Yöntem makalesi

Mikroglia'da Tau Clearance'ın Zamanla Çözülmüş Ölçümü için Bölünmüş-Luciferase Tamamlama Testi

DOI:

10.3791/71870

⸱

24 Temmuz 2026

 ,  ,  , 
1Neuroscience and Behavior Graduate Program, University of Massachusetts Amherst, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts Amherst, 3Molecular and Cellular Biology Graduate Program, University of Massachusetts Amherst

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevli mikroglialarda mikroplaka tabanlı lüminesans sistemi kullanarak hücre dışı tau'nun klirensini ölçmek için hassas, zaman çözümlülüğüne sahip bir nicel platform tanımlıyoruz. Bu yaklaşım, mikro kuyu formatında tau bozulma kinetiklerinin hassas tespitini sağlar ve çeşitli deneysel koşullarda tau yönetiminin yüksek verimli sorgulanmasını sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkezi sinir sisteminin yerleşik bağışıklık hücreleri olarak mikroglia, beyin homeostazının merkezi düzenleyicileri ve nörodejeneratif hastalıkların ana aracılarıdır. Bu hücreler sürekli olarak sinir ortamını inceler ve patolojik tau gibi yanlış katlanmış ve agregasyona uğramış proteinler dahil olmak üzere hücre dışı substratların tanınması, içselleştirilmesi ve bozulmasında kritik bir rol oynarlar. Mikrogliyanın tau temizlenmesinde rol oynadığını gösteren artan kanıtlara rağmen, tau alımı ve bozulmasını ölçmek için mevcut yaklaşımlar, bu dinamik süreçleri tam olarak yakalamak için gereken zamansal çözünürlük ve hassasiyetten yoksundur. Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) türevli mikroglialarda tau temizlemeyi nicel olarak izlemek için lülümensans tabanlı bir test geliştirdik. Bu platform, canlı hücrelerde tau'nun son derece hassas ve gerçek zamanlı tespitini sağlamak için bölünmüş lusiferaz tabanlı bir tamamlama sistemini kullanır ve böylece hücre içi işlemlerinin hassas şekilde izlenmesini sağlar. Bu test, birden fazla hücre tipi arasında ölçeklenebilir ve uyarlanabilir olup, Alzheimer hastalığı da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıklarda endolizozomal yolları ve tau yönetimini yöneten hücresel mekanizmaları sorgulamak için çok yönlü bir araç sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alzheimer Hastalığı (AD) dahil olmak üzere tauopatiler, mikrotubul ilişkili protein tau'nun sinirdevreleri 1,2 boyunca toplanması ve yayılması ile karakterize edilir. Glia, tau hastalığı dinamiklerinin düzenleyicisi olarak giderek daha fazla takdir görmektedir; bunlar arasında alım, bozulma veyayılım 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Glia'nın tauopatilere nasıl katkıda bulunduğunu anlamak, nöroinflamasyon ve tau yayılması dahil olmak üzere temel hastalık dinamiklerinin çözümünde acil bir endişedir. Glial popülasyonlar arasında, mikroglia - beynin yerleşik fagositleri - tau temizleme aracılığı için benzersiz bir konuma sahiptir.

Mikroglialarda tau işleme mekanizmalarının aydınlanma ihtiyacına rağmen, mevcut testlerin çözünürlüğü ve verimliliği açısından alan sınırlıdır. Tau içselleştirmesi, hücre içi trafik ve hücresel temizleme ile ilgili temel sorular hâlâ çözülmemiştir. Bu adımların her biri mekanik olarak farklı bir süreci temsil eder: alım, plazma zarında ekstrasellüler tau'nun içselleşmesini ifade eder; Ticaret, içsel tau'nun endozomal, lizozomal ve diğer hücre içi bölümler aracılığıyla ayırılması ve taşınmasını içerir; ve degradasyon, öncelikle lizozomal ve proteazomal yollar yoluyla Tau'nun proteolitik parçalanmasını ifade eder. Bu adımlar hücre dışı tau işleme için ardışık olsa da, içselleştirilmiş tau, bozulma mekanizmasına ulaşmadan önce hücre içi bölmelerden geçmek zorundadır; bağımsız olarak düzenlenir ve belirli bir deneysel bozulma bir adımı diğerlerini değiştirmeden bir adımı etkileyebilir. Örneğin, hücre içi tau sinyalindeki azalma, alımın bozulması, bozucu bölmelerden yanlış yönlendirme veya artan bozulma anlamına gelebilir. Bu süreçlerin çözümü, protein varlığını tespit edebilen ve mevcut ölçümlerle birleştirilerek protein kaderini zamanla belirleyebilen yeni analiz platformları gerektirir.

