Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yüksek İçerikli Görüntüleme ve Veri İşleme için Standartlaştırılmış İş Akışı

44 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71863

⸱

21 Ağustos 2026

 ,  , 
1College of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Institute of Interdisciplinary Studies, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Life Science and Technology, Southeast University

Bu makalede

Özet

Burada, otomatik görüntüleme ve analiz iş akışlarını kullanarak tekrarlanabilir hücre canlılığı analizi gerçekleştirmek amacıyla, propidyum iyodür (PI)/Hoechst 33342 ile boyanmış hücrelerin standartlaştırılmış yüksek içerikli görüntülemesi ve veri işlemesi için bir protokol sunmaktayız.

Özet

Bilimsel araştırma görüntülemesindeki operasyonel varyasyonlardan kaynaklanan düşük tekrarlanabilirlik sorunlarını ve geleneksel yöntemler kullanılarak çok sayıda örneğin analiz edilmesinin karmaşıklığını gidermek amacıyla, HT22 hücrelerinin PI ve Hoechst 33342 ile boyanması, ardından High-Content Imaging System kullanılarak görüntülenmesi ve verilerin analiz edilmesi için bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, sağlam görüntüleme ayar parametreleri ve sıkı kalite kontrol standartları oluşturmayı amaçlamaktadır. Çalışma, cihazın görüntüleme ayarlarını ve cihaz tarafından sağlanan üç farklı görüntü işleme yöntemi olan Çok Dalga Boylu Hücre Skorlaması (Multi), Canlı-Ölü (Live) ve Özel Modül Düzenleyici (CME) için iş akışını göstermektedir. Görüntü işleme yöntemlerinin etkinliğini sağlamak için geleneksel yöntem olan ImageJ ile karşılaştırmaları ve doğrulamaları yapılmıştır. Çalışma sonuç olarak, PI ve Hoechst çift boyama yöntemini kullanarak hücre canlılığını belirlemek için High-Content Imaging System kullanımına yönelik bir iş akışını özetlemektedir. Tüm görüntüleme ve veri işleme iş akışını standartlaştırarak bu çalışma, bilimsel araştırma görüntülemesinin tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini önemli ölçüde artırmakta, böylece laboratuvarlar arası veri karşılaştırması için sağlam metodolojik destek sağlayarak bilimsel araştırmaları ileriye taşımaktadır.

Giriş

Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi, hasarlı veya hasarsız hücrelerin yüksek hızlı görüntülenmesini ve çok parametreli değerlendirmesini sağlayarak modern bilimsel araştırmalarda kritik bir araç görevi görür1,2,3. Çeşitli disiplinlerde yeri doldurulamaz bir rol oynamaktadır. Yaşam bilimleri alanında, araştırmacıların hücrelerin ve dokuların mikroskobik dünyasını keşfetmelerine yardımcı olur4,5. Örneğin, hücre içindeki floresan işaretli moleküllerin ve yapıların hassas bir şekilde tespit edilmesi, hücresel ince yapıların ve dinamik değişimlerin net bir şekilde görselleştirilmesine olanak tanır6. Nörobilim araştırmalarında, nöronların üç boyutlu görüntülemesini gerçekleştirebilir; bu da nöronal ağların karmaşık bağlantılarının ve sinyal iletim mekanizmalarının analiz edilmesine yardımcı olarak beyin fonksiyonlarının ve nörolojik hastalıkların patogenezinin anlaşılması için kritik ipuçları sağlar7,8,9.

Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi teknolojisinin önemli avantajlarına rağmen, görüntüleme sürecinde bazı sorunlar devam etmektedir. Numune hazırlama aşamasında yüksek derecede öznellik söz konusudur. Biyolojik numune hazırlama sürecinde, hücre işlemleri ve boyama gibi işlemler ilgili standartlardan yoksundur. Görüntüleme parametreleri açısından, laboratuvarlar ve yüksek içerikli mikroskop modelleri arasında pozlama süreleri ve kuyucuklu plaka seçimlerinde belirgin farklılıklar bulunmaktadır. Veri işleme aşamasında, ham görüntülerin gürültü azaltma ve kontrast ayarlarından, parametre tanımlama ve hedef özelliklerin belirlenmesine kadar standartlaşma eksikliği vardır. Bu sorunlar, mikroskop görüntüleme sonuçlarında doğrudan yanlılıklara yol açarak bir tekrarlanabilirlik krizine neden olmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, ticari bir hücre hattı (HT22, ATCC) kullanmaktadır ve insan denekleri veya primer insan dokularını içermemektedir. Bu çalışmada hayvan kullanılmamıştır.

