Yöntem makalesi

Anti-Tüberküloz Rifampisin Yüklü Lipozomların Hazırlanması ve Kalite Değerlendirmesi

8 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71858

⸱

1 Ekim 2026

 ,  ,  , 
1School of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Resources Biorefinery, Guangdong University of Technology

Bu makalede

Özet

Bu protokol, anti-tüberküloz ilaç yüklü lipozomların hazırlanmasını optimize etmeyi ve lipozomal formülasyonlar için standartlaştırılmış bir kalite değerlendirme sistemi kurmayı amaçlamaktadır.

Özet

Mycobacterium tuberculosis (MTB) tarafından neden olan Tüberküloz (TB); çoklu ilaç/rifampisin dirençli TB'nin yayılması ve yetersiz ilaç penetrasyonu, şiddetli sistemik toksisiteler ve düşük tedavi uyumu gibi konvansiyonel kemoterapinin kritik sınırlamalarının etkisiyle, Çin'de ağır bir hastalık yüküne sahip olarak küresel ölçekteki önde gelen enfeksiyöz katillerden biri olmaya devam etmektedir. Lipozomal taşıyıcı sistemler, anti-TB tedavisi için benzersiz avantajlar sunmakla birlikte; geliştirilmeleri, tutarsız hazırlama süreçleri, düşük ilaç yükleme verimliliği ve standartlaştırılmış bir kalite değerlendirme çerçevesinin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Bu çalışmada, farklı fosfolipid-kolesterol oranlarına sahip rifampisin yüklü nanolipozomlar hazırlamak için ultrasonik işlem ve filtrasyon ile kombine edilmiş ince film hidratasyon yöntemi kullanılmıştır. Enkapsülasyon verimliliğini ve ilaç yüklemesini belirlemek için valide edilmiş bir yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi oluşturulmuştur. Parçacık boyutu, zeta potansiyeli ve mikroskobik morfolojiyi karakterize etmek için dinamik ışık saçılması ve transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) kullanılmış, in vitro ilaç salınım profilleri ise çözünme testleri ile analiz edilmiştir. Optimize edilen lipozomlar yüksek enkapsülasyon verimliliği, ideal ilaç yüklemesi, üniform nano ölçekli parçacık boyutu, iyi depolama stabilitesi ve sürdürülebilir in vitro ilaç salınımı sergilemiştir. Bu çalışma, anti-TB lipozomların geliştirilmesi için standartlaştırılmış deneysel yöntemler ve kapsamlı bir kalite değerlendirme sistemi sağlayarak, TB tedavisi için lipozomal taşıyıcı sistemlerin klinik translasyonunu desteklemektedir.

Giriş

Mycobacterium tuberculosis (MTB) tarafından neden olan kronik bir enfeksiyon hastalığı olan tüberküloz (TB), tek bir patojene atfedilen enfeksiyon hastalıkları arasında önde gelen ölüm nedeni olmaya devam etmekte, hem insan sağlığı hem de küresel halk sağlığı güvenliği için kalıcı ve ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. Dünya Sağlık Örgütü'nün (WHO) 2025 Küresel Tüberküloz Raporu'na göre, 2024 yılında dünya genelinde tahminen 10,7 milyon yeni TB vakası ve yaklaşık 1,23 milyon TB ile ilişkili ölüm gerçekleşmiştir1. Bunlar arasında, yaklaşık 390.000 yeni çok ilaç dirençli/rifampisin dirençli tüberküloz (MDR/RR-TB) vakası bildirilmiş olup, etkilenen bireylerin yalnızca %42'si tedaviye dahil edilmiştir. İlaç dirençli TB'nin devam eden yayılımı, WHO'nun küresel End TB Stratejisinin uygulanmasının önündeki temel bir engel olarak ortaya çıkmıştır.

Günümüzde kemoterapi, TB'nin klinik tedavisinin temel taşı olmaya devam etmektedir. Standart birinci basamak rejimi; izoniazid, rifampisin, pirazinamid ve etambutol kombinasyonundan oluşur ve 6 ila 9 aylık uzun bir tedavi süresi gerektirir2. MDR/RR-TB için rejim, ikinci basamak anti-TB ilaçlarının dahil edilmesini gerektirerek tedavi sürecini 18–24 aya kadar uzatır3; bu durum, maliyetlerin önemli ölçüde artması ve advers ilaç reaksiyonlarında belirgin bir yükselişle birlikte seyreder4. Bedaquiline, delamanid ve pretomanid gibi yeni anti-TB ajanları son yıllarda onaylanmış ve ilaç dirençli TB için yeni terapötik seçenekler sunmuş olsa da5, mevcut anti-TB tedavisinin doğasında bulunan temel darboğazların henüz üstesinden gelinememiştir6,7.

İlk olarak, M. tuberculosis öncelikle konak alveoler makrofajların içinde yaşayan tipik bir hücre içi patojendir. Serbest ilaçlar, makrofaj membranından düşük penetrasyon gösterir ve bu durum, hücre içi ilaç konsantrasyonlarının minimum inhibitör konsantrasyonun (MIC) çok altında kalmasına neden olur8. Bunun sonucunda hücre içi persisterların elimine edilememesi, TB nükslerinin ve ilaç direncinin ortaya çıkmasının temel itici gücü olarak hizmet eder9. İkinci olarak, TB lezyonları, kazeöz nekrotik doku ve fibrotik kapsüller dahil olmak üzere, serbest ilaçların lezyon merkezine penetrasyonunu engelleyen birden fazla biyolojik bariyer sunar; bu da suboptimal lokal ilaç konsantrasyonlarına ve bozulmuş bakterisidal etkinliğe yol açar10,11. Üçüncü olarak, yüksek dozlarda uzun süreli sistemik uygulama; rifampisin kaynaklı hepatotoksisite, aminoglikozid ile ilişkili ototoksisite ve nefrotoksisite ile florokinolon ilişkili tendinopati ve kardiyotoksisite gibi şiddetli advers reaksiyonlara yatkındır ve bunlar tedavi kesintilerinin ve düşük hasta uyumunun temel nedenleridir12,13. Dördüncü olarak, monoterapi veya ardışık uygulama, M. tuberculosis'te ilaç dirençli mutasyonların seçilmesine kolayca yol açarken, çoklu ilaç kombinasyon rejimleri kümülatif toksisite riskini daha da artırarak kalıcı bir klinik ikilem yaratır14.

Nanotıp taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesi, anti-TB tedavisindeki yukarıda belirtilen darboğazları gidermek için gelecek vadeden bir strateji sunmaktadır. Bunlar arasında, fosfolipid çift katmanlarından kendi kendine monte olan nano ölçekli, kapalı veziküler taşıyıcılar olan lipozomlar; mükemmel biyouyumlu, biyobozunur, hedeflenmiş taşıma kapasitesine sahip ve kontrollü sürdürülebilir salım özellikleri sayesinde anti-infektif tedavi için klinik olarak en fazla uygulama potansiyeline sahip nanotaşıyıcı platformlardan biri olarak ortaya çıkmıştır15,16. Serbest anti-TB ilaçlarla karşılaştırıldığında, lipozomal taşıyıcı sistemler TB tedavisi için birçok yeri doldurulamaz avantaja sahiptir.

İlk olarak, makrofajlarda hedeflenmiş zenginleştirmeyi mümkün kılarlar. Lipozomlar, retikuloendotelyal sistemin (RES) fagositleri tarafından tercih edilen şekilde alınır ve bu durum akciğerler, karaciğer ve dalak gibi MTB barındıran ana organlarda spesifik birikime yol açar. Ayrıca, makrofaj membranını etkili bir şekilde geçerler17; bu da hücre içi ilaç konsantrasyonlarını önemli ölçüde artırarak kalıcı hücre içi bakterileri yok eder ve böylece TB nüksünü ve ilaç direncini temelden azaltır. İkinci olarak, TB lezyonlarına gelişmiş penetrasyon sergilerler. Parçacık boyutu, yüzey yükü ve yüzey modifikasyonları düzenlenerek, lipozomlar TB lezyonlarının fibrotik kapsülünü ve kazeöz nekrotik bariyerini etkili bir şekilde aşabilir, yerel ilaç konsantrasyonlarını önemli ölçüde artırarak bakterisidal etkinliği iyileştirebilirler18. Üçüncü olarak, ilaç toksisitesini belirgin şekilde azaltırlar. Lipozomlar, ilaçların in vivo biyodağılımını değiştirerek sağlıklı doku ve organlara maruz kalımı sınırlar ve böylece anti-TB ajanların sistemik toksisitesini önemli ölçüde düşürürler. Örneğin, aminoglikozid yüklü lipozomlar, kokleada ve böbreklerde ilaç birikimini büyük ölçüde azaltarak ototoksisite ve nefrotoksisite risklerini neredeyse tamamen ortadan kaldırır19. Dördüncü olarak, uzun etkili sürdürülebilir salım sağlarlar. Fosfolipid çift katmanlı yapı, kontrollü ve yavaş ilaç salımına olanak tanıyarak in vivo dolaşım yarı ömrünü ve etki süresini uzatır, dozlama sıklığını azaltır ve hasta uyumunu önemli ölçüde iyileştirir20. Beşinci olarak, birden fazla ilacın birlikte iletilmesine olanak tanırlar. Lipozomlar, farklı fizikokimyasal özelliklere sahip birden fazla anti-TB ilacını aynı anda enkapsüle ederek senkronize iletim ve sinerjik bakterisidal etkiler sağlayabilir, böylece ilaç dirençli MTB mutantlarının ortaya çıkmasını etkili bir şekilde baskılayabilirler21.

