Stabil sinek Stomoxys kalsitransının genetik modifikasyonu için verimli bir yetiştirme ve mikroenjeksiyon protokolü

Summary

Bu protokol, yabancı genetik materyali stabil sinek genomuna entegre etmek için güvenilir bir embriyo mikroenjeksiyon yöntemi, enjeksiyon sonrası embriyonik gelişimi izlemek için floresan tarama sistemi ve yumurtadan yetişkinliğe gelişimi destekleyen Escherichia coli ile aşılanmış aktif karbon takviyeli yumurta sarısı agarından oluşan larva yetiştirme substratını tanımlar.

Abstract

Ahır sinekler, hayvanların, evcil hayvanların ve insanların kan besleyici zararlılarıdır ve Antarktika hariç tüm kıtalarda bulunurlar. Hem erkek hem de kadın yetişkinlerin acı verici ısırıkları, hayvanlarda stresle ilgili davranışlara yol açar; bu da kilo kaybına ve üreticiler için önemli ekonomik kayıplara yol açar. Hem erkek hem de dişi stabil sinekler zorunlu kan besleyicilerdir; bu da steril böcek tekniği ve erkeklerin toplu salını gerektiren diğer haşere yönetimi stratejilerine meydan okumaktadır. Mevcut istikrarlı sinek haşere yönetimi stratejileri genellikle sinek popülasyonlarını yeterince kontrol etmekte başarısız olur. Sivrisinekler, Drosophila ve diğer model böcek grupları için dışsal genetik materyal eklemek veya gen etkisini artırmak için çok sayıda genetik manipülasyon yöntemi geliştirilmiş olsa da, kararlı sineklerin genetik dönüşümü için yöntemler sınırlıdır. Bu protokol, piggyBac transpozazının hiperaktif bir varyantı ve embriyonik mikroenjeksiyondan sonra larva iyileşmesi, yumurtadan çıkma, beslenme ve floresan taramayı destekleyen yeni bir katı larva yetiştirme ortamı kullanarak stabil sineklere yabancı genetik materyal eklemek için güvenilir ve geliştirilmiş bir yaklaşımı tanımlar.

Introduction

Stabil sinekler (Stomoxys calcitrans L., 1758) ekonomik açıdan önemli zararlılar ve hayvan hastalıklarının vektörüdür ^1,2,3 ve küresel olarak kozmopolit bir dağılıma sahiptir. Entegre haşere yönetimi (IPM) stratejileri genellikle istikrarlı sinek popülasyonlarını yeterince kontrol^{edemez 2,3} ve yalnızca Amerika Birleşik Devletleri'nde yıllık kayıpların 2 milyar USD'yi aşacağı tahmin edilir³. Ayrıca, Avrupa'da stabil sinek popülasyonlarında böcek ilacı direnci^{belgelenmiş 4,5} ve Amerika Birleşik Devletleri'nde de^{rapor edilmiştir 6}. Sonuç olarak, steril böcek tekniği (SIT) ve gen sürücü sistemleri gibi genetik kontrol yaklaşımları, geleneksel IPM programlarına arzu edilen eklemelerdir.

Stabil sineklerde genetik kontrol yöntemleri geliştirmeye yönelik önceki çalışmalar, SIT için genetik cinsiyet suşlarının oluşturulması dahil, seçici yetiştirme ve radyasyonla indüklenen^{translokasyon 7,8'e} dayanıyordu. Bu yaklaşımlar emek yoğundur ve transgenik olmayan modifikasyonlarla sınırlıdır. Daha sonra, O'Brochta ve diğerleri⁹, Hermes transpozaz sisteminin kullanımının transgenleri S. calcitrans'a entegre edebildiğini gösterdi; ancak protokol, enjekte edilen embriyonların yaklaşık %0,11'inin transjenik yavrular üretmesiyle düşük bir dönüşüm verimliliği sağladı ve dışsal bir promotor 9 kontrolü altında geliştirilmiş yeşil floresan protein (eGFP) belirtecinin zayıf ekspresyonunu sağladı^.

CRISPR-Cas sistemleri dahil olmak üzere diğer genetik manipülasyon yaklaşımları, kısmen stabil sinek embriyolarının dayanıklı korionunu delme zorluğu nedeniyle henüz stabil sineklerde yaygın olarak uygulanmamıştır. Sert dış koryon, diğer kaslı sineklerle^{karşılaştırılabilir 10,11}. Kuvars iğneleriyle koryona enjekte etme veya iki taraflı yapışkan bantla koryonu çıkarma girişimleri başarısız oldu; bu da yumurta çatlama hızını düşüren oksitleyici bir çözelti (%3 sodyum hipoklorit, NaOCl) ile işlem gerektirdi.

Stabil sinekler laboratuvar koşullarında uzun süre korunabilir ve olgunlaşmamış evreler genellikle odun yongası, buğday kepeği veya saman gibi fermente selülozik, azot kaynaklarıyla desteklenen altlıklarda, örneğin buzağı proteini takviyeleri veya balık pulları gibi ürünlerde^{yetiştirilir 12}. Ancak, bu substratlar, mikroenjeksiyonlu embriyoların yetiştirilişinde kullanılırken çeşitli dezavantajlara sahiptir. Opaklıkları ve yüksek otofloresansı, yumurtadan çıkıp substrata kazdıktan sonra GFP pozitif larvaların tanımlanmasını zorlaştırır. Ayrıca, larva hayatta kalmak için bazı bakteri^{varlığı gerekse de fermente} ortam, embriyoları çatlamadan önce zarar verebilir veya tüketebilecek öngörülemez bakteriyel ve mantar toplulukları oluşturur. Bu sınırlamalar, daha önce tanımlanan enjeksiyon ve yetiştirme^{yöntemleri 9} kullanılarak dönüştürülmüş larvaların geri alınmasını engelledi ve geliştirme boyunca floresan taramaya izin veren daha güvenilir bir enjeksiyon protokolüne ihtiyaç olduğunu ortaya koydu.