Tau içselleştirme ve bozulmayı çözmeye yönelik mevcut yöntemler, tau türlerinin alımı, hücrealtı lokalizasyonu ve hücre içi işlemesini nicelikten ölçemek için immünositokimya, akış sitometrisi, western blotting ve floresan etiketlemeyaklaşımlarına dayanır 13,14,15,16,17,18 . Ancak, bu yaklaşımların her biri protein temizlenme dinamiklerinin incelenmesine uygulandığında temel sınırlamalara sahiptir. İmmünositokimya ve western blotting, düşük bolluklu tau türlerini tespit etme hassasiyetinden yoksun ve emek yoğundur. Akış sitometrisi ve floresans tabanlı testler, protein klirensi hakkında sadık bir rapor yapmaz çünkü floroforlar, konjuge protein19 parçalandıktan sonra da devam edebilir ve böylece floresan sinyal ilgi konusu proteinin gerçek kaderinden ayrılır. Bu kısıtlamalar birlikte, mevcut hiçbir yöntemin aynı anda tau temizleme dinamiklerini nicel olarak takip etmek için gereken hassasiyeti, zamansal çözünürlüğü ve ölçeklenebilirliği sağlayabilmesi kritik bir boşluk bırakır. Bu nedenle, mikroglialarda tau işleme dinamiklerini anlamada ilerleme sürecindeki büyük bir engel, canlı hücrelerde tau temizlemesini ölçmek için nicel, zaman çözünürlüğüne sahip ve yüksek verimli testlerin eksikliğidir.

Canlı tau dinamiklerini izlemek için nicel bir platformun eksikliğini gidermek amacıyla, hücre içi tau protein dinamiklerini tespit etmek için kullanılabilecek hassas bir lüminesans tabanlı test geliştirdik. Bu yaklaşım, küçük bir peptit etiketi (Yüksek Afinity Binary Technology veya HiBiT) tau'ya birleştirilerek canlı hücrelerde kinetik ölçümlerin yapılmasını sağlayan split-luciferaz tabanlı bir tamamlama sistemi kullanır. Tamamlayıcı bağlanma ortağı (Büyük İkili Teknoloji veya LgBiT) ile etkileşime girdiğinde, etiketlenmiş protein aktif bir lusiferaz enzimini yeniden oluşturur ve nicel bir biyolüminesanssinyal 20,21,22 üretir. Bu parlak sinyal, protein bolluğunun doğrudan ve hassas bir okumasını sağlar ve zamanla hücre içi seviyelerdeki değişikliklerin dinamik izlenmesini sağlar. Sonuç olarak, lüminesans hücre içi bozulma örneğinde olduğu gibi protein varlığını veya kaybını sağlam bir raporlayıcı olarak kullanabilir. Bu platform, tau yönetiminin kesin ve zamansal çözümlü bir ölçüm yapılmasını sağlar ve protein dönüşümünü incelemek için geniş uygulanabilir bir strateji sunar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hücresel deneyler, Massachusetts Üniversitesi Amherst Çevre ve Sağlık Hizmetleri tarafından onaylanmış uygun bir Biyogüvenlik Seviye 2 laboratuvarında gerçekleştirildi.