Anti-TB tedavisi için lipozomal ilaç taşıyıcı sistemlerin klinik translasyonunda önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Amikasin lipozom inhalasyon süspansiyonu (ALIS), Mycobacterium avium kompleks (MAC) akciğer hastalığının tedavisi için ABD Gıda ve İlaç İdaresinden (FDA) onay almış22 ve o zamandan beri birçok ülkede çok ilaç dirençli tüberküloz (MDR-TB) tedavi rejimlerine dahil edilmiştir; bu durum, TB yönetiminde lipozomal platformların klinik değerini ve geniş uygulama perspektiflerini vurgulamaktadır23. Buna rağmen, anti-TB lipozomların geliştirilmesi ve endüstriyelleştirilmesi; preparasyon süreçlerinin düşük tekrarlanabilirliği, düşük ilaç yükleme kapasitesi ve enkapsülasyon verimliliği, homojen olmayan partikül boyutu dağılımı, depolama sırasında agregasyon ve ilaç sızıntısı ile in vitro çözünme/salınım davranışı ile in vivo etkinlik arasındaki korelasyonun yetersiz anlaşılması gibi birkaç kritik teknik darboğazla karşılaşmaya devam etmektedir. Bu zorluklar, yeni anti-TB lipozomal formülasyonların araştırma-geliştirme sürecini ve klinik translasyonunu ciddi şekilde engellemektedir24,25.

Bu çalışma, hidrofobik veya zayıf lipofilik küçük moleküllü ilaçların (örneğin rifampisin) fosfolipid çift tabakası içine enkapsülasyonu için uygun olan bir ince film hidrasyonu–ultrasonikasyon–filtrasyon yöntemi belirlemektedir. Yüksek derecede hidrofilik ilaçlar için, ek optimizasyonlar (örneğin amonyum sülfat gradyan yüklemesi) uygulanmadıkça geleneksel ince film yöntemi düşük enkapsülasyon verimliliği sağlar. Prosedür; standart ekipmanlar (döner evaporatör, ultrasonik temizleyici, HPLC, DLS, TEM) kullanmakta ve özel cihazlar gerektirmeden kolay tekrarlanabilirlik sağlamaktadır. Mevcut 10 mL laboratuvar ölçekli kurulum, stabil kalite ve iyi parti tutarlılığı sunmaktadır. Endüstriyel ölçeğe taşıma; evaporasyon vakumunun, rotasyon hızının, ultrasonik gücün ve membran spesifikasyonlarının optimizasyonunu gerektirecektir. Özellikle lipozomlar, 4 °C'de 30 gün boyunca stabil kalmakta ancak 60 gün sonra oksidasyon, agregasyon ve katmanlaşma göstermekte olup, uzun süreli koruma için dondurarak kurutma veya formülasyon modifikasyonu gerektirmektedir. Fosfolipid-kolesterol oranını sistematik olarak optimize ettik, hazırlama iş akışını standartlaştırdık ve enkapsülasyon verimliliği, ilaç yüklemesi, partikül boyutu, zeta potansiyeli, morfoloji, in vitro salınım ve depolama stabilitesini kapsayan kapsamlı bir kalite değerlendirme sistemi kurduk. Bu protokol, araştırmacıların yöntemin hidrofobik ilaç iletimi için uygunluğunu değerlendirmeleri için açık bir kılavuz sağlamakta; formülasyon adaptasyonu, deneysel tasarım ve ön ölçek büyütme araştırmaları için bir referans görevi görmektedir.

Protokol

Bu çalışma insan katılımcılar veya hayvanlar içermemektedir ve etik onay gerekmemiştir.

1. Rifampisin yüklü nanolipozomların hazırlanması

NOT: Tüm formülasyonları üç paralel olarak hazırlayın.

  1. Lipozom bileşenlerini on binde bir hassasiyetli analitik terazi kullanarak tartın. Fosfolipid ile kolesterolün kütle oranları sırasıyla 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25 ve 70:30 olarak ayarlanmıştır (Tablo 1).
  2. Üç bileşeni döner evaporasyona uygun 100 mL'lik balon flaska yerleştirin. Tüm lipid bileşenlerini 6 mL kloroform içinde çözün. Karışımı, berrak bir çözelti elde edilene kadar bir su banyosunda (40 kHz, 100 W) 1 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.
    ​UYARI: Kloroform, solunması veya cilt yoluyla emilmesi durumunda zararlı olan uçucu bir organik çözücüdür. Kloroform içeren tüm adımları (1.3–1.5) sertifikalı bir kimyasal çeker ocak içinde gerçekleştirin. Nitril eldiven, laboratuvar önlüğü ve kimyasal koruyucu gözlük kullanın.
  3. Aşağıdaki parametreleri kullanarak döner evaporatör ile kloroformu uzaklaştırın:
    1. Kondanser sıcaklığını -5 °C'den daha yüksek olmayacak şekilde ayarlayın.
    2. Su banyosu sıcaklığını 37 °C olarak ayarlayın.
    3. Dönüş hızını 60 rpm olarak ayarlayın.
    4. Kloroformun kaynama noktasını düşürmek için vakumu 330 mbar'a ayarlayın.
      UYARI: Döner evaporatör bir çeker ocak içinde çalıştırılmalıdır. Çözücü buharının vakum pompasına girmesini önlemek için soğuk tuzağın düzgün şekilde bağlandığından emin olun.
  4. 330 mbar'da 20 dakika çalıştırın, ardından vakumu 80 mbar'a yükseltin ve kalıntı çözücüyü tamamen uzaklaştırıp ince bir lipid film tabakası oluşturmak için 10 dakika daha devam edin26.
    NOT: Kondanserde yoğuşan evaporate olmuş çözücüyü organik halojen içeren atık olarak toplayın. Tüm kloroform atıklarını uygun şekilde etiketlenmiş halojenli organik çözücü konteynerine atın. Lavaboya dökmeyin.
  5. Lipid filmini vakum altında (≤ 80 mbar), 25 °C'de 12 saat boyunca kurutun.
    NOT: Kurutma adımı, herhangi bir kalıntı çözücünün salınmasını önlemek için çeker ocak içindeki bir vakumlu desikatörde gerçekleştirilir.
  6. Kurutulmuş filmi 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) tamponu ile hidrate edin. Flaskı, lipid filmi tamamen ayrılana kadar döner evaporatöre (vakumsuz olarak) 100 rpm ve 37 °C'de 1 saat boyunca yerleştirin. Rifampisin'in nihai konsantrasyonu 1 mg/mL'dir.
  7. 37 °C'de bir su banyosunda (40 kHz, 100 W) 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Su banyosu sıcaklığının 37 °C'de kaldığından emin olun. İşlem gören numunenin toplam hacmi 10 mL'dir.
  8. Sonikasyona tabi tutulmuş süspansiyonu ardışık olarak filtreleyin. 0,45 µm'lik bir PES şırınga filtresini (13 mm çapında) 1 mL PBS ile önceden ıslatın. 10 mL'lik bir şırınga kullanarak, 10 mL numunenin tamamını 0,45 µm'lik filtreden bir kez geçirin. Ardından, 0,22 µm'lik bir PES şırınga filtresini (13 mm çapında) önceden ıslatın ve filtresini bir kez buradan geçirin. Lipozom ekstrüderi kullanmayın (Şekil 1).