Burada sunulan bir tekrarlanabilir mikroenjeksiyon protokolü yer alıyor; bu protokol, transpozaz seçimi, enjeksiyon metodolojisi ve tarama ile yetiştirme ortamlarında iyileştirmeleri içeriyor. Bu modifikasyonlar, SIT için genetik cinsiyet suşları, gen sürücüleri ve CRISPR-Cas aracılı gen etkisi gibi uygulamalar için genetik olarak modifiye edilmiş stabil sineklerin geliştirilmesini kolaylaştırır. Önemli iyileştirmeler arasında, stabil sinek ısı şoku proteini (hsp)83 promotorunun kontrolü altında hiperaktif piggyBac^{transpozazı 14} kullanımı, enjeksiyon sonrası ooplazma kaybını en aza indirmek için embriyo kurutması ve embriyo enjeksiyonu sırasında yapışkan bant ile halokarbon yağının eliminasyonu yer almaktadır.

Enjekte edilen embriyoların iyileşmesi, toplu yetiştirme ortamının yerine yassı, pigmentli besin agar plakaları ve Escherichia coli çimi ile aşılanarak daha da iyileştirildi. Bu agar formülasyonu iki büyük avantaj sağlar. İlk olarak, larva gelişimi için öngörülebilir monojenik bakteriyel bir besin kaynağı sağlar. İkincisi, birinci nesil (G0) larvalarda morfoloji, gelişim ve GFP ekspresyonunun gözlemlenmesini kolaylaştıran yüksek kontrastlı, düşük otofloresans bir arka plan sağlar. Ev sinekleri ve stabil sinekler, E. coli aşılanmış yumurta sarısı bazlı agar^{plakalarında normal} şekilde gelişir ve pupa olur ^13,15. Burada tanımlanan formülasyon, arka plan floresansını daha da azaltmak için reaktif olmayan, gıda açısından güvenli bir katkı maddesi olarak aktif karbon tozunu içermektedir.

Protocol

Tüm deneyler ve operasyonlar, Texas A&M'nin Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin (protokol IBC2019-081) onayı ile gerçekleştirilmiştir. Bu protokolde kullanılan reaktifler, kimyasallar ve araçlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Yumurta üretimi için sinek yetiştirme