1. Standardize edilmiş numune hazırlama

  1. HT22 hücrelerinin hazırlanması
    1. HT22 hücrelerinin konfluens oranı %80'e ulaştığında10,11, eski medyumu dökün. Hücreleri yerinden ayırmak için %0,25 tripsin kullanın ve oda sıcaklığında 1–2 dk inkübe edin.
    2. Ayrılma işlemini durdurmak için %0,25 tripsin hacminin 3 katı oranında Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ekleyin. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
    3. Oda sıcaklığında 3 dk boyunca 175 x g hızda santrifüjleyin ve ardından süpernatantı dökün. Tek hücre süspansiyonu oluşturmak için hücreleri komple DMEM içinde yeniden süspande edin.
    4. Hücreleri bir hücre sayım odası kullanarak sayın. 96 kuyucuklu bir plakaya12, her kuyucuğa 100 µL komple medyum içinde 5.000 hücre gelecek şekilde ekim yapın.
    5. Plakayı 37 °C'de %5 CO2 ile 24 sa boyunca inkübe edin. Deneysel tasarıma göre 96 kuyucuklu plaka üzerinde örnek gruplandırma, dozajlama ve boyama işlemlerini gerçekleştirin.
      ​NOT: Görüntüleme sistemiyle uyumlu bir 96 kuyucuklu plaka kullanın. Üretici spesifikasyonlarına göre uygun taban kalınlığına ve geometrisine sahip bir plaka seçin. Daha yüksek görüntü kalitesi gerektiğinde cam tabanlı plakalar (130–170 µm taban kalınlığı) önerilir13,14,15,16.
  2. Boyama prosedürü
    1. Hücre örtüşmesini minimize etmek için hücrelerin tek, iyi dağılmış bir monokatman oluşturduğundan ve konfluens oranının %70'i aşmadığından emin olun (Şekil 1B).
    2. Örnekleri deneysel gereksinimlere göre gruplandırın ve işlem sonrası boyama aşamasına geçin. Çalışma boya çözeltilerini, PI için 6,684 µg/mL ve Hoechst 33342 için 10 µg/mL nihai konsantrasyonda hazırlayın17,18.
    3. 96 kuyucuklu plaktaki eski medyumu dökün ve her kuyucuğu 100 µL PBS ile iki kez yıkayın. Boyama için boya çalışma çözeltisini ekleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dk inkübe edin.
    4. Her kuyucuğu 100 µL PBS ile iki kez yıkayın, ardından DMEM ekleyin.
      NOT: Farklı deneysel tasarımlarda örnek yükleme ve boyama parametreleri farklılık gösterebilir.