2. Kapsülleme verimliliği

NOT: Kapsülleme verimliliği (EE), serbest ilacı liposom içine hapsolmuş ilaçtan fiziksel tutulma yoluyla hızla ayıran ultrafiltrasyon santrifüjasyonu ile belirlenmiştir. Ardından, her iki fraksiyondaki ilaç içeriği ölçülür ve kapsülleme verimliliği hesaplanır27.

  1. 0,5 mL'lik bir ultrafiltrasyon tüpünün (3 kDa MWCO) örnek haznesine tam olarak 200 µL lipozom süspansiyonu ekleyin, ardından serbest ilacı lipozomlardan ayırmak için santrifüjleyin.
  2. 25 °C'de, 7.000 x g (sabit açılı rotor) hızında 15 dk boyunca santrifüjleyin. Filtratı toplama tüpüne alın, bu işlemi 4–5 döngü boyunca tekrarlayın.
  3. Tüm filtratı birleştirin ve bir balon joje içerisinde Metanol ile 10 mL'ye seyreltin. HPLC enjeksiyonundan önce 0,22 µm Nylon66 şırınga filtresinden süzün.
  4. HPLC koşullarını şu şekilde ayarlayın: Kolon: C18 kolonu (4,6 mm x 250 mm, 5 µm); Mobil faz: asetonitril: sulu fosforik asit = 45: 55 (V/V); Deteksiyon dalga boyu: 475 nm; Akış hızı: 1,0 mL/dk; Kolon sıcaklığı: 40 °C; Enjeksiyon hacmi: 20 µL; Çalışma süresi: 20 dk
    DİKKAT: Asetonitril yanıcı ve toksiktir. Mobil fazı çeker ocak altında hazırlayın ve taşıyın. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) kullanın.
  5. Enkapsülasyon verimliliğini (EE) şu denklemle hesaplayın: Enkapsülasyon Verimliliği (EE, %) = [(Wrfb − Wfree) / Wrfb] × 100%
  6. İlaç yüklemesini (DL) şu denklemle hesaplayın: İlaç Yüklemesi (DL, %) = [(Wrfb − Wfree) / Wtotal] × 100%.
    NOT: Wtotal—Eklenen toplam fosfolipid, kolesterol ve rifampisin içeriği; Wrfb—Eklenen rifampisin içeriği; Wfree—Lipozomlardaki serbest ilaç miktarı.

3. HPLC yöntem validasyonu

NOT: Lineerlik, kesinlik, tekrarlanabilirlik, stabilite, geri kazanım ve özgünlük için HPLC yöntem validasyonunu aşağıdaki şekilde gerçekleştirin.

  1. Mobil faz içerisinde şu konsantrasyonlarda rifampisin standart çözeltileri hazırlayın: 1.15, 2.3, 4.6, 9.2, 13.8, 18.4 ve 23.0 µg/mL. Her birini HPLC ile analiz edin, pik alanlarını kaydedin, regresyon denklemini ve R2 değerini hesaplayın.
  2. 9.2, 13.8 ve 18.4 µg/mL rifampisin çözeltilerinin pik alanlarını ölçün. Bir gün içinde beş paralel test gerçekleştirin ve RSD değerini hesaplayın.
  3. Dört paralel 9.2 µg/mL rifampisin çözeltisi hazırlayın. Pik alanlarını HPLC ile ölçün ve yöntemin tekrarlanabilirlik RSD değerini hesaplayın.
  4. 9.2 µg/mL standart çözeltiyi oda sıcaklığında tutun. Çözeltiyi 0, 2, 4, 6, 12 ve 24. saatlerde analiz edin, pik alanlarını kaydedin ve stabilite için RSD değerini hesaplayın.
  5. Boş lipozom matrislerine bilinen miktarlarda rifampisin standardı ekleyin. Numuneleri ultrafiltrasyon ile işleyin, HPLC ile analiz edin ve ardından geri kazanım ile RSD değerlerini hesaplayın.
  6. Kromatogramları, rifampisinin alıkonma süresinde girişim pikleri açısından inceleyin.

4. Parçacık boyutu ve zeta potansiyeli

  1. 980 µL ultrapure suyun (0,22 µm filtreden önceden geçirilmiş) içerisine 20 µL lipozom süspansiyonu pipetleyin. 10 s boyunca vorteksleyin, ardından bir su banyosunda 30 s boyunca sonikasyona tabi tutun.
  2. Seyreltilmiş numuneyi boyut ölçümü için evrensel bir küvete, zeta potansiyeli ölçümü için ise katlanmış bir kapiler hücreye aktarın.
  3. Parametreleri şu şekilde ayarlayın: dispersan = su, sıcaklık = 25 °C.
  4. Her biri 10–15 ölçümden oluşan en az 3 teknik tekrar gerçekleştirin. Z-ortalama (şiddete göre ağırlıklandırılmış ortalama hidrodinamik çap) ve polidispersite indeksini (PDI) kaydedin.
  5. Aynı parametreler altında zeta potansiyelini ölçmek için küvete bir paladyum elektrot yerleştirin28.
  6. Küveti çıkarın ve cihazı kapatın.

5. Morfolojik karakterizasyon (TEM)

  1. TEM gözlemi için uygun konsantrasyonu elde etmek amacıyla, rifampisin yüklü lipozom süspansiyonunu ultrapure su ile 50–100 kat seyreltin.
  2. Seyreltilmiş örneği, bir banyo sonikatörü (40 kHz, 100 W) kullanarak su banyosunda 30 s boyunca sonike edin.
    DİKKAT: Lipozomların parçalanmasını önlemek için aşırı sonikasyondan kaçının.
  3. 300-mesh karbon kaplı bakır ızgarayı, karbon yüzeyi yukarı bakacak şekilde filtre kağıdına yerleştirin.
  4. Seyreltilmiş lipozom süspansiyonundan 10 µL miktarını ızgaranın merkezine pipetleyin. 1 dk boyunca adsorbe olmasını bekleyin.
  5. Fazla süspansiyonu, temiz bir filtre kağıdı kullanarak ızgaranın kenarından emdirin; merkezi gözlem alanına dokunmayın.
  6. Negatif boyama: Izgara üzerine hemen 10 µL %2 (w/v) fosfotungstik asit (pH 7.0) ekleyin. 1 dk sonra, fazla boyayı kenardan emdirerek temizleyin.
  7. Izgarayı oda sıcaklığında 3 saat boyunca havada kurutun. Kuruyan ızgarayı TEM örnek tutucuya yerleştirin.
  8. 80–120 kV hızlandırma voltajında gözlem yapın. Düşük doz görüntüleme modu29 kullanın ve bir CCD kamera (örneğin, Gatan OneView) ile 10,000x, 25,000x ve 40,000x nominal büyütmelerde görüntüler alın.
  9. Temsili alanları seçin ve agregasyonun veya boyama artefaktlarının olduğu bölgelerden kaçının.

6. In vitro ilaç salınımı

  1. Uygun uzunluklarda diyaliz membranı (MWCO 7 kDa) kesin. pH değeri 8.0'a ayarlanmış, %2 (a/h) sodyum bikarbonat ve 1 mmol/L EDTA içeren yüksek hacimli bir çözelti hazırlayın.
  2. Diyaliz membranını bu çözelti içerisinde 10 dk boyunca kaynatın. Membranı distile su ile iyice yıkayın.
  3. Yıkanmış membranı salım ortamında (0.01 M PBS) 30 dk boyunca dengeleyin. 1 mL lipozom süspansiyonunu ön işlem görmüş diyaliz torbasına aktarın; her iki ucu diyaliz klipsleri ile kapatın.
  4. Diyaliz torbasını, %0.1 askorbik asit (a/h) ve 0.1 mL Tween 80 ile desteklenmiş, 37 °C'ye önceden ısıtılmış 80 mL salım ortamı içeren 100 mL'lik bir behere yerleştirin. Beheri ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kapatın.
  5. Manyetik karıştırıcı kullanarak 37 °C'de ve 200 rpm hızda, karanlıkta karıştırın. Belirlenen zaman noktalarında (0.5, 1.5, 3, 5, 7, 9, 12, 24 ve 48 sa) 1 mL salım ortamı örneği alın.
  6. Bir pipet yardımıyla, akışı nazikçe beher duvarına yönlendirerek behere 1 mL taze, önceden ısıtılmış salım ortamı (37 °C) ekleyin30 (Sistem kapalıdır; bu nedenle buharlaşma için düzeltme yapılmasına gerek yoktur).
  7. Örnekleri 0.22 µm'lik bir filtreden süzün ve HPLC ile analiz edin. Örneklerin analizini Bölüm 2.4'te açıklanan HPLC koşullarının aynısını kullanarak gerçekleştirin.
  8. Kümülatif Salım (%) = (Her zaman noktasında tespit edilen toplam ilaç / Başlangıç ilaç yüklemesi) × 100% şeklinde hesaplayın.

