol, bir HIV deneysel aşı protokolüne dahil olan rhesus makaklarından elde edilen taze PBMC ve BM hücre preparasyonlarını kullanan ELISpot prosedürünü açıklamaktadır.

NOT: Bölüm 1–4'teki tüm prosedürleri, aseptik teknik kullanarak sertifikalı bir Sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. Mümkün olduğunda çok kanallı pipetler kullanın.

1. ELISpot plaklarının hazırlanması

  1. ELISpot plaklarının kaplanması
    1. Toplam immünoglobulin (Ig) plakları 1 ve 3'ü, steril DPBS ile seyreltilmiş 5 µg/mL konjuge edilmemiş keçi anti-maymun IgG + IgM + IgA'dan 100 µL/kuyu ekleyerek kaplayın. Plakları 4 °C'de en az 8 saat, tercihen gece boyunca inkübe edin (Şekil 1A,C).
    2. Antijen spesifik plaklar 2 ve 4'ü, DPBS ile seyreltilmiş 20 µg/mL Galanthus nivalis lektini (GNL)'den 100 µL/kuyu ekleyerek kaplayın. Plakları 4 °C'de en az 8 saat, tercihen gece boyunca inkübe edin (Şekil 1B,D).
    3. Kaplanmış plakları kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
  2. Toplam immünoglobulin plaklarının yıkanması ve bloklanması
    1. Her bir plağı hızla bir atık kabının üzerine ters çevirerek 1 ve 3 numaralı plakalardaki kaplama solüsyonunu uzaklaştırın. Kalan sıvıyı temizlemek için ters çevrilmiş plağı emici kağıt üzerine sertçe vurun.
    2. Her plağı, %0,05 Tween 20 içeren 200 µL/kuyu PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, kalıntı deterjanı uzaklaştırmak için plakları 200 µL/kuyu DPBS ile iki kez yıkayın.
      NOT: Tween 20 sitotoksiktir. Hücre ekimi yapmadan önce tamamen uzaklaştırın.
    3. Her kuyucuğa 200 µL/kuyu RPMI-10 ekleyin. Plakları nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
  3. Antijen spesifik plakların yıkanması ve bloklanması
    1. Her bir plağı hızla bir atık kabının üzerine ters çevirerek 2 ve 4 numaralı plakalardaki GNL kaplama solüsyonunu uzaklaştırın. Kalan sıvıyı temizlemek için ters çevrilmiş plakları emici kağıt üzerine sertçe vurun.
    2. Her plağı 200 µL/kuyu DPBS ile dört kez yıkayın.
      NOT: GNL kaplı plaklar için Tween 20 içeren PBS kullanmayın.
    3. Her kuyucuğa 200 µL/kuyu RPMI-10 ekleyin. Plakları nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
    4. Bloklama solüsyonunu dökün. Her plağı 200 µL/kuyu DPBS ile dört kez yıkayın.
    5. 5 µg/mL nihai konsantrasyonda 100 µL/kuyu CH505 SOSIP antijeni ekleyin. Plakları 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
    6. Antijen solüsyonunu dökün ve her plağı steril DPBS ile dört kez yıkayın.
      NOT: Hücre ekimi öncesinde MCE membranının kurumasını önlemek için son yıkamadan sonra kuyucuklarda DPBS bırakın.