2. Görüntüleme özellikleri ve parametre ayarları

  1. Görüntüleme parametre standartları
    ​NOT: Bu çalışma, PI ve Hoechst 33342 boyaması sonrası cihaz için yalnızca geniş alan görüntüleme iş akışını göstermektedir.
    1. Cihazı açın ve ardından bilgisayarı başlatın. Cihazla birlikte sağlanan analiz yazılımını açın.
    2. 96 kuyucuklu plakayı cihaza yerleştirin. Görüntüleme için numunelerin bulunduğu görüş alanını seçin.
    3. Objektif ve Kamera ayarlarında, Büyütme oranını şu şekilde ayarlayın: "20XPh1SPlanFluorELWDADM" (Nikon, S Plan Fluor, ELWD, 20X/0.45, ∞/0-2, WD 8.2-6.9, OFN22, Ph1, AMD, MRH48230), Kamera binleme şuna: "2"ve Kazanım Modu şu şekildeye "Geniş alanlı".
    4. Plaka modunda, 96 kuyucuklu plakaya karşılık gelen parametreleri seçin ve plaka parametrelerini ürün boyut verilerine göre ayarlayın.
    5. Saha Seçeneği (Site Option) altında, yoğun görüntüleme için genellikle kuyu başına 9 alan seçin. Otodokus (Autofocus) seçeneklerinde, şunları seçin: Lazer tabanlı odaklamayı etkinleştirin.
    6. En az üç örnek kuyucuktan ölçülen ortalama plaka taban kalınlığına dayanarak, Autofocus altındaki lazer otomatik odaklama parametrelerini ayarlayın. Bottom thickness, Bottom thickness max variation, Adjacent well max variation, Intra-well max variation ve Plate max variation değerlerini buna göre düzenleyin.
    7. Dalga Boyları başlığı altında, Dalga boyu sayısını 3 olarak ayarlayın. İlk Aydınlatma için DAPI'yi seçin. Gölgelendirme Düzeltme kısmında, şunları seçin "FL için Otomatik Düzeltme" (Şekil 2B).
    8. Görüntü bulunduktan sonra, başlangıç Pozlama (ms) değerini 20–30 olarak ayarlayın. Yakalanan görüntüleri gözlemleyin ve aşırı pozlamaya yol açmadan orta düzeyde bir floresan yoğunluğu elde etmek için pozlamayı sürekli olarak ayarlayın ve bit derinliğini 16 olarak belirleyin (Şekil 2A).
    9. Odaklama ayarı için z-offset'li Lazer'i seçin. Odak net değilse, Z stack Use seçeneğini işaretleyin, Calculate Offset'e tıklayın ve uygun bir odak uzaklığı seçin. Kontrol edin Dijital Konfokal (bilgi) ve şunlar için ayarlama parametrelerini belirleyin: Keskinliği Artırma ve Gürültüyü Azaltma 0,200'e.
      NOT: Görüntü pozlaması veya netliği tatmin edici değilse, pozlamayı ayarlayın ve ofset parametrelerini yeniden hesaplayın.
    10. İkinci Aydınlatma (Illumination) için Cy3'ü seçin. 2.1.7-2.1.9 adımlarındaki ayarların aynısını uygulayın.
    11. Üçüncü Aydınlatma için TL 25'i seçin. 2.1.7-2.1.9. adımlardaki ayarların aynısını uygulayın.
      NOT: Kanal bazlı gölgelendirme düzeltmesini ayarlayın ve TL 25 seçilmelidir TL için Otomatik DüzeltmeDalga Boyları kısmında, hücre konumlandırma ve morfolojik gözlem için TL kanalı ayarlanmalıdır.
    12. Run sekmesinde, plakaya şu isimlendirme konvansiyonuna göre isim verin: plaka adı-hücre tipi-deney kimliği-tarih-objektif büyütmesi-görüntüleme tipi. Açıklama (Description) altındaki görüntüleme kanalıyla ilgili parametreleri onaylayın.
    13. Görüntülemeyi başlatmak için Plakayı Edin (Acquire Plate) düğmesine tıklayın. Görüntüleme tamamlandıktan sonra sırasıyla yazılımı, cihazı ve bilgisayarı kapatın.
      ​NOT: Bundan sonra bilgisayar yalnızca görüntü aktarımı, veri işleme ve sonuç analizi için açılabilir
  2. Görüntüleme operasyon standartları ve gereksinimleri
    1. Kenar etkilerinden kaçınmak için görüş alanını kuyucuğa ortalayın (Şekil 1A). Görüntüleme parametrelerinin ayarlanması sırasında, en yüksek floresan yoğunluğuna sahip pozitif kontrolü referans olarak kullanın. Ayrıca, odaklama yaparken tek bir hücre katmanının bulunduğu, temiz ve kalıntılardan arındırılmış bir görüş alanı seçin.
    2. Kamerada, kalıcı bilgi kaybına yol açabilen saturasyonu önlemek için piksel değerlerini kesinlikle 60000'in altında tutun (maksimum değer 65535'tir). Satüre olmuş parlak noktalar veya alanlar görülürse pozlama süresini kısaltın. Aynı zamanda, pozlama süresini çok düşük tutmayın; aksi takdirde görüntüde gürültü hakim olacaktır.
    3. Zayıf floresan sinyaller için, fotobezmeye bağlı geri dönüşümsüz hasarları önlemek amacıyla, parametreleri zorlayarak yükseltmek yerine pozlama süresini hafifçe artırmaya öncelik verin.
      NOT: Aydınlık alan görüntüleme için bu ilkeler uygun şekilde esnetilebilir, ancak temel odak noktası sinyal bütünlüğü ve numunenin korunmasıdır.
    4. Numunenin kenar konturlarının belirgin olduğundan emin olun ve iç kısımdaki ince yapıların (granüller, lifler, organeller gibi) bulanık değil, belirgin dokulara sahip olduğunu kontrol edin; arka plandaki saçılan ışığın, bölgesel parlak noktalar veya bulanık haleler olmaksızın homojen dağıldığından emin olun. Aşırı odaklama (over-focusing) ve yetersiz odaklamadan (under-focusing) kesinlikle kaçının.
    5. Normal, pozitif, negatif ve deneysel grupların olduğundan ve her bir işlem grubunun en az 3 paralel kuyucuğa sahip olduğundan emin olun. Paralel kuyucukların dikey olarak düzenlenmesi önerilir.