1. Yetişkin kafeslerin hazırlanması
   1. Bir kuluçka makinesinin termostatını 28°C'ye ayarlayın ve 3 kg sodyum klorür ile ~5 L musluk suyu 10 L'lik bir tavada karıştırın, tuzun %%50'sini çözerek çözün.
   2. Bu açıkta bırakılmış tuzlu su tavasını kuluçka odasının dibine yerleştirerek yaklaşık %80 RH nem elde edin. Odada veya odada gündüz-gece 16:8 döngüsünü sürdürün.
   3. Böcek kafeslerinin altını (30 x 30 x 30 cm paslanmaz / alüminyum kafesler, ağ örtülü 30 x 30 cm) iki kat kağıt havlu ile kaplayın ve kağıt havlu katmanının üzerine toz şekerle doldurulmuş 45 mL'lik tek kullanımlık sos kabı yerleştirin (Şekil 1A).
      NOT: Kağıt havlular sinek beneklerini emmeye yardımcı olur ve şeker kan beslenmeden önce bir besin kaynağı sağlar.
   4. 250 mL'lik Griffin kabını yaklaşık 100 mL oda sıcaklığında musluk suyu ile doldurun ve 20 cm x 20 cm ölçülerinde siyah pamuk kumaşı (sade siyah yastık kılıfından veya çarşaftan kesim) suya paketleyin, kumaş nemlenene kadar. Siyah kumaşı, kenarları beğenin kenarından 1-2 cm uzağa uzanacak şekilde ayarlayın (Şekil 1B).
      NOT: Bu nemli kumaş, yetişkin sinekler için hem sıvı su hem de yumurtlama yüzeyi sağlar. Yetişkinlerin nem kaynağına erişimi yoksa ölüm hızla gerçekleşebilir.
   5. 500-1.500 stabil sinek pupasını küçük bir tabağa veya beakere aktarın ve böcek kafesine yerleştirin. Yetişkin kafesi nemli yetiştirme odasına yerleştirin (adım 1.1.1) ve günlük olarak eklozyonu izleyin. Yetişkinler çıktıktan sonra, günlük olarak sitratlı sığır kanı ile beslenmeye başlayın (bölüm 1.2.).
2. Yetişkin sinekleri besleme
   1. Sitredilmiş sığır kanını taze toplanan sığır kanına son olarak 10,9 mM trisodyum sitrat dihidrat ekleyerek hazırlayın.
   2. Kısaca, ~12,8 gram sitrat tuzunu minimum hacimde deiyonize suya askıya alın ve yerel mezbahaneden toplanan 4 litre kanı ekleyin.
      NOT: Kan kaplarının kapakları vida kaplı olmalı (örneğin, kare şekilli, geniş ağızlı, 4L gripli şişeler) ve kullanımdan önce sıcak sabun ve suyla iyice temizlenmelidir. Mezbaharede, kesilmiş bir hayvandan ilk ~1 litre sığır kanını toplamaktan kaçının, böylece tüy, ter, kir ve diğer pıhtılaşanlarla kontaminasyonu en aza indirin.
   3. 200 mL aliquotlarda sitratlı sığır kanını dondurun ve gerektiğinde eritin, eritilmiş aliquotları 4°C'de bir haftaya kadar buzdolabında tutun.
   4. Her yetişkin kafese 600 sinek başına ~40 mL oda sıcaklığında kan verin.
   5. Kan bir çörek kabında veya beakerde sunulabilir ve kanı çekmek için katlanmış, steril olmayan pamuklu gazlı bez süngeri damara yerleştirilmelidir. Fitili pamuk tamamen doygunlaşana kadar karıştırın ve kafese yerleştirin.
      NOT: Eklozyondan 24 saat sonra her gün kan değişimi yapılmalıdır.
3. Yumurta koleksiyonu
   1. Siyah pamuk kumaşta yumurtalar gözlemlendikten sonra, beni bedekten çıkarın ve yumurtaları ayrı ~700 mL sığ plastik bir kapta yıkama şişesi ile yıkayın (Şekil 2A). Yumurtalama genellikle sinekler 7-10 günlük olduğunda gerçekleşir.
      NOT: Kan kupalarında da yumurta olup olmadığını kontrol edin ve oraya birikmiş olabilecek dağınık yumurtaları toplayın.
   2. Yumurtaları vakum filtreleme yoluyla filtre kağıdına toplayın. Bu, siyah bir filtre kağıdının bir Buchner hunisine yerleştirilmesi, vakum uygulanması ve ardından 1.3.1. adımdan itibaren yumurtaların kurulumun üzerine dökülmesiyle yapılır.
   3. Daha sonra, yumurtaları bir yıkama şişesi kullanarak dereceli silindire veya derecelendirilmiş 1,7 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve toplanan yumurta hacmini kaydedin (Şekil 2B).
      NOT: Yumurtaları uzun süre suya batırmaktan kaçının, çünkü ölüm oranı batırmadan ~10 dakika sonra artmaya başlar.
4. Toplu larva ortamının hazırlanması
   1. Toplu larva ortamı için materyal toplayın (Şekil 3A), Tablo 1'de belirtildiği gibi.
   2. 1000 mL'lik bir kaba içine buzağı proteini takviyesini ve tüm musluk suyunu ekleyin. Oda sıcaklığında gece boyunca yeniden nemlenmesine izin verin.
   3. Buğday kepeği ve vermiküliti ayrı ve daha büyük bir karıştırma kabına ekleyin.
   4. Gece boyunca yeniden hidrasyondan sonra, yeniden nemlendirilmiş buzağı takviyesini iyice karıştırarak topakları kırın, ardından karışımı buğday kepeği ve vermikülit ile birlikte kaba dökürün. Homojen olana kadar iyice karıştırın ve tüm buğday kepeği buzağı takviyesi çamuruyla kaplanana kadar.
   5. Toplu ortamı, tüm kap tabanını kaplayan ~8 cm derinliğinde bir tabakada polipropilen gıda depolama kabına aktarın (Şekil 3B).
   6. Embriyoları toplayarak ~1.000 embriyo ekleyin (2,2 L toplu ortam başına yaklaşık 0,2 mL yumurta) .90 mm çapında dairesel bir filtre kağıdına vakum filtrasyonu ve ardından filtre kağıdının yumurtaları yüzü aşağı bakarak medya kutusunun ortasına yerleştirilmesi (Şekil 3B, C).
   7. Filtre kağıdını nemi korumak için ~1 cm ortamla kaplayın (Şekil 3C) ve kabı siyah pamuk kumaşından oluşan büyük bir dikdörtgen ile kap kenarından 5 cm sarkan pamuk beziyle kap kenarından geçerek kap kenarından geçin.
   8. Gaz değişimi için gıda kabının kapağında ~12 cm çapında büyük bir delik açın ve kapağı medya kutusuna takarak siyah pamuk bezi kap ile kap arasında sıkıştırın (Şekil 3D).
      NOT: Bu, kapağdan konteynere olan boşluğun yoğuşma damlalarında 1^. instar larvaların hapsedilmesini engelleyen bir conta görevi görür.
   9. Bitmiş ortam kutusunu pupa oluşana kadar yetişkin yetiştirme odasına yerleştirin ve larva gelişimini izleyin (Şekil 4) (pupa etrafı ortam sıcaklığına ve larva yoğunluğuna bağlı olarak ~10 gün içinde gerçekleşir).
      NOT: Kumaş kaplama, birinci instar larvaların geçmesini engelleyecek kadar ince olmalı, ancak ortam kutularının iç duvarlarında yoğuşmanın oluşmasını engelleyecek kadar geçirgen olmalı; bu da larvaları tuzağa düşürüp boğabilir.
5. Pupaların ayrılması
   1. Pupal kutulardan kumaş örtüsünü çıkarın ve pupaları bir kaşık veya kepçeyle toplayın.
      NOT: Stabil sinek pupaları, hareketli sarı-beyaz larvaların aksine, 4-7 mm uzunluğunda, hareketsiz kırmızı-kahverengi silindirler olarak görünür. Pupalar genellikle kap duvarlarının dış çevresinde veya sineklerin larvalardan pupaya, oradan yetişkinlere dönüşüm yapmaya başlamasıyla ürgi ve yüksek pozisyonlarda birikir.
   2. Bir kaba üzerine ~1 cm derinlikte 500-1.500 pupa tabakası yerleştirin ve 1.1. bölümde açıklandığı gibi yeni temiz bir kafese yerleştirerek bir sonraki nesli üremek için kullanın.