7. Depolama stabilitesinin değerlendirilmesi

  1. Hazırlanan rifampisin yüklü lipozom süspansiyonunu kapalı bir cam flakon içinde 4 °C'de saklayın ve ışıktan koruyun.
  2. Saklama sonrası 1., 4. ve 30. günlerde numuneler toplayın. Alınan numuneyi imha edin (orijinal flakona geri koymayın).
  3. Her zaman noktasında lipozomların partikül boyutunu, polidispersite indeksini ve zeta potansiyelini belirleyin31.
  4. Görsel görünümü kaydedin ve lipozom süspansiyonunda herhangi bir çökelme veya katmanlaşma olup olmadığını gözlemleyin.
  5. Süspansiyon oksidasyonunu, çökelmesini ve katmanlaşmasını görsel olarak gözlemlemek için 60. günde ek numuneler toplayın.
    NOT: Tüm ölçümler üç paralel deneyde gerçekleştirilmiştir. Deneysel veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilmiştir.

Sonuçlar

Rifampisin miktar tayini için valide edilmiş bir HPLC yöntemi geliştirilmiştir. Rifampisin standart çözeltilerine ait temsilci kromatogramlar Şekil 2A'da gösterilmiştir. Rifampisinin ana piki, iyi bir pik şekliyle ve diğer piklerden önemli bir girişim olmaksızın 14,13 dk tutunma süresinde görülmüştür. Kalibrasyon eğrisi, Y = 12729.5X-4778.6 regresyon denklemi ve R2=0,9995 belirleme katsayısı ile 1,15–23 µg/mL konsantrasyon aralığında iyi bir doğrusallık sergilemiştir. Farmasötik laboratuvarlardaki kantitatif analizler için genellikle R2 ≥ 0,999 değeri kabul edilebilir olarak görülmektedir; dolayısıyla elde edilen 0,9995 değeri, yöntemin test edilen aralık boyunca oldukça doğrusal olduğunu kanıtlamaktadır. Siyah kareler ölçülen veri noktalarını, düz çizgi ise uydurulmuş doğrusal regresyonu temsil etmektedir (Şekil 2B).

Hassasiyet testleri üç farklı rifampisin konsantrasyonunda (9.2, 13.8 ve 18.4 µg/mL) gerçekleştirilmiştir. Pik alanlarının bağıl standart sapma (RSD) değerlerinin tamamı %1'in altında çıkmış ve yüksek cihaz hassasiyeti onaylanmıştır (Tablo 2). Tekrarlanabilirlik testi (n = 4), %0.32'lik bir RSD değeri vererek güvenilir bir tekrarlanabilirliğe işaret etmiştir (Tablo 3). Oda sıcaklığında 24 saat boyunca yürütülen stabilite testi %0.59'luk bir RSD göstermiş ve rifampisin solüsyonunun bu koşullar altında stabil kaldığını kanıtlamıştır (Tablo 4). Ortalama geri kazanım oranı %98.12 olarak belirlenmiş ve lipozom örneklerindeki rifampisin analizine yönelik yöntemin doğruluğu onaylanmıştır. Bu sonuçlar toplu olarak, HPLC yönteminin bu çalışmadaki rifampisin miktar tayini için uygun olduğunu doğrulamıştır. Bu titiz validasyon; enkapsülasyon verimliliği, ilaç yüklemesi ve salım profillerine ilişkin sonraki ölçümlerin farklı deneysel partiler arasında güvenilir ve tekrarlanabilir olmasını sağlamaktadır.

Serbest ilaç ve lipozom içine hapsedilmiş ilaç, ultrafiltrasyon santrifüjasyonu ile birbirinden ayrıldı. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kantitatif analizi, kolesterol içeriği %20 olduğunda, rifampisin yüklü lipozomların enkapsülasyon verimliliğinin maksimum %68,54'e ulaştığını göstermiştir. ± 2,19 ve ilaç yükleme oranı 11,42 idi ± 0.37 (Şekil 3). Kolesterol miktarı fazla olduğunda, lipozomların kapsülleme verimliliği ve ilaç yükleme oranı önemli ölçüde azalır (Tablo 5). Bu sonuçlar, membran rijitliği ve akışkanlığını dengelemek ve rifampisini çift katman içinde tutmak için %20'lik bir kolesterol-fosfolipid oranının optimal olduğunu göstermektedir. Küçük standart sapmalar (tüm <EE için %2,2 ve <(üç tekrarlı hazırlıklar için DL'de %0,4), hazırlama protokolünün, iyi parti sonrası tekrarlanabilirliğe sahip tutarlı bir formülasyon kalitesi sağladığını doğrulamaktadır.

Optimize edilmiş yöntem kullanılarak hazırlanan lipozomlar, dar bir boyut dağılımı sergilemiştir (Şekil 4), ortalama 185 nm boyuta sahip. Bir PDI değeri <0,3 değeri, monodispers bir popülasyonun göstergesi olarak yaygın kabul görmektedir; bu nedenle elde edilen 0,153'lük PDI, lipozomların boyut bakımından oldukça homojen olduğunu doğrulamaktadır. Mutlak bir zeta potansiyeli >30 mV, agregasyonu önlemek için genellikle yeterli elektrostatik itme sağlar. Ölçülen −38 mV, böylece iyi kolloidal stabilite öngörür32Üç tekrarlı örnekler arasındaki düşük standart sapmalar (örneğin, boyut 185,41 ± 0.72 (nm, %20 kolesterolde) hazırlama prosedürünün yüksek tekrarlanabilirliğini daha da kanıtlamaktadır. Bu sonuçlar, ince film hidratasyon-ultrasonikasyon-filtrasyon protokolünün, dar bir boyut dağılımına ve yeterli yüzey yüküne sahip nano ölçekli lipozomları güvenilir bir şekilde ürettiğini ve böylece uzun süreli stabilite sağladığını göstermektedir.

Hazırlanan lipozomlar belirgin bir Tyndall etkisi göstermiştir. Şekil 5A, lipozomların Tyndall etkisini göstermektedir33. Rifampisin yüklü nanolipozomların morfolojik özellikleri TEM ve dinamik ışık saçılması (DLS) ile değerlendirilmiştir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, lipozomların DLS yoğunluk ağırlıklı boyut dağılım eğrileri, görünür büyük parçacıklar veya agregatlar olmaksızın tek ve dar bir pik sergilemiş olup, bu durum hazırlanan formülasyonun iyi bir homojenliğe ve monodisperiteye sahip olduğunu göstermektedir (Şekil 5B). Düşük büyütmede küresel lipozomal veziküller gözlemlenmiş; ancak, örnek hazırlama sırasındaki yetersiz dağılmaya ve kurutma sırasında olası vezikül füzyonuna bağlanabilecek bazı yerel agregasyonlar kaydedilmiştir (Şekil 5C). Yüksek büyütmede (50,000×, Şekil 5D), belirgin kontrast farkları görülmüştür: koyu renkli merkez bölge ilaç içeren sulu çekirdeğe karşılık gelirken, daha açık renkli dış halka, negatif boyalı lipozomların tipik bir özelliği olan lipid çift tabakasını temsil etmektedir34.

TEM ile gözlemlenen partikül boyutu, DLS ile belirlenen hidrodinamik çapla karşılaştırıldığında daha küçüktü. Bu farklılık, iki tekniğin farklı prensiplerinden kaynaklanmaktadır: TEM vakum altında dehidrate olmuş çekirdek çapını ölçerken; DLS, lipozomal nanopartiküllerin bilinen bir özelliği olan yüzey hidrasyon tabakasını da içeren hidrate çapı tespit eder35.