3. Görüntü işleme ve analiz

NOT: Bu belge, cihazın yardımcı yazılımı tarafından sağlanan ve tamamı bu çalışmada kullanılan boyama protokolü için uygun olan üç görüntü işleme yöntemini özetlemektedir. Bu yöntemler aynı temel tanıma prensibini paylaşsa da, spesifik işleme teknikleri ve veri sonucu türleri açısından farklılık gösterirler. Görüntü işleme iş akışı şu şekilde gerçekleştirilmiştir: Dosyayı aç → Orijinal görüntüyü ilgili işleme yöntemiyle yükle → Uygun kanal parametrelerini ayarla → Bir Maske oluştur → Ölçüm (Measure) kısmında ölçüm veri türünü belirle → Analizi çalıştır → Sonuçları gözlemle → Verileri dışa aktar.

  1. Cihazla birlikte verilen analiz yazılımını açın → Review Plate → Select Plate.
  2. Date görünümünde, Well arrangement seçeneğini seçin ve referans olarak pozitif gruptan bir görüş alanı belirleyin.
  3. Run Analysis altında, ilgili işlem programını seçin ve görüntü işlem parametrelerini ayarlayın veya görüntüyü dışa aktarın.
  4. Parametreleri ayarlayıp kaydettikten sonra, parametre ayar nesnesine göre Run on all wells/ Run on selections/ Run on displayed site seçeneğini belirleyin.
  5. Bilgisayar verileri işlemeyi tamamladıktan sonra, Measurements sekmesi altında, Analysis kısmından ilgili veri işlem programını seçin ve verileri kontrol etmek için Measurement kısmından farklı ölçüm sonuçlarını belirleyin.
  6. Verileri dışa aktarmaya başlamak için Open Log'a tıklayın. Üç görüntü işlem yöntemi için parametre ayarlarındaki şu ayrıntıları belirleyin:
    1. Birinci görüntü işlem yöntemi: Çok Dalga Boylu Hücre Skorlaması (Multi-Wavelength Cell Scoring)
      1. Multi-Wavelength Cell Scoring programını seçin ve ayarları yapılandırın. Dalga boyu sayısını (Number of wavelengths) ayarlayın. Algoritma (Algorithm) için Standard seçeneğini belirleyin.
      2. Tüm çekirdekler için tanıma parametrelerini PI boyama sonuçlarına göre ayarlayın. Varsayılan W1 Kaynak (Source) görüntüsü DAPI kanalıdır.
      3. Tanınacak bireysel nesnelerin boyutuna göre Yaklaşık minimum genişliği (Approximate min width) 8–10 µm ve Yaklaşık maksimum genişliği (Approximate max width) 30–35 µm olarak ayarlayın.
      4. Yerel arka plan üzerindeki yoğunluğu (intensity above local background) 2.000–10.000 gri seviyesi olarak ayarlayın. Ayarları test etmek ve tanıma sonuçlarına göre düzenlemek için Preview özelliğini kullanın.
      5. W2 parametrelerini Hoechst 33342 boyama sonuçlarına göre ayarlayın. Bu kanalı adlandırın. W2 Kaynak (Source) görüntüsü Cy3'tür.
      6. Stained area kısmında, bu kanal tarafından boyanan bölgeyi Nucleus olarak seçin. Sonraki ayarlar için 3.6.1.3–3.6.1.4 adımlarındaki ayarları takip edin. Configure Summary Log veya Configure Data Log (Cells) kısmında, istenen sonuç parametrelerine göre ilgili Parametre yapılandırmasını seçin.
        NOT: Genellikle Configure Summary Log gerekli veri türlerini ayarlamak için kullanılırken, Configure Data Log (Cells) bireysel hücrelerin özel olarak işaretlenmesi gerektiğinde kullanılır.
      7. Tanımayı gözlemlemek için bir Test Run gerçekleştirin. Tanıma sonuçlarından memnun kalındığında ayarları kaydedin.
    2. İkinci görüntü işlem yöntemi: Live-Dead
      1. Live-Dead programını seçin ve ayarları yapılandırmaya başlayın. Dalga Boyu 1 Parametrelerini (Wavelength 1 Parameters) ve Dalga Boyu 2 Parametrelerini (Wavelength 2 Parameters) sırayla ayarlayın.
      2. Wavelength 1 Parameters altında, Wavelength 1 Kaynağını (Source) DAPI olarak ayarlayın. Varsayılan Algoritma (Algorithm) "Standard"dır.