2. Numunelerin hazırlanması: PBKların ve kemik iliği mononükleer hücrelerinin izolasyonu

  1. Tam kandan PBMC'lerin izole edilmesi
    1. 10 mL'lik EDTA'lı kan tüplerini 450 x g'de santrifüjleyin g fren uygulanmadan oda sıcaklığında 20 dk boyunca.
    2. Plazmayı uzaklaştırın ve Ca içermeyen 4 mL DPBS ekleyin2+ ve Mg2+10 mL'lik serolojik pipet kullanarak nazikçe karıştırın.
    3. Seyreltilmiş kanı, 15 mL'lik bir santrifüj tüpündeki 4 mL Ficoll üzerine dikkatlice katmanlar halinde ekleyin. 800 x g'de santrifüjleyin. g yavaş hızlanma ve yavaş yavaşlama kullanarak oda sıcaklığında 30 dakika boyunca.
    4. Periferik kan mononükleer hücrelerini içeren buffy coat tabakasını temiz bir 15 mL'lik tüpe aktarın. 8–10 mL DPBS ekleyin ve 450 x g'de santrifüjleyin. g oda sıcaklığında 10 dakika boyunca.
    5. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini nazikçe resüspande edin.
    6. Hücre süspansiyonuna 2 mL amonyum klorür potasyum (ACK) lizis tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
      DİKKAT: ACK lizis tamponuna uzun süre maruz kalmak hücre canlılığını azalttığından, 5 dakikalık inkübasyon süresini aşmayın.
    7. %2 fetal bovine serum (FBS) içeren 10 mL DPBS ekleyerek eritrosit lizini durdurun. Hücreleri 300 x g'de santrifüjleyin. g oda sıcaklığında 10 dakika boyunca.
    8. Süpernatantı atın ve hücreleri RPMI-10 içerisinde yeniden süspande edin.
    9. Uygun bir hücre sayım yöntemi kullanarak PBK'ları sayın ve canlılığın şu düzeyde olduğundan emin olun: >%90, örneğin trypan mavisi boyaması yoluyla.
    10. Bir alikotu 5'e ayarlayın × 106 antijen spesifik ELISpot analizleri için hücre/mL. İkinci bir alikotu 1'e ayarlayın × 106 toplam immünoglobulin ELISpot analizleri için hücre/mL.
  2. Kemik iliği mononükleer hücrelerini izole edin
    1. 70'lik bir [buraya devamı gelecek] yerleştirin µhücre süzgecini 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Süzgeci 1 mL DPBS ile önceden ıslatın.
    2. 1 mL kemik iliği aspiratına 4 mL DPBS ekleyin. Serolojik pipet kullanarak iyice karıştırın.
    3. Kemik iliği süspansiyonunu 70 µm'lik süzgeçten geçirin µhücre süzgeci. Süzgeci atmadan önce 2 mL DPBS ile durulayın.
    4. Filtrelenmiş süspansiyonu, 15 mL'lik bir santrifüj tüpündeki 4 mL Ficoll üzerine katmanlar halinde ekleyin. 800 x g'de santrifüjleyin. g Yavaş hızlanma ve yavaş yavaşlama kullanarak oda sıcaklığında 30 dakika boyunca.
    5. Mononükleer hücre tabakasını yeni bir 15 mL'lik tüpe aktarın. 8–10 mL DPBS ekleyin ve 450 x g'de santrifüjleyin. g oda sıcaklığında 10 dakika boyunca.
    6. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini nazikçe yeniden süspanse edin.
    7. Hücre süspansiyonuna 2 mL ACK liziz tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
      DİKKAT: Hücre canlılığını korumak için önerilen lizis süresini aşmayın.
    8. %2 FBS içeren 10 mL DPBS ekleyerek eritrosit lizini durdurun. Hücreleri 300 x g'de santrifüjleyin. g oda sıcaklığında 10 dakika boyunca.
    9. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri RPMI-10 içerisinde yeniden süspande edin.
    10. Uygun bir hücre sayım yöntemiyle kemik iliği mononükleer hücrelerini sayın ve canlılığın şu değerde olduğundan emin olun >%90, örneğin, trypan blue boyaması yoluyla.
    11. Bir alikotu 5'e ayarlayın × 106 antijen spesifik ELISpot analizleri için hücre/mL. İkinci bir alikotu 1'e ayarlayın × 106 toplam immünoglobulin ELISpot analizleri için hücre/mL.