Şekil 1: Yetişkin sinek yetiştirme malzemeleri. (A) Yetişkin sinek yetiştirme kafesi, sukroz kupası (S) ve yumurtlama kabı (O) gösteriliyor. (B) Suyla doygun siyah pamuk beziyle hazırlanan yumurtlama bardağı, kabanın kenarının biraz ötesine uzanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Yumurta toplama. (A) Yumurtlama bezinden yıkama şiberesi kullanılarak yumurta toplama. (B) Yumurtaların yüksek kontrastlı filtre kağıdına vakum filtrelenmesiyle geri kazanılması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Toplu Larva Ortamı İçin Malzemeler
Reaktif	Kütle (g)
Su	900
Buğday kepeği	230
Baldır takviyesi	100
Vermikülit (A4 kaba)	70
De-koryonasyon çözeltileri için malzemeler
Çözüm	Bileşim
Oksitleyici banyo	Deionize suda %3 sodyum hipoklorit
Yıkama banyosu	Triton X-100 deionize suda %0,02 çözelti
Duru	Deionize su
Siyah Agar tarama ve yetiştirme plakaları için malzemeler
Reaktif	Kütle (g)
Su	500
Toz yumurta sarısı	18
Aktif kömür	4
Sodyum klorür	1

Tablo 1: Toplu larva ortamı için reaktifler, dekoryonasyon çözeltileri ve siyah agar plakaları. Koloni bakımı için toplu larva ortamlarının hazırlanmasında kullanılan reaktifler, stabil sinek embriyolarından koryonu zayıflatmak ve çıkarmak için kullanılan çözgütlerin bileşimi ve 500 mL siyah agar tarama ve yetiştirme ortamı hazırlamak için gereken malzemeler.

Şekil 3: Tople larva ortamının hazırlanması. (A) Tople larva ortamı hazırlamak için kullanılan malzemeler: buzağı protein takviyesi (CM), buğday kepeği (WB), vermikülit (VM), depolama kabı (SC), kapak (L) ve kumaş contası (FG). (B) Medya bileşenlerinin titiz karıştırılması. (C) Yumurta kaplı filtre kağıdının (EP) yüzeyi aşağı olarak ortam yüzeyine yerleştirilmesi ve kurumayı önlemek için ek malzeme ile örtülmesi. (D) Kab ile kapak arasına pamuk-kumaş contasının takılması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Toplu ortamda larval gelişimi. Şeffaf kaplar, larva gelişimi ve ortam durumunun izlenmesini sağlar. Larvalar (L) kap duvarlarında, kapakta ve ortam içinde görülebilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Enjeksiyon için hazırlık: dekoryonasyon ve kurutma

1. Adım 1.1.4'te açıklandığı gibi nemli siyah pamuklu bir bezi bir beakere yerleştirin ve yumurtaları toplamak için 25 dakika boyunca yetişkin kafese aktarın. Yumurtaları 106 μm paslanmaz çelik elek üzerinde yıkama şişesi ile durulayın.
   NOT: 25 dakikalık bir toplama dönemi genellikle yaklaşık 400 yumurta verir.
2. Embriyoların elek üzerinde rahatsız edilmeden 30 dakika daha dinlenmesine izin verin.
3. Embriyolar yaşlanırken, Tablo 1'in "De-koryonasyon Çözeltileri Malzemeleri" bölümünde tanımlanan oksitleyici, yıkama ve durulama çözeltilerinden her biri 150 mL hazırlanın. Embriyoları yaklaşık 1 cm çözeltiyle örtmek için yeterli hacim kullanın.
4. Embriyoları içeren elek oksitleyici banyoya 2 dakika daldırın ve embriyoları Pasteur pipeti ile nazikçe karıştırın (Şekil 6A).
   NOT: Tekrar tekrar aspirasyon ve çözeltinin dağıtılması, dairesel bir girdap oluşturmak için embriyoların elek merkezinde yoğunlaşmasına yardımcı olur ve yeni dekoryonlu embriyoların elek duvarlarına yapışmasını engeller.
5. Elekteri oksitleyici banyodan çıkarın ve fazla çözeltiyi boşaltın. Eleği yıkama çözeltisine aktarın ve 2 dakika boyunca aspirasyon ve dağıtımla karıştırın.
6. Embriyoları içeren eleği durulama çözeltisine aktarın ve 2.4. adımda tarif edildiği gibi 2 dakika boyunca karıştırın. Elemeyi durulama çözeltisinden çıkarın ve fazla suyu muslukla uzaklaştırın.
7. Steril cam kaplama tabakasını elek üzerine yerleştirin ve bir diseksiyon mikroskobu altında, ince uçlu naylon boya fırçası kullanarak embriyoları elek üzerinden kapak kenarına aktarın (Şekil 6B). Embriyoları birbirine yakın konumlandırın, dokunmalarına izin vermeden, daha geniş arka kutup örtü slip'in kenarına bakacak şekilde konumlandırın. Transfer sırasında embriyoları bükmetmekten, çarpıtmaktan veya yırtmaktan kaçının.
8. 1 L'lik bir şişenin altını 100 mL kalsiyum sülfat kurutucu ile kaplayarak ve şişeyi kauçuk bir stopperle kapatarak bir kurutma odası hazırlayın.
   NOT: 24 saatlik denge süresinden sonra, kurutma odası genellikle 23 °C'de %<5 bağıl nem elde eder.
9. Kaplama kapağından fazla suyu çıkarın ve dekoriyonlu embriyoları içeren örtü kapak definitosunu kurutucu üzerine yerleştirin. Matayı kauçuk stopperle tekrar kapatın ve embriyoları 8 dakika boyunca kurutun.
10. Kapak kadını kurutma odasından çıkarın ve mikroenjeksiyon için 20× hedefi altında mikroskop aşamasına yerleştirin.