      3. Boyama koşullarına göre Boyanmış hücre tipini (Stained cell type) All Cells ve Boyanmış alanı (Stained area) Nucleus olarak ayarlayın. Yaklaşık minimum genişlik, Yaklaşık maksimum genişlik ve yerel arka plan üzerindeki yoğunluk değerlerini Multi-Wavelength Cell Scoring yöntemiyle aynı ayarlar kullanarak belirleyin.
      4. Split touching objects seçeneğini kontrol edin ve test etmek için Preview özelliğini kullanın.
      5. Wavelength 2 Parameters altında, Wavelength 2 Kaynağını (Source) Cy3 olarak ayarlayın.
      6. Spesifik boyamaya göre Boyanmış hücre tipini (Stained cell type) Dead ve Boyanmış alanı (Stained area) Nucleus olarak ayarlayın. Yaklaşık minimum genişlik, Yaklaşık maksimum genişlik ve yerel arka plan üzerindeki yoğunluk değerlerini Multi-Wavelength Cell Scoring yöntemiyle aynı ayarlar kullanarak belirleyin.
      7. Configure Summary Log'a tıklayın ve gerekli veri türlerine göre Parametre yapılandırmasını seçin. Tanımayı gözlemlemek için bir Test Run gerçekleştirin. Tanıma sonuçlarından memnun kalındığında ayarları kaydedin.
    3. Üçüncü görüntü işlem yöntemi: geliştirici modu CME
      1. Custom Module (CME) programını seçin ve ayarları yapılandırmaya başlayın. Görüntü Adlarını (Image Names) ve kanalları ayarlayın.
        NOT: Sonraki parametre ayarlarını kolaylaştırmak için bunlar genellikle görüntüleme sırasında kullanılan kanal adlarına göre ayarlanır.
      2. Find Objects kısmında, tüm set için tanımayı ayarlamak amacıyla Simple Threshold'u açın.
      3. Kaynağı (Source), Görüntü Adı (Image Name) ile uyumlu olacak şekilde ayarlayın. 16-bit gri tonlamalı değer aralığına dayanarak, Threshold Low kısmına 0 ve Threshold High kısmına 65535 yazın.
      4. İşlem sonucunu Result kısmında adlandırın, uygulayın ve işaretleme durumunu gözlemleyin. Find Objects kısmında, bir Mask sonucu oluşturmak için Find Blobs'u açın.
      5. Kaynağı (Source), Simple Threshold'da olduğu gibi Görüntü Adı (Image Name) ile uyumlu hale getirin. Yaklaşık minimum genişlik, Yaklaşık maksimum genişlik ve yerel arka plan üzerindeki yoğunluğu Multi-Wavelength Cell Scoring ayarlarıyla aynı şekilde ayarlayın.
      6. İşlem sonucunu Result kısmında adlandırın, uygulayın ve işaretleme sonucunu gözlemleyin. Find Blobs tanıma sonucu için filtreleme, büyütme (grow), küçültme (shrink) ve tersine çevirme (invert) işlemleri için Modify Objects aracını kullanın.
      7. Measure altında, Modified'ı ayarlayın. Measurement Inputs kısmında, Standard Area Value için 1 girin ve Create Object Overlay seçeneğini işaretleyin.
      8. Objects to Measure kısmında, Mask of Objects'te işaretli nesnelerin kaynağını ve Image to Measure'da ölçülecek kaynak görüntüyü seçin. İstenen işlem sonucu parametrelerine göre ilgili Ölçüm Adını (Measurement Name) seçin, uygulayın ve parametre tanıma sonucunu gözlemleyin.
      9. Parametre ayarlarını onayladıktan sonra yapılandırmayı kaydedin.
    4. Genel yöntem: ImageJ
      ​NOT: Floresan görüntüler19 için ImageJ yöntemini kullanarak görüntüleme sonuçlarını analiz edin ve ardından bu cihazın üç yöntemiyle karşılaştırmalı bir analiz yapın.
      1. ImageJ yazılımını açın. Görüntü Aktarma: File → Open → analiz edilecek orijinal gri tonlamalı görüntüyü seçin.
      2. Görüntüyü 8-bit'e dönüştürün: Image → Type → 8-bit. Gri Tonlamalı Değer Tanıma: Image → Adjust → Threshold → Default, Red → Check Dark background → Set → OK.