3. Hücrelerin ekimi ve inkübasyonu

  1. Toplam immünoglobulin plaklarının ekimi
    1. 1 ve 3 numaralı plakları bir atık kabının üzerine hızla ters çevirerek bloklama ortamını uzaklaştırın. Kalan ortamı temizlemek için ters çevrilmiş plaklara emici kağıt üzerinde sertçe vurun.
    2. Birinci sıradaki her kuyucuğa 100 µL RPMI-10 ve ikinci ile üçüncü sıradaki her kuyucuğa 133 µL RPMI-10 ekleyin. Bu işlemler teknik dublikat olarak gerçekleştirilir.
    3. 1 numaralı plaktaki her sütunun ilk kuyucuğuna 100 µL PBMC süspansiyonu (1 × 106 hücre/mL) ekleyin. Örnekleri plak düzenine göre yerleştirin [örneğin, rhesus macaque 1 (RM1) için A1–A6 kuyucukları ve rhesus macaque 2 (RM2) için A7–A12 kuyucukları].
    4. 3 numaralı plaktaki her sütunun ilk kuyucuğuna 100 µL kemik iliği hücresi süspansiyonu (1 × 106 hücre/mL) ekleyin. Örnekleri plak düzenine göre yerleştirin.
    5. Bir kuyucuktan diğerine 67 µL aktararak ve her aktarımdan sonra iyice karıştırarak üç katlı seri dilüsyonlar hazırlayın. Seri dilüsyon işlemine belirlenen kuyucuklarda devam edin, ardından her kuyucukta 133 µL nihai hacmi korumak için son 67 µL'yi atın.
    6. Plakları, %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.
      ​NOT: Çift lekelerin oluşmasını önlemek için inkübasyon sırasında plakları hareket ettirmekten veya sarsmaktan kaçının.
  2. Antijen spesifik plakların ekimi
    1. 2 ve 4 numaralı plakları bir atık kabının üzerine hızla ters çevirerek DPBS'yi uzaklaştırın. Kalan tamponu temizlemek için ters çevrilmiş plaklara emici kağıt üzerinde sertçe vurun.
    2. Birinci sıradaki her kuyucuğa 100 µL RPMI-10 ve ikinci ile üçüncü sıradaki her kuyucuğa 133 µL RPMI-10 ekleyin.
    3. 2 numaralı plaktaki her sütunun ilk kuyucuğuna 100 µL PBMC süspansiyonu (5 × 106 hücre/mL) ekleyin. Örnekleri plak düzenine göre ekleyin.
    4. 4 numaralı plaktaki her sütunun ilk kuyucuğuna 100 µL kemik iliği hücresi süspansiyonu (5 × 106 hücre/mL) ekleyin. Örnekleri plak düzenine göre ekleyin.
    5. Bir kuyucuktan diğerine 67 µL aktararak ve her aktarımdan sonra iyice karıştırarak üç katlı seri dilüsyonlar hazırlayın. Seri dilüsyon işlemine belirlenen kuyucuklarda devam edin, ardından her kuyucukta 133 µL nihai hacmi korumak için son 67 µL'yi atın.
    6. Plakları, %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.
      NOT: Vibrasyon çift lekeler veya kuyruklu yıldız benzeri (comet-tail) artefaktlara neden olabileceği için inkübasyon sırasında inkübatörü sarsmaktan kaçının.