İlk üç lipozom grubunda belirgin bir ani salım (burst release) gözlenmemiştir (0,5. saatteki kümülatif salım oranı <tüm gruplarda %40). Ani salınım <Uzun etkili antitüberküloz preparatlar için ilk saat içinde %40'lık salımın, akut sistemik toksisite riskini minimize ettiği için genellikle güvenli olduğu kabul edilir. Spesifik salınım aşamaları şu şekilde bölünebilir:

Hızlı salınım dönemi (0,5–12 sa): İlaç, lipozomların yüzey tabakasından veya membran yakınındaki bölgeden yavaşça difüze olmuş ve salınım hızı nispeten hızlı seyretmiştir. İlk üç grubun kümülatif salınım oranı 12. saatte %90'a yaklaşmıştır (Şekil 6).

24 saat sonra, rifampisinin oksidatif ve hidrolitik bozunmaya uğradığı ve bunun da kümülatif salım hızında anormal bir azalmaya yol açtığı öngörülmüştür.36Kolesterol içeriği %30 olduğunda, 0,5. saatteki kümülatif salınım hızı >kontrollü salım standardını karşılamayan %40.

Bu nedenle, %5–15 kolesterol içeren formülasyonlar kabul edilebilir düzeydedir ve %20 oranı da ani salınım (burst-release) kriterini karşılamaktadır. Gruplar arası düşük değişkenlik (Şekil 6), salınım test yönteminin tekrarlanabilirliğini doğrulamaktadır.

İlk üç grup için salınım verileri, yaygın kinetik modellere (sıfırıncı derece, birinci derece, Higuchi ve Ritger-Peppas) uyduruldu (Şekil 7). Sonuçlar, birinci derece kinetik modelin en yüksek uyum iyiliğine (R2= 0.987) ulaştığını ve bunun sıfırıncı derece (R2= 0.246), Higuchi (R2= 0.544) ve Ritger-Peppas (R2 = 0.926) modellerinden anlamlı derecede daha üstün olduğunu gösterdi. Bu durum, lipozomların ilaç salınım davranışının birinci derece kinetiği izlediğini göstermektedir. Salınım hızı, lipozomlardaki kalıntı ilaç konsantrasyonu ile pozitif korelasyon göstermekte olup, tipik bir "başlangıçta hızlı salınım - ardından sürdürülebilir salınım" karakteristiği sergilemekte ve kolesterolün membran yapısını düzenleyerek difüzyon hızını etkileme mekanizmasını daha da doğrulamaktadır37.

Rifampisin yüklü lipozomlar, 4 °C'de 30 günlük saklama süresi boyunca iyi bir kısa vadeli stabilite göstermiştir. 1, 4 ve 30 günlük değerlendirme süresi boyunca partikül boyutu hafifçe artarken, mükemmel boyut homojenliği (PDI < 0.15) ve uygun kolloidal stabilite (mutlak zeta potansiyeli > 24 mV) korunmuştur (Tablo 6). 60. günde belirgin oksidasyon ve floküller gözlemlenmiş, bu da formülasyonun uzun vadeli stabilitesinin zayıf olduğunu göstermiştir. Bu sonuç, uzun süreli koruma için dondurarak kurutmanın veya formülasyon modifikasyonunun (örneğin, antioksidanların veya liyoprotektanların eklenmesi) gerekliliğini vurgulamaktadır; bu durum, bu protokolü kullanan araştırmacılar için önemli bir pratik çıkarımdır.

figure-results-1
Şekil 1. İnce film hidratasyonu ile rifampisin yüklü lipozomların hazırlanması. Rifampisin yüklü lipozomların hazırlanmasını gösteren şematik iş akışı. Lipid bileşenler organik bir çözücüde çözülmüş, ardından son lipozomal formülasyonu üretmek için döner buharlaştırma ile ince film oluşturma, vakumlu kurutma, hidratasyon ve sonikasyon işlemleri uygulanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2. Rifampisinin HPLC ile tanımlanması ve kalibrasyonu. (A) Kantitatif analiz için kullanılan karakteristik tutunma pikini gösteren rifampisine ait temsili HPLC kromatogramı. (B) Pik alanının rifampisin konsantrasyonuna (1.15–23.0 µg/mL) karşı çizilmesiyle oluşturulan kalibrasyon eğrisi. Regresyon denklemi ve korelasyon katsayısı (R2 = 0.9995), test edilen konsantrasyon aralığında mükemmel bir doğrusalite sergilemektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3. Rifampisin yüklü lipozomların enkapsülasyon verimliliği ve ilaç yüklemesi. Farklı kolesterol içerikleriyle hazırlanan lipozomların enkapsülasyon verimliliği (EE) ve ilaç yüklemesi (DL). En yüksek EE (%68,5) ve DL (%11,4) değerleri %20 kolesterol ile gözlemlenmiş olup, bu durum kolesterol içeriğinin ilaç enkapsülasyonu ve yüklemesini önemli ölçüde etkilediğini göstermektedir. Hata çubukları ortalama × SD (n = 3) değerlerini temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4. Rifampisin yüklü lipozomların partikül boyut dağılımı. Farklı fosfolipid-kolesterol oranları ile hazırlanan rifampisin yüklü lipozomların partikül boyut dağılım profilleri. Optimize edilmiş formülasyon, dar bir boyut dağılımı ve iyi bir homojenlik gösteren 185 nm Z-ortalama çap ve 0,153 polidispersite indeksi (PDI) sergilemiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5. Rifampisin yüklü lipozomların fizikokimyasal karakterizasyonu. (A) Rifampisin yüklü lipozom süspansiyonunda gözlenen Tyndall etkisi, nanoboyutlu partiküllerin varlığını göstermektedir. (B) Optimize edilmiş lipozom formülasyonunun üç paralel tekrarından elde edilen partikül boyutu dağılım eğrileri. (C) Çok sayıda küresel lipozomal vezikülü gösteren transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) görüntüsü. (D) Tek bir lipozomal vezikülün temsilci yüksek büyütmeli TEM görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6Rifampisinin lipozomlardan in vitro salınım profilleri. Farklı fosfolipid-kolesterol oranlarıyla hazırlanan lipozomlardan rifampisinin çalışma süresi boyunca kümülatif salınım profilleri. Salınım davranışı kolesterol içeriğine göre farklılık göstermiş ve kolesterolün ilaç salınım özellikleri üzerindeki etkisi ortaya konmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7. Lipozomlardan rifampisin salınımının kinetik modellemesi. Optimize edilmiş formülasyon ( %20 kolesterol) için salınım verilerinin (A) sıfırıncı derece, (B) birinci derece, (C) Higuchi ve (D) Ritger-Peppas kinetik modellerine uydurulması. Birinci derece modelin en yüksek uyum iyiliği değerine (R2 = 0.987) sahip olduğu görülmüş ve bu durum deneysel salınım verileriyle en iyi uyumu gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Lipozom bileşenleriLesitinKolesterolRifampisin
5%47,5 mg2,5 mg10 mg
10%45 mg5 mg10 mg
15%42,5 mg7,5 mg10 mg
20%40 mg10 mg10 mg
25%37,5 mg12,5 mg10 mg
30%35 mg15 mg10 mg
Final hacim10 mL

Tablo 1: Rifampisin yüklü lipozom formülasyonlarının bileşimi. Final hacim 10 mL olarak sabit tutulurken, farklı fosfolipid-kolesterol oranlarına sahip lipozomlar hazırlamak için lecturesin, kolesterol ve rifampisin kullanılmıştır.

Konsantrasyon (µg/mL)X±SRSD(%)
9.2114012.75 ± 502.420.44
13.8171412.50 ± 493.900.29
18.4232334.00 ± 1358.420.59

Tablo 2: Farklı rifampisin konsantrasyonlarında HPLC kantifikasyon hassasiyeti. 9.2, 13.8 ve 18.4 µg/mL konsantrasyonlardaki rifampisin standart çözeltileri için pik alanı ölçümleri elde edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur ve bağıl standart sapma (RSD) değerleri yüksek analitik hassasiyet göstermektedir.

HAYIR.1234RSD (%)
Pik alanı1145031141251139691145390.32

Tablo 3: HPLC yönteminin cihaz hassasiyeti. Aynı rifampisin standart çözeltisinin ardışık dört enjeksiyonuna dayanan hassasiyet değerlendirmesi. Cihaz tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için pik alanı değerleri ve göreceli standart sapma (RSD) rapor edilmiştir.

Zaman (h)024681224RSD (%)
Pik alanı1145031143251145161139781138941136381125760.59%

Tablo 4: Rifampisin standart çözeltisinin stabilitesi. Oda sıcaklığında saklanan ve 0, 2, 4, 6, 8, 12 ve 24. saatlerde analiz edilen 9,2 µg/mL rifampisin standart çözeltisinin stabilite değerlendirmesi. Test süresi boyunca çözelti stabilitesini değerlendirmek için pik alanı değerleri ve göreceli standart sapma (RSD) bildirilmiştir.