1. Tau-SLP proteininin ifadesi, arındırılması ve endotoksin çıkarımı

  1. Bölünmüş lusiferaz peptidi veya SLP etiketini (VSGWRLFKKIS) bir Tau yapısına ekleyerek standart klonlama yöntemleri, örneğin Gibsonassembly 23 kullanılarak etiketlenmiş bir yapı (Tau-SLP) oluşturulur.
    NOT: Split-lusiferaz peptid etiketinin tamamlayıcılığı, C-terminalinde, N-terminalinde veya 2N4R Tau24'ün iç bölgelerinde bulunduğunda sağlam bir sinyal üretir.
  2. Tau-SLP'yi daha önce tanımlananyöntemler 25,26 ile eksprese edin ve arındırın, SDS-PAGE ve bağışıklık oblotasyonu ile saflığı sağlayın.
  3. Mikroglial hücrelerle kullanım için, Tau-SLP saflaştırmasından sonra bakterik endotoksin uzaklaştırılan yayımlanmış protokollere uyarak karıştırıcı tepkiteliğisınırlamak için 27.
  4. Tau-SLP protein konsantrasyonunu standart bir bicinchoninic asit testi (BCA) veya Bradfordtesti 28,29 kullanarak nicelikleştirin.
  5. Istenirse, daha önce tanımlananprotokoller 24'e uygun olarak Tau-SLP'yi birleştirin.
  6. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, ticari olarak mevcut bir lusiferaz substratı ve tamamlayıcı reaktifi kullanarak standart bir eğri oluşturarak Tau-SLP'nin fonksiyonel lüminesansını doğrulayın (bkz. Malzemeler Tablosu).

2. iPSC-türev mikroglia (iTF-Microglia) kültürü

  1. Uygun kültür ortamında %5 CO2 ile 37 °C sıcaklıkta mikroglial hücreler kültürlenin.
  2. Altı doksisiklin indüklenebilir transkripsiyon faktörü barındıran indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) hattını farklılaştırarak doğrulanmış bir protokol30 kullanarak mikrogliyal benzeri bir hücre (indüklenmiş transkripsiyon faktörü mikroglia benzeri veya iTF-Mikroglia) üretin (bkz. Materyaller Tablosu).
    NOT: Bu test sadece iTF-Microglia ile sınırlı değildir ve herhangi bir yapışkan hücre hattıyla kullanılabilir. Diğer hücre hatlarıyla çalışırken boşalma süreleri için optimizasyon gerekebilir.