        NOT: Kırmızı alan tanıma yetersizse, Default seçeneğini ImageJ'in yerleşik diğer 16 tanıma modelinden biriyle değiştirin veya iletişim kutusundaki sürgüyü ayarlayın.
      3. Parametreleri Ayarlayın: Analyze → Set Measurements. Açılan iletişim kutusunda Area, Mean gray value, Integrated density, Limit to threshold, Display label seçeneklerini işaretleyin, Redirect to None (varsayılan) yapın ve Ondalık basamaklar (Decimal places 0-9) için 2 girin. OK'ye tıklayın.
      4. Tanıma Sonuçlarını Analiz Edin: Analyze → Measure. Sonuçları Kaydedin: Açılan sonuçlar iletişim kutusunda File → Save As yolunu izleyin ve kayıt konumunu seçin.
  7. Görüntü dışa aktarımı
    1. Referans standart olarak yüksek kaliteli, pozitif bir kuyucuk görüş alanı seçin.
      NOT: Temel kalite gereksinimleri; gerçeklik, doğru odaklama, uygun pozlama (16-bit) ve uygun kontrasttır (yüksek sinyal-gürültü oranı daha iyidir). Yüksek kalite gereksinimleri arasında belirgin özellikler, kontrast, uygulanabilirlik, sezgisel morfolojik değişiklikler ve vurgulanmış ana noktalar yer alır.
    2. Run Analysis altında, Analysis bölümünden ExportPro'yu seçin ve Analysis için Run Setup'ı başlatın. Select output options kısmında, görüntü gereksinimlerine göre Individual channel, Color overlay, shrink image (isteğe bağlı) ve Scale bar (isteğe bağlı) seçeneklerini belirleyin.
    3. Her görüş alanı için dışa aktarılacak floresan kanal görüntülerini seçin. Individual Channel kısmında, her kanal için bir renk seçin (örneğin DAPI kanalı için Blue ve TL kanalı için Monochrome).
    4. Color overlay kısmında; BRIGHTFIELD, RED, BLUE ve GREEN kanallarına karşılık gelen kanalları sırasıyla seçin (renkli bindirme için renk dalga boyunu seçin). Sayıyı (Number) 100 olarak ayarlayın; önizleme görüntüsünü gözlemleyin ve önizleme sonucunu kabul edin.
    5. Çıktı (output) kısmında, dışa aktarılan görüntülerin saklanacağı klasörü Export to folder seçeneğiyle belirleyin. Çalıştırmayı (run) başlatın.
      NOT: Aynı partiye ait görüntüler ayrı ayrı dışa aktarılmamalıdır; bir görüntü partisi, tamamen tutarlı deneysel koşullar altında elde edilen dört temel örnekten (negatif kontrol, pozitif kontrol, temel kontrol grubu ve hedef deney grubu) oluşan görüntü koleksiyonunu ifade eder.
  8. Görüntü işlem yöntemlerinin karşılaştırılması
    1. 9 görüş alanı seçin ve canlı ve ölü hücrelerin geleneksel manuel sayımını; canlı hücreler, ölü hücreler ve ölü/canlı hücre oranının sayımı için Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME ve ImageJ yöntemleriyle karşılaştırın. Farkları analiz etmek için GraphPad Prism versiyon 10.1 kullanarak tek yönlü ANOVA ve beraberinde Tukey'nin çoklu karşılaştırma testini uygulayın.
    2. 81 görüş alanı seçin ve hücre sayımı, alan ve yoğunluk açısından Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME ve ImageJ yöntemleri arasındaki farkları karşılaştırın. Farkları analiz etmek için GraphPad Prism versiyon 10.1 kullanarak tek yönlü ANOVA ve beraberinde Tukey'nin çoklu karşılaştırma testini uygulayın.
      NOT: Hücre kültürü ve boyama deneyleri bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilmelidir. Atık sıvıları, uçları ve diğer deneysel atıkları laboratuvar düzenlemelerine göre imha edin. Deney boyunca tam koruma sağlandığından emin olun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Standartlaştırılmış hazırlığın görüntüleme kalitesi üzerindeki etkisi