KolesterolBoyut(nm)PDIZeta potansiyeli (mV)EE (%)DL (%)
5%206.27±1.140.240±0.004-42.72±0.2664.09±1.3010.68±0.22
10%183.87±2.540.149±0.004-24.80±1.0464.70±0.3010.78±0.05
15%202.06±3.160.131±0.007-27.90±1.0465.11±1.6210.85±0.27
20%185.41±0.720.164±0.044-37.74±1.4468.54±2.1911.42±0.37
25%181.58±1.310.100±0.008-19.96±0.1649.38±2.528.23±0.42
30%178.78±0.820.074±0.014-40.25±0.3348.24±2.068.04±0.34 

Tablo 5: Rifampisin yüklü lipozomların fizikokimyasal özellikleri. Farklı kolesterol içerikleriyle hazırlanan lipozomların partikül boyutu, polidispersite indeksi (PDI), zeta potansiyeli, enkapsülasyon verimliliği (EE) ve ilaç yükleme (DL) miktarları. Veriler ortalama ± SD (n = 3) olarak sunulmuştur.

1 gün4 gün30 gün 
Boyut(nm)183.87±2.54212.42±3.12273.57±4.38
PDI0.149±0.0040.106±0.0020.126±0.009
Zeta potansiyeli(mV)-24.80±1.04-57.12±1.49-55.38±2.50

Tablo 6: Rifampisin yüklü lipozomların 4 °C'deki depolama stabilitesi. Rifampisin yüklü lipozomların 4 °C'de 1, 4 ve 30 gün boyunca depolanması sonrası partikül boyutu, polidispersite indeksi (PDI) ve zeta potansiyelindeki değişimler. Sonuçlar, lipozomal formülasyonun depolama sırasındaki fiziksel stabilitesini değerlendirmek için kullanılmıştır.

Tartışma

Rifampisin, birinci basamak anti-tüberküloz kemoterapisinin temel taşı olmaya devam etmektedir; ancak klinik faydası, doza bağlı hepatotoksisite, Mycobacterium tuberculosis (MTB) barındıran makrofajlara düşük hücre içi penetrasyon ve subterapötik maruziyet altında hızlı gelişen ilaç direnci nedeniyle ciddi şekilde kısıtlanmaktadır. Bu karşılanmamış klinik ihtiyaçları gidermek amacıyla, bu çalışmada rifampisin yüklü lipozomların üretimi için ultrasonikasyon ve filtrasyonla birleştirilmiş, sağlam bir ince film hidratasyon protokolü oluşturulmuş ve optimize edilmiştir. Optimize edilen formülasyon; dinamik ışık saçılması (DLS), transmisyon elektron mikroskobu (TEM), yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve in vitro çözünme testleri aracılığıyla gerçekleştirilen kapsamlı fizikokimyasal karakterizasyon sonucunda, tekdüze nanometre ölçekli partikül boyutu, bozulmamış veziküler morfoloji, yüksek ilaç enkapsülasyon verimliliği ve sürdürülebilir in vitro ilaç salınım profili sergilemiştir.

Çeşitli protokol adımları, lipozom kalitesini ve tekrarlanabilirliğini kritik düzeyde etkiler. İlk olarak, fosfolipid-kolesterol oranı büyük önem taşır. Optimal 80:20 oranı %68,5 EE ve %11,4 DL sağlarken; 75:25 veya 70:30 oranlarındaki sapmalar şuna neden olur >%30 EE kaybı. Yüz binde bir hassasiyete sahip bir terazi ile hassas tartım zorunludur. İkinci olarak, hidratasyon (bölüm 1.6) 100 hızında rotasyon gerektirir dak/dk, 37 °C 1 için vakum olmadan döner evaporatör üzerinde h. Statik inkübasyon veya manuel çalkalama düşük tekrarlanabilirliğe yol açar. Üçüncüsü, ultrasonikasyon (bölüm 1.7): 40 kHz, 100 W, 10 37°C'de ... dakika °C 185'lik bir Z-ortalaması verir nm ve bir PDI < 0.2. Daha kısa süreli sonikasyon (5 dk) verim sağlar >300 nm ve PDI > 0,3; daha uzun sonikasyon (20 dak) ilaç bozunması riskini taşır. 37°C'de muhafaza edin °C çünkü rifampisin ısıya duyarlıdır. Dördüncü olarak, ardışık filtrasyon için (0,45 µm Ardından 0,22 µm), filtreleri PBS ile önceden ıslatın ve tek bir yumuşak geçiş uygulayın. Kuru filtrelerden zorlayarak geçirmek veya küçük bir şırınga kullanmak vezikülleri yırtabilir. Beşincisi, EE için ultrafiltrasyon (bölümler 2,1–2,3): tam olarak 200 µL, 7.000'de 4 döngü × g, 25 °Cher döngüden sonra tüm filtratların toplanıp birleştirilmesi. Tamamlanmamış döngüler, EE değerinin olduğundan yüksek hesaplanmasına neden olur. Altıncısı, TEM negatif boyama (bölüm 5.6): %2 fosfotungstik asit, pH 7,0; hemen blotlama yapın. Gecikme veya yanlış pH veziküllerin çökmesine neden olur. Bu altı adımın tutarlı bir şekilde uygulanması, üç tekrarlı ölçümlerdeki düşük standart sapmalarla kanıtlandığı üzere, kabul kriterlerini karşılayan lipozomlar sağlar.

Kolesterol, lipozomal çift katmanların kritik bir yapısal bileşenidir ve membran akışkanlığı, mekanik stabilite ve lipofilik ilaç tutulumu üzerinde iyi belgelenmiş çift etkileri vardır. Bu çalışmada, kolesterol molar oranının formülasyon performansı üzerindeki etkisini sistematik olarak değerlendirdik ve %20'lik (kütle oranı) bir kolesterol içeriğinde %68,5 ile maksimum enkapsülasyon verimliliğine ulaşıldığını tespit ettik. Bu optimal oranın, ilaç sızıntısını minimize etmek için fosfolipid çift katmanının düzenli lamellar yapısını korumak ile lipofilik rifampisin moleküllerini çift katman hidrofobik çekirdeğine yerleştirmek için yeterli membran akışkanlığını sürdürmek arasında bir denge kurduğu varsayılmaktadır. Aksine, %20'yi aşan kolesterol içeriği, lipid çift katmanının aşırı katılaşmasına, düzenli lamellar dizilimin bozulmasına ve buna bağlı olarak hem enkapsülasyon verimliliğinde hem de ilaç yükleme kapasitesinde önemli azalmalara yol açmıştır. Bu bulgular, kolesterolün lipozomal membran mühendisliğindeki rolüne dair yerleşik mekanistik anlayışla uyumludur. Bu nedenle, yüksek ilaç yüklemesi sağlamak için hassas lipid tartımı (yüz binlik terazi kullanılarak) ve %20 kolesterol kütle oranına kesin bağlılık zorunludur.

Optimize edilmiş rifampisin yüklü lipozomlar, 0,164 ± 0,044 polidispersite indeksi (PDI) ile 185 nm ortalama hidrodinamik çap sergilemiş olup, bu durum oldukça tekdüze bir partikül boyut dağılımına işaret etmektedir. Bu nano ölçekli boyut (< 200 nm), sadece inflamasyonlu pulmoner tüberküloz lezyonlarına pasif hedefleme için gelişmiş geçirgenlik ve tutulum (EPR) etkisi ile uyumlu olmakla kalmayıp, aynı zamanda MTB'nin birincil hücre içi nişi olan alveolar makrofajlar tarafından etkili fagositoz için de optimaldir. Bu partikül boyutu tasarımı, MTB ile enfekte makrofajlar içinde terapötik konsantrasyonlara ulaşamayan serbest rifampisinin temel kısıtlamasını giderme potansiyeline sahiptir. Optimize edilmiş formülasyon için −38 mV olan zeta potansiyeli, güçlü interpartiküler elektrostatik itme sağlayarak vezikül agregasyonunu, füzyonunu ve kısa süreli depolama sırasında çökelmesini etkili bir şekilde önlemekte, böylece mükemmel kolloidal stabilite sağlamaktadır. Özellikle, TEM ile ölçülen çekirdek partikül boyutu, DLS aracılığıyla elde edilen hidrodinamik çaptan daha küçüktür; bu, lipozom karakterizasyonunda iyi belgelenmiş bir fenomendir: DLS, çevreleyen sulu hidratasyon tabakası dahil olmak üzere hidrate vezikül çapını nicelleştirirken, TEM görüntüleme yüksek vakum koşulları altında dehidrate lipid çekirdeğini yakalar. Bu nedenle söz konusu tutarsızlık, karakterizasyondaki bir uyumsuzluktan ziyade, beklenen ve fizikokimyasal olarak rasyonel bir bulgudur.