4. ELISpot plakalarını işleyin

  1. Toplam immünoglobulin plaklarını işleyin
    1. Plakları yaklaşık 18 saatlik inkübasyonun ardından inkübatörden çıkarın.
    2. Her bir plağı hızla %10 çamaşır suyu içeren bir atık kabının üzerine ters çevirerek hücreleri ve kültür ortamını atın. Kalan sıvıyı uzaklaştırmak için ters çevrilmiş plaklara emici kağıt üzerinde kuvvetlice vurun.
      NOT: Kalan işlem adımlarını steril olmayan koşullar altında gerçekleştirin.
    3. Her bir plağı, kuyu başına 200 µL %0,05 Tween 20 içeren DPBS ile dört kez yıkayın.
      NOT: Membranların kurumasını önlemek için son yıkama tamponunu kuyucuklarda bırakın.
    4. Çok sayıda plaktan işlem yapılıyorsa, plakları otomatik bir mikroplak yıkayıcı kullanarak yıkayın.
    5. Biotinillenmiş anti-maymun IgG ve IgM antikorlarını 1:1.000 ve biotinillenmiş anti-maymun IgA antikorunu 1:500 oranında %0,05 Tween 20 ve %1 FBS içeren DPBS içinde seyrelterek deteksiyon antikoru çözeltisini hazırlayın.
    6. Plakları emici kağıda vurarak son yıkama tamponunu uzaklaştırın. 1. ve 2., 7. ve 8. sütunlara kuyu başına 100 µL seyreltilmiş anti-IgG antikoru; 3. ve 4., 9. ve 10. sütunlara anti-IgM antikoru; 5. ve 6., 11. ve 12. sütunlara ise anti-IgA antikoru ekleyin.
      NOT: Membranların kurumasını önlemek için plakları tek tek işleyin.
    7. Plakları oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
    8. Deteksiyon antikoru çözeltisini atın ve plakları %0,05 Tween 20 içeren DPBS ile dört kez yıkayın.
    9. HRP-avidin'i %0,05 Tween 20 ve %1 FBS içeren DPBS içinde 1:1.000 oranında seyrelterek enzim konjugatını hazırlayın.
    10. Her kuyucuğa 100 µL/kuyu seyreltilmiş HRP-avidin ekleyin. Plakları ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
    11. HRP-avidin çözeltisini atın ve plakları %0,05 Tween-20 içeren DPBS ile dört kez yıkayın.
      ​NOT: Substrat gelişimi tamamlanana kadar son yıkama tamponunu kuyucuklarda bırakın.
  2. Antijenle spesifik plakları işleyin
    NOT: Prosedür, toplam immünoglobulin plakları için kullanılanla benzerdir. Ancak, GNL kaplamasını korumak için tüm yıkama adımlarını Tween 20 içermeyen DPBS kullanarak gerçekleştirin.
    1. Plakları yaklaşık 18 saatlik inkübasyonun ardından inkübatörden çıkarın.
    2. Her bir plağı hızla %10 çamaşır suyu içeren bir atık kabının üzerine ters çevirerek hücreleri ve kültür ortamını atın. Kalan sıvıyı uzaklaştırmak için ters çevrilmiş plaklara emici kağıt üzerinde kuvvetlice vurun.
      NOT: Kalan işlem adımlarını steril olmayan koşullar altında gerçekleştirin.
    3. Her bir plağı, kuyu başına 200 µL DPBS ile dört kez yıkayın.
      NOT: Membranların kurumasını önlemek için son yıkama tamponunu kuyucuklarda bırakın.
    4. Biotinillenmiş anti-maymun IgG ve IgM antikorlarını 1:1.000 ve biotinillenmiş anti-maymun IgA antikorunu 1:500 oranında %1 FBS içeren DPBS içinde seyrelterek deteksiyon antikoru çözeltisini hazırlayın.
    5. Plakları emici kağıda vurarak son yıkama tamponunu uzaklaştırın. 1. ve 2., 7. ve 8. sütunlara kuyu başına 100 µL seyreltilmiş anti-IgG antikoru; 3. ve 4., 9. ve 10. sütunlara anti-IgM antikoru; 5. ve 6., 11. ve 12. sütunlara ise anti-IgA antikoru ekleyin.
      NOT: Membranların kurumasını önlemek için plakları tek tek işleyin.
    6. Plakları oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
    7. Deteksiyon antikoru çözeltisini atın ve plakları kuyu başına 200 µL DPBS ile dört kez yıkayın.
    8. HRP-avidin'i %1 FBS içeren DPBS içinde 1:1.000 oranında seyrelterek enzim konjugatını hazırlayın.
    9. Her kuyucuğa 100 µL/kuyu seyreltilmiş HRP-avidin ekleyin. Plakları ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
    10. HRP-avidin çözeltisini atın ve plakları kuyu başına 200 µL DPBS ile dört kez yıkayın.
      NOT: Substrat gelişimi tamamlanana kadar son yıkama tamponunu kuyucuklarda bırakın.
  3. Otomatik yıkama gerçekleştirin (Opsiyonel)
    1. Otomatik mikroplak yıkayıcıyı üretici talimatlarına göre DPBS ile hazırlayın.
    2. Önceden tanımlanmış ELISpot yıkama programını seçin ve tüm yıkama adımlarını DPBS kullanarak gerçekleştirin.
      NOT: Cihazın farklı yıkama tamponlarıyla tekrar tekrar hazırlanmasını önlemek için tüm otomatik yıkamalar için DPBS kullanın.
    3. Mikroplak yıkayıcı için  Tablo 1'de listelenen yıkama ayarlarını kullanın.