Cihazın hücre görüntü katmanını güvenilir bir şekilde konumlandırabilmesini sağlamak için plaka parametreleri yapılandırılmıştır. Orta derecede konfluensle tek bir hücre katmanı şeklinde hazırlanan örnekler, farklı objektif büyütmelerinde görüntü odağını kolaylaştırmış; görüntü tanıma ve kantitatif analizi iyileştirmiştir. Standardize edilmiş örnek hazırlama ve optimize edilmiş plaka parametreleri; kenar etk...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hücre canlılığını belirlemek için PI ve Hoechst çift boyama yönteminin kullanılması durumunda, örneğin yüksek içerikli analiz cihazı, yerleşik algoritma modüllerini kullanarak aynı partideki hücre canlılığını hızlı ve yüksek verimlilikte hesaplayabilir. Bu yöntemin düşük örnek hacmi, düşük maliyet, minimum hücre hasarı, zayıf floresan ağarma, sönümlenmeye karşı direnç ve birden fazla görüntü yakalayabilme yeteneği gibi çeşitli avantajları vardır. Ek olarak, 96 kuyucuklu bir plaka için görüntüleme süresi genellikle sadece...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Makalenin çevirisi sırasında Zhipu AI, yalnızca çeviri amacıyla kullanılmış; araştırma verileri, deneysel sonuçlar veya temel akademik içerik oluşturmak için kullanılmamıştır. Yazarlar, makalenin içeriğiyle ilgili tüm sorumluluğu üstlenmektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Okul Vakfı tarafından sağlanan destek için teşekkür ederler. Yazarlar, MPRC2022034 hibe desteği için teşekkür ederler. Bu finansman, basit obez fareleri tedavi etmek için Erchen Dekoksiyonu içindeki bağırsak bakterileri için 3B dinamik görüntüleme yöntemi geliştirmek amacıyla kullanılmıştır. Yazarlar, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Çin Tıbbı ve Eczacılığı İnovatif Enstitüsü ile Disiplinlerarası Çalışmalar Enstitüsü tarafından sağlanan araştırma platformunu takdirle karşılamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 mL Santrifüj TüpüLabigic Technology Co., Ltd.MCT-001-150
1000 µL Pipet UcuLabigic Technology Co., Ltd.35423003E
15 mL Santrifüj TüpüLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-15A
2,5 µL Pipet UcuQingdao Haier Biomedical Co., Ltd.B10T
200 µL Pipet UcuLabigic Technology Co., Ltd.T-001-200
50 mL Santrifüj TüpüLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-50A
96 Kuyucuklu Hücre Kültür PlakasıCorning Incorporated3599
Ayarlanabilir Tek Kanallı Pipet, 0,1–2,5 μLEppendorf SE3120000216
Ayarlanabilir Tek Kanallı Pipet, 100–1000 μLEppendorf SE3120000267
Ayarlanabilir Tek Kanallı Pipet, 20–200 μLEppendorf SE3120000259
Ayarlanabilir Tek Kanallı Pipet, 2–20 μLEppendorf SE3120000232
Hücre Kültür KabıCorning Incorporated430167
Kriyojenik TüplerLabigic Technology Co., Ltd.BS-20-ST
Dimetil sülfoksit (DMSO)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.D8371
Dulbecco Modifiye Eagle Besiyeri (DMEM)Life Technologies Limited11966-025Bu çalışmada, tam DMEM; %10 FBS, %1 Penisilin-Streptomisin Çözeltisi ve %89 DMEM kullanılarak hazırlanmıştır.
ESCO CelCulture CO2 İnkübatörüEsco Micro Pte. Ltd.CCL-170B-8
Fetal Bovin Serum (FBS, Süper İnce)Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.164210-50
Hoechst 33342 Floresan BoyalarıBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.B8040
HT22 hücresiProcell Life Science & Technology Co.,Ltd.CL-0697
ImageJNational Institutes of HealthImageJ, makalede kullanılan görüntü işleme yazılımlarından biridir.
ImageXpress Micro Konfokal Yüksek İçerikli Görüntüleme SistemiMolecular Devices, LLCImageXpress Micro ConfocalMakalede, cihaz ismi yerine "Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi" ifadesini kullanın.
Düşük hızlı dondurma santrifüjüHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.L530R
MetaXpress Yüksek İçerikli Görüntüleme ve Analiz YazılımıMolecular Devices, LLCYazılım, ImageXpress® Micro Konfokal Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi'nin tamamlayıcısıdır. Makalede "Cihazla birlikte sağlanan analiz yazılımı" ifadesi bu yazılıma atıfta bulunmaktadır.
OptiMair Dikey Laminer Akış KabiniEsco Micro Pte. Ltd.ACB-4E1
Parafilm MPechiney Plastic Packaging Inc.PM996
PBS Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd YC-5013
Penisilin-Streptomisin ÇözeltisiProcell Life Science & Technology Co.,Ltd.PB180120
Propidyum İyodür Çözeltisi (PI)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.C0080
Trypsin-EDTA ÇözeltisiBasalMedia Technology Co.,Ltd.S310KJ