TEM görüntüleme, optimize edilmiş lipozomların morfolojik özelliklerini daha da doğrulamış olup; bu yapılar çoğunlukla tekdüze, küresel, bütünlemiş unilamellar veziküller şeklinde görünmüş, yalnızca küçük yerel agregasyonlar saptanmış ve belirgin bir füzyon veya membran rüptürü gözlemlenmemiştir. Bu bulgular, kombine ultrasonikasyon ve filtrasyon işleminin, lipozomal çift katmanın yapısal bütünlüğünü korurken vezikül morfolojisi ve lamellarite üzerinde hassas kontrol sağladığını doğrulamaktadır. Yapısal bütünlük, depolama sırasındaki ilaç tutulumu, in vivo dolaşım stabilitesi ve hedeflendirilmiş iletim performansı ile doğrudan ilişkili olduğundan, lipozomal formülasyonlar için kritik bir kalite özelliğidir. Ek olarak, lipozom süspansiyonunda gözlemlenen belirgin Tyndall etkisi, nanomal ölçekli vezikül dispersiyonunun kolloidal doğasını daha da doğrulamıştır.

İn vitro ilaç salım çalışmaları, optimize edilmiş rifampisin yüklü lipozomların ilk 0.5 h içerisinde anlamlı bir burst salım sergilemediğini göstermiştir; bu özellik, serbest rifampisinin hızlı pik plazma konsantrasyonları ile ilişkili akut sistemik toksisite riskini azaltan kritik bir özelliktir. İlaç salım kinetiği modellemesi, salım profilinin birinci derece kinetik modele en iyi şekilde uyduğunu ortaya koymuş ve bu durum, rifampisinin lipozomal çift tabakadan salımının lipid matris erozyonundan ziyade ağırlıklı olarak pasif difüzyon tarafından yönetildiğini göstermiştir. Difüzyon kontrollü bu sürdürülebilir salım paterni, etkili terapötik ilaç konsantrasyonlarının uzun süre korunmasına olanak tanıdığı için antitüberküloz tedavisi için oldukça arzulanan bir durumdur ve böylece ilaç direncinin ortaya çıkmasına neden olan subterapötik maruziyet riskini azaltır. 24 h sonra kümülatif ilaç salımında hafif bir azalma gözlemlenmiştir; bu durum büyük olasılıkla, sulu salım ortamındaki enkapsüle edilmemiş rifampisinin oksidatif ve hidrolitik bozunmasına bağlanabilir ve bu bulgu, rifampisinin sulu ortamlardaki stabilitesi için daha önce yayınlanmış verilerle uyumludur38. Önemli olan şudur ki, lipozomal çift tabaka enkapsüle edilen ilaç için koruyucu bir mikroortam sağlayarak, ilacın bozucu koşullara maruz kalmasını serbest rifampisine kıyasla azaltır.

Bu çalışmada geliştirilen optimize edilmiş rifampisin yüklü lipozomal formülasyon, konvansiyonel rifampisin kemoterapisinin temel kısıtlamalarını doğrudan ele alarak anti-tüberküloz tedavisi için çok sayıda belirgin avantaj sunmaktadır. İlk olarak, lipozomal çift katman, sulu ve biyolojik ortamlarda ilacın erken yıkımına karşı koruyucu bir bariyer oluşturarak rifampisinin antimikrobiyal aktivitesini korur. İkinci olarak, sürdürülebilir difüzyon kontrollü salınım profili, ilacın sistemik dolaşım yarı ömrünü uzatarak dozlama sıklığının azaltılmasını ve uzun süreli tüberküloz kemoterapisinde temel bir zorluk olan hasta tedavi uyumunun iyileştirilmesini sağlar. Üçüncü olarak, optimize edilmiş nano ölçekli partikül boyutu, hem EPR etkisi aracılığıyla enflame tüberküloz lezyonlarına pasif hedeflemeyi hem de MTB enfeksiyonlu alveolar makrofajlar tarafından etkili alımı kolaylaştırarak, serbest rifampisin ile ulaşılamayan yüksek hücre içi ilaç konsantrasyonlarına ulaşılmasını sağlar39,40. Son olarak, formülasyon biyoyumlu, doğal türevli fosfolipidler ve kolesterolden oluşturulmuştur; bu da taşıyıcı aracın kendisiyle ilişkili immünojenite veya sistemik toksisite riskini minimize eder.

Özellikle, bu çalışmanın gelecek araştırmalarda ele alınması gereken birkaç kısıtlılığı bulunmaktadır. İn vitro fizikokimyasal karakterizasyon ve salınım profilleri gelecek vaat eden bir formülasyon performansı sergilese de, rifampisin yüklü lipozomların farmakokinetik davranışını, doku dağılımını, antitüberküloz etkinliğini ve sistemik toksisitesini ilgili hayvan modellerinde değerlendirmek için daha fazla in vivo çalışmaya ihtiyaç vardır. Ayrıca, optimize edilmiş hazırlama protokolünün endüstriyel ölçekli üretim için ölçeklenebilirliği daha fazla doğrulanmalıdır.

Sonuç olarak, bu çalışma rifampisin yüklü lipozomların üretimi için basit, yüksek düzeyde tekrarlanabilir ve sağlam bir ince film hidratasyonu-ultrasonikasyon-filtrasyon protokolü oluşturmuştur. Sistematik formülasyon optimizasyonu, kolesterol içeriğinin enkapsülasyon verimliliğini ve membran stabilitesini belirlemedeki kritik rolünü ortaya koymuş; optimize edilmiş formülasyon ideal fizikokimyasal özellikler, yüksek ilaç enkapsülasyon verimliliği, mükemmel kolloidal stabilite ve kontrollü, sürdürülebilir in vitro ilaç salınımı sergilemiştir. Bu standartlaştırılmış protokol, lipozomal antitüberküloz ilaç taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesi ve karakterizasyonu için güvenilir bir metodolojik çerçeve sunmakta ve hem ilaca duyarlı hem de ilaca dirençli tüberküloz tedavisinde lipozomal rifampisinin sonraki preklinik değerlendirmeleri için sağlam bir temel oluşturmaktadır.

Açıklamalar

Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 21977019) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
L-α-Fosfatidilkolin (Soya fasulyesi)RHAWNR024502≥%90 saflık, 25 g/şişe, CAS: 97281-47-5
1× PBS TamponuSolarbioP1038500 mL, 0,01 mol/L, pH 6,5
1× PBS Tamponu, pH 7,4ThermoFisher Scientific (Gibco)C10010500BT-1500 mL, pH 7,4
KloroformGuangzhou MarkasıGD10-AR-2.5LAR saflığında, 500 mL/şişe, CAS: 67-66-3
KolesterolAladdinC104028-5g AR kalite, ≥%95 (HPLC), 5 g/şişe, CAS 57-88-5
Diyaliz Membranları (MD25, 7000 Da)SolarbioYA1081-5m7000 Da MWCO, 5 m uzunluk, metalik olmayan malzeme
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Sistemi, LC-20AShimadzu Corporation, JaponyaLC-20ASistem; bir SPD-20A UV dedektör, bir CBM-20A kuaterner pompa, bir LC-20AT çevrimiçi gaz giderici, bir SIL-20A otomatik örnekleyici, bir CTO-20A kolon fırını ve LC-solution iş istasyonu yazılımı ile donatılmıştır. Sistem, rifampisinin kantitatif tayini için kullanılmıştır.
Yüksek Hızlı Masaüstü SantrifüjShanghai Anting Bilimsel Enstrüman FabrikasıTGL-16BNumunelerin santrifüjlenmesi için kullanılır
L-Askorbik asitMacklinA800296%99,99 saflık, 100 g/şişe, CAS: 50-81-7
Omni Parçacık Boyutu ve Zeta Potansiyeli AnalizörüBrookhaven Instruments Corporation, ABD173PILipozomların partikül boyutunun, polidispersite indeksinin (PDI) ve zeta potansiyelinin belirlenmesinde kullanılır
RifampisinMacklinR817237%97 saflık, şişe başına 250 mg, CAS: 13292-46-1
Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM)Hitachi, Ltd., JaponyaHT7700Lipozomların morfolojik gözlemi için kullanılır
Tween 80Enerji KimyasıE0807391000-A01AR saflıkta, şişe başına 100 mL, CAS: 9005-65-6
Ultrafiltrasyon Santrifüj Filtre Üniteleri (0,5 mL, 3 kDa)Merck MilliporeUFC5003963 kDa MWCO, 0,5 mL hacim, plastik malzeme