3. Tau Temizleme Testi

  1. 24 kuyu ölçülü bir plakaya, her kuyu başına 1 x 105 hücre yoğunluğunda, her koşul başına üçlük olarak, kültür ortamı (250 μL) ile birlikte 24 kuyruklu bir plakaya alın ve gece boyunca 37 °C ve %5CO2 sıcaklıkta kuluçka yapın (Şekil 1A).
  2. Kültür ortamını çıkarın, hücreleri bir kez PBS (250 μL) ile yıkayın ve yerine 250 μL kültür ortamı verin.
  3. Tau-SLP temizlemesini zamansal olarak ölçmek için, hücreleri kademeli bir şekilde Tau-SLP'ye maruz bırakın; böylece tüm kuyular aynı anda hasat edilir ve sadece temizleme süresi açısından farklılık gösterir. Örneğin, 0 saat, 2 saat ve 4 saat temizleme grupları için, önce 4 h grubuna 100 nM Tau-SLP içeren ortam, sonra 1 saat sonra 2 h grubuna ve son olarak 1 saat sonra 0 h grubuna ekleyin (zamanlama önerileri için Şekil 1B'ye bakınız). Son içselleştirme dönemi tamamlandığında, tüm kuyular aynı Tau-SLP maruziyet döneminden geçmiş olacak ancak sadece temizleme süresi açısından farklılık gösterecektir (Şekil 1B).
  4. Arka plan çıkarma için Tau-SLP tedavisi almayan kuyuları dahil edin (Şekil 1C).
  5. İçselleştirme süresinin sonunda, Tau-SLP içeren ortamı çıkarın. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayarak ekstrahücre Tau-SLP'yi çıkarın ve yerine Tau-SLP içermeyen kültür ortamı ile değiştirin.
  6. Hücreleri belirlenen temizleme süresi için kuluçka yapın (Şekil 1A). Içselleştirme döneminden hemen sonra hasat edilen 0 saat temizlik grubu, temizleme aşamasının başında içselleştirilmiş Tau-SLP'nin toplam miktarını temsil eder.
  7. Tüm temizleme zaman noktalarını takip ederek, kuyulardan ortam çıkarın ve 250μL PBS ile yıkayın.
  8. Her birini 250 μL Tripsin-EDTA 0.25% ile 37 °C'de 5 dakika boyunca iyi tedavi edin. Bu adım, yüzeye bağlı tau'yu kaldırarak parlaklığın içsel Tau-SLP'yi yansıtmasını sağlar. Her kuyuyu 250 μL tripsin inhibitörü (5 mg/mL) ile nötralize edin.
  9. Her kuyuyu, uygun şekilde etiketlenmiş 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü ve pelet ile santrifüjle (500 x g, 5 dakika) toplayın.
  10. Lusiferaz substratı ve tamamlayıcı bileşenleri içeren uygun miktarda lizis tamponu hazırlayın ( bkz. Malzeme Tablosu; 50 μL x # kuyu + %10).
  11. Her bir süpernatantı aspirasyon pipetiyle çıkarır ve hücre pelletini lusiferaz substratı ve komplement bileşenleri içeren 50 μL liz tamponunda yeniden askıya alın. Bu, bölünmüş lusiferaz tamamlama kompleksi üretir ve lüminesans üretir (Şekil 1D).
  12. Lizlenmiş hücreleri beyaz, yarı hacimli 96 kuyu plakasına aktarın.
  13. Hücre pelletlerinin tam olarak analiz edilmesini sağlamak için oda sıcaklığında (~23 °C) 10 saniye orbital sallanma ile mikroplaka okuyucuda lüminesansı okun.
  14. Tau-SLP bolluğunu, önce Tau-SLP'ye maruz kalmamış kuyulardan elde edilen ortalama lülümensans değerini çıkararak normalleştirilmiş Tau-SLP bolluğunu belirleyin. Her değeri 0 h temizleme grubunun ortalama arka plan çıkarılmış sinyaline normalize edin.
  15. Normalize edilmiş Tau-SLP bolluğunu temizleme süresinin bir fonksiyonu olarak çizin. Lüminesansın ilerleyici bir azalması, hücre içi Tau-SLP bolluğunda azalma gösterir ve Tau-SLP boşluğu olarak yorumlanırken, stabil lüminesans değerleri bozulmuş veya gecikmiş boşalma anlamına gelir. Yüzde temizlemeyi şu şekilde hesaplayın: % Temizleme = [1 − (RLUt / RLUt = 0)] x 100.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu hassas lüminesans tabanlı testi kullanarak, insan iPSC'den türetilen mikroglialarda senkronize bir alım dönemi sonrası hücre içi Tau-SLP bolluğu zaman içinde izlenebilir. Tau-SLP yıkamasının ardından lüminesans sürekli olarak azaldı ve bu, hücre içi Tau-SLP klirensi ile uyumludur. Bu platform, mikroglia ile monomerik ve fibrillar Tau-SLP türlerinin tutuluşundaki farklılıkları tespit edecek kadar hassastı. Monomerik Tau-SLP iTF-Microglia'da 60 dakika içinde tamamen temizlenirken, fibrillar Tau-SLP 240 dakikadan fazla sürede kalmıştır (Şekil 2A). Ayrıca, mutant tau (örneğin, N279K) ile yapılan testi temizlik kinetiklerini değerlendirmek için yaptık ve TauN279K-SLP'nin sadece kısa temizlenme zaman noktalarında (15 dakika) belirgin şekilde azalmış clearance kinetik gösterdiğini bulduk (Şekil 2B). Bu sonuçlar, gözlemlenen bozulmanın yalnızca bu testin yüksek hassasiyeti nedeniyle belirgin olabileceğini göstermektedir. Lizozomal salımı doğrulamak için küçük molekül L-Leucyl-L-Leucine metil esteri (LLOMe) kullanılarak Tau-SLP bozulma deneyi gerçekleştirdik. LLOMe, lizozomal zarları geçirimlileştiren ve lizozomal aktiviteyi bozan bir katepsin Csubstratıdır 31. LLOMe tedavisiyle, t=0 seviyesinde Tau-SLP sabit durum seviyelerinin anlamlı artışını (Şekil 3A) ve bozulma oranının anlamlı şekilde azaldığını (Şekil 3B) gözlemledik; 60 dakikalık temizlenme süresinden sonra Tau-SLP'nin 4 kat artışı kalmıştır. Son olarak, hücre tipleri arasında uyumluluğu doğrulamak için iPSC kaynaklı nöronlarda Tau-SLP temizleniş testi yaptık. Burada, iPSC kaynaklı nöronların hem monomerik (Şekil 4A) hem de fibril formları (Şekil 4B) için azalmış klirens kinetiklerine sahip olduğunu gördük. En dikkat çekici özellik, Tau-SLP fibril seviyeleri 240 dakikalık bir boşalma süresi boyunca ~%100 seviyesinde sabit kalırken, aynı zaman diliminde iTF-Microglia'da Tau-SLP fibril seviyeleri %50'nin altına düşmüştür. Bu sonuçlar, split-lusiferaz tabanlı tamamlayıcı platformumuzun Tau-SLP'nin hücre içi endolizozomal klirensinin sağlam ve güvenilir bir tespitini sağladığını ve çok sayıda diğer protein veya hücre tipine uygulanabilecek son derece uyarlanabilir bir test tasarımı sergilediğini göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Tau-SLP temizleme testinin temsil deneysel tasarımı. (A) Bu test için kullanılan iTF-Mikroglia'nın temsil parlak alan görüntüsü (ölçek çubuğu = 100μm) (B) İnsan mikrogliaları (iTF-Microglia) rekombinant 2N4R-SLP'ye kademeli şekilde maruz kalır, böylece sağlam lüminesans tabanlı tespit sağlanır. 