5. Tespit

  1. Substrat çözeltisini hazırlayın
    1. Her 1 mL substrat çözeltisine bir damla kromojen çözeltisi ekleyerek AEC çalışma substratını kullanımdan hemen önce hazırlayın. Vorteksleyerek iyice karıştırın.
      NOT: Dört adet 96 kuyucuklu plaka için yaklaşık 40 mL çalışma substratı hazırlayın.
  2. ELISpot plakalarını oda sıcaklığında geliştirin
    1. Her seferinde bir plakayı işlemlemiş olun. Son yıkama tamponunu boşaltın ve hemen kuyucuk başına 100 µL AEC çalışma substratı ekleyin.
    2. Belirgin kırmızı lekeler görünür olana kadar, genellikle 2–4 dk içinde, leke gelişimini görsel olarak izleyin.
      DİKKAT: Plakaları aşırı geliştirmeyin; çünkü aşırı gelişim arka plan boyanmasını artırır ve leke çözünürlüğünü bozar.
    3. Plakayı akan musluk suyu altında iyice durulayarak enzimatik reaksiyonu durdurun.
    4. Plakayı musluk suyu ile dört ila beş kez yıkayın. Fazla suyu emici kağıt havlularla alın.
    5. Plakanın alt tahliye kısmını çıkarın ve lekeleri saymadan önce plakaların yaklaşık 24 sa boyunca havada kurumasını bekleyin.
      NOT: Aşırı gelişimi önlemek için, en yüksek hücre konsantrasyonlarını içeren kuyucuklarda lekeler görünür olur olmaz reaksiyonu durdurun.
    6. Kalan her plaka için 5.2.1–5.2.5 arasındaki adımları tekrarlayın.

6. Lekelerin nicelendirilmesi

  1. ELISpot görüntülerinin elde edilmesi
    1. Her plakayı, görüntüleme yazılımıyla donatılmış bir ELISpot okuyucu kullanarak tarayın.
    2. Uygun plaka şablonunu seçin, analiz edilecek kuyucukları belirleyin ve yazılım talimatlarına göre görüntüleri elde edin.
    3. Ham verileri kaydedin ve arşivleme amacıyla plaka görüntülerini TIFF formatında dışa aktarın.
  2. Antikor salgılayan hücrelerin sayılması
    1. Her kuyucuk için otomatik spot sayımlarını gözden geçirin.
    2. Hatalı birleştirilmiş veya ayrılmış spotları belirlemek için her kuyucuğu manuel olarak doğrulayın. Doğru sayımlar elde etmek için gerektiğinde tekil spotları manuel olarak işaretleyin.
      NOT: Büyük spotlar otomatik analiz yazılımı tarafından birden fazla kez sayılabileceği için manuel doğrulama önerilir.
    3. Spot sayımlarını, Tablo 2'de belirtildiği gibi ilgili dilüsyon faktörleriyle birlikte bir hesap tablosuna kaydedin.
    4. Her dilüsyon için ortalama spot sayısını hesaplamadan önce, IgG, IgM ve IgA için duble kuyucukları ayrı ayrı analiz edin.
    5. Ortalama spot sayısını ilgili dilüsyon faktörüyle çarparak milyon girdi hücresi başına düşen antikor salgılayan hücre sayısını hesaplayın.
      NOT: Toplam immünoglobulin analizleri için 15×, 45× ve 135×; antijene özgü analizler için ise 3×, 9× ve 27× dilüsyon faktörlerini kullanın.
    6. Tüm hesaplamaları hesap tablosu yazılımında gerçekleştirin ve istatistiksel grafik yazılımı kullanarak grafikleri oluşturun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu B-hücresi ELISpot analizinde, HIV-1'e karşı geniş kapsamlı nötralize edici antikorlar (bnAb'ler) uyarmayı amaçlayan bir aşı çalışmasında, kaplama antijeni olarak çözünür bir HIV-1 zar glikoproteini (Env) trimeri olan CH505 SOSIP kullanılarak antikor salgılayan hücreler (ASC'ler) tespit edilmiştir. Şekil 1, toplam ve antijene özgü ASC'leri ayrı plakalarda nicelendirmek için kullanılan ELISpot plaka düzenini göstermektedir. Düzen; bireysel hayvanları ve IgG, IgM ve IgA analizleri için atana...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