Kaynaklar

  1. World Health Organization. Global tuberculosis report 2025. Geneva: World Health Organization; 2025.
  2. Wei X, Yue L, Zhao B, Jiang N, Lei H, Zhai X. Recent advances and challenges of revolutionizing drug-resistant tuberculosis treatment. Eur J Med Chem. 2024;277:116785.
  3. World Health Organization. Consolidated guidelines on tuberculosis: module 4: treatment and care. Geneva: World Health Organization; 2022.
  4. Singh V. Tuberculosis treatment-shortening. Drug Discov Today. 2024;29(5):103955.
  5. Li SY, et al. Next-generation diarylquinolines improve sterilizing activity of regimens with pretomanid and the novel oxazolidinone TBI-223 in a mouse tuberculosis model. Antimicrob Agents Chemother. 2023;67(4).
  6. Timm J, et al. Baseline and acquired resistance to bedaquiline, linezolid and pretomanid, and impact on treatment outcomes in four tuberculosis clinical trials containing pretomanid. PLOS Glob Public Health. 2023;3(10).
  7. Chesov E, et al. Emergence of bedaquiline resistance in a high tuberculosis burden country. Eur Respir J. 2022;59(3):2100621.
  8. Dhillon J, Mitchison DA. Activity and penetration of antituberculosis drugs in mouse peritoneal macrophages infected with Mycobacterium microti OV254. Antimicrob Agents Chemother. 1989;33(8):1255-9.
  9. Ge Z, Wang Z, Wei M. Measurement of the concentration of three antituberculosis drugs in the focus of spinal tuberculosis. Eur Spine J. 2008;17(11):1482-7.
  10. Parbhoo T, Schurz H, Mouton JM, Sampson SL. Persistence of Mycobacterium tuberculosis in response to infection burden and host-induced stressors. Front Cell Infect Microbiol. 2022;12:981827.
  11. Sarathy JP, et al. Prediction of drug penetration in tuberculosis lesions. ACS Infect Dis. 2016;2(8):552-63.
  12. Fountain FF, Tolley EA, Jacobs AR, Self TH. Rifampin hepatotoxicity associated with treatment of latent tuberculosis infection. Am J Med Sci. 2009;337(5):317-20.
  13. Chen X, et al. Acquired resistance during short-course treatment for rifampicin-resistant tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 2026;32(2):315-22.
  14. Singh V, Chibale K. Strategies to combat multi-drug resistance in tuberculosis. Acc Chem Res. 2021;54(10):2361-76.
  15. Pinto-Alphandary H, Andremont A, Couvreur P. Targeted delivery of antibiotics using liposomes and nanoparticles: research and applications. Int J Antimicrob Agents. 2000;13:155-68.
  16. Drulis-Kawa Z, Dorotkiewicz-Jach A. Liposomes as delivery systems for antibiotics. Int J Pharm. 2010;387(1-2):187-98.
  17. Singh SR, et al. Advancing tuberculosis chemotherapy: targeted nanomedicines for the mycobacterium TB granuloma. Small. 2025;21(49).
  18. Ferreira M, et al. Liposomes as antibiotic delivery systems: a promising nanotechnological strategy against antimicrobial resistance. Molecules. 2021;26(7):2047.
  19. Zweijpfenning SMH, et al. Safety and outcomes of amikacin liposome inhalation suspension for Mycobacterium abscessus pulmonary disease: a NTM-NET study. Chest. 2022;162(1):76-81.
  20. Allen TM, Cullis PR. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Adv Drug Deliv Rev. 2013;65(1):36-48.
  21. Truzzi E, et al. Drugs/lamellae interface influences the inner structure of double-loaded liposomes for inhaled anti-TB therapy: an in-depth small-angle neutron scattering investigation. J Colloid Interface Sci. 2019;541:399-406.
  22. U.S. Food and Drug Administration. ARIKAYCE (amikacin liposome inhalation suspension) [prescribing information]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2018.
  23. Yıldırım M, Düzgüneş N. Liposome-encapsulated antibiotics for the therapy of mycobacterial infections. Antibiotics (Basel). 2025;14(7):728.
  24. Yun Y, et al. Recent advances in functional lipid-based nanomedicines as drug carriers for organ-specific delivery. Nanoscale. 2025;17(13):7617-38.
  25. Farooque F, Mughees MM, Wasi M. Liposomes as drug delivery system: an updated review. J Drug Deliv Ther. 2021;11(5 Suppl):149-58.
  26. Wang Z, Liu L, Yin W, Liu Z, Shi L, Tang M. A novel drug delivery system: the encapsulation of naringenin in metal-organic frameworks into liposomes. AAPS PharmSciTech. 2021;22(2):61.
  27. Niu NK, et al. Preparation and characterization of HRZ triple anti-tuberculosis drugs/TGF-β1 siRNA nanoliposomes. Orthop J China. 2018;26(23):2177-82.
  28. Wang Y, et al. Formulation and pharmacokinetic evaluation of a paclitaxel nanosuspension for intravenous delivery. Int J Nanomedicine. 2011;6:1497-507.
  29. Mishra M, et al. Mycobacterial lipid-derived immunomodulatory drug-liposome conjugate eradicates endosome-localized mycobacteria. J Control Release. 2023;360:578-90.
  30. Yoshizawa Y, Kono Y, Ogawara KI, Kimura T, Higaki K. PEG liposomalization of paclitaxel improved its in vivo disposition and anti-tumor efficacy. Int J Pharm. 2011;412(1-2):132-41.
  31. Guo LN, et al. Liposome and exosome pre-treatment for transmission electron microscopy and morphological observation. Acta Sci Nat Univ Sunyatseni. 2025;64(4):62-68.
  32. Crommelin DJA, van Bommel EMG. Stability of liposomes on storage: freeze dried, frozen or as an aqueous dispersion. Pharm Res. 1984;1(4):159-63.
  33. Wang F, et al. Nanoliposome-encapsulated brinzolamide-hydropropyl-β-cyclodextrin inclusion complex: a potential therapeutic ocular drug-delivery system. Front Pharmacol. 2018;9:91.
  34. Ubhe AS. Imaging of liposomes by negative-stain transmission electron microscopy and cryo-transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 2023;2633:245-51.
  35. Filippov SK, et al. Dynamic light scattering and transmission electron microscopy in drug delivery: a roadmap for correct characterization of nanoparticles and interpretation of results. Mater Horiz. 2023;10:2023-42.
  36. Wallenwein CM, et al. How wound environments trigger the release from rifampicin-loaded liposomes. Int J Pharm. 2023;633:122606.
  37. Forte J, et al. Mucoadhesive rifampicin-liposomes for the treatment of pulmonary infection by Mycobacterium abscessus: chitosan or ε-poly-L-lysine decoration. Biomolecules. 2023;13(6):924.
  38. Sorokoumova GM, et al. Bacteriostatic activity and decomposition products of rifampicin in aqueous solution and liposomal composition. Pharm Chem J. 2008;42:475-8.
  39. Fenaroli F, et al. Enhanced permeability and retention-like extravasation of nanoparticles from the vasculature into tuberculosis granulomas in zebrafish and mouse models. ACS Nano. 2018;12(8):8646-61.
  40. Hamed A, Osman R, Al-Jamal KT, Holayel SM, Geneidi AS. Enhanced antitubercular activity, alveolar deposition and macrophage uptake of mannosylated stable nanoliposomes. J Drug Deliv Sci Technol. 2019;51:513-23.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Rifampisin LipozomlarıAnti-Tüberküloz TerapiLipozomal İlaç Salınımıİnce Film HidrasyonuKapsülleme VerimliliğiYüksek Performanslı Sıvı KromatografisiDinamik Işık SaçılımıTransmisyon Elektron MikroskobuIn Vitro İlaç Salınımı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.