1 saatlik kuluçkadan sonra, hücre dışı tau ortam değişimiyle çıkarılır ve hücreler PBS ile yıkanır. Hücreler, hasat öncesi ilgili temizleme dönemleri (0 saat, 2 saat, 4 saat) bazal ortamda tutulur. Son noktada hücreler lizize edilir ve lüminesans ölçülür. (C) Monomerik ile fibrillar bozunmayı karşılaştıran Tau-SLP boşluğunu ölçmek için önerilen plaka tasarımı. (D) Tau-SLP proteini hücrelere içselleştirilir ve lizozomal bozunmaya yönlendirilir. LgBiT eklenmesi, hücrede kalan Tau-SLP miktarının tamamlayıcı ve lüminesans üretimi yoluyla nicel bir şekilde okunmasını sağlar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: iTF-Microglia temiz ekstrasellüler Tau-SLP. (A) iTF-Microglia, monomerik Tau-SLP (100nM) veya fibrillar Tau-SLP (50nM) ile maruz kaldı, örnekler ise ilgili başlangıç alımına (t = 0; %100) ve Tau-SLP'ye maruz kalmamış hücrelere (%0) normalize edildi (ortalama ± SD; n = 9 üç bağımsız farklılaşmadan). (B) iTF-Microglia, monomerik Tau-SLP veya TauN279K-SLP (100nM) ile kuluçka edildi ve örnekler ilgili başlangıç alımına (t = 0; %100) ve Tau-SLP'ye maruz kalmamış hücrelere (%0) (ortalama ± SD) normalleştirildi; n ≥ 7 üç bağımsız farklılaştırmadan; ∗ p < eşleşmemiş Welch t-testini kullanarak 0.05). Veriler Shultz ve ark., 2025,24'ten yeniden basılmış ve Creative Commons Atıfı (CC BY 4.0) lisansı altında kullanılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Lizozomal inhibisyon, Tau-SLP klirensini zayıflatır. (A) 24 saat boyunca 1mM lizozomal inhibitörü L-Leucyl-L-Leucine metil esteri (LLOMe) ile tedavi, H4 nöroglioma hücrelerinde başlangıç Tau-SLP alımını (t = 0) artırdı (ortalama ± SD; n = 9 bağımsız kültür; ∗ p < 0.05 eşleşmemiş Welch t-testi ile). (B) 24 saat boyunca LLOMe (1 mM) ile tedavi, 60 dakikalık temizlik süresi (t = 60 dakika) sonra Tau-SLP RLU'yu araç (DMSO) ile karşılaştırıldığında %% normalleştirilmiş hale getirdi. Lüminesans sinyal, Tau-SLP'ye maruz kalmamış hücrelere (%0) ve Tau-SLP'ye maruz kalmamış hücrelere (%0) normalize edilir (ortalama ± SD; n = 9 bağımsız kültür; ∗∗∗∗ p < 0.0001, ∗ p < 0.05 ile eşleşmemiş Welch t-testi ile). Veriler Shultz ve ark., 2025,24'ten yeniden basılmış ve Creative Commons Atıfı (CC BY 4.0) lisansı altında kullanılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: iTF-Microglia ve iNeuronlar, Tau-SLP klirensinde farklılıklar gösterir. (A) iTF-Microglia veya iNöronlar monomerik Tau-SLP (100nM) ile kuluçka edildi, örnekler ilgili başlangıç alımına (t=0; %100) ve Tau-SLP'ye maruz kalmamış hücrelere (%0) (ortalama±SD; n ≥ 6, iki-üç bağımsız farklılaşmadan normalize edildi; ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗∗ p < 0.0001 iki yönlü ANOVA kullanıldı; zaman: F(1, 28) = 7.489, p = 0.0107; hücre tipi: F(1, 28) = 46.61, p < 0.0001; etkileşim: F(1, 28) = 3.229, p = 0.0831; Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi, şekilde belirtilen p değerleri, t=0 değerleri referans olarak gösterilmiştir ancak istatistiksel analizden hariç tutulmuştur. (B) iTF-Microglia veya iNöronlar fibrillar Tau-SLP (50nM) ile kuluçka edildi, örnekler kendi başlangıç alımına (t=0; %100) ve Tau-SLP'ye maruz kalmamış hücrelere (%0) normalize edildi (ortalama±SD; n ≥ 6, iki ile üç bağımsız diferensiasyon; ∗∗ p <0.01, ∗∗∗∗ p < 0.0001 iki yönlü ANOVA kullanılarak; zaman: F(1, 26) = 0.3888, p = 0.5384; hücre türü: F(1, 26) = 43.09, p < 0.0001; etkileşim: F(1, 26) = 1.209, p = 0.2816; Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi, şekilde belirtilen p değerleri, t=0 değerleri referans olarak gösterilmiştir ancak istatistiksel analizden hariç tutulmuştur. Veriler Shultz ve ark., 2025,24'ten yeniden basılmış ve Creative Commons Atıfı (CC BY 4.0) lisansı altında kullanılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu test, mikroglia ile yüksek hassasiyet ve zamansal çözünürlükle ekstrasellüler Tau-SLP clearansını ölçmek için ölçeklenebilir ve nicel bir platform sağlar. Geleneksel görüntüleme tabanlı yaklaşımların aksine, genellikle zahmetli örnek işleme gerektiren ve veri ile zaman örnekleme açısından sınırlı olan bu lüminesans tabanlı sistem, mikroplaka formatında tau yönetiminin doğrudan, popülasyon düzeyinde nicelenmesini sağlar. Ortaya çıkan okuma, ekstraselüler tau'ya maruz kaldıktan sonra Tau-SLP clearansının nicel bir ölçümü sağlar. Ölçümler birden fazla zaman noktasında ve daha uzun kuluçka dönemlerinde tekrar tekrar elde edilebildiği için, bu test tau alımı ve temizlik dinamiklerinin yüksek verimli, kinetik olarak çözülmüş bir analizini mümkün kılar. Ayrıca, zaman içinde lüminesanstaki değişiklikler, hücre içi Tau-SLP bolluğundaki değişikliklerle tutarlıdır, ancak taşıma, bozulma veya salgı arasında tamamlayıcı yaklaşımlar olmadan ayrım yapılmaz. Tau-SLP etiketleme, ortakçalışmamızda tau alımını veya toplanmasını anlamlı şekilde değiştirmese de, dış etiketler diğer proteinlerin davranışını etkileyebilir. Bu nedenle, test bulguları ortogonal yaklaşımlarla tamamlanmalı ve mümkün olduğunda etiketlenmemiş tau preparatlarıyla karşılaştırılmalıdır. Ek bir sınırlama olarak, bu testin endozen tau veya hastadan kaynaklanan patolojik tau agregaları yerine rekombinant Tau-SLP türleri kullanılmasıdır. Rekombinant 2N4R tau, tekrarlanabilir deneysel bir alt tabaka sağlarken, insan hasta beyinlerinden izole edilen tau türlerinin endojen heterojenliğini (yani translasyon sonrası modifikasyonları) tam olarak tekrarlamaz. Rekombinant tau proteininin in vitro fosforilasyonu için birçok protokol mevcuttur ve bu iş akışına kolayca dahil edilebilir. Bu platform ayrıca endozen tau'nun incelenmesine de uyarlanabilir; bu, tau (MAPT) lokusunda bir SLP etiket dizisinin dahil edilmesi için genetik mühendislik kullanılmasını gerektirir.