Şekil 5: Dekoryonasyon çözümleri. Soldan sağa: paslanmaz çelik elek, oksitleyici çözeltisi, yıkama çözeltisi ve embriyo dekoryonasyonu için kullanılan durulama çözeltisi. Sodyum hipoklorit, ışıktan korunan %6 stok çözelti olarak tutulurken, Triton X-100 ise 10× stok çözeltisi olarak tutulur ve kullanımdan önce %0,02 nihai konsantrasyona kadar seyreltilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Embriyo dekoryonasyonu. (A) Nazik aspirasyon ve çözeltinin dağıtılması, embriyoları eleğin ortasında yoğunlaştıran ve elek duvarlarına yapışmayı azaltan bir girdap oluşturur. (B) Durulama sonrası saydam koryondan çıkan dekoryonlu embriyo. Ön kutup (dar uç) genellikle arka kutuptan önce çıkar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Mikroenjeksiyon

1. 100 mm filamentli cam kapillyarlardan (I.D. 0.7 mm, O.D. 1.0 mm) kuvars mikroenjeksiyon iğnelerini Tablo 2'de listelenen parametrelerle çekin. İğneleri kullanıma kadar tozsuz bir yerde sakla.
   NOT: Benzer geometriye sahip borosilikat iğneler de kullanılabilir.
2. Enjeksiyon tamponu (%0,1 w/v fenol kırmızısı, fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS), pH 7,4) hazırlayın ve 0,22 μm şırınga filtresinden filtre sterilizasyonu yapın.
3. 20 μL enjeksiyon karışımı, sol ve sağ piggyBac ters terminal tekrarları arasındaki genetik kargoyu içeren 10 μg donör plazmid ile 4 μL enjeksiyon tamponu ile birleştirerek hazırlayın. Nukleazsız su kullanarak son konsantrasyona 500 ng/μL kadar seyreltin.
   NOT: Yardımcı plazmid, hsp83. başlangıç kodonu ve hiperaktif piggyBac transpozaz kodlama dizisinin yukarısındaki 3.1 kb hsp83 promotor dizisini içerir.
4. Enjeksiyon karışımını düşük hacimli 0,20 μm PTFE şırınga filtresine aktarın ve filtreyi 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünün açıklığına yerleştirin (Şekil 7A). Santrifüj işlemi ≥11.000 x g. ile 10 dakika veya tüm enjeksiyon karışımı filtreden geçene kadar kullanın. Kullanılmayan enjeksiyon karışımını -20 °C'de sakla.
5. Bir kuvars mikroenjeksiyon iğnesini yaklaşık 2 μL enjeksiyon karışımıyla mikro jel yüklemeli pipet ucu kullanarak geri doldurun (Şekil 7B). Yükleme sırasında hava kabarcıklarının oluşmasından kaçının.
   NOT: Mikroenjeksiyon iğnesini embriyoda uzun eksenine paralel konumlandırın ve yırtılma ile kesilmeyi en aza indirmek için sıfır yatay ve dikey açısal kaydırma kalın.
6. İğne ucunu cam sürgüsünün kenarına nazikçe vurarak enjeksiyon karışımı iğne ucundan geçene kadar (Şekil 7C).
   NOT: İğne ucunu yavaş yavaş kırarak enjeksiyon-karışım akışına izin veren en küçük ve keskin açıklığı oluşturun.
7. Embriyoyu kurutmadan hemen sonra arka kutup üzerinden yaklaşık 700 hPa enjeksiyon basıncı ve 300 hPa geri basınç kullanarak enjekte edin.
8. Embriyoyu nazikçe delin ve enjeksiyon karışımıyla embriyo hacminin yaklaşık onda birini enjekte edin (Şekil 7D–F).
   NOT: İğne sızmasını en aza indirerek vitelline zarının bozulmasını azaltmak ve iğne çekilmesi sırasında ooplazma kaybını önlemek için en aza indirin.
9. Kaplamayı, enjeksiyondan hemen sonra steril, nemli 90 mm siyah bir filtre kağıdıyla kaplanmış bir Petri kabına aktarın ve oda sıcaklığında 48 saat kuluçka yapın.
   NOT: Tüm enjeksiyonları, sinsityal aşamadan önce embriyoları hedef almak için yumurtlamadan 2 saat içinde tamamlayın.
10. Her 12–16 saatte bir embriyoların yumurtadan çıkmasını inceleyin. Yeni çıkmış larvaları ve cam kapak parçasını bölüm 4'te tanımlandığı şekilde aşılanmış ve koşullandırılmış bir agar plakasına aktarın.

Parametre	Isı	Fil	Vel	Del	Çek
Değer	825	5	60	150	175

Tablo 2: İğne Çekme Parametreleri. Kuvars mikroenjeksiyon iğneleri üretmek için kullanılan parametreler.