Kaynaklar

  1. Dariolli R, Nir R, Mushlam T, Souza GR, Farmer SR, Batista ML. Optimized scaffold-free human 3D adipose tissue organoid culture for obesity and disease modeling. SLAS Discovery. 2025;31:100218.
  2. Menduti G, Boido M. Recent advances in high-content imaging and analysis in iPSC-based modelling of neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 2023;24(19).
  3. Park JC, Mook-Jung I. Toward brain organoid-based precision medicine in neurodegenerative diseases. Organoid. 2022;2.
  4. Geyer M, Schreyer D, Gaul LM, Pfeffer S, Pilarsky C, Queiroz K. A microfluidic-based PDAC organoid system reveals the impact of hypoxia in response to treatment. Cell Death Discovery. 2023;9:20.
  5. Huang CJ, Shieh PC, Yang JS, et al. Pterostilbene suppressed cell viability, induced apoptosis and autophagy of cisplatin-resistant gastric cancer cells. Anticancer Res. 2025;45(2):511-523.
  6. Wang G, Li Y, Sun T, et al. BMSC affinity peptide-functionalized β-tricalcium phosphate scaffolds promoting repair of osteonecrosis of the femoral head. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):204.
  7. Uzoechi SC, Collins BE, Badeaux CJ, et al. Effects of amyloid beta (aβ) oligomers on blood–brain barrier using a 3D microfluidic vasculature-on-a-chip model. Appl Sci. 2024;14(9). doi:10.3390/app14093917
  8. Pereira JD, DuBreuil DM, Devlin AC, et al. Human sensorimotor organoids derived from healthy and amyotrophic lateral sclerosis stem cells form neuromuscular junctions. Nat Commun. 2021;12(1):4744.
  9. Cromwell EF, Leung M, Hammer M, Thai A, Rajendra R, Sirenko O. Disease modeling with 3D cell-based assays using a novel flowchip system and high-content imaging. SLAS Technol. 2021;26(3):237-248.
  10. Tabęcka-Łonczyńska A, Skóra B, Szlachcikowska D, et al. Impact of Hericium erinaceus and Ganoderma lucidum metabolites on AhR activation in neuronal HT-22 cells. Pharmacol Rep. 2025;77(6):1557-1572.
  11. Tang J, Chen R, Wang L, et al. Melatonin attenuates thrombin-induced inflammation in BV2 cells and then protects HT22 cells from apoptosis. Inflammation. 2020;43(5):1959-1970.
  12. Zhang W, Sun H, Zhao W, Li J, Meng H. Suppression of JNK pathway protects neurons from oxidative injury via attenuating parthanatos in glutamate-treated HT22 neurons. Sci Rep. 2024;14(1):25793.
  13. Thoudam T, Chanda D, Lee JY, et al. Enhanced Ca2+-channeling complex formation at the ER-mitochondria interface underlies the pathogenesis of alcohol-associated liver disease. Nat Commun. 2023;14(1):1703.
  14. Huang Z, Zhang Q, Wang Y, et al. Inhibition of caspase-3-mediated GSDME-derived pyroptosis aids in noncancerous tissue protection of squamous cell carcinoma patients during cisplatin-based chemotherapy. Am J Cancer Res. 2020;10(12):4287-4307.
  15. Andreyev AY, Yang H, Doulias PT, et al. Metabolic bypass rescues aberrant S-nitrosylation-induced TCA cycle inhibition and synapse loss in Alzheimer’s disease human neurons. Adv Sci. 2024;11(12):2306469.
  16. Backström A, Kugel L, Gnann C, et al. A sample preparation protocol for high throughput immunofluorescence of suspension cells on an adherent surface. J Histochem Cytochem. 2020;68(7):473-489.
  17. Hongxing Tang et al. Protective effects of hinokitiol on neuronal ferroptosis by activating the Keap1/Nrf2/HO-1 pathway in traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2024;41(5-6):734-750.
  18. Teerawonganan P, Hasriadi, Dasuni Wasana PW, et al. Synthesis, cytotoxicity, and mechanistic evaluation of tetrahydrocurcumin-amino acid conjugates as LAT1-targeting anticancer agents in C6 glioma cells. Int J Mol Sci. 2024;25(20):11266.
  19. Shihan MH, Novo SG, Le Marchand SJ, Wang Y, Duncan MK. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 2021;25:100916.
  20. Gomez-Dopazo G, Nieves RJA, Rivera RLA, et al. Cellulose acetate microwell plates for high-throughput colorimetric assays. RSC Adv. 2024;14(22):15319-15327.
  21. DuBreuil DM, Chiang BM, Zhu K, et al. A high-content platform for physiological profiling and unbiased classification of individual neurons. Cell Rep Methods. 2021;1(1).
  22. Ronzetti M, Simeonov A. A comprehensive update on the application of high-throughput fluorescence imaging for novel drug discovery. Expert Opin Drug Discovery. 2025;20(6):785-797.
  23. Jiang X, Li M, Wang Y, et al. 1,2,4,5-tetrazine-tethered probes for fluorogenically imaging superoxide in live cells with ultrahigh specificity. Nat Commun. 2023;14(1):1401.
  24. Yu Y, Chen J, Zhang X, et al. Identification of anti-inflammatory compounds from zhongjing formulae by knowledge mining and high-content screening in a zebrafish model of inflammatory bowel diseases. Chin Med. 2021;16(1):42.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Görüntüleme İş AkışıHücre CanlılığıPI Hoechst BoyamaHT22 HücreleriGörüntü İşleme YöntemleriÇok Dalga Boylu Hücre SkorlamaCanlı-Ölü AnaliziImageJ Karşılaştırması

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.