Önemli olarak, sinyal indirgeniminin bozulma olarak yorumlanması, örneğin tripsizasyon veya eşdeğer soyma adımları yoluyla hücre dışı ve yüzeye bağlı tau'nun etkili şekilde uzaklaştırılmasına bağlıdır. Etkili çıkarma sağlanmazsa yanlış negatifler meydana gelebilir. Tau bozulmasının yanlış pozitif olarak yorumlanacak görünen sinyal kaybı da mümkündür. Bu, hücre ayrılması veya ölümü, Tau-SLP salgısı veya SLP'yi tau'dan ayıran proteolitik bölünme ile proteini bozgunlaştırmadan kaynaklanabilir. Buna göre, lüminesanstaki azalmalar, lizozomal bozulmanın doğrudan ölçülmesi yerine hücre içi Tau-SLP bolluğundaki azalmalar olarak yorumlanmalıdır. Sinyal değişikliklerini lizozomal bozulmaya daha kesin olarak bağlamak için ortogonal doğrulama stratejileri önerilir. Bunlar, bafilomisin A1 veya LLOMe ile tedavi gibi lizozomal fonksiyonun farmakolojik bozulmasını (Şekil 3) ve alım ile bozulma kinetiği arasındaki dengeyi çözmek için darbe peşinde deneysel tasarımları içerebilir.