Şekil 7: Embriyo mikroenjeksiyonu. (A) 0,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilmiş bir şırınga filtresi kullanılarak enjeksiyon karışımının filtrasyonu. (B) Jel yüklemeli pipet ucu kullanılarak mikroenjeksiyon iğnesine filtrelenmiş enjeksiyon karışımının yüklenmesi. (C) Kuvars mikroenjeksiyon iğnesinin terminal geometrisi. (D) İğnenin embriyonun arka kutup ile hizalanması. (E) Embriyo yüzeyine nüfuz ederek vitelline zarın bozulmasını en aza indirmek. (F) Embriyo hacminin yaklaşık onda birinin enjeksiyonu ve ardından iğne çekilmesi. Artan şeffaflık, enjeksiyon karışımı tarafından ooplazmanın yer değiştirdiğini gösterir. Ölçek çubuğu = 400 μm (D–F) Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. İşlenmiş tabak hazırlama

1. Agar ortamı formülasyonu
   1. Tablo 1'in "Siyah Agar Tarama ve Yetiştirme Plakaları için Malzemeler" bölümünde tanımlanan ortamı hazırlayın ve 121 °C'de 15 dakika otoklav yapın. Agarı 40 °C'de dökün veya oda sıcaklığında saklayın, sonra tekrar ısıtıp 90 mm Petri kaplarına dağıtın.
      NOT: Katı partikülleri geri almak için dökmeden önce şiddetle dön.
2. Plaka aşısı
   1. K12 Escherichia coli'nin 24 saat kültürünü Luria-Bertani çorbasında OD600 = 0.200 olarak seyreldin ve 200 μL soğutulmuş, katılaşmış agar plakasına dağıtın. Kültürü steril cam boncuklar veya cam yayıcı ile eşit şekilde yayın ve plakanın fazla nemi emmesine izin verin (Şekil 8A, B).
      NOT: Bakteriyel ve larva büyümesini sağlamak için dökümden sonraki 1 ay içinde agar plakaları kullanın veya atın.
3. Plaka koşullandırma
   1. 6 × 6 cm uzunluğunda siyah filtre kağıdını katlayarak 6-10 oluklu çıkıntı oluşturup fırında veya otoklavlama ile sterilize edin. Aşılanmış Petri kabına bir steril olikli filtre kağıdını aseptik olarak yerleştirin ve birkaç damla steril suyla nemlendirin (Şekil 8C).
   2. Tedavi edilmemiş, enjekte edilmemiş vahşi tip (WT) birinci dönem larvaları yüzey sterilizasyonu ve 10 larvanı nemli filtre kağıdına aktarın.
      NOT: WT embriyolarını %10 çamaşır suyu (%0,6 NaOCl) içinde 1 dakika boyunca batırarak sterilize edin, ardından steril deionize suyla 2 dakika durulayın.
   3. Petri kabının kapağı ile gövdesi arasına conta görevi yapacak şekilde 90 mm filtre kağıdı yerleştirin.
   4. WT larvalarının plakaları 24 saat boyunca koşturmasına izin verin, ardından enjekte edilen embriyoları cam kapak kapaklarına ekleyin (Şekil 8C). İlk enjekte edilen embriyolar çatladıktan sonra WT larvalarını çıkarın.

Şekil 8: Agar plaka hazırlama ve enjeksiyon sonrası geri kazanım. (A) Agar plakalarının steril cam boncuklarla OD600 = 0.2 Escherichia coli kültürü ile aşılanması. (B) Embriyo transferinden önce fazla yüzey neminin emili. (C) Petri kabının kapağı ile gövdesi arasına 90 mm filtre kağıdı contasının yerleştirilmesi. (D) Koşullu agar plakalarında larvaların floresan işaretleyiciler için taraması. Enjekte edilen embriyolar, ters çevrilmiş bir Petri kabının kapağına yerleştirilen deionize suya doygun 90 mm filtre kağıdında geri kazanılır ve tarama plakalarına aktarılmadan önce 48 saat kuluçka halindedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Results

Bu protokol kullanılarak, 431 stabil sinek embriyosu dekoryonlanarak piggyBac-Hsp83 donör plazmidi ve Hsp83 yardımcı plazmid ile enjekte edildi, nihai konsantrasyon 500 ng/μL. Enjekte edilen 431 embriyodan, 18 ZsGreen-pozitif larva (%4,2) ve 8 ZsGreen negatif larva (%1,9) enjeksiyondan 48-76 saat sonra siyah karbon agar plakalarında tarama yaptıklarında çıktı (Tablo 3). Genel olarak, enjeksiyon yapılan 431 embriyonun 26'sı (%6,0) çıktı ve 26 yumurtadan çıkan larvadan 16'sı yetişkinliğe ulaştı (%61,5).

Türler	Enjeksiyon türü	Yapı	# enjekte edildi	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	ZsGreen(+) Pupae	ZsGreen(-) Pupae	ZsGreen(+) Yetişkinler	ZsGreen(-) Yetişkinler	# ZsGreen(+) yavrusu üreten yetişkinler
Stomoxys kalsitransları	Transpozaz yerleştirme	Hsp83:hy-pBac (yardımcı, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (donör, 500 ng/uL)	226	5	8	5	6	3	6	1
Stomoxys kalsitransları	Transpozaz yerleştirme	Hsp83:hy-pBac (yardımcı, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (donör, 500 ng/uL)	205	13	0	7	0	7	0	5

Tablo 3: Enjeksiyon İstatistikleri. Embriyo mikroenjeksiyonu sonrası hayatta kalma, dönüşüm ve iyileşme oranları.

18 ZsGreen-pozitif G0 larvasından 12'si pupasyona (%66,7) hayatta kaldı ve 10'u yetişkin olarak kapatıldı. Altı ZsGreen-pozitif yetişkin (enjekte edilen embriyoların %1,4'ü, verimli G0 hayatta kalanların %60'ı) ZsGreen pozitif yavrular üretmiştir. Bu yavrular (Şekil 9A–E) yazıldığı dönemde altı nesil boyunca kendi kendine çaprazlanmış ve floresansı korudu.

Sekiz ZsGreen-negatif larvadan altısı yetişkinliğe (%75) ulaştı. Flüoresan olmayan yetişkinlerin hiçbiri floresan yavru üretmedi.