B hücresi ELISpot, kan, plazma ve kemik iliği hücrelerindeki toplam immünoglobülin ve antijene özgü antikor salgılayan hücre (ASC) yanıtlarının tespit edilmesi için hassas bir yöntemdir8,9,10,11. Protokolün tekrarlanabilirliğini sağlamak için birkaç adım kritik öneme sahiptir. İlk olarak, membranlar yakalayıcı antikorun optimal konsantrasyonu ile hassas bir şekilde kaplanmalıdır. Membran blokla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar beyan edilecek herhangi bir finansal çıkarı olmadığını belirtmişlerdir.

Teşekkürler

Yazarlar, bakımlarından dolayı Keeling Karşılaştırmalı Tıp ve Araştırma Merkezi'ndeki hayvanlara ve araştırma bakım personeline, ayrıca prosedürün aşamalı olarak geliştirilmesindeki katkıları için birçok eski ekip üyesine ve iş birliği yapan kişiye teşekkürlerini sunarlar. Bu NHP HIV aşı projesinin finansmanı, MBZ'ye verilen 5R01AI183472 ve FJV'ye verilen R24OD010947 numaralı NIH ödülleri tarafından sağlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ACK LizizQuality Biological118-156-101500 ml
70µm süzgeçFisher2236354850 mL konik tüplere uygun steril hücre süzgeci
AEC çalışma substratıBD Biosciences55195110 plaka için reaktifler
Analiz: ExcelMicrosoft officeSürüm 2508 Derleme 16.0.19127.20678Microsoft 365 için Microsoft Excel
Analiz: GraphPad PrismGraphPad Software, LLCSürüm 10.6.1 (892) GraphPad Prism 10
Anti Rhesus IgA biotinNHPRRAB-3086851liyofilize
Anti-maymun IgG biotinRocklandP/N 617-106-012liyofilize
Anti-maymun IgM biotinRocklandP/N 617-106-007liyofilize
Bloke etme besiyeriLaboratuvar hazırlamalı reaktiflerkurum içinde formüle edildiRPMI-10
Sekonder antikor ve HRP seyreltme tamponuLaboratuvar hazırlamalı reaktiflerkurum içinde formüle edildi%1 FBS içeren 1X DPBS
Santrifüj Thermo Scientific75004521Sorvall Legend XTR, Üretim yılı: 2013, TX-750 rotoru ve 75003608 (Yuvarlak kova)
Kaplama tamponuLaboratuvar hazırlamalı reaktiflerkurum içinde formüle edildi1X DPBS
DPBSGibco14190-1361X
ELISpot plakalarıMillipore SigmaMSHAN4B5050 plakalı paket
Fetal Bovin Serum (FBS)Omega ScientificFB-011X
FicollSTEMCELL Technologies18061500 ml
GNL Konjugasyonu yapılmamışVector LaboratoriesL-1240-5liyofilize
Yabani Turbu Peroksidaz (HRP) - AvidinVector LaboratoriesA-20045mg/ml kullanıma hazır
Mabtech IRIS Fluorospot/ELISpot okuyucuMabtech ABP/N: 2000ELISpot ve Flurospot analizleri için otomatik görüntüleme ve analiz cihazı
Penisilin/StreptomisinGibco15140-122100X
Plaka yıkayıcıBioTek Instruments, Inc.REF# 405TSRS405 TS Mikroplaka yıkayıcı
RPMI-10Laboratuvar hazırlamalı reaktiflerkurum içinde formüle edildiRPMI-1640 + %10 Fetal Bovin Serum ve %1 Penisilin/Streptomisin 
RPMI-1640Gibco22400-0711X
Tween20Sigma Life sciencesP7949500ml
Konjugasyonu yapılmamış Poliklonal Keçi anti maymun IgG+IgA+IgM Antikoru IgG/IgM/IgALS-BioC347340liyofilize
Yıkama tamponu (Antijene Özgü Plakalar)Laboratuvar hazırlamalı reaktiflerkurum içinde formüle edildi(Sadece 1X DPBS)
Yıkama tamponu (Toplam Ig Plakaları)Laboratuvar hazırlamalı reaktiflerkurum içinde formüle edildi(1X DPBS + %0,05 Tween 20)