Bu testin esnekliği, tau alımı, hücre içi taşım ve bozulmayı yöneten mekanizmaların sorgulanması ile insan hücre sistemlerinde tau temizlemenin farmakolojik veya genetik modülatörlerinin taraması için oldukça uygun hale gelir. Burada iPSC kaynaklı mikroglialarda gösterilmiş olsa da, platform diğer hücre tiplerine kolayca uyarlanabilir (Şekil 4), Alzheimer hastalığı ve diğer birincil ve ikincil tauopatiler dahil olmak üzere tau biyolojisi ve nörodejeneratif hastalık modellerinde geniş uygulama imkanı sağlar. Bu test, Tau-SLP'nin hücre dışı maruziyetine ve lüminesans tabanlı tespite dayandığı için, astrositlere, oligodendrositlere veya yaygın kullanılan hücre hatlarına kolayca uyarlanabilir, ancak alım koşullarının optimize edilmesi gerekebilir. Bu yaklaşım topluca, proteostazda yer alan hücresel yolları incelemek ve nörodejeneratif hastalık süreçlerinin mekanik anlayışını geliştirmek için güçlü bir araç sağlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (AG064116, AG077672) alınan hibelerle desteklenmiştir

Malzemeler

```html

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AccutaseThermo ScientificA1110501
Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific12-565-268
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-freeCorning356231
DMEM/F-12, HEPESThermo Scientific11330057
DoxycyclineClontech631311
DPBSThermo Scientific14-190-250
GlutaMAXThermo Scientific35050061
Graphing SoftwareGraphPad Prism (or similar)n/a
Human GM-CSFThermo Scientific300-03
KnockOut DMEMThermo Scientific10829018
Luminescent Plate ReaderSpectraMax i3x (or similar) - Molecular Devicesn/a
Microcentrifuge TubesFisher Scientific02-682-002
Microplate, 96 Well, PS, Half-area, WhiteGreiner675075
mTeSR PlusSTEMCELL Technologies100-0276
Nano-Glo HiBiT Lytic Detection SystemPromegaN3030
Poly-L-Lysine hydrobromide Fisher ScientificICN15017750
Recombinant Human IL-34Thermo Scientific200-34
Recombinant Human M-CSFThermo Scientific300-25
Recombinant Human TGF-β1Thermo Scientific100-21C
Surface Treated Sterile Tissue Culture PlatesFisher ScientificFB012927
Tau-HiBiT proteinIn housen/aTau protein with a VSGWRLFKKIS peptide tag
Trypsin InhibitorSigma AldrichT9128
Trypsin-EDTAThermo Scientific5-200-072
Y-27632 dihydrochlorideBio-techne1254
```

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

N robilimSay 233Say 233Bo De erSayNano GloHiBiTlizozomal degradasyon
Video yakında

İlgili makaleler