Şekil 9: Transgenik sineklerin floresan taraması. (A) ZsGreen eksprese eden F1 larvaları ile WT larvalarının karşılaştırılması. (B) Pupal kütikül üzerinden görülen floresans, pupa aşamasında transgenik taramayı mümkün kılar. (C,D) Üç ZsGreen ekspresyonu yapan larva ve pupaların (solda) beyaz ışık (C) ve floresans (D) aydınlatması altında üç WT larva ve pupaları (sağda) karşılaştırılması. (E) ZsGreen ifade eden yetişkin transgenik F1 sineği (solda) WT yetişkin sineği (sağda) karşılaştırıldığında. Ölçek çubukları = 1 mm (A), 2 mm (B,E) ve 3 mm (C,D). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Model dışı böcek türlerinin genetik dönüşümü, artropodlu zararlılar ve vektörler için genetik kontrol stratejilerinin geliştirilmesi ve değerlendirilmesinde büyük bir darboğaz olmaya devam etmektedir.

Stabil sinekler için burada tanımlanan protokol, embriyo mikroenjeksiyonu sonrası G0 sineklerinin enjeksiyonu ve yetiştirilmesiyle ilgili zaman, kaynaklar, iş gücü ve değişkenliği azaltır. Ayrıca, siyah agar tarama plakalarının kullanımı, yaşam döngüsü boyunca gelişimin doğrudan gözlemlenmesini sağlar ve enjeksiyon, iyileşme ve larva yetiştirme sırasında ortaya çıkan sorunların tespit edilmesini ve düzeltilmesini kolaylaştırır. Bu çalışmada değerlendirilen plazmid yapıları kullanılarak, protokol daha önce bildirilen yöntemlere göre daha az enjekte embriyoya sahip transjenik stabil sinek hatları^{üretmiştir 9}. Bu yöntem makalesinin kapsamının dışında olmasına rağmen, transgen yerleştirme noktalarının doğrulaması ve lokalizasyonu ters PCR ve splinkerette PCR gibi yerleşik yaklaşımlarla gerçekleştirilebilir.

Verimli bir enjeksiyon protokolü ayrıca, floresan muhabirler kullanılarak promotor karakterizasyonu dahil olmak üzere fonksiyonel genomikte gelecekteki çalışmaları kolaylaştırır; vektör yetkinliği, patojen iletimiyle ilişkili genlerin ters genetik analizleriyle; CRISPR-Cas9 ve diğer programlanabilir çekirdeklerin kararlı sineklerde değerlendirilmesi dahil olmak üzere nukleaz karakterizasyonu; aday direnç allellerinin modifikasyonu yoluyla böcek isit direnci araştırması; ve kan beslenme, çiftleşme ve gelişimde rol alan genler dahil olmak üzere temel biyolojinin araştırmaları. Protokolümüz ayrıca, önceki Musca evi ve Lucilia cuprina piggyBac dönüşüm literatürünün^16,17 numaralarında belgelendiği gibi, enjeksiyon sonrası embriyo enjeksiyonları ve oksijenli nem odalarına olan ihtiyacı da ortadan kaldırmaktadır.

Başarılı transgenezler için birkaç parametre kritik öneme sahiptir. Embriyo kurutması ve enjeksiyon zamanlaması özellikle önemlidir çünkü plazmid DNA'sının hücreselleşmeden önce eklenmesi ve germ hattı öncü hücrelerine dahil edilmesi sağlanması gerekir. Ancak, stabil sinek embriyolarında sinsityum oluşumunun kesin zamanlaması bilinmemektedir. Ayrıca, embriyonik gelişim hızı sıcaklıktan etkilenir ve farklı çevresel koşullarda stabil sinek embriyolarının gelişim zaman çizelgesi tam olarak tanımlanmamıştır. Stabil sinek laboratuvar suşlarının gelişim hızları ve embriyogenezi üzerine gelecekteki araştırmalar, mikroenjeksiyon ve dönüşüm protokollerinin optimize edilmesi konusunda içgörü sağlayabilir, böylece verimliliği ve protokol tekrarlanabilirliğini daha da artırabilir. Ancak, o zamana kadar, optimal enjeksiyon penceresinin belirlenmesi, dönüşüm verimliliğini etkileyebilecek metodolojik bir sınırlama olarak kalır. Hayatta kalma oranları düşük olduğunda, sorun giderme işlemleri, tedavi edilmemiş embriyolar, dekoryonlu embriyolar, filtreyle sterilize edilmiş PBS enjekte edilen embriyolar ve agar plakalarında yetiştirilen WT embriyoları arasındaki çatma ve yetişkin hayatta kalma oranları karşılaştırılarak yapılabilir. Musca evcil hayvanının dönüşümünü anlatan önceki literatürler, enjeksiyonun %0,84'ü olan 1.668 enjeksiyondan 14'ünü sağlamıştır ve koyun zararlısı Lucilia cuprina'nın dönüşümü yaklaşık 900 embriyo enjeksiyonundan (enjekte edilenlerin %0,33'ü) 3 transgenik hatt ^{oluşturmuştur}; bu da bu protokolde tanımlanan stabil sinek dönüşüm protokolünün (431 enjeksiyonda 6 entegrasyon olayı) olduğunu göstermektedir. Enjeksiyonun %1,4'ü) edebiyatta diğer zararlı dipteran türlerine kıyasla enjeksiyon verimliliğinde bir iyileşme sağlar.