Kaynaklar

  1. Hwai H, Chen YY, Tzeng SJ. B-Cell ELISpot Assay to Quantify Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Methods Mol Biol. 2018;1808:133-141.
  2. Haralambieva IH, Ovsyannikova IG, Kennedy RB, Poland GA. Detection and Quantification of Influenza A/H1N1 Virus-Specific Memory B Cells in Human PBMCs Using ELISpot Assay. Methods Mol Biol. 2018;1808:221-236.
  3. Sahay B, Aranyos AM, McAvoy A, Yamamoto JK. Utilization of Feline ELISpot to Evaluate the Immunogenicity of a T Cell-Based FIV MAP Vaccine. Methods Mol Biol. 2018;1808:197-219.
  4. Silveira EL, et al. Vaccine-induced plasmablast responses in rhesus macaques: Phenotypic characterization and a source for generating antigen-specific monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 2015;416:69-83.
  5. Arunachalam PS, et al. A comparative immunological assessment of multiple clinical-stage adjuvants for the R21 malaria vaccine in nonhuman primates. Sci Transl Med. 2024;16(758):eadn6605.
  6. Kasturi SP, et al. 3M-052, a synthetic TLR-7/8 agonist, induces durable HIV-1 envelope-specific plasma cells and humoral immunity in nonhuman primates. Sci Immunol. 2020;5(48):eabb1025.
  7. Kasturi SP, et al. Adjuvanting a Simian Immunodeficiency Virus Vaccine with Toll-Like Receptor Ligands Encapsulated in Nanoparticles Induces Persistent Antibody Responses and Enhanced Protection in TRIM5alpha Restrictive Macaques. J Virol. 2017;91(4):e01844-16.
  8. Shah HB, Koelsch KA. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods Mol Biol. 2015;1312:419-426.
  9. Czerkinsky CC, et al. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 1983;65(1-2):109-121.
  10. Saletti G, et al. Enzyme-linked immunospot assays for direct ex vivo measurement of vaccine-induced human humoral immune responses in blood. Nat Protoc. 2013;8(6):1073-1087.
  11. Walsh PN, et al. Optimization and qualification of a memory B-cell ELISpot for the detection of vaccine-induced memory responses in HIV vaccine trials. J Immunol Methods. 2013;394(1-2):84-93.
  12. Brunner C, et al. Cell-based ELISpot protocol to detect and quantify antigen-specific antibody-secreting cells in murine whole-organ single-cell suspensions. STAR Protoc. 2025;6(3):103797.
  13. Rouers A, Tay MZ, Ng LFP, Renia L. B-cell ELISpot assay to analyze human memory B cell and plasmablast responses specific to SARS-CoV-2 receptor-binding domain. STAR Protoc. 2023;4(1):102130.
  14. Tian C, et al. Use of ELISpot assay to study HBs-specific B cell responses in vaccinated and HBV-infected humans. Emerg Microbes Infect. 2018;7(1):16.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Periferik KanAşı İmmünojenitesiPlazmablast YanıtıPlazma Hücreleriİmmünizasyon StratejisiPreklinik Aşı Çalışmaları

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.