Stabil sinek hsp83 yapısal promotoru, gelişim boyunca ZsGreen'in sağlam ekspresyonunu sağlamış ve erken embriyogenezde hiperaktif piggyBac transpozazının ekspresyonunu desteklemiş, böylece daha önce bildirilen kararlı sinek dönüşüm^{protokolüne kıyasla} floresan belirteç görünürlüğünü ve dönüşüm verimliliğini artırmıştır 9. Bu çalışmada kullanılan yardımcı plazmid, hsp83 başlangıç kodonunun hemen yukarısında 3,1 kb genomik DNA'nın hiperaktif piggyBac transpozaz kodlama dizisinin yukarısında minimal plazmid vektörüne subklonlanmasıyla oluşturulmuştur. Yardımcı-kargo plazmid oranı ampirik olarak kütle olarak 1:1 olarak belirlenmiş ve çalışma boyunca kullanılmıştır. Ek plazmid oranları değerlendirilmemiş olsa da, alternatif oranlar da etkili olabilir.

Burada açıklanan iyileştirmeler, diğer artropodlular için transgenez protokollerine de uygulanabilir. Ayrıca, agar tabanlı tarama ve yetiştirme sistemi şu anda siyah asker sineği (Hermetia illucens) embriyosu enjeksiyonu ve taramasına uygulanmaktadır. Protokol, Musca domestica ve Haematobia irritans gibi diğer kaslı sineklerde transgenezler için özellikle faydalı olabilir; çünkü larva ekolojileri ve parçalanan lifli substratlarda gelişimleri benzerdir. Escherichia coli ile aşılanmış agar plakalarının kullanımı, enjeksiyon sonrası izleme için pratik bir yaklaşım sağlarken, araştırmacıların embriyonik gelişimi, larva morfolojisini, işaretleyici ifadesini, yumurta çıkma oranlarını ve genel iyileşmeyi değerlendirmelerine olanak tanır. Ortamın bakteriyel bileşeninin hedef türün biyolojisine uyarlanması, bu yaklaşımın transgenez protokollerinin geliştirilmesi ve optimize edilmesinde faydasını daha da artırabilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L flask with rubber stopper (desiccation chamber)	VWR	214-1134	Kurutma odası
Bacto Agar	Difco	281230	Siyah agar plakaları için agar
Black pillowcases	Aisawate	3.45496E+11	Yumurtayı toplama kapları için siyah pamuklu bez ve larvaları yetiştirme kutuları için kumaş conta
Calcium sulfate desiccant	Drierite	21001	Kurutma odası için desikant
Calf Manna Performance Supplement	Manna Pro	095668940010	Toplu larval medya
Compound microscope	Leica Microsystems	DM750M	Enjeksiyon mikroskobu
Dried Egg Yolks	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	Siyah agar plakaları için besin kaynağı
E. coli	New England Biolabs	C2987H	Siyah agar plakalarında kullanılan bakteri
Femtojet 4i microinjection pressure supply	Eppendorf	5252000021	Mikroenjeksiyon basınç kaynağı
Fine-tipped nylon paintbrush	Transon	7.42298E+11	Embriyoların transferi
Fire-polished quartz capillaries with filament, OD 1.0 mm, ID 0.70 mm, 10 cm length	World Precision Instruments	QF100-70-10	İğne çekmek için kapillerler
Forceps	Fine Science tools	11251-20	Numune işleme
Full height seive, 3” dia, No. 140 ASTM-E11 Standard test sieve (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	Embriyoların dekoriyonasyon sırasında tutulması
Germicidal Ultra Bleach (6% sodium hypochlorite)	Pure Bright	59647-21014	Koryonu çıkarmak için ağartma solüsyonu
GladWare Family Size Food Storage Containers, XL 104 oz	Glad	012587701294	Toplu larval medya kabı
Grade 8613, 9cm Black qualitative filter papers	Ahlstrom	8613-0550	Embriyoların toplanması
LB Broth	BD Difco	DF0446-17-3	E.coli kültürü için LB besi
M60 zoom stereo dissecting microscope with Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	Embriyoları hareket ettirme ve sıralama mikroskobu
Microloader tips 0.5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	Enjeksiyon karışımını iğnelere yüklemek için kullanılır
Micromanipulator	Leica Microsystems	11520137	Enjeksiyon için mikromanipülatör
Millex Syringe Filter, Hydrophilic PTFE, 0.2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	Enjeksiyon karışımını filtrelemek için kullanılır
Nuclease-free water	Corning	46-000-CM	Enjeksiyon tamponu
Organic coconut activated charcoal powder	Belle Chemical	B073BSNLJ3	Siyah agar plakaları için pigment
P-2000 Laser-based pipette puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Kapillerlerden iğneler çekmek için cihaz
PBS, pH 7.4	Gibco	10-010-023	Enjeksiyon tamponu
Petri plates	VWR	391-0609	Agar siyah yumurta plakaları için petri kapları
Phenol red, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	Enjeksiyon için boya
Rubber stoppers	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	Kurutma odası tapası
Soft wheat bran (soft red winter wheat) 50 lb	Siemer	55600050500000	Toplu larval medya
Square Glass Coverslips, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	Mikroenjeksiyon için cam kapakçıklar
Stereo microscope fluorescent adapter	Nightsea	SFA-RB	Larvayı taraması için floresan lamba ve filtreler
Sterile glass beads	VWR	1.04016.0500	Bakterileri plakalara yayıyor
Transfer Pipette Disposable 5mL	LabAid	BP1200	Embriyoların dekoriyonasyonu sırasında yıkanması
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	Embriyoların koryonlarının çıkarılması
Wash bottle	Safetyware	Z423335	Yüzeylerden embriyoları yıkamak